Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Nov 24; 106 (47): 20016 – 20020.
Publié en ligne 2009 Nov 9. est ce que je: 10.1073 / pnas.0908789106
PMCID: PMC2785284
Pietro Cottone,a,b,c,d,1,2 Valentina Sabino,a,b,c,d,1 Marisa Roberto,a,c,d Michal Bajo,e Lara Pockros,a Jennifer B. Frihauf,a,c,d,f Eva M. Fekete,a,c,d Luca Steardo,g Kenner C. Rice,h Dimitri E. Grigoriadis,i Bruno Conti,d,e George F. Koob,a,c et Eric P. Zorrillaa,c,d,2
Abstract
Un régime visant à contrôler le poids corporel implique des cycles de privation de nourriture savoureuse qui peuvent favoriser une alimentation compulsive. La présente étude montre que les rats retirés d'un accès intermittent à une nourriture au goût agréable présentent une suralimentation en nourriture au goût agréable lors d'un accès renouvelé et à un état de repli affectif caractérisé par le facteur 1 libérant de la corticotropine (CRF).1) les comportements antagonistes réversibles des récepteurs, y compris l'hypophagie, les déficits de motivation pour obtenir des aliments moins appétissants et un comportement de type anxiogène. Le retrait était accompagné d’une augmentation de l’expression de la CRF et de la CRF1 réactivité électrophysiologique dans le noyau central de l’amygdale. Nous proposons que le recrutement de CRF-CRF extrahypothalamique anti-récompense1 les systèmes pendant le sevrage des aliments agréables au goût, analogues à l’abstinence des drogues maltraitées, peuvent favoriser la sélection compulsive d’aliments agréables au goût, la sous-consommation d’alternatives plus saines et un état émotionnel négatif lorsqu’on évite la consommation d’aliments agréables au goût.
Les formes d'obésité et de troubles de l'alimentation, similaires à la toxicomanie, peuvent être conceptualisées comme des affections récurrentes chroniques alternant des périodes d'abstinence (par exemple, un régime pour éviter les aliments «interdits» au goût) et des rechutes (par exemple, une alimentation compulsive, souvent incontrôlable, appétissants) qui continuent malgré les conséquences négatives (1). Bien que les propriétés de renforcement positives des aliments au goût agréable soient bien connues (2, 3), moins d'attention a été accordée à leurs propriétés de renforcement négatives (4-6), à savoir la probabilité accrue d'une réponse comportementale produite par la suppression d'un stimulus aversif (par exemple, la prise d'aliments appétibles pour soulager les états émotionnels négatifs). Des cycles intermittents d’abus prolongés d’abus de drogues peuvent progressivement conduire à une «dépendance affective», constatée comme un besoin de quantités de drogue plus élevées et / ou plus régulières pour maintenir un seuil émotionnel donné, ainsi qu’un état émotionnel négatif lors de la cessation de la consommation. consommation de drogue (7, 8). Un tel sevrage affectif peut maintenir l'utilisation et motiver la rechute via les propriétés de renforcement négatives de la poursuite et de la reprise de la consommation de drogue, respectivement (7, 8).
Les systèmes de stress cérébral du facteur de libération de la corticotropine (CRF) extrahypothalamique sont supposés être impliqués dans la transition de la toxicomanie à la dépendance, au cours de laquelle la consommation de drogues maltraitées est de plus en plus motivée par ces mécanismes de renforcement négatifs plutôt que positifs. La CRF joue un rôle important sur le plan de la motivation dans les syndromes de sevrage de chaque drogue majeure, y compris l’alcool, la nicotine, la cocaïne, les opiacés, les amphétamines et le tétrahydrocannabinol (7, 8). Par analogie, des cycles répétés d’accès prolongé intermittent et prolongé à des aliments très appétents ont été supposés induire des neuro-adaptations du système de CRF similaires à celles observées dans les modèles de pharmacodépendance (4, 5, 9).
