Abstract
Psychostimulant-induzearre feroaring fan dendrityske stekels op dopaminoceptive neuroanen yn nucleus accumbens (NAcc) is hypoteze as in adaptive neuronale antwurd dy't keppele is oan lang duorjende ferslaavjend gedrach. NAcc is foar it grutste part gearstald út twa ûnderskate subpopulaasjes fan middelgrutte spiny neuroanen dy't hege nivo's fan dopamine D1- as D2-receptors útdrukke. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje analysearren wy dendrityske spine-tichtens nei chronike kokaïne-behanneling yn ûnderskate D1- of D2-receptor-befette middelgrutte spiny neuroanen yn NAcc. Dizze stúdzjes makken gebrûk fan transgene mûzen dy't EGFP útdrukten ûnder de kontrôle fan sawol de D1- as D2-receptorpromotor (Drd1-EGFP of Drd2-EGFP). Nei 28 dagen fan kokaïne-behanneling en 2 dagen fan weromlûking, ferhege spine-tichtens yn sawol Drd1-EGFP- as Drd2-EGFP-positive neuroanen. De ferheging fan 'e dikke tichtens waard lykwols allinich bewarre yn Drd1-EGFP-positive neuroanen 30 dagen nei it weromlûken fan drugs. Opmerklik waard ferhege ΔFosB-ekspresje ek waarnommen yn Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-positive neuroanen nei 2 dagen fan medisyn weromlûken, mar allinich yn Drd1-EGFP-positive neuroanen nei 30 dagen fan medisyn weromlûken. Dizze resultaten suggerearje dat de ferhege spine-tichtens waarnommen nei chronike kokaïne-behanneling allinich stabyl is yn D1-receptor-befette neuroanen en dat ΔFosB-ekspresje is assosjeare mei de formaasje en / of it ûnderhâld fan dendrityske spines yn D1 lykas D2-receptor-befettende neuronen yn NAcc.
De mesolimbyske dopaminergyske paad is gearstald út neuroanen yn it ventral tegmentale gebiet dy't de nucleus accumbens (NAcc), olfaktoryske tuberkel, prefrontale cortex, en amygdala innervearje (1), wylst nigrostriatale dopaminergyske neuroanen yn 'e substantia nigra (pars compacta) in opkommende projeksje leverje oan dorsale striatum (2). Psychostimulanten ferheegje synaptyske konsintraasjes fan dopamine yn NAcc: kokaïne, troch it blokkearjen fan dopamine-opname fan 'e synaptyske spleet, en amfetamine, troch it befoarderjen fan dopamine frijlitting fan nerveterminals (3-5). Werhelle, intermitterende administraasje fan psychostimulanten resultearret yn ferhege gedrachsreaksjes (sensibilisaasje) foar de akute stimulearjende effekten fan dizze medisinen (6-8). De measte rigels fan bewiis suggerearje dat adaptive feroaringen yn it ventral tegmentale gebiet-NAcc dopaminergysk systeem sintraal binne foar feroaringen yn 'e ûnderfining-ôfhinklike plastykens dy't ûndergrûn fan drugs-induzearre gedrach.
Neist dopamine is glutamate nedich foar de ûntwikkeling fan gedrachsensibilisaasje yn reaksje op psychostimulanten (9, 10). Middelgrutte spiny neuroanen (MSN's) yn ventral striatum ûntfange excitatory glutamatergyske projeksjes fan prefrontale cortex dy't synapse op 'e hollen fan dendrityske stekels. MSN's binne ek it haaddoel foar dopaminergyske axons dy't synapsearje op 'e rêchbonke (1, 11, 12). Dêrom fertsjintwurdigje dendrityske spines yn MSN's it sellulêre fak dêr't dopaminergyske en glutamatergyske oerdracht ynearsten yntegreare binne.
