J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
Foinse
An Roinn Síciatrachta, an tIonad um Néareolaíocht Bhunúsach, Ollscoil Ionad Leighis Southwestern Texas, Dallas, Texas 75390-9070, SAM.
Abstract
Is idirghabhálaí tábhachtach é an fachtóir trascríofa DeltaFosB (ar a dtugtar FosB2 nó FosB [foirm ghearr]) freisin maidir leis an bplaisteacht fhadtéarmach a spreagtar san inchinn trí nochtadh ainsealach do roinnt cineálacha spreagthaí sícighníomhacha, lena n-áirítear drugaí mí-úsáide, struis, agus urghabhálacha leictreacónacha . Gné ar leith de DeltaFosB is ea go bhfanann sí san inchinn ar feadh tréimhsí fada ama gan spreagadh breise. Níl na meicníochtaí atá mar bhonn leis an gcobhsaíocht dealraitheach seo fós anaithnid. Anseo, léirímid gur fachtóir trascríobh réasúnta seasmhach é DeltaFosB, le leathré thart ar 10 h i gcultúr na gceall. Ina theannta sin, taispeánann muid gur fosfaphrotein san inchinn é DeltaFosB agus go gcosnaíonn fosfathú as iarmhar sárchoimeádta (Ser27) i DeltaFosB é ó dhíghrádú próitéineach. Cuirimid roinnt línte fianaise ar fáil a thugann le tuiscint go bhfuil an fosfaicealú seo idirghabhála ag cáiséin kinase 2. Is ionann na torthaí seo agus an chéad fhianaise go ndéantar DeltaFosB a phosphorylated agus go dtaispeánann sé go gcuireann fosfaireachas lena chobhsaíocht, atá ag croílár a chumas chun idirghabhálacha fadtéarmacha san inchinn a idirghabháil.
Réamhrá
Is é an fachtóir trascríobh ΔFosB, FosB2 ainmnithe nó FosB [foirm ghearr] ainmnithe freisin, malairtí spíosraí teasctha C foirceanta den ghéin luath láithreach fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu agus Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Cosúil le FosB ar fhad iomlán, tá bun fearainn DNA ceangailteach ag ipperFosB agus zipper leucine trínar dtógann sé le próitéiní Jun chun coimpléisc fachtóra trascríobh próitéine-1 (AP-1) a fhoirmiú, a rialaíonn léiriú go leor géinte (Morgan agus Curran, 1995; Rylski agus Kaczmarek, 2004). In ainneoin nach raibh cuid den bhfearann trasghníomhaíochta a fuarthas i gcríochfort FosB, tá ΔFosB ag feidhmiú mar ghníomhaire cumhachtach athscríofa agus mar fhulaingt i gcealla saothraithe agus san inchinn (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu agus Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung agus Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔTarlaíonn FosB chuig ardleibhéil ar bhealach réigiún-sonrach san inchinn tar éis nochtadh ainsealach, ach ní géarmhíochaine, ar éagsúlacht spreagthaí sícighníomhacha, lena n-áirítear strus, loit áirithe, drugaí frithshíceacha agus frithdhúlagráin, drugaí mí-úsáide, agus luach saothair nádúrtha (Hope et al., 1994b; Hiroi agus Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Tá ionduchtú ΔFosB tar éis a bheith bainteach go díreach le héifeachtaí feidhme roinnt de na spreagthaí seo ar an inchinn. Díríonn marthanacht ΔFosB, fiú mura bhfuil spreagadh breise ann, ar gach fachtóir trascríobh eile de chuid teaghlach Fos, a spreagtar go gasta mar fhreagra ar ghéar-spreagthaigh, meath ar ais go leibhéil basal laistigh de chúpla uair an chloig, agus léiríonn siad desensitization go ginearálta tar éis spreagadh ainsealachHope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi agus Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Fágann sé seo gur iarrthóir tarraingteach é BFosB chun cuid de na hathruithe fadtéarmacha a léiriú in léiriú géine a bhaineann le hoiriúnuithe cobhsaí néaróin de bharr spreagthaí ainsealacha áirithe.
Toisc go dtarlaíonn láithreacht fhada ΔFosB in éagmais ionduchtú breise dá mRNA (Chen et al., 1995,, ní thuigimid go bhféadfadh ΔFosB a bheith ina fhachtóir trascríobh neamhchoitianta seasmhachHope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Thairis sin, thug anailís imdhíonachta ar fhíochán inchinn géara-ainsealach-spreagtha le fios go bhfuil ΔFosB shifts dealraitheach Mr (mais mhóilíneach) ó ∼33 kDa sa riocht géar go ∼35-37 kDa le linn cóireála ainsealaí (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Toisc nach bhfuil aon fhianaise ann go bhfuil mRNAanna breise ann a d’fhéadfadh a ionchódú do na holafhathanna éagsúla seo, rinneamar tuairimíocht eile go bhfuil ΔFosB modhnaithe go trasuite agus go gcuireann sé seo lena chobhsaíocht neamhghnách. Go dtí seo, áfach, níor tuairiscíodh aon anailís bithcheimiceach ar an láimhdeachas ná ar na modhnuithe iar-aistrithe ar BFosB. Ba é sprioc an staidéir seo ná a fháil amach an fosfófaigin é roFosB agus an bhfuil ról ag phosphorylation ina chobhsaíocht.
An Roinn Roimhe SeoAn Roinn Ar Aghaidh
Ábhair agus Modhanna
Línte cealla mamacha agus tógann DNA.
