L'insuline active les récepteurs d'insuline (InsR) dans l'hypothalamus pour signaler la satiété après un repas. Cependant, l'incidence croissante de l'obésité, qui entraîne des niveaux d'insuline chroniquement élevés, implique que l'insuline peut également agir dans les centres du cerveau qui régulent la motivation et la récompense. Nous rapportons ici que l'insuline peut amplifier la libération de dopamine (DA) d'action dépendante du potentiel dans le noyau accumbens (NAc) et le caudé – putamen par le biais d'un mécanisme indirect impliquant des interneurones cholinergiques striataux exprimant des InsR. En outre, deux manipulations alimentaires chroniques différentes chez le rat, la restriction alimentaire (FR) et un régime obésogène (OB), modifient de manière opposée la sensibilité de la libération de DA striatal à l'insuline, avec une réactivité accrue en FR, mais une perte de réactivité en OB. Des études comportementales ont montré que des niveaux d’insuline intacts dans la coquille d’acide nitrique sont nécessaires pour acquérir une préférence pour l’arôme d’une solution de glucose couplée. Ensemble, ces données impliquent que la signalisation d'insuline striatale améliore la libération de DA pour influencer les choix alimentaires.

Il est bien établi qu’une augmentation soutenue de l’insuline plasmatique pendant et après un repas active les récepteurs de l’insuline (InsR) dans l’hypothalamus, ce qui produit une rétroaction négative aux circuits de l’appétit qui diminue la consommation^{1, 2, 3}. L'insuline cérébrale est principalement issue des cellules β pancréatiques, avec un transport actif du plasma au cerveau au niveau de la barrière hémato-encéphalique^{4, 5, 6, 7, 8}, bien qu'il existe de plus en plus de preuves de synthèse et de libération d'insuline neuronale^{1, 9}. Notamment, l'expression des InsR ne se limite pas à l'hypothalamus, bien que la fonction des InsR extra-hypothalamiques reste non résolue.^{1, 2, 3}. Compte tenu de l'incidence croissante de l'obésité et du diabète de type II, les niveaux d'insuline en circulation sont perpétuellement élevés et le transport de l'insuline cérébrale et la sensibilité des récepteurs diminués^{3, 8, 10, 11}, il est essentiel de comprendre la fonction de l’insuline dans les régions du cerveau qui régulent la motivation et la récompense. Les régions du cerveau présentant un intérêt particulier incluent le noyau accumbens (NAc), qui médie les effets bénéfiques des aliments et des médicaments.^{12, 13}et le caudate – putamen (CPu), qui joue un rôle dans les comportements liés aux habitudes et à l'état de manque¹³. Les InsRs sont exprimés dans toutes ces régions, la densité la plus élevée se trouvant dans les NAc.^{3, 14}; Les récepteurs InsR sont également exprimés par les neurones dopaminergiques (DA) du mésencéphale, y compris ceux situés dans la région du tegmental ventral (VTA) et la substantia nigra pars compacta (SNc).¹⁵. Les taux d'insuline dans le cerveau sont proportionnels aux concentrations plasmatiques d'insuline et à l'adiposité du corps^{6, 7, 8}, conduisant à l'hypothèse que l'insuline pourrait agir sur les récepteurs InsR de ces régions du cerveau pour influencer la récompense alimentaire^{3, 16, 17}.

Des études antérieures sur des synaptosomes striataux, des cellules hétérologues, des tranches de cerveau et in vivo ont montré que l'activation de l'insuline par Insulin entraîne une augmentation de l'absorption de DA par le transporteur de DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Ce processus implique la voie de signalisation de la kinase PI3^{19, 20}et entraîne l’insertion de DAT dans la membrane plasmique¹⁹. Les niveaux d'insuline en circulation modulent dynamiquement l'activité DAT striatale, avec une diminution de l'absorption de DA et de l'expression de la surface de DAT observées dans des modèles animaux de diabète et après restriction alimentaire (FR)^{20, 21}. Il a été démontré que l’augmentation de l’activité DAT de l’insuline dépendait de la concentration de DA extracellulaire évoquée ([DA]_o) dans la VTA²³, traduisant un changement d’équilibre entre la libération et l’absorption de DA. En accord avec le rôle établi de l'insuline dans la satiété, la microinjection aiguë d'insuline dans la VTA peut diminuer la récompense alimentaire.^{23, 24}, alors que les souris dépourvues d'InsR dans les neurones VTA et SNc DA présentent un apport alimentaire accru et deviennent obèses²⁵. Bien que l'insuline puisse induire une dépression à long terme des excitateurs dans les neurones VTA DA²⁴, encore une fois compatible avec un rôle dans la satiété, l'exposition à l'insuline peut également augmenter la vitesse de décharge des neurones DA, éventuellement en diminuant la libération de DA et l'inhibition à médiation par l'autorécepteur²⁵. L’effet net de l’insuline sur la libération de DA striatal est donc difficile à prédire. En effet, les résultats d’études sur l’influence de l’insuline sur la libération de DA striatal chez ex vivo tranches¹⁹ et l'effet de la microinjection locale d'insuline dans le NAc sur la récompense alimentaire²⁶ semble être contradictoire. Pour résoudre ce problème, nous avons évalué la libération et l’absorption de DA axonale dans le microenvironnement intact de l’ANc et du CPu dans ex vivo coupes striatales en utilisant la voltamétrie cyclique à balayage rapide (FCV), et a déterminé les effets de la signalisation de l'insuline dans le NAc sur le comportement de récompense in vivo.

Nos études montrent que le principal effet de l'insuline dans NAc et CPu est d'augmenter la libération de DA, malgré une augmentation simultanée de l'absorption de DA. Cette régulation dynamique de la libération de DA implique une augmentation insulinodépendante de l'excitabilité des interneurones cholinergiques striataux (ChI), ce qui conduit à une libération accrue de DA par l'activation des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (ACh) (nAChR). L'influence de l'insuline sur les IC et sur la libération de DA est médiée par les InsR. Notamment, l'effet de l'insuline sur la libération de DA est amplifié dans les tranches de rats FR, mais émoussé chez les rats soumis à un régime obésogène (OB). Ces données montrant l’amplification de la libération de DA dans ex vivo les tranches d'insuline permettent de prédire que l'insuline pourrait agir comme un signal de récompense in vivo. En effet, des études comportementales parallèles démontrent un rôle de l'insuline dans la coque de NAc dans le conditionnement des préférences aromatiques. Ensemble, ces résultats indiquent un nouveau rôle de l'insuline en tant que signal de récompense pouvant influer sur le choix des aliments.

L'insuline agissant à l'InsRs augmente la libération évoquée de DA dans le striatum

Examen initial de l'invocation locale [DA]_o surveillé avec FCV en ex vivo tranches striatales de rats avec ad libitum (AL) l'accès à la nourriture et à l'eau a révélé la découverte inattendue que l'application aiguë d'insuline à une gamme de concentrations physiologiquement pertinentes^{1, 4} augmentation évoquée par impulsion unique [DA]_o (Fig. 1a – c), avec insuline EC₅₀ valeurs (la concentration à laquelle l'effet était moitié maximum) de 2 – 12 nM (Fig. 1b). Augmentation évoquée [DA]_o particulièrement surprenant, dans la mesure où cela s’est accompagné d’une augmentation significative du taux maximal (V_max) pour l'absorption induite par le DAT dans chaque sous-région (Tableau 1), ce qui conduirait à une diminution concurrente du nombre évoqué [DA]_o, comme signalé précédemment^{22, 23}. Au lieu de cela, nous avons trouvé que évoqué [DA]_o était amplifié au maximum 20 – 55% par l'insuline 30 nM; la région avec l'effet proportionnel le plus important était la coquille NAc, qui est la sous-région striatale avec l'expression la plus élevée d'InsR^{1, 14}. Les tranches exposées à l'insuline 30 nM dans des conditions identiques n'ont montré aucun changement dans la teneur en DA striatal (Fig. Supplémentaire 1a), ce qui implique que l’insuline altère la régulation de la libération dynamique, plutôt que la simple régulation positive de la synthèse de DA. Notamment, l’effet de l’insuline sur le [DA] évoqué_o a été perdu aux concentrations supraphysiologiques ≥100 nM (Fig. 1b). Cela n’a pas été causé par une augmentation de l’activité de la DAT après sa libération, l’effet de l’insuline sur V_max également perdu à ces concentrations (Tableau 1). Globalement, ces données montrent que, dans le microenvironnement intact du striatal, l’effet prédominant de l’insuline sur les effets évoqués [DA]_o est d'augmenter la libération, malgré une augmentation simultanée de l'absorption de DA.