Dopamine wurket op twa grutte receptor subfamyljes, de D1 subfamy (D1 en D5 subtypes) en de D2 subfamy (D2, D3, en D4 subtypes) (13). Yn dorsale striatum hawwe anatomyske stúdzjes oantoand dat striatonigraal MSN's hege nivo's fan D1-receptors befetsje (tegearre mei substans P en dynorphin), wylst striatopallidale MSN's foaral D2-receptors útdrukke (tegearre mei enkephalin) (14-17). De projeksjes fan NAcc binne komplekser as yn dorsale striatum, mei de shell en kearndielen fan 'e NAcc projektearje nei ûnderskate subregio's fan' e ventral pallidum en nei it ventral tegmentale gebiet en substantia nigra (18). Wylst D2-receptors en enkephalin tige útdrukt wurde yn projeksjes nei it ventral pallidum, wurde D1-receptors en substans P like ferdield fûn yn projeksjes nei ventral pallidum en ventral tegmental gebiet (19). Stúdzjes fan agonisten en antagonisten selektyf foar D1- of D2-receptors lieten sjen dat sawol D1- as D2-receptors nedich binne foar psychostimulant-ôfhinklike gedrachsferoarings (20-25). De rollen fan dizze receptors lykje lykwols oars te wêzen. Bygelyks, stimulearring fan D1-receptors attenuates kokaïne sykjen feroarsake troch kokaïne priming ynjeksjes en kokaïne-relatearre miljeu cues, wylst stimulearring fan D2 receptors fasilitearret kokaïne-induzearre werynrjochting (26-28).
De gedrachsôfwikingen ferbûn mei psychostimulant-ferslaving binne ekstreem lang libben. Dêrom is d'r in protte belangstelling west foar it identifisearjen fan langduorjende drugs-induzearre feroaringen op it molekulêre en strukturele nivo yn neuronale circuits regele troch dopamine en glutamate (29-32). Opmerklik, lange-termyn bleatstelling oan kokaïne of amfetamine is fûn om it oantal dendrityske branchpunten en spines fan MSN's yn NAcc te ferheegjen (33-35). Dizze strukturele feroarings binne oantoand oant ≈1-3.5 moannen nei de lêste eksposysje foar drugs (30, 35) en binne suggerearre om langduorjende feroaringen te ûnderlizzen yn synaptyske plastykens ferbûn mei psychostimulant eksposysje.
It doel fan 'e hjoeddeiske stúdzje wie om te ûndersiikjen fan kokaïne-induzearre strukturele feroarings fan dendrityske spines yn subpopulaasjes fan accumbale MSN's dy't D1- as D2-receptors útdrukke. Yn dizze stúdzjes hawwe wy bakteriële keunstmjittige chromosoom (BAC) transgene mûzen brûkt dy't EGFP ekspresje ûnder de kontrôle fan of de D1 (Drd1-EGFP) of D2 (Drd2-EGFP) dopamine receptor promoter (36). De resultaten jouwe oan dat, hoewol ferhege spine-tichtens yn earste ynstânsje foarkomt yn D1-receptor-befette MSN's en D2-receptor-befette MSN's, is de feroare spine-tichtens allinich stabyl yn D1-receptor-befettende neuronen. Boppedat fine wy ferlykbere feroaringen yn 'e ekspresje fan' e transkripsjefaktor ΔFosB, wat suggerearret dat ΔFosB kin belutsen wurde by de formaasje en / of ûnderhâld fan dendrityske spines yn D1 lykas D2-receptor-befette neuroanen yn NAcc.
results
Analyse fan MSN's yn Drd1-EGFP en Drd2-EGFP BAC Transgene mûzen.
It projeksjepatroan fan MSN's fan dorsale en ventrale striatum yn Drd1-EGFP of Drd2-EGFP BAC transgene mûzen is karakterisearre troch analyze fan GFP-ekspresje (36). De differinsjaal ekspresje fan GFP yn MSN's fan dorsale striatum komt oer it algemien oerien mei dy fan respektivelik endogenous D1 of D2 receptors (36). Wy analysearre fierder differinsjaal ekspresje fan GFP yn NAcc yn Drd1-EGFP of Drd2-EGFP mûzen (Fig. 1a en b). Hoewol ≈58% fan neuroanen yn NAcc ekspresje GFP yn Drd1-EGFP-mûzen (Fig. 1a), ≈48% fan neuroanen yn NAcc útdrukt GFP yn Drd-2-EGFP-mûzen (Fig. 1b). MSN's fertsjintwurdigje 90-95% fan alle neuroanen yn NAcc (12, 37). D1-receptors wurde allinich útdrukt yn MSN's, en D2-receptors wurde útdrukt yn MSN's en yn cholinergyske ynterneurons, dy't 1-3% fan striatale neuroanen fertsjintwurdigje (37). Mei dizze faktoaren yn rekken brocht, suggerearje de resultaten dat, minimaal, ≈10-15% fan MSN's yn NAcc wierskynlik sawol D1- as D2-receptors útdrukke.