Résultats
Un accès prolongé et intermittent à des aliments au goût agréable conduit progressivement à une sous-consommation des régimes moins préférés lorsque la nourriture au goût est indisponible et à une surconsommation d'aliments au goût lors d'un nouvel accès (10-12). Pour tester l'hypothèse que CRF1 systèmes, ces rats adaptent leur alimentation à des rats Wistar mâles (n = 20) recevaient une diète chow ad libitum (Chow / Chow) chaque jour ou du Chow ad libitum les jours 5 (phase C) suivis d’un régime très appétissant et sucré les jours 2 (phase P) (Chow / Palatable ) (voir Fig. S1 pour le programme de régime et Fig. S2 effets du régime alimentaire sur la consommation de nourriture et le poids corporel). Après des semaines de cycle alimentaire 7, les rats ont reçu le CRF non peptidique1 R121919 (0, 5, 10 et 20 mg / kg, sc), antagoniste des récepteurs, de forme carrée en latin (13) Les traitements ont été administrés à 1 h avant de passer d'un régime alimentaire au goût agréable ou d'un régime alimentaire au goût agréable. R121919 a réduit de manière dose-dépendante la diète palatable et la prise de nourriture de Chow chez les rats Chow / Palatable (phase de régime × programme de régime × dose de médicament): F3,54 = 7.25, P <0.001), sans modifier la consommation des contrôles de nourriture. R121919 a diminué la consommation de la diète très appétissante lors d'un accès renouvelé à l'aliment appétent (phase P) (Fig. 1A) Dans des tests indépendants, le CRF1 l’antagoniste des récepteurs a augmenté la consommation de nourriture moins appétissante chez les rats Chow / Palatables retirés du régime appétissant (phase C) (Fig. 1B) Ainsi, en atténuant l’hypophagie et l’alimentation excessive des aliments au goût agréable, R121919 a atténué l’amplitude du cycle d’admission (différence entre l’ingestion au cours de la première phase P agréable et du premier sevrage pour la phase C: régime alimentaire × dose de médicament: F3,54 = 7.25, P <0.001) (Fig. 1C) Soutenir un recrutement progressif de CRF-CRF1 R121919 n'a pas réduit la consommation de nourriture au goût agréable après une seule exposition au régime ni augmenté la consommation de nourriture lors du premier retrait d'aliments au goût agréable (Fig. S3).
Le retrait de l'accès prolongé et intermittent à une nourriture savoureuse peut également accroître les comportements de type anxiété (11). Pour tester l'hypothèse que CRF1 Les récepteurs sont impliqués dans les signes de comportement émotionnel négatif qui suivent le retrait de la nourriture au goût agréable. Les rats ont reçu R121919 (0, 20 mg / kg, sc, prétraitement 1-h) et ont été testés entre les sujets dans le labyrinthe plus élevé (14), 5 – 9 h après le passage d’un régime alimentaire agréable au goût. Les rats Chow / Palatable traités avec le véhicule ont présenté moins de temps au bras ouvert que les témoins nourris avec la méthode Chow, reflétant un effet de type anxiogène, lors du sevrage de 7 au cours de semaines de cycles de régime (Fig. 2A), effet non encore observé après seulement deux cycles de sevrage (Fig. S4) Le prétraitement avec R121919 (20 mg / kg, la dose qui modulait à la fois la suralimentation d’aliments au goût et le sous-aliment de la nourriture) bloquait la diminution de l’exploration à bras ouvert des rats Chow / Palatables à une dose ne modifiant pas le comportement du labyrinthe en plus chez les témoins Calendrier de régime × Dose: F1,43 = 7.25, P <0.02; Fig. 2Une gauche) L'administration de R121919 n'a pas modifié l'activité générale mesurée en tant qu'entrée de bras fermé. Par conséquent, R121919 a bloqué l'augmentation du comportement de type anxiété associée au retrait de l'accès prolongé intermittent à une nourriture savoureuse, sans modifier le comportement des témoins, suggérant le recrutement de CRF.1 systèmes.