  

  

(a) Moyenne évoquée par impulsion unique [DA]_o dans le shell NAc, le noyau NAc et le CPu avant et après l'insuline (Ins) illustrés pour 30 nM; barres d'erreur omises, mais voir (b) les flèches indiquent l'heure du stimulus. Augmentation de l'insuline évoquée [DA]_o en coque (par 55 ± 10%), noyau (par 37 ± 5%) et CPu (par 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) L’effet de l’insuline était dépendant de la concentration dans une plage physiologique (1 – 30 nM) en coque (n= 22 – 24, F_5,133= 14.471, P<0.001), noyau (n= 36 – 76, F_5,308= 16.318, P<0.001) et CPu (n= 30 – 62, F_5,253= 13.763, P<0.001), mais perdu à ≥ 100 nM. (c) Enregistrements représentatifs de pics évoqués [DA]_o en fonction du temps en un seul site dans le noyau NAc en l'absence d'application de médicament (Con), pendant l'application d'insuline (30 nM) ou lorsque l'insuline a été appliquée en présence d'un inhibiteur de l'InsR, HNMPA (5 μM). (d) Moyenne du pic évoqué [DA]_o données montrant la prévention de l'effet de l'insuline (30 nM) par HNMPA, l'antagoniste InsR S961 (1 µM) et l'inhibiteur de PI3K LY294002 (1 µM), mais pas par l'inhibiteur de l'IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29 – 76; P> 0.9 par rapport à l'insuline seule). Pour Fig. 1a – d, n= nombre de sites par sous-région de rats 3 – 6 pour chaque médicament ou concentration d'insuline; ANOVA à un facteur, test de signification significative de Tukey (HSD). Voir Supplémentaire Fig. 1b, c pour les données de shell NAc et CPu.

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Parce que l'insuline peut également agir sur les récepteurs du facteur de croissance 1 (IGF-1R), bien qu'à des concentrations dépassant 100 nM (réf. 1), nous avons cherché à confirmer que l'effet stimulant de l'insuline sur [DA]_o était dépendante de InsR. Cela s'est avéré être le cas, l'effet étant prévenu par un inhibiteur intracellulaire de l'acide hydroxy-2-naphtalénylméthylphosphonique (HNMPA) et par un antagoniste de l'InsR, S961, mais pas par un inhibiteur sélectif de l'IGF-1R, picropodophylline²⁴ (PPP; Fig. 1c, d et Supplémentaire Fig. 1b, c). Nous avons ensuite examiné l'implication de la kinase PI3, qui initie la voie de signalisation responsable de la régulation insulinodépendante du DAT.¹⁹. À une concentration de 1 µM, l'inhibiteur de P13K, LY249002 seul, n'a eu aucun effet sur le pic évoqué [DA]_o or V_max (n= Sites 29 – 76 (noyau NAc) par médicament, P> 0.05, analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA); données non présentées), mais a empêché l'effet de l'insuline sur la [DA] évoquée_o dans toutes les sous-régions striatales (Fig. 1d et Supplémentaire Fig. 1b, c).

Localisation des InsR sur les axones DA et les ChI

L'augmentation observée de V_max pour l'absorption de DA avec des niveaux physiologiques d'insuline implique la présence d'InsRs sur les axones de DA, comme le font les résultats antérieurs dans diverses préparations striatales^{18, 19, 20, 21, 22}. Bien que l’expression fonctionnelle des récepteurs InsR sur les neurones DA du cerveau moyen ait été démontrée^{15, 23, 24, 25}, L'expression InsR sur les axones DA striataux n'a pas été rapportée. Nous avons abordé cette question en utilisant l'immunohistochimie. L'immunoréactivité InR dense tout au long du striatum a limité l'évaluation quantitative de la localisation de l'InsR sur les axones DA, qui ont été identifiés par immunoréactivité pour une enzyme synthétisant l'AD, la tyrosine hydroxylase (TH). Nous avons donc adopté un protocole précédemment rapporté²⁷, qui consistait à compter InsR puncta qui chevauchait les profils TH + dans la visualisation d’image normale et à compter à nouveau une fois que l’image InsR avait uniquement pivoté de 90 °. Si le chevauchement apparent des profils InsR et TH + n'était pas spécifique, cette procédure devrait donner des comptes statistiquement similaires, qu'ils soient normaux ou déphasés 90 °. Cependant, cette analyse a montré une diminution du chevauchement de InsR puncta avec les profils TH + de 14 ± 9% (n= Champs 42, P<0.01, jumelé bilatéral t-tester; données non présentées), confirmant la présence de InsR sur les axones DA. De manière plus intriguante, cependant, l’immunomarquage InsR du striatum a révélé une expression distincte de l’InsR sur les corps cellulaires de grande taille identifiés comme étant des ChI striatales par co-immunomarquage de la choline acétyltransférase (ChAT), l’enzyme primaire requise pour la synthèse de l’ACh. Utilisation de critères électrophysiologiques²⁸ pour identifier les ChI dans les études préliminaires d'enregistrement de cellules entières, plusieurs neurones ont été remplis de biocytine puis traités pour l'immunohistochimie; tous ceux-ci (4 / 4) étaient immuno-positifs à la fois pour InsR et pour ChAT (Fig. 2a). Une évaluation ultérieure de la co-localisation de InsR et de ChAT dans le NAc a confirmé que pratiquement tous les neurones de ChAT + exprimaient InsR (96%; n= 27 / 28 neurones dans quatre sections de deux rats).

  

  

(a) ChI rempli de biocytine, puis immunomarqué contre la ChAT et InsR (représentant les ChI remplies de biocytine 4 / 4); l'image fusionnée montre la co-localisation; barre d'échelle, 10 μm. (b-e) Réponse des Ich striatales à une série d’impulsions de courant dépolarisant (intervalles 3; 200, 300 et 400 pA; intervalles 120) avant et après l’insuline (30 nM). (b) On observe une adaptation de la fréquence des pointes dans une ChI (supérieure) lors de la décharge d'une perte de potentiel d'action (PA) lors de l'injection de courant, alors qu'une surdimensionnement persiste tout au long de l'impulsion de courant dans l'insuline (inférieure); ensemble de données complet indiqué dans d. (c) Évolution temporelle représentative de l’augmentation du nombre de PA induite par l’insuline à chaque pas en cours pour le b. (d) Résumé du nombre de PA pendant les impulsions de courant délivrées avant et au maximum de l'effet de l'exposition à l'insuline (n= Stimulations appariées 21, neurones 7, rats 5) (e) Réponses moyennes montrant l’effet de l’insuline (+ Ins) dans des conditions de contrôle (Con; n= Stimulations appariées 21, neurones 7, ***P<0.001, jumelé bilatéral t-test), en présence de HNMPA (5 µM) (n= Stimulations appariées 12, neurones 4, rats 4, P>0.05, jumelé à deux queues t-test), et en présence de PPP (1 µM) (n= Stimulations appariées 18, neurones 6, rats 6, **P<Test de rang signé par paires appariées par Wilcoxon, 0.01). (f) Moyenne évoquée par impulsion unique [DA]_o dans le noyau NAc avant et après l'insuline (30 nM) dans la mécamylamine (Mec; 5 µM) ou DHβE (1 µM) normalisé au 100% témoin de contrôle (n= Sites 20 – 40 par sous-région et condition provenant de rats 3 – 4, P> 0.05 par rapport au contrôle, non apparié t-tester). (g) Moyenne évoquée par impulsion unique [DA]_o dans le cerveau antérieur des tranches de contrôle hétérozygote (Het) et Bavarder Souris KO avant et après insuline (30 nM) normalisées au% de contrôle de pointe 100. Augmentation de l'insuline évoquée [DA]_o chez les souris hétérozygotes de 190 ± 23% dans une coquille NAc, 140 ± 8% dans un noyau NAc et 137 ± 12% dans CPu (n= Sites 15 – 25 par sous-région à partir de souris 3 – 4 par génotype, **P<0.01, ***P<0.001 par rapport au contrôle non apparié t-test), mais n'a eu aucun effet sur évoqué [DA]_o dans toute sous-région striatale de Bavarder KO souris (P> 0.1).

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L'insuline augmente l'excitabilité ChI

Pour tester la fonctionnalité des InsR sur les Ik striatales, nous avons examiné l'effet de l'insuline sur l'excitabilité de l'Ik à l'aide de l'enregistrement par clamp de cellules entières. L’excitabilité de ChI a été évaluée à l’aide d’une série d’impulsions de courant dépolarisant de 3 afin de générer un train de potentiels d’action présentant de manière fiable une adaptation de la fréquence de crête (Fig. 2b), avec souvent une perte de pic à la fin de l’impulsion de courant. De manière frappante, l’adaptation de la fréquence des pics atténuée de l’insuline (30 nM) a entraîné une augmentation progressive du nombre de potentiels d’action au fil du temps (Fig. 2c), avec une augmentation maximale (Fig. 2d, e) généralement observée entre l'exposition à l'insuline par 20 et 50 min. En l'absence d'insuline, les ChI témoins n'ont montré aucun changement dans le nombre de potentiels d'action évoqués (P> 0.05, jumelé bilatéral t-tester; données non présentées); comparés aux neurones de contrôle surveillés sur le même intervalle de temps, les neurones exposés à l'insuline ont présenté une modification significativement plus importante du nombre de potentiels d'action évoqués (contrôle n= Paires de stimulus 12 de quatre neurones, insuline n= Paires de stimulus 21 de sept neurones, F_1,25= 5.63, P<0.05, ANOVA bidirectionnelle à mesures mixtes; données non présentées). L'effet de l'insuline sur l'augmentation du nombre de potentiel d'action a été empêché par HNMPA mais pas par l'inhibiteur sélectif de l'IGF-1R PPP (Fig. 2e), démontrant que l'excitabilité accrue du ChI par l'insuline était induite par InsR.

