PLoS One. 2014 juillet 29; 9 (7): e102524. doi: 10.1371 / journal.pone.0102524. eCollection 2014.
Abstract
L'exposition chronique à la cocaïne chez les toxicomanes humains et chez les modèles de toxicomanie chez les rongeurs réduit l'activité corticale préfrontal, ce qui par la suite dérègle le traitement des récompenses et la fonction exécutive supérieure. L’effet net de cette limitation du comportement est une vulnérabilité accrue à la rechute. Auparavant, nous avions montré que l'augmentation induite par la cocaïne de l'expression du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) dans le cortex préfrontal médian (PFC) est un mécanisme neuroadaptif qui atténue l'efficacité de renforcement de la cocaïne. Comme le BDNF est réputé affecter la survie neuronale et la plasticité synaptique, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle l'abstinence de l'auto-administration de cocaïne entraînerait des altérations de la morphologie neuronale et de la densité synaptique dans le PFC. En utilisant une nouvelle technique, la tomographie en réseau et la coloration de Golgi, les modifications morphologiques du PFC du rat ont été analysées après les jours 14 d’auto-administration de cocaïne et les jours 7 d’abstinence forcée. Nos résultats indiquent que la ramification dendritique globale et la densité synaptique totale sont considérablement réduites dans le PFC du rat. En revanche, la densité des fines épines dendritiques est considérablement accrue sur les neurones pyramidaux de la couche V du PFC. Ces résultats indiquent que des changements structurels dynamiques se produisent pendant l'abstinence de la cocaïne, ce qui peut contribuer à l'hypo-activité observée du PFC chez les individus dépendants à la cocaïne.
Introduction
Les altérations de la plasticité structurelle au sein du circuit de récompense sont proposées comme étant des mécanismes clés contribuant à la puissante capacité de la cocaïne à maintenir un comportement de recherche de drogue (examiné dans ). Des études antérieures ont montré une augmentation de l'arborisation dendritique et de la densité de la colonne vertébrale dans le noyau accumbens (NAc) - , zone tegmentale ventrale et du cortex préfrontal (PFC) suivant l'exposition à la cocaïne. Alors que la plupart des études ont porté sur les changements structurels associés à l'activité dysfonctionnelle de l'ANc, beaucoup moins d'études ont examiné les modifications du PFC. Plusieurs sources de données démontrent un dysfonctionnement du PFC suite à une exposition chronique à la cocaïne chez les deux toxicomanes , et dans les modèles de dépendance des rongeurs , . Par conséquent, caractériser les changements structurels qui se produisent dans le PFC est pertinent pour comprendre les événements moléculaires qui sous-tendent la dépendance.
Le PFC régule le contrôle des impulsions et la prise de décision et joue ainsi un rôle important dans la capacité d'un individu à contrôler son comportement, en particulier dans la toxicomanie , . Par exemple, chez les toxicomanes à la cocaïne, une diminution de l'activation du cortex préfrontal est associée à un sevrage de la drogue et à une perturbation des réponses exécutives d'ordre supérieur , , ce qui peut augmenter la vulnérabilité à la rechute. Chez les rongeurs, une activité neuronale accrue dans le PFC est associée à la consommation de cocaïne , , comportement compulsif de recherche de drogue et rétablissement de la cocaïne après le retrait - . De plus, la bistabilité membranaire est abolie dans les PFC après une administration chronique de cocaïne . Enfin, l’activité métabolique induite par le médicament dans le PFC est atténuée chez les rats auxquels on a administré une injection lors du sevrage de la cocaïne lors de l’auto-administration. , . Ensemble, ces études indiquent que la cocaïne chronique induit de profonds changements fonctionnels dans le PFC, qui peuvent être associés à une augmentation du nombre de synapses inhibitrices et / ou à une réduction du nombre de synapses excitatrices dans le PFC. Cependant, les altérations morphologiques qui se produisent dans les PFC à la suite d’une consommation chronique de drogues n’ont pas été élucidées.