Analyse fan dendrityske spines yn Drd1-EGFP en Drd2-EGFP-mûzen.
GFP-ekspresje yn 'e Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-mûzen wie nuttich om neuronale sellichems te kleurjen. It GFP-sinjaal yn dendriten en dendrityske stekels wie lykwols te swak om har analyse te tastean nei immunokleuring mei anty-GFP-antylders. Partikel-bemiddele ballistyske levering fan fluorescent kleurstoffen is koartlyn brûkt om neuronale populaasjes op in rappe en effisjinte manier te markearjen (38). Hiele neuroanen kinne wurde markearre mei dizze technyk, en de metoade liket te fergelykjen mei Golgi-Cox-kleuring. Om de dendrityske morfology fan neuroanen yn NAcc te analysearjen, waarden fêste accumbale plakjes markearre mei de lipofile fluoreszensferve 1,1'-diotadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) troch it brûken fan in gengewear. In foarbyld fan in DiI-bevlekte MSN wurdt werjûn yn Fig. 1c. Under de brûkte betingsten observearren wy yn 't algemien markearre neuroanen sûnder oerlappende dendriten fan oare markearre neuroanen. By hegere fergrutting koe detaillearre dendrityske morfology, ynklusyf dendrityske stekels, wurde waarnommen (Fig. 1d).
Wy brûkten doe in kombinaasje fan DiI-labeling en immunohistogemy foar GFP yn Drd1-EGFP of Drd2-EGFP transgene mûzen, dy't mooglik makke waard troch it brûken fan in lege konsintraasje fan detergent foar weefselpermeabilisaasje (sjoch metoaden). Troch soarchfâldige fergeliking fan 'e DiI-flekke en GFP-ekspresje yn' e sellelichamen fan MSN's, koene wy DiI- en GFP-positive as DiI-positive en GFP-negative neuroanen identifisearje yn Drd1-EGFP (Fig. 2a) of Drd2-EGFP (Fig. 2b) mûzen. Foar de folgjende stúdzjes analysearren wy dendrityske morfology yn allinich DiI- en GFP-positive neuroanen fan Drd1-EGFP of Drd2-EGFP-mûzen.
Chronyske kokaïnebehanneling resulteart yn ferhege spine-tichtens yn accumbale MSN's dy't Drd1-EGFP of Drd2-EGFP útdrukke.
Drd1-EGFP- of Drd2-EGFP-mûzen waarden fjouwer opienfolgjende wiken meardere kearen ynjeksje mei kokaïne (30 mg / kg) of saline (sjoch metoaden). Twa dagen (2WD) of 30 dagen (30WD) nei de lêste medisynbehanneling waarden harsens ferwurke foar DiI-labeling en immunohistochemy lykas hjirboppe beskreaun. In eardere stúdzje rapportearre dat chronike behanneling mei amfetamine de spine-tichtens fergrutte op distale mar net proximale dendriten fan MSN's yn NAcc (35). Wy beheine ús analyze dêrom ta distale dendriten (dat wol sizze dy mei twadde- of tredde-order-tûken), ynklusyf terminalregio's. Doe't analysearre op 2WD, spinne tichtens waard fûn te fergrutsjen yn Drd1-EGFP-positive MSNs (128% fan saline groep) (Fig. 3a en c) en yn mindere mjitte yn Drd2-EGFP-positive neuroanen (115% fan saline groep) (Fig. 3 b en d). Nei 30WD waard ferhege spine-tichtens hâlden yn Drd1-EGFP-positive neuroanen (118% fan salinekontrôle) (Fig. 3 a en c) mar net yn Drd2-EGFP-positive neuroanen (Fig. 3 b en d).