Augmentation de l'insuline évoquée [DA]_o nécessite nAChR et ACh

Des études antérieures ont montré que ChIs et ACh régulent puissamment la libération de DA striatal via les nAChR sur les axones de DA^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. L'expression abondante d'InsR sur les ChI et l'amélioration de l'excitabilité de ChI observée lors d'une exposition aiguë à l'insuline suggéraient que ces neurones pourraient être de nouvelles cibles de l'insuline pouvant conduire à une libération accrue de DA. Pour tester cela, nous avons examiné l'effet de l'insuline en présence de mécamylamine, un antagoniste non sélectif du nAChR ou de la dihydro-β-érythroïdine (DHβE), un antagoniste sélectif des nAChRs contenant la sous-unité β2 (β2 *) enrichis. DA axones³⁵. Évoqué [DA]_o a été facilement détecté en présence de ces antagonistes, même si les deux médicaments ont diminué l'amplitude de l'effet évoqué par impulsion unique [DA]_o (par exemple, par 13 – 26% dans le noyau NAc), comme indiqué précédemment^{29, 30, 31, 32}. À l'appui d'un rôle pour l'ACh et les nAChR, l'effet de l'insuline sur la [DA] évoquée_o de la mécamylamine ou de la DHβE (Fig. 2f). Pour confirmer l’implication de la signalisation de l’ACh striatale dans la libération de DA augmentée par insuline, nous avons examiné l’effet de l’insuline dans ex vivo tranches striatales de souris chez lesquelles l'expression de la ChAT a été génétiquement supprimée dans les structures du cerveau antérieur (structures du cerveau antérieur) Bavarder Souris KO), y compris le striatum³². Bien que les chI soient intactes chez ces souris, la synthèse d’ACh est abolie, ce qui entraîne une diminution, mais toujours facilement détectable, évoquée une seule impulsion évoquée [DA]_o, comme décrit précédemment³². Chez les sujets témoins hétérozygotes, l'insuline (30 nM) a augmenté évoquée [DA]_o Xcx, 37% dans shell et core et CPuFig. 2g), dépassant l'amplification observée chez le striatum de rat (par exemple, Fig. 1). Cependant, l’effet de l’insuline sur [DA] évoqué_o était absent dans tout le complexe striatal du cerveau antérieur Bavarder Souris KO, démontrant que l'amélioration de la libération de DA par l'intermédiaire de l'insuline nécessite une ACh striatale, mais pas les émetteurs co-libérés des Ik, tels que le glutamate³⁶.

L'influence de l'insuline sur évoquée [DA]_o dépend du régime

Les concentrations plasmatiques et d'insuline cérébrale sont proportionnelles à l'adiposité corporelle^{6, 7, 8}et pourrait entraîner des modifications compensatoires de la sensibilité du cerveau à l'insuline. Nous avons donc testé l’hypothèse selon laquelle le régime alimentaire influe sur la capacité de l’insuline à favoriser la libération de DA, en utilisant des tranches striatales de rats maintenues sous un régime FR ou OB chronique versus des témoins AL. Comme prévu, les taux plasmatiques d’insuline étaient corrélés au poids corporel, les taux d’insuline FR étant inférieurs à ceux des rats AL ou OBFig. 3a et Tableau 2). Malgré ces différences d'insuline en circulation, le pic évoqué [DA]_o dans le shell et le noyau de NAc, et le CPu était significativement plus bas dans ex vivo tranches striatales des deux groupes de régime comparées à AL (Fig. 3b et Supplémentaire Fig. 2 a, b), ce qui implique que des facteurs autres que l'insuline régissent l'absolu évoqué [DA]_o. Le contenu en DA striatal ne différait pas entre les groupes de régimes, indiquant un changement de la régulation de la libération plutôt que de la synthèse du DA (Fig. Supplémentaire 2c). En cohérence avec un changement de régulation dynamique, la sensibilité de l'insuline striatale à l'insuline dépendait nettement de l'alimentation. Chez les rats FR, les concentrations d’insuline ≤1 nM, qui n’a eu aucun effet sur AL (Fig. 1b), augmenté évoqué [DA]_o (Fig. 3c), reflétant une sensibilité accrue à l'insuline, avec EC₅₀ valeurs dans le striatum FR (0.4 – 0.6 nM) qui étaient approximativement inférieures d’un ordre de grandeur à celles de AL (comparaison Figues 1b et 3c). À l’opposé, l’effet de l’insuline a été perdu chez OB striatum; même l'insuline 30 nM, qui a eu un effet maximal sur AL striatum (Fig. 1b) n’a aucun effet sur OB (Fig. 3c).

  

  

(a) La concentration plasmatique d’insuline est positivement corrélée au poids corporel dans les groupes d’alimentation (R= 0.76). (b) Moyenne évoquée par impulsion unique [DA]_o dans le noyau NAc (voir Fig. Supplémentaire 2a, b pour NAc shell et CPu) était plus faible en FR (38 ± 4%) et en OB (25 ± 4%) par rapport à AL (n= Sites 50 – 60 provenant de rats 5 – 6 par groupe de régime, F_2,156= 23.337, ANOVA à une voie, Tukey HSD; ***P<0.001); OB contre FR (P<0.08). (c) Sensibilité évoquée [DA]_o l'insuline a été améliorée en FR mais perdue en OB (n= Sites 21 – 49 par sous-région par concentration de rats 2 – 4 par groupe de régime, ANOVA à une voie, Tukey HSD), avec une plus grande sensibilité des rats FR par rapport aux rats AL dans toutes les sous-régions (P<0.001 pour chaque région; ANOVA bidirectionnelle; CPU: F_{(conc × régime; 3,286)}= 10.253; coeur: F_{(conc × régime; 3,353)}= 6.166; coquille: F_{(conc × régime; 3,195)}= 10.735).

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Ces données impliquent une relation inverse entre la sensibilité striatale de l'InsR et l'adiposité corporelle. Cependant, ces différences dépendantes de l’alimentation peuvent également refléter une sensibilité altérée au nAChR. Nous avons donc déterminé la réponse en fonction de la concentration de nicotine dans le noyau NAc de chaque groupe de régime. La nicotine provoque une désensibilisation nAChR, qui peut être quantifiée en comparant le rapport de [DA]_o évoqué par un bref train de cinq impulsions à 100 Hz à une impulsion évoquée [DA]_o (5 p: rapport 1 p) en tant qu’indice d’activation / désensibilisation nAChR^{30, 31}. En utilisant cette approche, nous n’avons trouvé aucune différence entre les groupes de régimes en ce qui concerne la sensibilité au nAChR dans le noyau de l’ANcFig. 3a – c supplémentaire). De plus, le ratio contrôle 5 p: 1 p ne différait pas entre les groupes de régimes du noyau NAc (Fig. Supplémentaire 3d) ou CPu (non illustré), ce qui implique que le régime alimentaire ne modifie pas la régulation de la libération de DA dépend du nAChR. Ainsi, la sensibilité Striatal InsR semble être accrue chez les rats FR par rapport à AL, mais absente chez les rats OB, avec une perte de régulation de la libération de DA striatal aux concentrations physiologiques d'insuline.

L'insuline de coque NAc module la préférence de saveur conditionnée

Les préférences alimentaires sont générées à la fois par des facteurs pré et post-ingestion; les mécanismes pour chacun ne sont pas complètement résolus, mais les preuves actuelles impliquent la signalisation NAc DA dans les deux cas.^{37, 38}. Etant donné que les taux d'insuline dans le plasma et le liquide céphalorachidien (LCR) augmentent rapidement après l'élévation du glucose périphérique⁶, et qu'une augmentation de l'insuline dans le striatum peut être détectée dans 5 min de l'élévation de l'insuline plasmatique⁷, il est logique de faire l'hypothèse que la libération d'insuline périphérique au cours d'un repas pourrait améliorer la libération d'AD NAc et contribuer aux mécanismes de récompense post-ingestion. Nous avons adapté un protocole de préférence de goût décrit précédemment³⁷ avec des solutions de glucose sucrées à la saccharine chez le rat afin de vérifier l’hypothèse selon laquelle le blocage de l’effet de l’insuline endogène par l’application locale d’un anticorps anti-insuline (InsAb) dans le NAc diminuerait la préférence pour l’arôme apparié. L’efficacité de InsAb dans le blocage des effets de l’insuline a été testée dans un in vitro dosage de l'absorption de DA dans les synaptosomes striataux. L’insuline (30 nM) a entraîné une augmentation significative du V_max dans les synaptosomes de NAc ou de CPu (Fig. Supplémentaire 4), conforme à notre V_max données de tranches striatales (Tableau 1) et avec des études antérieures^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. En l'absence d'insuline, ni InsAb ni un anticorps témoin, l'immunoglobuline G (IgG), n'ont modifié le V_max pour l'absorption de DA versus le contrôle. En présence d’IgG, l’insuline a quand même entraîné une augmentation significative du V_max; Cependant, l'effet de l'insuline sur V_max a été perdu en présence d'InsAb (Fig. Supplémentaire 4).