Le retrait d'un accès prolongé et intermittent à une nourriture savoureuse peut également entraîner un déficit de motivation pour obtenir un régime moins préféré, un indice potentiel de comportement de type hypohédonique (10) De manière analogue, la réponse aux renforcements gustatifs moins préférés avec des calendriers de renforcement à rapport progressif a déjà été utilisée pour indexer les déficits de motivation observés lors du sevrage du médicament (15) Déterminer l'implication de CRF1 récepteurs, nous avons testé les effets de R121919 sur les performances des rats soumis à un cycle alimentaire pour obtenir leur apport moins préféré selon un schéma à rapport progressif. Confirmation des résultats précédents (10), les rats Chow / Palatable traités avec le véhicule ont montré une motivation réduite à travailler pour obtenir un atome moins agréable au goût, reflétée par une diminution du point d'arrêt et des réponses totales émises diminuées par rapport aux rats Chow / Chow (10) (Fig. S5) Le prétraitement R121919 (20 en mg / kg, dose efficace pour augmenter l'hypophagie à chow, réduire l'hyperphagie alimentaire palatable et les comportements de type anxiogène) a atténué de manière sélective les déficits de performances progressives chez les rats soumis à un cycle de régime à une dose inefficace chez les rats (point d'arrêt: programme de régime × médicament: F1,15 = 8.17, P <0.02; réponses totales: Calendrier de régime × Médicament: F1,15 = 9.14, P <0.01; Fig. 2B, la gauche). Contre l’interprétation alternative voulant que R121919 facilite la performance chez les rats Chow / Palatable en diminuant la satiété postestif, R121919 a bloqué les déficits en répondant dès le début de la session 5 min (Diet Planning × Drug: F1,15 = 2.55, P <0.05) (Fig. 2Brillant) Par conséquent, le CRF1 antagoniste du récepteur a atténué les déficits de motivation dans la réponse à rapport progressif pour les agents de renforcement gustatifs moins préférés observés chez les animaux retirés de l'accès prolongé intermittent à une nourriture très appétissante.
Pour tester l’hypothèse selon laquelle le retrait d’une nourriture au goût agréable pourrait activer le système de CRF extrahypothalamique lié au stress, les taux d’ARNm et de peptide de CRF dans le noyau central de l’amygdale ont été mesurés par PCR quantitative et RIA, respectivement. Les rats ont été soumis à un cycle diététique pendant les semaines 7 ou ont été nourris de manière continue. Après anesthésie et décapitation, des coups de poing du noyau central de l'amygdale ont été recueillis pendant le sevrage et après le renouvellement de l'accès au régime appétissant. Le retrait d’aliments au goût agréable chez les rats Chow / Palatables a entraîné une multiplication par cinq de l’expression de l’ARNm du CRF dans le noyau central de l’amygdale par rapport aux rats Chow / Chow (Fig. 3A) Inversement, l'ARNm de la CRF est revenu à des niveaux similaires à ceux d'un contrôle avec un accès renouvelé à une nourriture savoureuse (F2,19 = 6.97, P <0.01). L'expression de l'ARNm du CRF dans le noyau central de l'amygdale n'a pas changé lorsque les rats Chow / Palatable ont été cyclés une seule fois (Chow / Chow vs Chow / Palatable: 5.5 ± 2.2 vs 6.3 ± 1.7 ns), soutenant un recrutement progressif de CRF- CRF1 systèmes par l'histoire du régime plutôt que par un effet aigu du régime. En outre, l’expression de l’ARNm de la CRF n’a pas changé dans le noyau accumbens, le cortex préfrontal ou le cortex insulaire, confirmant ainsi la spécificité régionale des résultats (Fig. S6) Fait intéressant, aucun changement significatif dans l’expression de l’ARNm du CRF n’a été observé dans le noyau paraventriculaire de l’hypothalamus ou dans la corticostérone en circulation au même moment d’attente chez les rats Chow / Palatable (Figues. S6 et S7), suggérant l’hypothèse selon laquelle des modifications des systèmes de stress des CRF amygdalaires, plutôt que hypothalamiques, sous-tendaient les adaptations comportementales. En outre, l’immunoréactivité du peptide CRF dans le noyau central de l’amygdale d’animaux retirés du régime au goût était de 70% plus élevée que chez les animaux nourris au chow, mais était revenue aux niveaux de contrôle nourris au chou avec accès au régime au goût agréable (F2,24 = 4.01, P <0.01) (Fig. 3B) Ainsi, le fait de retirer de la nourriture au goût agréable a activé le système peptidique de CRF lié au stress dans le noyau central de l’amygdale, de manière analogue aux résultats des modèles de sevrage de drogue et d’éthanol (7, 8) Parce que l'accès renouvelé à une nourriture savoureuse a diminué l'activation du système CRF extrahypothalamique dans le noyau central de l'amygdale, l'activation du CRF étant liée à l'anxiété (16), les présents résultats suggèrent également que les aliments au goût agréable pourraient acquérir des propriétés de renforcement négatives en atténuant les conséquences affectives négatives de l'abstinence (17).