Dans la présente étude, nous avons cherché à déterminer si l’abstinence de cocaïne entraînait des changements structurels dans le PFC. Les altérations morphologiques ont été examinées à l'aide d'une méthode traditionnelle, la coloration de Golgi, ainsi que d'une nouvelle technique, la tomographie en réseau. La tomographie sur matrice est une méthode unique qui combine une coupe de tissu ultra-mince avec une immunofluorescence et une reconstruction d'image en trois dimensions pour permettre une quantification précise de la densité synaptique totale et de sous-types , . En utilisant ces méthodes, nos résultats ont indiqué une plasticité importante dans les PFC de rat en réponse à l’abstinence de la cocaïne.
Matériels et méthodes
Animaux et logement
Des rats mâles Sprague-Dawley (Rattus norvegicus) pesant 250 à 300 g ont été obtenus auprès des laboratoires Taconic (Germantown, NY). Les animaux étaient logés individuellement avec de la nourriture et de l'eau disponibles ad libitum dans leur cage domestique. Les protocoles expérimentaux étaient tous conformes aux directives émises par les National Institutes of Health des États-Unis et ont été approuvés par la Perelman School of Medicine de l'Université de Pennsylvanie et le Comité institutionnel d'utilisation et de soin des animaux de l'Université de Pennsylvanie.
Chirugie
Avant la chirurgie, les rats ont été anesthésiés avec 80 en mg / kg de kétamine et 12 en mg / kg de xylazine (par exemple, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Un cathéter en silastic à demeure (diamètre intérieur 0.33 mm, diamètre extérieur 0.64 mm) a été inséré dans la veine jugulaire droite et suturé en place. Le cathéter a ensuite été passé sous la peau par-dessus l'omoplate et acheminé vers une plate-forme arrière en maillage (CamCath, Cambridge, Royaume-Uni) qui a été suturée sous la peau, juste au-dessus de l'omoplate. Les cathéters ont été rincés quotidiennement avec 0.3 ml de l'antibiotique Timentin (clavulanate de ticarcilline disodique / potassique, 0.93 mg / ml; Henry Schein, Melville, NY) dissous dans du sérum physiologique hépariné (10 U / ml). Les cathéters ont été scellés avec des obturateurs en plastique lorsqu'ils ne sont pas utilisés.
Auto-administration de cocaïne
Les rats ont eu 7 jours pour se remettre de l'opération avant le début de l'auto-administration de cocaïne. Les rats ont été assignés au hasard à l'un des deux groupes suivants: animaux auto-administrés à la cocaïne et contrôles salins sous le joug. Chaque rat entraîné pour répondre à des infusions de cocaïne éventuelles était associé à un sujet sous joug recevant le même nombre et le même schéma temporel de perfusions que celui auto-administré par le rat expérimental couplé à la cocaïne. Une pression exercée sur le levier pour les rats à la gorge salée n’a eu aucune conséquence programmée.
Initialement, des rats expérimentaux utilisant la cocaïne ont été placés dans des chambres opérantes modulaires (Med Associates, St. Albans, Vermont) et autorisés à utiliser une presse à levier pour les perfusions intraveineuses de cocaïne (0.25 mg cocaïne / 59, une solution saline, sur 5) ratio 1 (FR1) calendrier de ferraillage. Une fois qu'un rat expérimental ayant consommé de la cocaïne avait réalisé au moins une infusion de cocaïne 20 au cours d'une seule session opérante dans le programme FR1, l'exigence de réponse a été remplacée par un programme de renforcement FR5. Pour les deux calendriers à taux fixes, le nombre maximum de perfusions de cocaïne a été limité à 30 par séance d'auto-administration quotidienne et une période de temporisation de 20 a suivi chaque perfusion de cocaïne, période pendant laquelle les réponses à effet de levier actif ont été totalisées mais n'ont pas eu de conséquences programmées. . Des sessions opérantes quotidiennes 2 h (7 jours / semaine) ont été conduites pendant un total de 14 jours. Les réponses apportées sur le levier inactif, qui n’ont pas eu de conséquences programmées, ont également été enregistrées au cours des sessions de formation FR1 et FR5.
Après le 14th Une session quotidienne d'opération, des rats témoins expérimentaux avec de la cocaïne et une solution saline avec contrôle de la fourchette ont été ramenés dans leurs cages domestiques où ils ont subi une abstinence forcée de drogue pendant plusieurs jours. Sur le 7th jour d'abstinence de cocaïne, les cerveaux ont été prélevés et le PFC a été disséqué sur la glace. On a choisi sept jours d'abstinence de cocaïne afin d'établir des comparaisons directes avec notre étude publiée précédemment, qui portait sur les modifications de l'expression du BDNF de PFC induites par la cocaïne. .