De morfology fan dendrityske stekels is fariabel yn termen fan har lingte en de breedte fan 'e rêchbonke. Wy hawwe dêrom dendrityske protrusions klassifisearre yn fjouwer spineklassen (stubby, paddestoel, tinne, en filopodia) by 2WD fan kokaïne (gegevens net werjûn). De tichtens fan paddestoeltype (119.7 ± 4.0%, P < 0.01) en tinne stekels (120.0 ± 3.4%, P <0.01) waard ferhege troch kokaïne-behanneling yn Drd1-EGFP-positive MSN's, wylst de tichtens fan stubby (182.4 ± 21.6%, P < 0.05) en paddestoelen (122.5 ± 5.0%, P <0.01) waard ferhege yn Drd2-EGFP-positive MSN's. D'r wie gjin signifikante ferheging fan stompe spines yn Drd1-EGFP-positive neuroanen of fan tinne spines yn Drd2-EGFP-positive neuroanen.
Chronike kokaïne induceart ΔFosB-ekspresje yn Drd1-EGFP- of Drd2-EGFP-positive MSN's yn NAcc.
ΔFosB is in lid fan 'e Fos-famylje fan transkripsjefaktoaren. Wylst acute administraasje fan kokaïne in rappe en transiente yndeksje fan ferskate Fos-isoformen yn NAcc induceart, fergruttet werhelle eksposysje foar kokaïne it nivo fan ΔFosB. Boppedat bliuwt de ferheging fan ΔFosB-ekspresje yn NAcc foar wiken oant moannen nei it stopjen fan eksposysje foar medisyn en is suggerearre om belutsen te wêzen by langduorjende regeling fan gene-ekspresje, sels nei't it nimmen fan medisinen ophâldt (29, 39, 40).
Om de yndeksje fan ΔFosB yn NAcc te ûndersiikjen fan Drd1-EGFP- of Drd2-EGFP-mûzen nei kokaïnebehanneling, analysearren wy FosB- en GFP-ekspresje troch dûbele labeling (Fig. 4 en Table 1) It anty-FosB antykodym herkent alle foarmen fan FosB, mar wy geane der fan út dat de ferhege immunostain ΔFosB fertsjintwurdiget (sjoch metoaden foar fierdere diskusje). Yn saline-behannele mûzen ekspresje 16% fan Drd1-EGFP-positive neuroanen en 15% fan Drd2-EGFP-positive neuroanen FosB-immunoreaktiviteit mei relatyf swakke yntensiteit (Fig. 4 a en b en Table 1). Werhelle kokaïne-behanneling folge troch 2WD resultearre yn in signifikante ferheging fan it oantal Drd1-EGFP-positive neuroanen dy't ΔFosB (55% fan GFP-positive neuroanen) co-ekspresje (Fig. 4c en Table 1). In lytsere, mar noch signifikante ferheging fan ΔFosB-ekspresje waard fûn yn Drd2-EGFP-positive neuroanen (25% fan GFP-positive neuroanen) (Fig. 4d en Table 1). Lykas by de wizigingen yn 'e rêchtensiteit, waard de ferhege ekspresje fan ΔFosB bewarre yn Drd1-EGFP-positive neuroanen (46% fan GFP-positive neuroanen), mar net yn Drd2-EGFP-positive neuroanen (15% fan GFP-positive neuroanen) nei 30WD (Fig. 4 e en f en Table 1). Tink derom dat de ferhege ΔFosB-ekspresje waarnommen yn Fig. 4f is oanwêzich yn Drd2-EGFP-negative neuroanen.
Diskusje
Lang duorjende oanpassingen yn dopaminergyske neurotransmission wurde leaud om ferslaavjend gedrach te ûnderlizzen ferbûn mei psychostimulante medisinen. Benammen psychostimulant-induzearre ferhegingen yn dendrityske spine-tichtens fan MSN's yn NAcc binne hypoteze keppele oan reorganisaasje fan synaptyske ferbining (30). De NAcc is foar in grut part gearstald út twa ûnderskate subpopulaasjes fan MSN's dy't hege nivo's fan D1 of D2 dopamine receptors útdrukke. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje hawwe wy de dichtheid fan' e rêch analysearre yn ûnderskate D1- of D2-receptor-befette MSN's yn NAcc nei chronike kokaïne-behanneling. De resultaten dy't krigen hawwe litte sjen dat, hoewol ferhege spine-tichtens yn earste ynstânsje foarkomt yn D1-receptor-befettende MSN's en D2-receptor-befette MSN's, feroare spine-tichtens is allinich stabyl yn D1-receptor-befettende neuronen. Boppedat fine wy in ferlykber patroan fan feroaringen yn 'e ekspresje fan' e transkripsjefaktor ΔFosB yn D1- en D2-receptor-befettende MSN's.