Pour tester l'hypothèse que les rats retirés de la nourriture au goût agréable pourraient montrer une sensibilité accrue au CRF1 modulation antagoniste de la signalisation de l'acide γ-aminobutyrique (GABA) dans le noyau central de l'amygdale, qui se produit pendant le sevrage de l'éthanol (18), nous avons examiné l'effet de R121919 sur la transmission GABAergique du noyau central des neurones de l'amygdale dans une préparation en coupes. Rats Wistar mâles (n = 14) ont été soumis à un cycle de diète pendant 7 semaines et ont été sacrifiés après avoir été remplacés par l’aliment moins agréable au goût. La transmission GABAergique basale dans le noyau central des synapses de l’amygdale n’a pas différé en fonction de l’histoire de l’alimentation (n = Cellules 23) pour toutes les intensités de stimulus utilisées pour évoquer les potentiels postsynaptiques inhibiteurs du GABA (IPSP). Cependant, la superfusion min 20 avec R121919 (1 µM) a induit une réduction plus importante du GABA évoqué.A-IPSP dans le noyau central des neurones amygdales de rats Chow / Palatable (M ± SEM: 30 ± 6%, n = Cellules 9) que dans celles des témoins nourris au chow (M ± SEM: 12 ± 6%, P <0.05, n = Cellules 11) (Fig. 4). Après une période d'élimination minime 30, les IPSP des deux groupes sont revenus à des niveaux similaires à ceux de la ligne de base. Par conséquent, compatible avec une suractivation de l'amygdale CRF-CRF1 système et effets observés lors du sevrage à l'éthanol (18), des rats soumis à un régime ont présenté une sensibilité accrue aux effets inhibiteurs d'un effet de1 antagoniste des récepteurs sur le noyau central de la transmission GABAergique de l’amygdale.
a lieu
Les résultats collectifs fournissent des preuves fonctionnelles qu'un accès prolongé et intermittent à des aliments appétissants a conduit à des neuroadaptations progressives et importantes sur le plan de la motivation dans le CRF-CRF extrahypothalamique lié au stress.1 systèmes. Plus précisément, le CRF sélectif1 L'antagoniste des récepteurs R121919 a affecté de manière différenciée et sélective l'alimentation chez les rats soumis à un régime alimentaire, en augmentant la consommation régulière de nourriture et en diminuant la consommation d'aliments très appétissants lors d'un nouvel accès. Le CRF1 L'antagoniste des récepteurs a également bloqué de manière sélective l'augmentation du comportement de type anxiété et des déficits de motivation dans la réponse à une alimentation moins préférée observée lors du sevrage du régime appétissant. Le fait de retirer l’accès au régime appétissant a augmenté l’expression des gènes et des peptides du CRF dans le noyau central de l’amygdale, effets qui ont été éliminés lors d’un nouvel accès. De plus, les rats soumis à un régime alimentaire ont montré une sensibilité accrue aux effets inhibiteurs d'un1 antagoniste du récepteur sur la transmission GABAergique dans le noyau central de l'amygdale, suggérant en outre une suractivation de l'amygdale CRF-CRF1 système. La suralimentation d'aliments au goût agréable lors d'un accès renouvelé peut résulter de l'activation accrue par le système CRF de la période de sevrage qui vient de s'achever, considérée comme une expression accrue de la CRF et une sensibilité électrophysiologique à la CRF.1 blocage des récepteurs dans le noyau central de l'amygdale. CRF1 le prétraitement antagoniste juste avant l'accès au goût agréable est ainsi interprété comme s'opposant au CRF-CRF initialement présent1 suractivation du système par le retrait. La brève évolution dans le temps de la nourriture savoureuse trop mangée que l’on observe chez les animaux non traités (10) peut refléter le temps écoulé au cours duquel l'expression, la libération et les effets du peptide CRF se normalisent une fois que l'accès aux aliments appétissants est retrouvé, comme le montre la présente étude. Ainsi, manger par intermittence des régimes appétissants peut induire un changement allostatique dans les systèmes de récompense du cerveau avec le recrutement de CRF-CRF anti-récompense.1 systèmes dans le noyau central de l'amygdale.