Perfusion
Les rats ont été anesthésiés (100 mg / kg, ip pentobarbital sodique) et perfusés avec 4% paraformaldéhyde glacé dans 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA). Un hémisphère de chaque cerveau a été utilisé pour la coloration de Golgi et l'autre hémisphère pour la tomographie en matrice. Les hémisphères du réseau ont été post-fixés dans 4% PFA avec 2.5% saccharose pendant 2 heures et les hémisphères de Golgi ont été post-fixés pour 48 h dans 4% PFA.
Tomographie à matrice
Des expériences de tomographie sur matrice ont été effectuées comme décrit précédemment , . En bref, le tissu fixé au PFA a été inclus dans de la résine et des coupes coronales (70 nm) au niveau de la mPFC ont été coupées et collectées sous forme de ruban. Les rubans ont été hydratés dans de la glycine 50 mM dans du Tris et bloqués dans une solution bloquante (0.05% Tween / 0.1% de la sérumalbumine bovine dans du tampon Tris (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6). Les rubans ont été colorés avec des anticorps primaires, GADNUMX ( Chemicon), PSD65 (signalisation cellulaire) ou synaptophysine (Abcam) dans une solution de blocage pendant une nuit à 95 ° C. Les rubans ont été lavés avec du tampon Tris et colorés avec des anticorps secondaires à 4![[rapport]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
50 dans une solution de blocage (farine Alexa de chèvre Alexa 488 et cy3 de chèvre anti-lapin ou cy5 d'âne anti-lapin). Les rubans ont été contre-colorés avec DAPI pour faciliter la recherche des mêmes sites sur chaque section. Les images de balayage en mosaïque ont été recueillies à l'aide d'un microscope à épifluorescence Zeiss AxioImager Z2. Les images du même site sur chacune des sections en série 20 – 30 par ruban ont été acquises chez 63x avec des programmes automatisés spécialisés pour la tomographie par balayage.
Analyse par tomographie sur matrice
Les images série de chaque ruban ont été ouvertes séquentiellement, converties en une pile et alignées avec les plugins MultiStackReg et StackReg (avec la permission de B. Busse de l’Université Stanford et , . Des boîtes de culture (19.5 µmx19.5 µm) ont été utilisées pour sélectionner des régions d'intérêt (ROI) dans le neuropile à quantifier. Les sélections devaient exclure les corps de cellules neuronales ou d’autres caractéristiques obscurcissantes. Pour l'analyse d'image automatisée, les cultures d'intérêt (ou ROI) de la synaptophysine, de l'acide glutamique décarboxylase-65 (GAD65) et de PSD95 ont été seuillées automatiquement avec des algorithmes automatisés dans ImageJ. Les cultures ont été codées et l'analyse a été effectuée à l'aveugle. Un programme de détection automatisé, basé sur le seuil, pour quantifier le nombre de puncta identifiées comme synapses positives, a été utilisé comme décrit précédemment. . Les densités des terminaux présynaptiques, des terminaux postsynaptiques excitateurs et le pourcentage de synapses GAD-positives (inhibitrices) ont été calculés à partir d'une moyenne de sites d'échantillonnage 75 par animal prélevés dans deux blocs de tissus différents du PFC (n
=5 traités à la cocaïne, animaux traités à la solution saline 5) pour un total de punctas postsynaptiques 29,154 et de puncta présynaptiques 53,565 provenant de sites d’échantillonnage 818 sur les sites d’échantillonnage traités à la solution saline 5 et 29,662 situés à l’extérieur de 17,034 Les valeurs médianes pour la densité de synapse et le pourcentage de synapses inhibitrices par animal ont été calculées et des tests t ont été réalisés en utilisant les médianes des animaux pour vérifier s'il existait une différence entre les moyennes de groupe.