Pour minimiser les dommages tissulaires et préserver la sensibilité du tissu cible, nous avons testé deux groupes de sujets dans lesquels nous avons alterné la microinjection intra-NAc avec une procédure de microinjection factice, plutôt que d’utiliser un seul groupe de sujets et d’apparier une solution aromatisée avec InsAb et une autre avec véhicule. Par conséquent, lors de séances de conditionnement d’une bouteille, le groupe expérimental a reçu des micro-injections d’InsAb associées à l’un des deux arômes et, en alternance, de micro-injections simulées associées à l’autre arôme (Fig. 4a, la gauche). Le groupe témoin a reçu des micro-injections factices alternées avec des micro-injections de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou d'IgG. Les deux solutions aromatisées contenaient du glucose pendant le conditionnement. Aucune préférence différentielle entre les arômes n'était attendue dans le groupe de microinjections de contrôle, alors que la préférence devait se déplacer vers l'arôme simulé de paires de microinjections dans le groupe de microinjections de InsAb.

  

  

(a) Schéma illustrant le conditionnement d’une bouteille (à gauche) et le test des deux bouteilles (à droite). (b) Volume consommé (ml) au cours d’une séance de conditionnement d’une bouteille. Il existait une interaction significative entre la séance de conditionnement de la perfusion et le traitement par microinjection (n= Rats 19 – 20 par groupe, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 ANOVA mixte avec mesures répétées sur séance de conditionnement par perfusion). La micro-injection d'InsAb a considérablement diminué la consommation par rapport au contrôle au cours de la troisième (t(40) = 3.026, **P<0.01) et quatrième (t(40) = 3.052, **P<0.01, protégé unilatéral t-tests) infusions. Les injections simulées n'ont eu aucun effet sur la consommation dans les deux groupes (F_3,111= ANOVA mixte 1.110, 2 × 4 avec mesures répétées lors d'une session de conditionnement simulé). (c) Volume consommé au cours du test de préférence de goût de deux bouteilles. Il y avait une interaction significative entre le goût et le traitement de microinjection pendant le conditionnement (F_1,37= 5.36, P<0.05, ANOVA mixte bidirectionnelle avec mesures répétées de la saveur). Le groupe InsAb a consommé beaucoup moins de saveur appariée InsAb par rapport à l'arôme d'appariement simulé (t(18) = 2.82, ** P<0.01, protégé unilatéral t-tester); le groupe témoin n'a montré aucune préférence en matière de goûtt(19) = 0.803, P> 0.05, protégé t-tester). En comparant les groupes, les rats InsAb ont bu beaucoup moins de la saveur jumelée à la perfusion (t(40) = 1.96, *P<0.05) et beaucoup plus de la saveur de la paire simulée (t(40) = 1.77, *P<0.05, protégé unilatéral t-test) que les contrôles.

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Au cours des séances de conditionnement d'une bouteille, la microinjection de InsAb a significativement diminué la consommation par rapport au véhicule lors des troisième et quatrième perfusions (Fig. 4b) En revanche, les deux groupes ont consommé le même volume de solution au cours des quatre simulations d’injection (F_3,111= 0.127, P>0.05, ANOVA mixte à deux voies) (Fig. 4b) Après un total de huit séances de conditionnement, la préférence en matière de saveur a été évaluée dans un test de deux bouteilles dans lequel les rats avaient accès simultanément aux deux solutions aromatisées (Fig. 4a) L’analyse statistique a révélé une interaction significative entre l’arôme et le traitement de microinjection reçu pendant le conditionnement (Fig. 4c) Le groupe InsAb a consommé beaucoup moins de la saveur appariée InsAb que de la saveur simulée (Fig. 4c), alors que le groupe de véhicules n'a montré aucune préférence en matière de saveur (Fig. 4c), ce qui implique que la signalisation intacte par l'insuline a contribué à la sélection d'une solution calorique douce. Par rapport au véhicule, les rats ayant reçu une micro-injection de InsAb buvaient nettement moins de la saveur associée à la perfusion et beaucoup plus de la saveur associée à une injection simulée (Fig. 4c) Microinjection d'IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, protégé t-tests) ou PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, protégé t-tests) n’a eu aucun effet sur la préférence en matière de saveur (données non présentées), plaidant contre la possibilité qu’un effet non spécifique de la micro-injection de InsAb diminue la consommation ou la préférence en matière de saveur. Il convient également de noter que la préférence du groupe InsAb au test n’est pas une préférence pour la saveur moins nouvelle, car il n’y avait pas d’interaction entre session et type de session (perfusion réelle versus perfusion simulée) pour le groupe InsAb (F_3,54= 1.584, P> 0.05, ANOVA bidirectionnelle). C'est-à-dire que le groupe InsAb n'a pas consommé plus de la saveur appariée par infusion simulée par rapport à l'arôme apparié par infusion InsAb; plutôt, les différences entre les groupes de traitement n'apparaissaient que pendant les séances de conditionnement par perfusion. Dans l'ensemble, ces données indiquent que l'insuline contenue dans le NAc joue un rôle dans le renforcement de la préférence pour une saveur qui signale une charge glycémique.

Nous rapportons ici que l'insuline amplifie la libération de DA dans le striatal de manière dépendante du nAChR en modulant l'excitabilité de la ChI via les InsR. Nos résultats impliquent que l'insuline peut servir de signal de récompense, en plus de son rôle établi dans la signalisation de la satiété. En particulier, l’effet de l’insuline sur la libération de DA est modulé par le régime alimentaire, avec une sensibilité nettement accrue à l’insuline après FR, mais une perte complète de la régulation renforcée par l’insuline dans le régime des OB. Ces modifications semblent refléter des modifications de la sensibilité de l'InsR inversement liées aux taux d'insuline en circulation, car les concentrations plasmatiques d'insuline se sont avérées dépendantes du régime alimentaire, alors que la sensibilité du NAChR ne l'était pas. Enfin, nos études sur les préférences en matière de saveur chez les animaux qui se conduisent impliquent que la signalisation de l'insuline dans la coquille de NAc influence les préférences alimentaires, ce qui non seulement implique l'insuline dans l'apprentissage lié aux aliments, mais confirme également son rôle en tant que signal de récompense.

Net [DA]_o reflète l’équilibre entre la libération de DA et l’absorption de DA via le DAT. Données antérieures montrant que l'insuline peut réguler l'activité du DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} conduit à la prédiction selon laquelle une augmentation de l'insuline devrait entraîner une nette diminution du nombre évoqué [DA]_o via une augmentation de l'absorption de DA. Cependant, nous avons constaté que dans le striatum, l’effet de l’insuline est plus complexe que cela. Bien que l'exposition à l'insuline ait augmenté V_max pour le DAT, le principal effet de l'insuline était sur la libération de DA, et non sur l'absorption de DA, avec une augmentation constante du nombre évoqué [DA]_o sur une plage physiologique de concentrations d'insuline dans la coquille et le noyau et dans le CPu de l'ANc. Bien que l’augmentation du nombre évoqué [DA]_o sont revenus à des niveaux de contrôle à une concentration supraphysiologique de 100 nM, V_max était également inchangé par rapport au contrôle, éliminant un effet prédominant sur le DAT comme explication. Au lieu de cela, la perte de l'effet sur l'absorption ainsi que la libération impliquent une désensibilisation des InsR ou une régulation négative des voies de signalisation en aval à des concentrations d'insuline élevées. En effet, les InsR subissent une endocytose et une dégradation rapides après la liaison à l'insuline dans les tissus périphériques.¹, avec de nouvelles preuves de perte de sensibilité neuronale InsR après une exposition de courte durée à des niveaux élevés d'insuline ou de régimes hypercaloriques^{10, 11, 39}.

L’effet dominant de l’insuline sur l’augmentation de la libération de DA dans un striatum, présenté ici, contraste avec les résultats de deux autres études récentes. ex vivo études de tranche. Dans le premier cas, l’insuline a provoqué une diminution du trop-plein évoqué électriquement de [³H] DA de tranches striatales, bien que augmenté [³Un débordement de H] DA a été détecté alors que le DAT était inhibé²². Étant donné que libéré [³H] DA doit échapper à l'absorption médiée par le DAT dans le tissu pour être détectée dans la solution de perfusion, ce protocole est particulièrement sensible à la régulation du DAT. Nos résultats montrant que l'insuline améliore la libération de DA via l'activation de ChI et de nAChR, en plus d'augmenter l'absorption médiée par le DAT, expliqueraient l'augmentation apparemment paradoxale de l'insuline renforcée [³H] Débordement de DA observé lorsque des effets concurrents sur le DAT ont été bloqués²². La deuxième étude a utilisé le FCV pour la détection directe de la libération de DA somatodendritique dans la VTA, mais a également mis en évidence un effet prédominant de l'insuline sur l'absorption de DA, se traduisant par une diminution de la [D] évoquée_o (réf. 23) Différences dans un certain nombre de facteurs, des microcircuits locaux aux mécanismes de libération de DA somatodendritique par rapport aux mécanismes de libération axonale⁴⁰, pourrait contribuer à cette différence régionale. Comme on le verra plus loin, cependant, les rôles de l'insuline dépendants de la région seront vraisemblablement complémentaires plutôt que contradictoires.