Ces résultats ont des implications non seulement pour l'alimentation compulsive, mais aussi pour la motivation en général. L’activation répétée des systèmes hédoniques a provoqué des processus analogues à ceux de l’opposant dans le cerveau (c.-à-d. Le recrutement de CRF).1 circuits) distincts d’une simple perte de fonction des systèmes d’émetteur de récompense. De telles neuro-adaptations entre systèmes (19) se produisent également pendant la transition vers la dépendance à l’égard de toutes les principales drogues d’abus (7, 8). La généralisation aux stimuli non médicamenteux dans la présente étude suggère que les processus de motivation peuvent être perturbés chez les individus qui subissent des contrastes répétés de l'intensité des stimuli hédoniques au fil du temps (20). De manière adaptative, de tels processus peuvent déplacer le comportement de recherche de nourriture et de consommation vers des aliments riches en énergie et à haute récompense, tout en dévaluant les efforts pour obtenir des aliments (ou non alimentaires) moins riches en énergie et à faible récompense, une adaptation utile sur le plan de l'évolution lorsqu'il y a les coûts de recherche de nourriture (p. ex., exposition aux prédateurs, temps et ressources énergétiques limités). Dans l'environnement actuel, cependant, les mêmes processus peuvent conduire à la consommation d'aliments qui favorisent l'obésité au détriment d'alternatives moins savoureuses, mais peut-être plus nutritives.
Ainsi, les modifications analogues à la dépendance dans le FRC1 les systèmes peuvent aider à conduire (i) la consommation d'aliments savoureux et denses en énergie, (ii) sous-consommation d'alternatives plus saines, et (iii) l'état émotionnel négatif associé à la prévention de l'accès à des aliments au goût agréable (4, 5, 10-12, 17). Activée, l’activation du système CRF peut favoriser la rechute lorsqu’elle mange l’obésité et les troubles de l’alimentation associés, ainsi que d’autres séquelles motivationnelles négatives de l’abstinence cyclique d’aliments agréables au goût.
Matériels et méthodes
Sujets.
Rats Wistar mâles (n = 155, 180 – 230 g, jours 45) ont été obtenus auprès de Charles River et logés individuellement à leur arrivée dans des cages en plastique recouvertes de grillage (19 × 10.5 × 8 pouces) dans un cycle de lumière inverse 12 h: 12 h (10 : X X XUMUM h est éteint), un vivarium à humidité (00%) et à température contrôlée (60 ° C). Les rats avaient accès à la nourriture pour rongeurs à base de maïs [Harlan Teklad LM-22 Diet 485:% de glucides 7012 (kcal), 65% de matières grasses, 13% de protéines, énergie métabolisable 21 cal / 341 g] et de l'eau à volonté pour la semaine précédant le 100 début des expériences. Les procédures expérimentales ont été respectées par le National Institutes of Health Guide concernant le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (numéro de publication du NIH 1 – 85, version révisée de 23) et les «Principes de soin des animaux de laboratoire» (http://www.nap.edu/readingroom). / bookslabrats) et ont été approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut de recherche Scripps.
Drogues.
R121919 a été synthétisé comme décrit dans Chen et al. (21). R121919 est une affinité élevée (Ki = 3.5 nM) CRF sélectif1 antagoniste aux propriétés physicochimiques supérieures à beaucoup d'autres CRF1 antagonistes (p. ex. diminution de la logP et de la logD, augmentation de la solubilité dans l’eau) (13). Pour le test, R121919 a tout d'abord été solubilisé dans 1 M HCl (10% du volume final), puis dilué dans un véhicule final de 20% (poids / volume) 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine (Sigma-Aldrich), titré en retour avec NaOH à pH 4.5. La solution de R121919 a été administrée par voie sc (sc) dans un volume de 2 mL / kg.
Ad Libitum Diet Alternation.