Méthode de Golgi rapide
Une seule section de coloration de Golgi a été réalisée comme décrit précédemment , . En bref, la mPFC d'un hémisphère de chaque animal a été découpée dans des coupes coronales 100 µm et post-fixée dans du tétraoxyde d'osmium 1% suivie de trois lavages à la 0.1 M PB, pH 7.4. Les coupes ont été incubées pendant une nuit dans 3.5% dichromate de potassium, lavées brièvement et infiltrées avec 1.5% nitrate d'argent par la méthode sandwich. . Les coupes ont été montées sur des lames recouvertes de gélatine avec 20% saccharose et déshydratées par une série de concentrations en alcool suivies d'un dégraissage au xylène et d'un recouvrement.
Analyse de Golgi
Les lames de Golgi ont été codées et analysées sans distinction de condition et toutes analysées par le même expérimentateur. Des images et des tracés neuronaux et des images représentatives d'épines dendritiques ont été collectés à l'aide d'un microscope vertical Olympus BX51 avec une platine motorisée intégrée (Prior Scientific, Rockland, MA) avec un objectif 20 × 0.7 NA. Pour l'analyse des branches dendritiques, les neurones 7 ont été sélectionnés pour l'analyse par animal. Nous avons mesuré la longueur et la complexité des neurites à l'aide des macros NeuronJ et Advanced Sholl Analysis, respectivement. Le nombre d'intersections (points de ramification) dans les cercles concentriques aux rayons compris entre 5 – 250 µm (y compris les dendrites basale et apicale) a été mesuré et comparé entre les groupes. Pour l'analyse de la densité de la colonne vertébrale, les segments 4 – 5 d'au moins 20 µm de dendrites basales du troisième ordre ont été analysés par neurone à partir de neurones 5 – 7 par animal à l'aide d'un microscope à épifluorescence XXUMUMX de Zeiss AxioImager avec un objectif d'immersion dans l'huile 2x. La morphologie de l'épine a été classée comme décrit précédemment . La densité des épines linéaires pour chaque segment dendritique et leur morphologie (mince, trapu, champignon, en forme de coupe) de chaque épine ont été comparées entre les groupes. Un logiciel open source de National Institutes of Health (ImageJ) a été utilisé pour l'analyse des données de Golgi et de la tomographie en réseau.
Résultats
L'abstinence de cocaïne réduit la densité totale de synapse
La tomographie sur matrice a été utilisée pour mesurer les changements dans les synapses excitatrices et inhibitrices afin de déterminer les altérations morphologiques spécifiques qui se produisent dans le PFC en réponse à l'abstinence de l'auto-administration de cocaïne. La tomographie sur matrice est une méthode à haut débit qui permet la quantification précise des synapses totales, inhibitrices et excitatrices dans des structures trop petites pour être correctement identifiées ou localisées avec les méthodes classiques de microscopie confocale. . Comme les synapses inhibitrices et excitatrices sont des composants essentiels du circuit de récompense du médicament , , nous avons utilisé cette nouvelle méthodologie pour évaluer les changements morphologiques du PFC pendant l'abstinence de cocaïne. Des coupes de PFC de soixante-dix nm d'un hémisphère cérébral de rats 5 expérimentés avec de la cocaïne salée et de 5 ont été colorées avec des anticorps anti-PSD95, un marqueur excitateur postsynaptique, la synaptophysine, un marqueur présynaptique et le GAD65, qui a désigné les neurones inhibiteurs et les synapses. Les densités de synapse et le pourcentage de synapses inhibitrices ont été déterminés dans la couche corticale V (Figure 1A et 1B). Nos résultats indiquent que pendant l’abstinence de cocaïne, il y avait une diminution significative de la densité de synaptophysine (Figure 1C), qui mesure tous les terminaux présynaptiques [t (7)=2, p <0.05]. Il n'y avait pas de diminution significative de la densité des synapses excitatrices [t (8)=0.48, p=0.32] mesuré en comptant PSD95 puncta (Figure 1D). Fait intéressant, il y avait une tendance non significative vers une augmentation du pourcentage de synapses inhibitrices GAD65 positives [t (8)=−1.39, p=0.9] (Figure 2E).