Auparavant, on supposait que tout rôle de la régulation insulino-dépendant de la signalisation de l'AD était médiatisé par l'activation directe des InsR sur les neurones de l'AD. Nous montrons ici que les InsRs sont également exprimés sur les Ik striatales et que l'insuline module l'excitabilité de l'Ik pour amplifier la libération de DA striatal, ce qui peut jouer un rôle central dans l'influence de l'insuline sur le régime alimentaire. Les ISC striatales reçoivent des projections des neurones des noyaux intralaminaires du thalamus, qui présentent une décharge en rafale en réponse à des stimuli sensoriels saillants et aident à induire des modèles de pics de pause qui sont importants pour diriger l'attention, renforcer et l'apprentissage associatif.⁴¹. Par conséquent, l'action de l'insuline à l'InsRs sur les ISC striatales pourrait renforcer l'effet des signaux sensoriels sur la réactivité du striato à la cuisson thalamique, contribuant ainsi à une meilleure perception de la valeur de récompense d'un repas ingéré. La promotion directe de la libération de DA par les patients striatés par l'activation de l'Ik a conduit à la suggestion que les facteurs qui stimulent les ISC joueraient un rôle privilégié en tant que déclencheurs de la libération de l'AD³³. Nos données fournissent la première preuve à l'appui de cette hypothèse, avec l'excitabilité de l'insuline chI améliorée par l'insuline et la signalisation par l'ACh entraînant une augmentation dynamique de la libération de DA.

Une libération élevée de DA en présence d'insuline va également à l'encontre d'une augmentation de la signalisation de l'ACh dans une mesure qui provoque une désensibilisation du nAChR ou une activation du récepteur muscarinique de l'ACh (mAChR), l'un ou l'autre pouvant supprimer l'inhibition évoquée par une impulsion unique [DA]_o (refs 29, 30, 31, 42). Ainsi, les mécanismes rapportés ici sont distincts de l'activation par l'ACh des mAChR, qui a été associée à l'aversion et à la satiété⁴³.

Une impulsion évoquée [DA]_o était plus faible chez les rats FR et OB que chez les rats AL; bien que ces résultats soient en accord avec les rapports précédents^{44, 45, 46}, nos études fournissent la première comparaison systématique de trois sous-régions striatales dans les deux groupes de régimes sur une période de temps constante. Les mécanismes sous-jacents aux changements dépendant de l'alimentation dans la libération de DA n'ont pas été élucidés et sortent du cadre des présentes études. Cependant, étant donné que les niveaux d'insuline dans le plasma sont modifiés de manière opposée par les régimes FR et OB, il est peu probable que la diminution évoquée [DA]_o dans les deux groupes est une conséquence des niveaux d'insuline dépendant de l'alimentation.

D'autre part, des changements de sensibilité InsR avec le régime alimentaire et les niveaux d'insuline plasmatiques dépendants du régime alimentaire qui en résultent fournissent l'explication la plus probable d'une augmentation de la sensibilité à l'insuline en FR et d'une perte de réactivité à l'insuline en OB. Il n'y avait aucune preuve de l'explication alternative de la sensibilité altérée au nAChR chez les rats FR ou OB par rapport à AL. Bien que nos résultats soient parmi les premiers à indiquer une augmentation de la sensibilité à l'InsR striatal avec FR¹⁸, la perte de poids peut être accompagnée d'une diminution du taux d'insuline dans le LCR⁷, ce qui contribuerait à une sensibilité accrue de la libération de DA à l’insuline en RF. Inversement, la perte de réactivité à l'insuline chez les rats OB est compatible avec les preuves antérieures d'une diminution de la sensibilité à l'InsR du cerveau induite par la prise de poids ou les régimes OB.^{3, 10, 11}.

Nos ex vivo Les données sur les tranches corroborent l'hypothèse selon laquelle l'insuline peut signaler à la fois la récompense et la satiété. Nous avons testé cette hypothèse en bloquant l'effet de l'insuline endogène par une micro-injection bilatérale de InsAb dans la coquille de NAc lors du conditionnement préférentiel. En accord avec un rôle dans la récompense, le blocage de l'effet de l'insuline a diminué la préférence pour le goût d'une solution jumelée contenant du glucose par rapport au goût associé à une signalisation intacte de l'insuline. Le blocage de l'insuline dans la coquille de Nac a également diminué la consommation d'une solution appariée pendant le conditionnement en une bouteille, alors que les micro-injections simulées ou de contrôle n'avaient aucun effet sur la consommation. Ces données suggèrent que l'insuline présente dans la coquille de NAC joue un rôle dans les préférences alimentaires. Des études antérieures ont montré qu'une signalisation intacte des DA dans le NAc est nécessaire pour l'acquisition du conditionnement des arômes^{37, 38}, confirmant le rôle de NAc DA dans la médiation des effets renforçants des solutions nutritives. Dans cette optique, la préférence pour la solution de glucose associée à une disponibilité d’insuline intacte va à l’encontre d’un effet principal de l’insuline sur l’absorption de DA induite par le DAT dans la coquille d’acide nitrique, car cela devrait diminuer [DA]_o et donc diminuer la consommation de la saveur appariée de contrôle. Nos résultats concordent également avec ceux d'une étude précédente dans laquelle la microinjection d'insuline dans la coquille de Nac augmentait la durée de l'auto-administration orale de saccharose par les animaux, avec une augmentation limite de la consommation de saccharose.²⁶, ce qui était opposé à la conséquence attendue de l’augmentation de l’absorption de DA. Dans l’ensemble, ces données comportementales concordent avec l’influence prévue de l’insuline sur les IC systématiques et la libération accrue de DA. Cependant, ces résultats n'excluent pas l'implication d'autres éléments du microcircuit striatal dans les comportements surveillés, compte tenu de l'expression généralisée de l'InsR dans l'ensemble du striatum.^{1, 14}.

Les études présentées ici fournissent la première preuve que l'insuline joue un rôle dans la communication de la valeur calorique et, par conséquent, des effets gratifiants d'un repas, ce qui a des conséquences importantes sur l'influence de l'insuline chez les sujets souffrant d'insuffisance pondérale et d'obésité. Plusieurs études indiquent que les effets post-ingestion des aliments, que les voies de transduction du goût soient intactes ou non⁴⁷, augmenter la libération de NAc DA et le renforcement positif du comportement^{37, 47}. Ainsi, la réponse à l'insuline post-absorption peut coder le rendement glycémique d'un repas et contribuer au renforcement des préférences alimentaires et des comportements permettant la consommation. Cependant, des changements extrêmes des niveaux d'insuline en circulation et de la sensibilité centrale de l'InsR pourraient jouer un rôle dans le comportement anormal et adaptatif. Par exemple, l'hypoinsulinémie et la régulation à la hausse de la sensibilité de l'InsR chez les sujets FR pourraient être un facteur de prédisposition à la frénésie alimentaire.⁴⁸. À l'inverse, une insensibilité centrale à l'insuline dans le diabète de type II ou l'obésité, reflétée ici chez les rats OB, pourrait contribuer à diminuer le sentiment de récompense après l'ingestion, en conduisant à la consommation d'aliments à indice glycémique élevé.^{49, 50}. Par conséquent, une augmentation ou une diminution de la sensibilité à l’insuline striatale pourrait contribuer à une alimentation pathologique, entraînant une hyperphagie boulimique et / ou l’obésité.

Dans l’ensemble, nos résultats révèlent un nouveau rôle de l’insuline en tant que signal de récompense. Un tel rôle contraste avec sa fonction connue en tant que signal de satiété, y compris des découvertes récentes selon lesquelles une insuline micro-injectée dans la VTA peut réduire l'alimentation hédonique et la préférence pour les signaux associés à la récompense alimentaire.^{23, 24}. Cela soulève la question de savoir comment les rôles apparemment opposés de l'insuline dans ces fonctions dépendant de l'AD peuvent être réconciliés. La réponse peut être que ces effets sont complémentaires plutôt que contradictoires. Les présents résultats indiquent que l'insuline dans le striatum communique la valeur de récompense d'un repas ingéré. Un double rôle dans la signalisation de la satiété peut simplement permettre à l'insuline de remplir l'objectif important de mettre fin à un repas, tout en créant simultanément un souvenir de ses qualités nutritionnelles et donc enrichissantes, renforçant ainsi la répétition du comportement ingestif.

Manipulation des animaux

Les procédures chez les animaux étaient conformes aux directives des NIH et approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux de la NYU School of Medicine. Tous les animaux étaient sur 12 h cycle: cycle sombre, avec des lumières allumées de 06: 00 à 18: 00; ex vivo des tranches ont été préparées entre 08: 00 et 12: 00. Des études mécanistes chez des rats et des souris AL ont été menées chez ex vivo des tranches d'animaux logés par paires, alors que les rats étaient logés séparément pour toutes les comparaisons de groupes de régime et pour les études comportementales.