Après acclimatation, les rats ont été divisés en deux groupes appariés pour l'apport alimentaire, le poids corporel et l'efficacité alimentaire des jours précédents 3 – 4. Un groupe recevait un régime Chow («Chow») ad libitum 7 jours par semaine (Chow / Chow), et un second groupe recevait du chow ad libitum pendant des jours 5 chaque semaine, suivis de 2 jours d'accès ad libitum aux produits très attrayants. , régime chocolaté, régime riche en saccharose («Palatable»; Chow / Palatable). Le régime au goût agréable est un régime à base de AIN-50A, riche en sucre, riche en saccharose (76% kcal), au goût riche en nutriments et comparable en densité de macronutriments et en densité énergétique au régime à chow [TestDiet; formule au chocolat 5TUL: 66.8% (kcal) glucides, 12.7% lipides, 20.5% protéines, énergie métabolisable 3.48 kcal / g; formulés sous forme de granulés alimentaires de précision 45-mg pour augmenter son degré de préférence (22, 23)]. Par souci de brièveté, les premières journées 5 (chow uniquement) et les derniers jours 2 (chow ou palatable selon le groupe expérimental) de chaque semaine sont appelées phases C et P dans toutes les expériences. Les régimes n'étaient jamais disponibles simultanément. La diète Chow était soit Harlan Teklad LM-485 Diète 7012 [glucide 65% (kcal), 13% graisse, 21% protéine, énergie métabolisable 341 cal / 100 g] ou 5TUM formulée sous forme de 4- en 5 extrudé % de glucides (kcal), 65.5% de matières grasses, 10.4% de protéines, énergie métabolisable 24.1 cal / 330 g; TestDiet]. Semblable aux études précédentes, Harlan Teklad LM-100 chow a été utilisé dans des expériences sur l'alimentation et l'élévation du labyrinthe en plus (11), tandis que TestDiet 5TUM chow (10) a été utilisé dans les expériences à rapport progressif d'ARNm de CRF, de contenu en peptide de CRF, d'AIR à la corticostérone et d'électrophysiologie.
Comme précédemment publié (10), les préférences alimentaires relatives, calculées en pourcentage de l'apport quotidien (en kcal) du premier régime par rapport au deuxième régime, étaient les suivantes: Régime au chocolat 5TUL (régime au goût sucré et palatable) vs Harlan LM-485 chow (M ± SEM préférence 90.7 ± 3.6%) et le régime au chocolat 5TUL (régime sucré au goût agréable) par rapport au régime 5TUM chow (préférence M ± SEM 91.2 ± 3.7).
Plus élevé Maze.
Le test de labyrinthe en élévation a été réalisé comme décrit dans Cottone et al. (24). Les rats Chow / Palatable ont été soumis à un cycle diététique pendant au moins 7 semaines, puis ont été prétraités avec le véhicule ou 20 en mg / kg R121919 (−1 h, sc) et testés avec 5 – 9 h après avoir été passés du régime appétissant à la nourriture (P → phase C). Des rats témoins Chow / Chow ont été testés simultanément dans une configuration inter-sujets (n = 47). Le régime Chow était disponible à volonté jusqu'au moment des tests. Pour plus de détails, voir le Texte SI.
Calendrier de renforcement progressif pour les aliments.
Le calendrier de renforcement progressif pour les aliments a été réalisé comme décrit dans Cottone et al. (10). Les animaux ont reçu ad libitum A / I Chow (granulés extrudés 5 g) dans leurs cages domestiques tout au long de l'expérience, sauf indication contraire. Les renforçateurs alimentaires étaient des granulés de précision de chow 45-mg, dont la composition était identique à celle du régime alimentaire extrudé pour chow à la maison. Les sessions se terminaient lorsque les sujets ne complétaient pas un rapport pour 14 min, le dernier rapport complété étant défini comme le point d'arrêt. Les rats Chow / Palatables ont été soumis à un cycle diététique pendant au moins 7 semaines, puis prétraités avec R121919 (-1 h, sc) au moment de la commutation du régime palatable à la nutrition (phase P → C). Des rats témoins Chow / Chow ont été testés simultanément dans une configuration inter-sujets (n = 17). Des doses de R121919 (0, 20 en mg / kg de poids corporel, sc) ont été administrées selon un schéma intra-sujet contrebalancé sur deux cycles diététiques. Pour plus de détails, voir le Texte SI.