L'abstinence de la cocaïne réduit la ramification dendritique tout en augmentant de manière transitoire la densité de la colonne vertébrale dans le PFC
La méthode de Golgi a été utilisée pour examiner les modifications de la densité des épines dendritiques et de la ramification neuronale afin de confirmer les modifications ultrastructurales observées dans la densité de la synapse (Figure 1). Nous avons effectué une imprégnation rapide de Golgi en une seule section sur un sous-ensemble de neurones du PFC provenant des autres hémisphères des mêmes animaux utilisés pour les études de tomographie en réseau. La ramification dendritique, le nombre d'épines dendritiques et la morphologie de l'épine ont été évalués. Deux neurones pyramidaux représentatifs du PFC d’un témoin salin-étrier et d’un rat exposé à la cocaïne sont présentés dans Figure 2A. Le diagramme de Sholl a mesuré le nombre d'intersections (points de ramification) dans des cercles concentriques aux rayons compris entre 5 et 250 µm. Nos résultats démontrent qu’après 7 jours d’abstinence forcée de l’auto-administration de cocaïne, il y avait une réduction significative de la complexité dendritique (Figure 2B). Analyse ANOVA à mesures répétées dans les deux sens des données du diagramme de sholl a révélé des effets principaux significatifs du traitement [F(1,738)=30.59, p <0.0001] et rayon [F(245, 738)=289.6, p <0.0001] (Figure 2B), confirmant une perte de dendrites en accord avec la perte de synapses mesurée dans des études sur le réseau (Figure 1C). L'analyse des dendrites basilaires des deuxième et troisième ordres a révélé une augmentation significative du nombre d'épines dendritiques après plusieurs jours d'abstinence de cocaïne 7 [t (6)=−3.12, p <0.05] (Figure 2D). Plus précisément, l’abstinence après exposition à la cocaïne a augmenté le nombre de sous-types de colonne vertébrale mince, tout en n’ayant aucun effet significatif sur les autres sous-types de colonne vertébrale (Figure 2E), révélée par une ANOVA à mesures répétées répétées avec effets principaux du traitement [F(1,30)=11.9, p=0.0017], sous-type de colonne vertébrale [F(4,30)=57.7, p <0.0001], et une interaction significative traitement x sous-type de rachis [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001].
Discussions
Dans la présente étude, nous démontrons qu'il existe des changements structurels et synaptiques prononcés dans la couche V du PFC après plusieurs jours d'abstinence forcée de la cocaïne par 7. Plus précisément, il y a une diminution significative de la ramification dendritique des neurones pyramidaux et une perte générale de la densité de la synapse mesurée par diminution de la densité de boutons présynaptiques globaux marqués à la synaptophysine. Malgré la perte de densité présynaptique, les dendrites basales des neurones pyramidaux de la couche V ont subi une augmentation de la densité des épines dendritiques, en particulier des épines minces en plastique. Comme nous n'avons pas détecté de changements significatifs dans la densité de PSD95, on peut supposer que la diminution des terminaux présynaptiques, mais que l'augmentation de la densité de la colonne vertébrale, peut être due à une augmentation du nombre de boutons multi-synaptiques. De plus, il convient également de noter que nous avons observé une tendance à l'augmentation du nombre de synapses inhibitrices dans le PFC. Puisque les fines épines sont impliquées dans la plasticité , l’augmentation de ces épines pourrait représenter une plasticité compensatoire permettant de maintenir les entrées synaptiques de ces neurones dénervés ayant perdu des branches dendritiques.