Dizze stúdzjes makken gebrûk fan BAC-transgene mûzen dy't GFP ekspresje yn spesifike subpopulaasjes fan MSN's ûnder de kontrôle fan sawol de D1- as D2-receptorpromotor. Boppedat hawwe wy in metoade foar dûbele-labeling ûntwikkele dy't immunhistochemy kombinearre foar GFP mei ballistyske labeling fan neuroanen mei DiI. Eardere ûndersiken hawwe de Golgi-Cox-metoade brûkt om it effekt fan psychostimulanten te analysearjen op de tichteens fan 'e rêch.34), en de hjir brûkte DiI-metoade joech resultaten dy't kwantitatyf fergelykber wiene. Wy hawwe de metoade foar dûbele labeling ûntwikkele om't Golgi-kleuring net kompatibel is mei immunhistochemy. Immunokleuring fereasket normaal weefselpermeabilisaasje mei detergenten, in proses dat typysk liedt ta solubilisaasje fan lipofile kleurstoffen út it membraan (38). Yn ús hjoeddeistige stúdzjes hat GFP-immunokleuring lykwols gjin hege konsintraasje fan detergent nedich foar weefselpermeabilisaasje en koe dus brûkt wurde yn kombinaasje mei lipofile kleurstoflabeling. Us metoade foar dûbele-labeling soe oer it algemien nuttich wêze moatte foar stúdzjes fan strukturele feroaringen yn dendrityske stekels, bygelyks as brûkt foar analyze fan BAC-transgene mûslinen wêr't GFP wurdt útdrukt yn spesifike populaasjes fan neuroanen yn cortex (36).
Hoewol noch wat kontroversjeel, wurdt leaud dat D1- en D2-receptors foar in grut part anatomysk segregearre binne nei de direkte (striatonigraal) en yndirekte (striatopallidale) striatale projeksjeneuronen, respektivelik (17, 41). Inisjele karakterisaasje fan 'e lokalisaasje fan GFP yn' e Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-mûzen wie konsekwint mei dizze konklúzje (36). Boppedat is ús analyze fan it oantal GFP-positive neuroanen yn NAcc fan Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-mûzen konsekwint mei de konklúzje dat ≈50% fan MSN's allinich D1-receptors útdrukke, dat ≈35-40% allinich D2-receptors útdrukke, en dat ≈10-15% beide D1- en D2-receptors mei-ekspresje. Dizze wearde fan koekspresje is fergelykber mei dy ymplisearre troch stúdzjes fan dorsale striatum dy't patch-clamp-analyze fan single striatale neuroanen kombineare mei RT-PCR-techniken om mRNA's te isolearjen en te fersterkjen (≈17% ko-ekspresje fan enkephalin en substans P) (42). It moat opmurken wurde dat ús hjoeddeistige stúdzjes de fraach fan ekspresje fan D3-, D4- en D5-receptors net oanpakke, noch it probleem oanpakke fan lege nivo's fan ekspresje fan D1-receptors yn MSN's dy't hege nivo's fan D2-receptors útdrukke of oarsom.
Ferskate eardere stúdzjes hawwe ûndersocht de neuronale lokalisaasje fan psychostimulant-induzearre Fos-ekspresje en de rol fan D1- en D2-receptors (43-45). Dy stúdzjes stipe de konklúzje dat Fos- en ΔFosB-ynduksje wurdt bemiddele troch aktivearring fan D1-receptors. De sellulêre lokalisaasje fan Fos-ekspresje wurdt lykwols beynfloede troch de omjouwingskontekst wêryn psychostimulante medisinen wurde administreare (46, 47). Bygelyks, amfetamine of kokaïne jûn yn 'e hûskaai bringt direkte iere genen (ynklusyf Fos) foarkar yn substans P-positive sellen dy't D1-receptors mei-ekspresje. Yn tsjinstelling kinne dizze medisinen Fos-ekspresje ynliede yn sawol D1- as D2-receptor-befettende MSN's by administraasje yn in nije omjouwing. It protokol brûkt yn ús hjoeddeistige stúdzjes omfette gjin keppeljen fan drugsynjeksje mei bleatstelling oan in nije omjouwing. Wy kinne lykwols in soarte fan kontekstôfhinklike stress net útslute dy't ferantwurdlik is foar ΔFosB-ekspresje yn D2-receptor-befette MSN's.