Régimes de rat

Les rats Sprague – Dawley mâles adultes (Taconic) étaient âgés de plusieurs semaines 8 – 10 au début du régime alimentaire pendant plusieurs jours 21 – 30. Les rats ont été répartis de manière semi-aléatoire dans les groupes de régime: les sujets ont été classés en fonction du poids initial, puis chaque trio de rats successifs a été réparti de manière aléatoire entre les groupes de régime. Les rats AL avaient librement accès à leur nourriture pendant la même période que les rats appariés recevant un régime FR ou OB. Tous les rats avaient libre accès à l'eau. La restriction alimentaire a été appliquée comme précédemment⁵¹; brièvement, les rats ont reçu 40 – 50% de l'apport quotidien de la nourriture standard pour rats à l'AL jusqu'à ce que le poids corporel ait été réduit de 20%, après quoi les aliments ont été titrés pour maintenir ce poids. Les rats OB avaient librement accès à la nourriture pour chats et au chocolat Ensure, un liquide très agréable au goût avec une teneur modérément élevée en graisse et en sucre⁵².

Cerveau antérieur Bavarder souris knock-out

Souris avec un allèle floxé conditionnel de Bavarder (Bavarder^flox) ont été croisés avec un Nkx2.1^Cre lignée transgénique pour produire des souris dans lesquelles l'ablation de la synthèse d'ACh est limitée au cerveau antérieur³². Les membres de la portée transgénique non mutants étaient des témoins; leurs génotypes Cre⁺;Bavarder^{flox / +} et Cre^-;Bavarder^{flox / flox} sont appelés «hétérozygotes». Les souris mâles adultes utilisées pour les études de tranches avaient ad libitum accès à la nourriture et à l'eau.

Ex vivo préparation de tranches et solutions physiologiques

Des rats ou des souris ont été profondément anesthésiés avec 50 en mg kg^-1 pentobarbital (intrapéritonéal (ip)) et décapité. Pour la voltamétrie, des tranches coronales du cerveau antérieur (300 – 400 épaisseur) ont été découpées sur un microtome à lame vibrante Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) dans du CSF artificiel tamponné HEPES et contenant (en mM): NaCl (120); NaHCO₃ (20); glucose (10); HEPES acide (6.7); KCl (5); HEPES sel de sodium (3.3); CaCl₂ (2); et MgSO₄ (2), équilibré avec 95% O₂/ 5% CO₂. Les tranches ont ensuite été maintenues dans cette solution à la température ambiante pendant 1 h avant l'expérimentation.^{30, 32, 53}. Pour l’électrophysiologie, après anesthésie, les rats ont été perfusés par voie transcardiale avec une solution glacée contenant (en mM): du saccharose (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glucose (7); ascorbate (1); et pyruvate (3), et équilibré avec 95% O₂/ 5% CO₂. Des tranches ont été coupées dans cette solution, puis transférées dans une chambre de récupération dans un aCSF modifié contenant (en mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glucose (25); ascorbate (1); pyruvate (3); et myo-inositol (4), équilibré avec 95% O₂/ 5% CO₂; cette solution était initialement à 34 ° C, puis laissée refroidir progressivement jusqu'à la température ambiante⁵⁴. Toutes les expériences de voltamétrie et de physiologie ont été conduites dans une chambre d'enregistrement par submersion à 32 ° C qui était sur-utilisée à 1.5 ml min.^-1 avec un CSF contenant (en mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); et glucose (10) et albumine sérique bovine (BSA, 0.05 – 0.1, mg ml^-1) équilibré avec 95% O₂/ 5% CO₂; les tranches ont été laissées s'équilibrer dans cet environnement pendant 30 min avant l'expérimentation.

Voltamétrie cyclique à balayage rapide

Des études de libération de DA évoquées ont été menées à l'aide de FCV dans des tranches de cerveau^{32, 53} préparé à partir de rats mâles ou Bavarder souris inhibitrices du cerveau antérieur et contrôles hétérozygotes (semaines 5 – 8). Études en Bavarder les souris knock-out ont été aveuglées, mais les groupes de régimes de rats ont des phénotypes évidents qui empêchent l'aveuglement. Les mesures voltamétriques ont été effectuées avec un voltamètre Millar (disponible sur demande spéciale auprès du Dr Julian Miller à St Bartholomew's et à la Royal London School of Medicine and Dentistry de l'Université de Londres). Une forme d'onde triangulaire conventionnelle a été utilisée pour le FCV, avec une plage de balayage de -0.7 à + 1.3 V (versus Ag / AgCl), une fréquence de balayage de 800 V s^-1et intervalle d'échantillonnage de 100 ms^{30, 32, 53}. Les données ont été acquises en utilisant une carte DigiData 1200B A / D contrôlée par le logiciel Clampex 7.0 (Molecular Devices). La libération de DA a été évoquée à l'aide d'une électrode de stimulation concentrique; l’amplitude de l’impulsion de stimulation était 0.4 – 0.6 mA et la durée était de 100 μs^{30, 32, 53}. La stimulation locale par impulsion unique a été utilisée dans le noyau NAc et le CPu; cependant, un bref train d'impulsions haute fréquence (cinq impulsions à 100 Hz) a été utilisé pour amplifier les effets évoqués [DA]_o en coquille NAc. Les deux paradigmes de stimulus évoquent la libération de DA, à savoir le potentiel d’action et la²⁺ dépendant, non affecté par le glutamate et le GABA libérés simultanément^{42, 55}et facilité par la libération simultanée de l'ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Quantifier évoqué [DA]_o, les électrodes ont été étalonnées avec des concentrations connues de DA à 32 ° C après chaque expérience dans un FCS et en présence de chaque médicament utilisé au cours d’une expérience donnée.⁵³.

Expériences de voltamétrie pour évaluer l'effet de l'insuline sur [DA]_o ont été obtenus en utilisant l'un des deux protocoles. Les premières expériences visant à déterminer l’évolution temporelle de l’effet de l’insuline (Sigma, I5523) ont été réalisées en surveillant évoquée [DA]_o chaque min 5 dans un seul site. L'insuline a été appliquée après invocation constante [DA]_o a été obtenu (généralement mesures 4 – 5); l'effet de l'insuline était maximal après 50 – 60 min, puis évoqué [DA]_o est resté à ce niveau pendant la durée de l'expérience (généralement, exposition totale à l'insuline 90 min; Fig. 1c). Par la suite, l’effet de l’insuline a été évalué par l’enregistrement évoqué [DA]_o sur des sites discrets 4 – 5 en tranches (+ 1.5 mm de bregma) dans chacune des trois sous-régions striatales dans des conditions de contrôle (aCSF ou aCSF plus un médicament), puis au moment de l’effet maximal de l’insuline (prélèvement sur 60 – 80 min), ces échantillons ont été moyennés pour chaque sous-région. L'effet de l'insuline diminue avec le temps après la préparation de la tranche; minimiser le temps ex vivo et pour optimiser l'utilisation des animaux, typiquement, deux tranches d'un animal donné ont été testées simultanément dans la chambre d'enregistrement. Les médicaments utilisés pour contester l’effet de l’insuline ont été appliqués 15 min avant l’insuline via une hyperfusion de CSF, y compris le HNMPA trisacetoxymethyl ester (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodophyllotoxine (PPP; Tocris), la mécamylamine (Tocris) et DHβE (Tocris). Comme décrit dans Résultats, une sensibilité altérée possible des récepteurs nicotiniques de l’ACh parmi les groupes de régime a été testée en comparant le rapport du pic [DA]_o évoqué par 5 p (100 Hz) avec celui évoqué par 1 p évoqué (rapport 5 p: 1 p)^{30, 31} dans le noyau NAc en présence de nicotine 0 – 500 nM (Sigma).

Détermination de V _max de évoqué [DA]_o transitoires en tranches striatales

Pour évaluer les changements induits par l'insuline dans l'absorption de DA induite par le DAT, la partie initiale de la phase de chute évoquée [DA]_o courbes a été ajustée à l’équation de Michaelis – Menten pour extraire V_max (constante du taux d'absorption maximale)⁵⁶. K_m (qui est inversement liée à l'affinité du DAT pour DA) a été fixée à 0.2 µM ​​et est connue pour être similaire dans les sous-régions striatales⁵⁷ insensible à l'insuline (voir Fig. Supplémentaire 4 légende).