PCR quantitative en temps réel.
Les rats (n = 20) ont été soumis à des cycles de régime pendant 7 semaines, anesthésiés et décapités pendant les deux conditions de régime (jours 5 et 7 de chaque cycle hebdomadaire). Les cerveaux ont été rapidement prélevés et tranchés coronairement dans une matrice cérébrale, et le noyau central de l'amygdale, le noyau accumbens, le cortex insulaire et les poinçons du cortex préfrontal ont été recueillis sur une scène glacée. L'ARN total a été préparé à partir de chaque poinçon cérébral en utilisant un protocole standard pour l'extraction d'ARN à partir de tissus animaux. L'ARN total (1 pg) a ensuite été transcrit en sens inverse en présence d'Oligo (dT) 20 selon les instructions du fabricant. Des réactions quantitatives de RT-PCR ont été réalisées dans un volume de 20 μL en utilisant des amorces de 0.5 μM et 4 mM de MgCl2. Les résultats ont été analysés par des méthodes de seconde dérivée et exprimés en unités arbitraires, normalisées aux niveaux d'expression du gène de référence, CypA. Toutes les réactions de RT-PCR pour une séquence donnée ont été réalisées dans le même cycle. Pour plus de détails, voir le Texte SI.
Extraction peptidique et RIA CRF.
Les rats (n = 25) ont été soumis à un cycle diététique pendant au moins 7 semaines, anesthésiés et décapités pendant les deux conditions de régime (jours 5 et 7 de chaque cycle hebdomadaire). Les cerveaux ont été rapidement retirés et tranchés coronaux dans une matrice cérébrale, et le noyau central des poinçons d'amygdale a été collecté à un stade glacé. L’extraction de l’acide peptidique suivait une procédure déjà établie (25). L'immunoréactivité de type CRF tissulaire a été quantifiée avec un RIA en phase solide sensible et spécifique adapté de Zorrilla et al. (26). Pour plus de détails, voir le Texte SI.
RIA à la corticostérone.
Les rats (n = 12) ont subi un cycle de régime pendant au moins 7 semaines, et le sang de queue a été prélevé pendant les deux conditions de régime (jours 5 et 7 de chaque cycle hebdomadaire). Les taux plasmatiques d'immunoréactivité de type corticostérone ont été déterminés avec un kit RIA disponible dans le commerce, selon les instructions du fabricant (MP Biomedicals, Inc.) (26). Pour plus de détails, voir le Texte SI.
Etudes électrophysiologiques
Préparation en tranches.
Les noyaux centraux des tranches d’amygdale ont été préparés comme décrit précédemment (27, 28) de rats (n = 7 / groupe) qui a été soumis à un cycle diététique pendant au moins 7 semaines, anesthésié et décapité 2 – 3 h après avoir été retiré de la nourriture au goût agréable. Les cerveaux ont été rapidement retirés et placés dans du liquide céphalorachidien artificiel refroidi par de la glace et gazéifié avec du 95% O2 et 5% CO2. Les tranches ont été coupées, incubées dans une configuration d'interface pendant environ 30 min et complètement submergées et continuellement surfondues avec du aCSF chaud et gazé. Des médicaments ont été ajoutés à l'aCSF à partir de solutions mères pour obtenir des concentrations connues dans le superfusat. Aux taux de surfusion 2 – 4 mL / min utilisés, les concentrations de médicament atteignent 90% de la concentration du réservoir dans les limites de 2 min.
Électrophysiologie.