In opmerklik skaaimerk fan 'e hjoeddeistige resultaten wie it parallelle patroan fan ferhege spine-tichtens en ΔFosB-ekspresje. Ferhege spine-tichtens en ΔFosB-ekspresje barde yn earste ynstânsje yn MSN's dy't Drd1-EGFP en Drd2-EGFP útdrukke. Dizze wizigingen wiene lykwols allinich stabyl yn D1-receptor-befettende neuronen. Ien mooglike ferklearring foar de beoardieling dat ferhege spine-tichtens en ΔFosB-ekspresje tydlik fûn waard yn D2-receptor-befettende neuronen is dat dit barde yn 'e lytse fraksje fan MSN's dy't sawol D1- en D2-dopamine-receptors mei-ekspresje. Sa kin de transiente aard fan dizze ferhegingen wurde assosjeare mei antagonistyske effekten fan D2-receptor-aktivearring op D1-ôfhinklike sinjaalpaden (48). It is fan belang dat de wizigingen yn 'e rêchtensiteit en ΔFosB-ekspresje omkearber wiene, wat it fermogen fan D2-receptor-ôfhinklike sinjaalpaden reflektearje kin om de stabiliteit fan ΔFosB te beynfloedzjen.
De beoardieling dat d'r parallelle feroaringen binne yn 'e ekspresje fan ΔFosB en spine-tichtens is konsekwint mei it idee dat ΔFosB belutsen is by de earste formaasje en it folgjende ûnderhâld fan dendrityske spines yn D1-receptor-befette neuroanen yn NAcc. Ekspresje fan ΔFosB wurdt regele troch de D1 / DARPP-32 / PP1-ôfhinklike sinjaalpaad yn MSN's (49). Ferskate stúdzjes hawwe oantoand dat ΔFosB in wichtige rol spilet yn 'e beleanjend en lokomotor-aktivearjende aksjes fan psychostimulanten (39), wierskynlik troch it beynfloedzjen fan de ekspresje fan meardere genen dy't neurotransmitterreceptors, sinjalearjende aaiwiten en aaiwiten omfetsje dy't belutsen binne by regeling fan neuronale morfology (50). De spesifike molekulêre meganismen belutsen by chronike kokaïne-induzearre spinefoarming binne op it stuit net bekend. Us eardere stúdzjes hawwe oantoand dat intraaccumbale infuzje fan 'e Cdk5-ynhibitor roscovitine troch kokaïne-induzearre ferhegingen yn' e rêchdichte fermindere (51). Boppedat is Cdk5 in streamôfwerts doelgen foar ΔFosB en is belutsen by kompensearjende adaptive feroaringen dy't ferbûn binne mei chronike kokaïnebehanneling (52). Dêrom is feroaring yn Cdk5-ôfhinklike phosphorylaasje in plausibele meganisme dy't ûnderlizzende kokaïne-induzearre spineformaasje en / of spinestabiliteit. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), en spinofiline (56) binne substraten foar Cdk5 en binne allegear belutsen by regeling fan spine morfogenese (57-60). Fierdere karakterisearring fan dizze en oare Cdk5 substraten yn spines sille hooplik ljocht skine op de meganismen belutsen by regeling fan spine formaasje troch psychostimulants.
metoaden
Dieren.
Mûzen dy't in EGFP-transgen drage ûnder de kontrôle fan sawol de D1 as D2 dopamine receptors waarden generearre troch it Gensat BAC transgene projekt (36). De transgene mûzen brûkt yn dizze stúdzje wiene 4-5 wiken âld en wiene op in Switserske-Webster eftergrûn. Mûzen waarden bewarre yn in 12:12-h ljocht / tsjustere syklus en ûnderbrocht yn groepen fan 2-5 mei iten en wetter beskikber ad libitum. Alle dierprotokollen wiene yn oerienstimming mei National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en waarden goedkard troch de Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee.