Enregistrement de cellules entières

Des tranches de cerveau ont été préparées à partir de rats mâles âgés de 29 à 35; les conditions d'enregistrement étaient identiques à celles utilisées dans les études de libération de DA. Les enregistrements à pince de courant de cellules entières ont utilisé des méthodes conventionnelles⁵⁴. Les chI striatales ont été visualisées à l'aide d'un microscope Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, Pennsylvanie) doté d'une optique de contraste à interférences différentielles infrarouges et d'un objectif à immersion dans l'eau × 40. La solution de pipette contenait (en mM): K-gluconate (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); N / a₂-ATP (2); N / a₃-GTP (0.3); et ajusté à pH 7.2 – 7.3 avec KOH. Pour que les neurones enregistrés soient évalués quant à l'immunoréactivité de ChAT, 0.3% biocytine a été inclus dans la solution de pipette et les neurones ont été enregistrés brièvement (~ 5 min) afin de minimiser la dilution du contenu intracellulaire. La résistance de la pipette était ~ 3 – 5 MΩ. Les enregistrements ont été obtenus à l'aide d'un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) et filtrés passe-bas à la fréquence 2 kHz. Les chI ont été identifiés selon des critères électrophysiologiques établis²⁸; la plupart étaient initialement toniques, mais leur activité diminuait de manière variable après le patch. Cependant, la réactivité à l'injection actuelle était généralement robuste et constante dans le temps et a donc été utilisée pour étudier l'effet de l'insuline sur l'excitabilité de l'Ik (voir Résultats). Dans des expériences visant à examiner le rôle des InsR et des IGF-1R dans cette réponse, HNMPA ou PPP a été appliqué pendant au moins 20 min avant l'application d'un patch. Les effets maximaux de l'insuline seule ont généralement été observés après l'exposition à ~ 16 min, bien que dans certaines cellules, l'augmentation n'ait été maximale que jusqu'à 50 min ou plus. De plus, dans quatre des six neurones enregistrés dans PPP, l'insuline a provoqué une diminution initiale du nombre de pointes avant de récupérer et de dépasser le nombre de pointes de départ. En conséquence, dans toutes les expériences, l’effet de l’insuline a été quantifié en comparant l’effet maximal sur le nombre de pics avec le nombre de pics évoqués immédiatement avant l’application d’insuline. La différence apparente dans le temps nécessaire pour atteindre l’effet maximum pourrait refléter un certain nombre de facteurs, notamment la profondeur de la cellule enregistrée dans la tranche. Des potentiels d'action évoqués ont également été enregistrés chez les IK en l'absence d'insuline à des moments comparables.

Chromatographie en phase liquide à haute performance

La teneur en DA des coupes striatales de rat (épaisseur 400-µm) a été déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance avec détection électrochimique.⁵⁸. Des paires de tranches ont été équilibrées pendant 30 min à 32 ° C dans un FCS, puis une tranche par paire a été incubée pendant une période supplémentaire de 60 min à 32 ° C dans un CSF, tandis que l'autre a été incubée dans un CSF avec 10 ou 30 nM insuline. Pour la comparaison des groupes de régimes, le tissu striatal a été recueilli entre 30 – 60 min après la récupération. Après incubation, l'excès de aCSF a été soigneusement éliminé des tranches, un échantillon de tissu striatal (7 – 10 mg) a été pesé, congelé sur de la neige carbonique, puis stocké à -80 ° C. Le jour de l'analyse, les échantillons ont été soumis à une sonication dans un éluant glacé, désoxygéné avec de l'argon.⁵⁸, centrifugé dans une microcentrifugeuse pour 2 min et le surnageant étant injecté directement dans la colonne HPLC (BAS, West Lafayette, IN); le détecteur était une électrode de carbone vitreux fixée à 0.7 V par rapport à Ag / AgCl.

Immunohistochimie

Pour le marquage immunohistochimique, les rats ont été anesthésiés au pentobarbital de sodium (50, mg kg^-1, ip), ensuite perfusée transcardialement avec du PBS (154 mM NaCl dans du tampon phosphate 10 mM, pH 7.2) suivi par 4% de paraformaldéhyde dans ce PBS; les cerveaux ont été prélevés et des coupes coronales (20 μm) ont été coupées et traitées de manière conventionnelle^{27, 59}. Les images d'immunofluorescence ont été obtenues avec un microscope confocal Nikon PM 800 équipé d'une caméra numérique contrôlée par le logiciel Spot (Diagnostic Instruments Inc.) et en utilisant un objectif × 100 (ouverture numérique = 1.4) ou avec un microscope confocal Zeiss LSM 510 utilisant un × objectif (ouverture numérique = 63). Les lasers étaient Argon (1.2 nm), He / Ne (488 nm) et He / Ne (543 nm). Des filtres appropriés pour chaque laser ont été sélectionnés par le logiciel de microscope confocal. La taille des trous d’épingle varie en fonction de l’objectif utilisé et de l’épaisseur de coupe sélectionnée zgénération de pile; nous avons choisi la valeur optimale du trou d'épingle indiquée par le logiciel (typiquement 30 µm). Les fichiers numériques ont été analysés à l'aide du logiciel de déconvolution (AutoQuant Imaging), les images finales étant traitées à l'aide d'Adobe Photoshop 7.0. Toutes les images ont été ajustées pour la luminosité et le contraste; ces ajustements ont été effectués uniformément sur toutes les parties de l'image. Les axones DA striataux ont été identifiés à l'aide de deux anticorps TH: un anticorps anti-TH polyclonal AB152 de lapin (1: 800) et un anticorps monoclonal de souris MAB318 (1: 500) (tous deux de Chemicon). Trois anticorps InsR ont été utilisés: sc-57342 et sc-09 (1: 100; Santa Cruz) et PP5 (un cadeau de Pfizer). La spécificité de chacun a été démontrée précédemment^{60, 61}et a été confirmé dans les présentes études par l’absence d’immuno-marquage avec les anticorps sc-57342 ou PP5 en présence du peptide bloquant correspondant. L'anticorps ChAT était AB144 (1: 200; Millipore) et la biotine était issue de Vector (1: 200). Les anticorps secondaires utilisés étaient Alexa 488 (Invitrogen), anti-lapin, ou Cy2, anti-lapin (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), Cy3, anti-chèvre, et Cy5, anti-souris,.

Pour évaluer la co-localisation des InsR dans les axones TH +, nous avons utilisé les méthodes décrites précédemment pour identifier la présence de Kir6.2, la sous-unité porogène de la protéine K sensible à l'ATP.⁺ canaux dans les axones DA²⁷. Des ponctuations représentant InsR ont été distribuées dans les images ajustées, indiquant que la superposition avec l'immunoréactivité de la TH peut survenir dans une certaine mesure par hasard. Pour tester cette hypothèse, nous avons compté les superpositions InsR / TH dans des champs indépendants de 42 dans trois sections immunomarquées avec NAc provenant de deux rats. Les fichiers numériques InsR ont ensuite été tournés 90 ° dans le sens des aiguilles d'une montre et les comptes ont été répétés; la rotation a diminué le nombre d'InsR puncta co-localisé avec TH dans la plupart des champs (voir Résultats). La diminution du nombre de superpositions avec rotation²⁷ a indiqué la proportion d'InsR puncta dans chaque champ striatal associé aux axones DA.

ELISA glycémie et insuline

Le sang du tronc a été recueilli au moment de la décapitation pour les études sur tranches. La glycémie a été déterminée immédiatement avec un glucomètre standard. Pour l’insuline, du sang supplémentaire a été prélevé dans des tubes contenant de l’EDTA et centrifugé à 1,500.g pour 15 min; le surnageant (plasma) a été recueilli et stocké à -80 ° C jusqu'au traitement avec un kit ALPCO Insulin ELISA Rat.

Positionnement de la canule et vérification histologique

Quarante-et-un rats mâles adultes Sprague – Dawley (Taconic et Charles River) pesant initialement 350 – 425 g ont été anesthésiés à la kétamine (100, mg kg^-1, ip) et la xylazine (10 mg kg^-1, ip) et stéréotaxiquement implantés avec deux canules de guidage résiduelles chroniques (jauge 26) placées bilatéralement en dorsale 2.0 mm aux sites de perfusion dans la coquille médiane NAc⁶² (1.6 mm antérieur à bregma; 2.1 mm latéral à la suture sagittale, pointes inclinées 8 ° vers la ligne médiane, 5.8 mm ventral à la surface du crâne). Les rats ont reçu de la banamine (2.0 mg kg^-1sous-cutané) en tant qu’analgésique post-chirurgical après la convalescence et le lendemain de l’anesthésie. Une semaine après la chirurgie, les rats ont été placés sur FR (décrit ci-dessus) et maintenus à 80% de leur poids de récupération post-chirurgical pour le reste de l'étude. La position de la canule a été déterminée histologiquement une fois les tests de comportement terminés. Chaque rat a été tué avec du CO₂, décapité et le cerveau prélevé et fixé dans du formol tamponné à 10% pendant> 48 h. Des coupes coronales congelées (épaisseur de 40 um) ont été coupées sur un cryostat Reichert-Jung, décongelées montées sur des lames de verre recouvertes de gélatine et colorées au violet de crésyle. Les données d'un rat donné ont été utilisées uniquement si les deux canules se trouvaient dans la coquille médiale NAc⁶² (y compris les carapaces / noyaux ou carapaces / tubercules olfactifs) ()Fig. Supplémentaire 5) Sur la base de ces critères, deux rats ont été exclus de l'analyse finale.