Des études antérieures avaient démontré que la cocaïne augmentait l’arborisation dendritique et la densité de la colonne vertébrale dans le NAc - . Dumitriu et al., 2012 ont démontré que la cocaïne modifie de façon dynamique les épines proximales dans le noyau et la coquille de NAc. Plus précisément, dans la coquille, le retrait de la cocaïne a augmenté les épines minces, tout en diminuant la densité de la tête de l’épine de champignon dans la coquille de NAc . Contrairement aux études sur le NAc, seules quelques études ont examiné les effets de la cocaïne sur la morphologie neuronale du PFC. , . Nos données sont cohérentes avec une étude récente démontrant que la cocaïne induit une augmentation de la densité de la colonne vertébrale dans le PFC. . Notamment, les souris qui présentaient une augmentation plus importante des épines persistantes et stables, c.-à-d. Que les épines présentent des jours 3 après le sevrage, sur les dendrites apicales présentent des scores de préférence de lieu conditionnés à la cocaïne plus élevés et une hyperactivité induite par la cocaïne . Une étude antérieure sur les neurones de couche II-III de PFC de rat a rapporté des valeurs d'environ 3 épines par µm de dendrite sur les dendrites tant apicales que basales, un niveau étonnamment dense d'épines modifiable par le stress. . Nos valeurs chez les rats témoins sp2 spines / 10 µm de segments dendritiques sont plus basses, ce qui peut être dû à la différence de population neuronale analysée (dendrites basales de couche V) ou à la différence de technique d’imagerie. Dans la présente étude, nous avons utilisé la méthode de coloration rapide au Golgi en une seule section, tandis que Radley et ses collègues ont utilisé des injections iontophorétiques de colorant jaune de Lucifer combinées à une imagerie confocale. visualiser la morphologie neuronale et dendritique. En outre, nos résultats soulignent également l’importance de la durée de l’abstinence de l’auto-administration de cocaïne, qui entraîne des modifications structurelles du cerveau. Un rapport précédemment publié a démontré une augmentation de l'arborisation dendritique après un sevrage à long terme (jours 24 – 25) de la cocaïne chez des rats femelles. , contrairement à notre diminution observée après 7 jours d’abstinence forcée chez le rat mâle. En dépit de ces différences méthodologiques et des données de branchement, un nombre accru d'épines a été observé dans les deux études, confirmant la réorganisation à grande échelle du circuit pendant l'abstinence de cocaïne. Les études futures préciseront la durée de ces événements afin de déterminer si ces changements structurels sont transitoires ou durables.
Nos résultats indiquent que l'abstinence forcée de l'auto-administration de cocaïne induit des changements structurels dynamiques et provoque une réorganisation synaptique du PFC. Ces résultats peuvent expliquer l'hypo-activité du PFC résultant d'une exposition répétée à la cocaïne , . De plus, nos résultats corroborent des études antérieures démontrant la désactivation du PFC. , et augmentation du GABA extracellulaire dans le PFC médian lors du sevrage de la cocaïne . Ainsi, les mécanismes responsables de l'hypo-activité des PFC après une exposition chronique à la cocaïne , peut inclure (1) une augmentation de la réduction de GABAergic, (2) de la réduction de la glutamatergique et / ou (3) de l’apport synaptique dopaminergique au PFC. La présente étude démontre que l’abstinence de cocaïne réduit considérablement la densité globale de la synapse, comme l’indique une réduction du nombre de ponctions synaptiques positives pour la synaptophysine. Ces données suggèrent qu'il y a une réduction de la réactivité post-synaptique dans le PFC, éventuellement induite par une diminution de l'apport en glutamate ou en dopamine. En effet, des études indiquent que la cocaïne induit une réduction du tonus glutamatergique , . Cependant, en utilisant la méthode de Golgi, nous avons observé une augmentation du nombre d'épines dendritiques minces sur les dendrites basales des neurones pyramidaux, ce qui suggère une augmentation de l'apport excitateur des PFC dans les neurites restants. Ces données apparemment contradictoires peuvent refléter une perte globale de synapses associée à la perte importante de dendrites que nous observons avec une réponse compensatoire, éventuellement induite par une augmentation du BDNF, comme le montrent nos conclusions précédentes. , pour augmenter la densité des épines dendritiques sur les neurites restants.
Ensemble, nos résultats indiquent une réorganisation dynamique du PFC pendant l’abstinence de cocaïne. En particulier, il existe une réduction significative de la connectivité synaptique, une perte de ramification dendritique et une augmentation du nombre d'épines minces dans le PFC du rat après plusieurs jours d'absence forcée de drogue de l'auto-administration de cocaïne par 7. Ces résultats peuvent constituer la base structurelle de l'hypo-activité observée dans le PFC d'abus de cocaïne chroniques et peut-être expliquer la perte de contrôle cognitif survenue lors d'une dépendance à la cocaïne.
Remerciements
Les auteurs souhaitent remercier Gavin Sangrey pour son aide dans la préparation des capsules incorporées.
Déclaration de financement
Ce travail a été soutenu par les subventions NIDA DA22339 et DA033641 (RCP & GSV) et DA18678 (RCP). HDS a été soutenu par un prix individuel K01 (DA030445). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Références