Drug Treatment.
Chronyske kokaïne-behanneling (30 mg / kg, deistich) waard rapportearre om in robúste ferheging te produsearjen fan 'e spine-tichtens fan MSN's yn sawol de kearn as de shell fan NAcc fan rat, mar in legere doasis (15 mg / kg) fergrutte spin-tichtens allinich yn de shell (61). Wy brûkten dêrom de hegere doasis kokaïne om strukturele modifikaasje yn beide dielen fan NAcc te stimulearjen. Mûzen krigen ien ynjeksje (ip) fan 30 mg / kg kokaïne-HCl (as saline) elke dei foar 5 opfolgjende dagen, folge troch 2 ynjeksjefrije dagen, en dizze proseduere waard werhelle foar 4 opienfolgjende wiken. Ynjeksjes waarden útfierd yn 'e thúskoai. 2WD of 30WD, mûsharsens waarden ferwurke foar DiI-labeling en / of immunohistochemy.
Ballistic Labeling mei de Fluorescent Dye DiI.
Mûzen waarden anesthetisearre mei 80 mg / kg natrium pentobarbital en transcardially perfuseare mei 5 ml PBS, folge troch rappe perfúzje mei 40 ml fan 4% paraformaldehyde yn PBS (20 ml / min). Harsens waarden fluch fuortsmiten fan 'e skedel en postfixed yn 4% paraformaldehyde foar 10 min. Brain slices (100 μm) waarden markearre troch ballistyske levering fan fluorescent kleurstof DiI (Molecular Probes) lykas beskreaun yn ref. 38. In kombineare DiI-labeling-immunohistochemy metoade waard ûntwikkele mei in lege konsintraasje fan detergent. DiI-labele seksjes waarden permeabilisearre mei 0.01% Triton X-100 yn PBS foar 15 min en dan ynkubeare yn 0.01% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum yn PBS foar 1 h om net-spesifike labeling te minimalisearjen. Tissue-seksjes waarden doe ynkubeare mei 1% normaal geitenserum / 0.01% Triton X-100 en anty-GFP-antybody (Abcam, Cambridge, MA) foar 2 oeren by keamertemperatuer, wosken en ynkubeare yn in 1: 1,000-verdunning fan FITC- konjugearre sekundêr antykodym (molekulêre probes). Seksjes waarden pleatst op mikroskoop dia 's en coverslipped mei mounting medium. De ballistyske etiketteermetoade liet in detaillearre analyze fan dendrityske struktuer fan 'e rêchbonke, en de resultaten krigen wiene kwalitatyf en kwantitatyf te fergelykjen mei eardere ûndersiken mei de Golgi-Cox-impregnaasjemetoade yn rat-harsensplakken (34). Lykwols, yn tsjinstelling ta eardere stúdzjes, hawwe wy selden twa-headed spines observearre yn DiI-bevlekte neuroanen. Dit ferskil kin feroarsake wurde troch de gefoelichheid fan kleurmetoaden of fariabiliteit fan mûs (dizze stúdzje) tsjin ratweefsel (34).
Immunohistochemy.