Nous avons enregistré le noyau central des neurones de l'amygdale avec des micropipettes pointues en mode discontinu de tension ou de courant. Nous avons tenu la plupart des neurones près de leur potentiel de membrane au repos. Les données ont été acquises avec un préamplificateur et stockées pour une analyse ultérieure à l'aide du logiciel pClamp. GABA isolé pharmacologiquementA potentiels postsynaptiques inhibiteurs médiés par le récepteur (GABAA-IPSP) ont été évoqués en stimulant localement dans le noyau central de l’amygdale au moyen d’une électrode de stimulation bipolaire tout en surfusant les inhibiteurs des récepteurs du glutamate CNQX, APV et GABA.B bloqueur de récepteur CGP 55845A. Pour déterminer les paramètres de réponse pour chaque cellule, nous avons effectué un protocole d'entrée-sortie. Une gamme de courants a été appliquée, à partir du seuil de courant requis pour générer un IPSP jusqu’à la tension requise pour obtenir l’amplitude maximale. Nous avons normalisé trois intensités de stimulus de pas égaux (seuil, demi-maximum et maximum) sous la forme 1 – 3 ×. Des étapes de courant hyperpolarisant et dépolarisant (incréments 200-pA, durée 750-ms) ont également été appliquées pour générer des courbes tension-courant (VI). Nous avons quantifié les amplitudes IPSP évoquées et les réponses VI en utilisant le logiciel Clampfit. Toutes les mesures ont été prises avant la superfusion avec le CRF sélectif1 R121919 (1 µM), antagoniste du récepteur, au cours de sa perfusion (20 min) et après le lavage (30 min). Pour plus de détails, voir le Texte SI.
Statistiques.
Les comparaisons de groupe ont utilisé Student's t- tests (comparaisons à deux groupes) ou analyse de variance (ANOVA) (comparaisons au moins à trois groupes), cette dernière étant interprétée par une analyse par effet principal simple ou des comparaisons de Newman-Keuls après des effets omnibus significatifs (P <0.05). Les données de l'expérience d'alimentation ont été analysées par des ANOVA mixtes à trois voies avec le régime alimentaire comme facteur inter-sujets et la dose et la phase d'alimentation comme facteurs intra-sujets. Les données de l'expérience du labyrinthe plus élevé ont été analysées par des ANOVA bidirectionnels avec le programme de régime et la dose comme facteurs inter-sujets. Pour le programme à rapport progressif de l'expérience de renforcement, le point de rupture et les réponses totales ont été analysés par des ANOVA mixtes bidirectionnelles avec le régime alimentaire comme facteur inter-sujets et la dose comme facteur intra-sujets. L'évolution temporelle de la réponse au cours des 5 premières minutes a été analysée par des ANOVA mixtes à trois voies avec le régime alimentaire comme facteur inter-sujets et la dose et le temps comme facteurs intra-sujets. Les données des études électrophysiologiques ont été analysées avec une ANOVA inter-sujets ou une ANOVA intra-sujets avec des mesures répétées, selon le cas. Les données de la corticostérone RIA ont été analysées par ANOVA mixte bidirectionnelle avec le programme de régime comme facteur inter-sujet et la phase de régime comme facteur intra-sujet. Les progiciels statistiques utilisés étaient Instat 3.0, Prism 4.0 (GraphPad), Systat 11.0 et SPSS 11.5 (SPSS).
Remerciements.
Nous remercions Mike Arends pour son aide à la rédaction, Mary Gichuhi pour son assistance administrative et Bob Lintz, Jeanette Helfers, Stephanie Dela Cruz et Molly Brennan pour son assistance technique. Ce travail a été financé par les subventions DK70118, DK26741 et P30DK56336 de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales; Subvention DA023680 de l'Institut national de lutte contre l'abus des drogues; Subventions de l'Institut national sur l'abus d'alcool et l'alcoolisme AA016731 et AA015566; Subvention de l'Institut national des troubles neurologiques et des accidents cérébrovasculaires IT32NS061847-01A2; Subvention de l'Institut national sur le vieillissement AG028040; Subvention de l'Institut national du coeur, des poumons et du sang HL088083; la Fondation médicale Ellison; et le Centre Pearson pour la recherche sur l'alcoolisme et la toxicomanie. Une partie de ce travail a été financée par les programmes de recherche intra-muros de l'Institut national de lutte contre l'abus des drogues et de l'Institut national de lutte contre l'alcoolisme et l'alcoolisme. Il s’agit du numéro de manuscrit 19807 du Scripps Research Institute.
Notes
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
Cet article est une soumission directe de PNAS.
Cet article contient des informations complémentaires en ligne sur www.pnas.org/cgi/content/full/0908789106/DCSupplemental.
Bibliographie
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