Pré-exposition de conditionnement de goût de préférence

Les rats ont reçu une nuit (dans une cage domestique) et six sessions de X-XUMX-min-par jour de pré-exposition (dans des enceintes d'essai) à 30% saccharine sodique (Sigma) dans de l'eau avec un intervalle de temps 0.2-h entre les sessions. Les rats ont ensuite reçu deux séances d'exposition de 48 min par jour à la saccharine sodique 5% sodique dans du raisin 0.2% non sucré ou du cerisier Kool-Aid (Kraft Foods) dans de l'eau. Lors de la première séance de pré-exposition au Kool-Aid, la moitié des rats ont reçu une solution aromatisée aux cerises et l'autre moitié, une solution aromatisée aux raisins. Les arômes ont été inversés lors de la deuxième session de pré-exposition Kool-Aid afin de s'assurer que tous les rats échantillonnaient chaque arôme. La consommation a été mesurée pour toutes les séances pré-exposition. Les chambres d'essai étaient des cages en plastique transparent avec une litière fraîche. Pour toutes les séances pré-exposition, les rats avaient accès à la même solution des deux côtés de la chambre. À l'exception de la séance pré-exposition nocturne, toutes les séances ont eu lieu dans une salle de procédures comportementales, avec une période d'accoutumance 0.05-min avant tout entraînement ou test.

Conditionnement d'une bouteille

Des études antérieures ont montré que la micro-injection de InsAb dans l'hypothalamus ventromédial peut bloquer l'effet de l'insuline sur le comportement alimentaire et la sécrétion de glucagon.^{63, 64}. Ici, nous avons utilisé cette approche pour évaluer le rôle possible de l'insuline dans le renforcement du choix des aliments. Les rats ont été répartis de manière semi-aléatoire en fonction du volume moyen d'absorption avant exposition dans deux groupes, témoin ou expérimental (InsAb). Dans le groupe témoin, les rats ont reçu le véhicule (PBS microinjection; NaCl 137 mM et KCl 2.7 mM dans un tampon phosphate 10 mM) ou IgG (Abcam ab81032; 0.5, μg, ul^-1 dans du PBS, à la réception) microinjection dans une coquille avant de consommer l'une des deux solutions aromatisées, et une microinjection factice avant de consommer l'autre solution aromatisée. Dans le groupe expérimental, des rats ont reçu une micro-injection de coquille d’acétate d’acide insulinémique (Abcam ab46707; 0.5, µl de 1, µg µl).^-1 dans du PBS, à la réception) avant l'exposition à une solution aromatisée et la microinjection factice avant l'exposition à l'autre. Deux séries de sujets alternant microinjection de fluide et microinjection factice ont été utilisées, de sorte que le nombre total de microinjections est limité à quatre, minimisant ainsi les dommages possibles aux tissus et la perte de sensibilité au site de microinjection.⁶⁵. Pour la micro-injection de fluide, la solution de contrôle ou InsAb a été chargé dans deux longueurs de tube X-30 d'une longueur de 50-cm, fixées à une extrémité aux seringues 5 de Hamilton remplies d'eau distillée et à l'autre extrémité à des canules d'injection de calibre 31, qui prolongeaient le 2.0 au-delà des guides implantés. Les volumes de perfusion de 0.5 ont été administrés sur 90 à un débit de 0.005.^-1; l'injecteur a été laissé en place pendant ~ 60 pour laisser le temps à la diffusion, puis l'injecteur a été remplacé par le stylet.

Les rats ont été transférés directement dans les chambres comportementales dans les 2 min après l'achèvement de la microinjection ou de la microinjection simulée. Les solutions de conditionnement contiennent 0.2% saccharine sodique, 0.05% raisin ou sucre Kool-Aid non sucré et 0.8% glucose. L'accès à la solution était limité à 30 min par session. Les saveurs appariées et le côté de la chambre avec accès à l’alcool étaient attribués de manière semi-aléatoire et contrebalancés dans chaque groupe. L'intervalle entre les microinjections était d'au moins 72 h, alternant entre des séances de perfusion et des séances de simulation, pour un total de huit séances de conditionnement.

Test de préférence de deux bouteilles

Quarante-huit heures après la dernière séance de conditionnement, les rats ont été placés dans des chambres d’essai avec accès simultané aux deux arômes de conditionnement; les solutions consistaient en 0.2% saccharine sodique dans du Kool-Aid 0.05% raisin ou cerisier, sans glucose. Les tests ont eu lieu au cours des jours 2 (60 min par jour). On a alterné la position du tube d'abreuvement contenant la solution simulée en paire ou en perfusion pour s'assurer que chaque rat était testé pour la consommation de chaque solution des deux côtés de la cage. L'apport de chaque solution aromatisée a été moyenné pour les deux jours de test afin de déterminer la préférence.

[³Absorption de H] DA dans les synaptosomes striataux pour évaluer l'efficacité de InsAb

Synaptosomes Striataux^{21, 66} ont été préparés à partir de rats AL (mâles, 350 – 400 g), avec NAc (coquille et noyau) et CPu disséqués et préparés séparément. Les tissus de chaque région ont été homogénéisés en volumes 15 d'une solution de saccharose 0.32 M glacée dans un homogénéisateur en verre avec un pilon en téflon à moteur; après rinçage et centrifugation, le dernier culot a été remis en suspension dans du saccharose 0.32 M glacé^{21, 66}. Avant de lancer le [³H] dosage d'absorption DA⁶⁶, des aliquotes synaptosomales dans un volume total de 180 μl de tampon d’absorption ont été incubées dans un agitateur pour 15 min à 30 ° C en présence ou en absence d’insuline 30 nM, dans le véhicule (PBS) ou dans InsAb (dilution finale 1: 500) , en IgG (dilution finale 1: 500) ou en véhicule. Tampon d'absorption contenu (en mM): NaCl (122); N / a₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glucose (10), CaCl₂ (1); nialamide (0.01); la tropolone (0.1); et acide ascorbique (0.001), pH 7.4. Absorption de [³H] DA a été initié par la distribution rapide de 20 μl de chaque suspension de synaptosomes dans les plaques à puits 96 avec diverses concentrations de DA (0.003 – 1.0 μM) et [³H] DA (5 nM); après 5 min dans un agitateur à plaque à 25 ° C, l'absorption a été interrompue par filtration sous vide rapide à froid⁶⁶. Les comptes par puits ont été convertis en pmoles, puis corrigés en mg de protéines totales par minute. Tous les tests ont été effectués en triple et répétés au moins quatre fois; V_max et K_m ont été calculés à l'aide du logiciel Biosoft Kell Radlig (Cambridge, Royaume-Uni).

analyses statistiques

Les données sont données en tant que moyennes ± sem; la signification a été évaluée à l'aide de la méthode de Student appariée ou non appariée. t-tests ou ANOVA, sauf indication contraire. Pour les données de voltamétrie, n est le nombre de sites d'enregistrement, étant donné que la variabilité d'un site à l'autre dans une sous-région striatale est supérieure à la variabilité inter-animaux ou inter-coupes^{30, 32, 55, 56}; le numéro de l'animal est noté pour chaque ensemble de données. La CE₅₀ pour l'effet de l'insuline et de la nicotine sur le pic évoqué [DA]_o a été calculé en utilisant Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Pour les données électrophysiologiques, la signification statistique a été évaluée à l’aide de tou un test de Wilcoxon dans Prism 6.0, ou une ANOVA mixte à deux voies dans SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, Caroline du Nord). Pour évaluer l'implication de l'insuline dans le conditionnement des préférences aromatisantes, deux études complètes ont été réalisées à l'aide de protocoles identiques à l'exception du traitement avec le véhicule utilisé. Dans la première étude, des rats 10 ont reçu des perfusions de véhicule de PBS et 9 ont reçu des perfusions de InsAB. Dans la deuxième étude, des rats 10 ont reçu des perfusions de véhicule d'IgG et 10 ont reçu des perfusions d'InsAb. Aucune différence significative n'a été observée entre les deux groupes de véhicules (PBS ou IgG) au cours des séances de conditionnement de la perfusion (F₁₉= 0.619, ANOVA mixte bidirectionnelle) avec mesures répétées lors d’une séance de conditionnement par perfusion) ou à l’essai (F₁₉= 0.012, ANOVA mixte bidirectionnelle avec mesures répétées de la saveur). Par conséquent, les deux expériences ont été combinées pour analyse. Pour cette analyse, une ANOVA mixte 2 × 4 (avec mesures répétées le jour du conditionnement de la perfusion) a été utilisée pour déterminer les effets du traitement par microinjection pendant le conditionnement, suivie d'une analyse protégée. t-tests (un test pour déterminer dans quelles séances de traitement le traitement par microinjection a diminué le volume absorbé). La même analyse a été effectuée pour les séances de simulation de conditionnement. Pour déterminer l’effet du traitement de conditionnement au cours d’un test de préférence de goût de deux bouteilles, les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA mixte à deux voies (avec mesures répétées de la saveur), suivie d’un traitement protégé. t-tests (un test pour vérifier l’hypothèse selon laquelle InsAb diminuerait la préférence).

Comment citer cet article: Stouffer, MA et al. L'insuline améliore la libération de dopamine striatale en activant les interneurones cholinergiques et signale ainsi la récompense. Nat. Commun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

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Ces études ont été financées par les subventions des NIH: DA033811 (MER, KDC et MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) et une bourse NARSAD pour chercheurs indépendants (KDC). S961 était un cadeau généreux du Dr Lauge Schaffer, Novo Nordisk. L’anticorps PP5 était un cadeau généreux de Pfizer. Nous remercions le Dr Charles Nicholson de la NYU School of Medicine pour le logiciel permettant d’extraire V_max valeurs des données FCV.