Dieren waarden anesthetized en perfused lykas hjirboppe beskreaun. Harsens waarden fuortsmiten en oernachtich opslein yn 4% paraformaldehyde by 4 ° C. Harsens waarden oerbrocht nei 30% sukrose yn PBS-oplossing foar kryoprotection. Koronale seksjes (12 μm) waarden ôfsnien op in frije mikrotome (Leica) en dêrnei ferwurke foar immunohistochemy. Brain-seksjes waarden doe permeabilisearre yn 0.3% Triton X-100 yn PBS foar 15 min en twa kear yn PBS spield. De seksjes waarden pre-ynkubearre yn 10% normaal geitenserum yn PBS foar 1 h op 37 ° C, bleatsteld oan primêre antykladen (fertinne yn 1% normaal geitenserum yn PBS) oernacht by 4 ° C, en dan spiele yn PBS en ynkubeare mei sekundêr antistoffen foar 1 h by 37 ° C. De folgjende antykladen waarden brûkt: konijn anty-pan-FosB (SC-48, 1:500; Santa Cruz Biotechnology), mûs anty-NeuN (Chemicon), rabbit anty-GFP, FITC-konjugearre anty-konyn IgG, en rhodamine- konjugearre anty-mûs IgG (molekulêre probes). Foar triple labeling (ΔFosB, NeuN, en GFP) waarden harsenseksjes earst ymmúnkleurd mei anty-pan FosB antybody en anty-NeuN antybody en dan ynkubeare mei sekundêre antylders (rhodamine-konjugearre anty-konyn IgG en cyaan-konjugearre anty-mûs IgG ). Dûbelkleurige harsenseksjes waarden fierder ferwurke foar GFP-immunokleuring mei Zenon-labeltechnology (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). It anty-pan-FosB antykodym waard ferhege nei it N-terminus fan FosB en herkent ΔFosB en FosB fan folsleine lingte (62). Op grûn fan eardere ûndersiken dy't sjen litte dat ΔFosB mar net FosB of oare Fos-relatearre antigenen stabyl útdrukt wurde nei chronike kokaïnebehanneling, geane wy derfan út dat de langduorjende ferheging fan immunoreaktiviteit stabile ekspresje fan ΔFosB fertsjintwurdigje. De identiteit fan it immunoreaktive FosB-sinjaal dat wurdt waarnommen yn saline-behannele mûzen is lykwols ûnbekend. Statistyske analyze yn Table 1 brûkte de studint t toets.
Dendrityske spine analyze.
Yndividuele MSN's yn 'e NAcc waarden keazen foar spinale analyze basearre op ferskate kritearia. (i) D'r wie minimaal of gjin oerlaap mei oare markearre sellen om te soargjen dat prosessen fan ferskate sellen net betize wurde. (ii) Op syn minst trije primêre dendriten moasten sichtber wêze foar sellen dy't brûkt wurde foar analyse. (iii) Distale dendriten (terminal dendrites of tichtby de terminal dendrite) waarden ûndersocht. Dendriten fan beide MSN's yn 'e kearn en shell fan' e NAcc waarden analysearre. Hoewol wy dun spinige MSN's (spiny type II) observearre, analysearren wy allinich ticht spined MSN's (spiny type I). Om de tichtens fan 'e spine te berekkenjen, waard in lingte fan dendrite (> 20 μm lang) traced troch it brûken fan in konfokale mikroskoop (Zeiss LSM 510) mei in oalje immersion lens (× 40). Alle bylden fan dendrites waarden nommen op ferskillende z nivo's (0.5-1 μm djipte-yntervallen) om de morfology fan dendrityske spinnen te ûndersykjen. Alle mjittingen waarden makke mei software foar metamorphbyldanalyse (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistyske analyze brûkt de Kolmogorov-Smirnov test.
Protrusions út dendrites waarden yndield yn fjouwer soarten basearre op harren lingte lykas beskreaun yn refs. 63 en 64. Klasse 1 protrusions, ek wol stubby protuberances neamd, wiene <0.5 μm yn 'e lingte, miste in grutte spinekop, en like gjin nekke te hawwen; klasse 2, of paddestoelfoarmige stekels, wiene tusken 0.5 en 1.25 μm lang en waarden karakterisearre troch in koarte nekke en grutte spinekop; klasse 3, of tinne stekels, rûn tusken 1.25 en 3.0 μm en hie langwerpige spine nekken mei lytse hollen; klasse 4, of filopodial extensions, wiene lange filamentous protrusions dy't mist in discernible spine holle.
Acknowledgments
Dit wurk waard stipe troch United States Public Health Service Grant DA10044 (oan PG en ACN) en troch The Simons Foundation, de Peter J. Sharp Foundation, de Picower Foundation, en de FM Kirby Foundation.
ôfkoartings
- NAcc
- nucleus accumbens
- MSN
- middelgrutte spiny neuron
- BAC
- bakteriële keunstmjittige chromosoom
- Drd1
- dopamine receptor D1 promotor-oandreaune
- Drd2
- dopamine receptor D2 promotor-oandreaune
- DiI
- 1,1'-diotadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
- 2WD
- 2 dagen nei lêste drug behanneling
- 30WD
- 30 dagen nei lêste drug behanneling.
Referinsjes
;