Saothraíodh cealla PC12 (Clontech, Mountainview, CA) i DMEM glúcóis ard ina bhfuil l-glutamine (L-Gln) agus forlíonadh le serum bólachta (FBS) 5%, serum capall 10 (ó Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml peinicillin, agus 100 μg / ml streptomycin (idir Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Rinneadh cealla HeLa (Bailiúchán Chultúr Cineál Meiriceánach, Manassas, VA) a shaothrú i DMEM glúcóis ard ina raibh L-Gln agus forlíonadh le FBS 10%, peinicillin, agus streptomycin. Coimeádadh an dá líne cille ag 37 ° C i CO 5% tais2 atmaisféar.
Do na haistrithe díomuana le cealla DNA, PC12 nó HeLa síoltar iad ar phlátaí sé-thoibreacha (brataithe le collagen I le haghaidh cealla PC12) chun comhchuibheas% 90-100 a bhaint amach an lá dár gcionn agus ansin aistríodh iad trí Lipofectamine 2000 (Invitrogen). I roinnt turgnamh (féach Figs. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), Cuireadh ΔFosB in iúl go neamhbhuan i gcealla PC12 trí ionfhabhtú le víreas herpes simplex athchuingreach (HSV).
Fuarthas BFosB agus cDNAs FosB ónár gcuid ptet-constructs féin (Chen et al., 1997), agus curtha isteach i veicteoir pcDNA3.1 (Invitrogen). Baineadh úsáid as na pcDNA3.1-BFosB / FosB seo chun iad a chur in iúl i gcealla mamacha agus mar theimpléad le haghaidh mutagenesis atá dírithe ar an suíomh. Ullmhaíodh athchomhcheangal HSV-ΔFosB mar a tuairiscíodh roimhe seo (Neve et al., 1997), agus bhí titer de ∼1 × 10 ag an ullmhúchán8 pfu / ml.
Turgnaimh phulse-chase.
Rinneadh thart ar 24 h tar éis an ionfhabhtaithe / na haistrithe, na gcealla (PC12 nó HeLa) i bplátaí sé go maith a nite dhá nó trí huaire le 2 ml de PBS agus a ghoradh ag 37 ° C le haghaidh ∼1 h i 2 ml de DMEM Cys / Met-saor in aisce (Invitrogen) le 5% dialyzed FBS (Hyclone, Logan, UT) chun linnte intracellular de Met agus Cys a ídiú. Ag deireadh na tréimhse “ocras” seo, cuireadh drugaí (dá gcaithfí le cealla), agus lipéadaíodh cealla (bíog) le 12-25 iCi 35Meascán Lipéadú Próitéin (PerkinElmer, Wellesley, MA) le haghaidh ∼1 h ag 37 ° C chun gach próitéin nua-shintéite a lipéadú. Baineadh an radiolabel amach ansin trí na cealla a ní le trí nó trí huaire le 2 ml de PBS, agus leis na cealla 35Leanadh próitéiní S-lipéadaithe (dul sa tóir orthu) trí mheán “fuar” (nonradioactive) a chur in áit an mheáin le FBS 5% agus na cealla a bhaint ag amanna éagsúla. Coimeádadh cóireálacha cealla i rith an tsár. Taispeánann figiúirí uile na dturgnaimh seo méideanna tosaigh den chineál céanna de na próitéiní éagsúla chun comparáid a dhéanamh idir a rátaí láimhdeachais.
Ainmhithe agus cóireáil urghafa ainsealach leictrimhevulsive.
Déileáladh le francaigh fireann Sprague Dawley (200-300 g; Saotharlanna Charles River, Kingston, RI) uair amháin gach lá le hurghabhálacha leictreacónacha (ECS) do 7-9 d. Rinneadh ECS mar a tuairiscíodh roimhe seo (Hope et al., 1994a) ag baint úsáide as Ugo Basile (Comerio VA, an Iodáil) aonad ECS leis na socruithe seo a leanas: minicíocht, 100 bídíní; cuisle le, 0.5 ms; ré turrainge, 1.0 s; agus reatha, 75 mA. Caitheadh le hainmhithe rialaithe Sham go comhthreomhar trí na leictreoidí cluaise cluaise a chur i bhfeidhm gan aon sruth leictreach.
32 P lipéadú meitibileach.
Maidir le lipéadú slisní inchinne, díthríodh francaigh, dhioscadh na brainsí go tapa, agus ullmhaíodh slisní cortical tosaigh 300 le micreascóir DSK (Ted Pella, Redding, CA). Gineadh na slisní taobh istigh de fheadáin phlaisteacha i 2 ml de CSF saorga easnamhach-fosfáite (ACSF) agus coinníodh iad ag 30 ° C faoi chnapshuim mhín shíor le O2/ CO2 meascánHemmings et al., 1989). Rinneadh na slisní (dhá shlis in aghaidh an fheadáin) a lipéadú le 1.3 mCi do 8-10 h i láthair nó gan aigéad okadaic (100 ng / ml) a bheith ann. Ag deireadh an ghoir seo, rinneadh na slisní a shruthlú trí huaire ar a laghad le ACSF fuar agus ansin iad a homogenized trí mhaolánú i mbuanán fuar-mheasctha (RIPA) RAMA [PBS, pH 250, 7.4 mm NaCl, 150% (v / v ) Igepal, 1% (w / v) sóidiam deoxycholate, 0.5% (w / v) SDS, 0.1 mm EDTA] arna fhorlíonadh sula n-úsáidtear é le SDS suas go 1%, manglam coscairí próitéine do chealla mamacha (a úsáidtear ag 0.6 μl / ml; Sigma-Aldrich), mhanglaim choisc phosphatase I agus II (a úsáidtear ag 5: 1; Sigma-Aldrich), 100 mm PMSF, agus 1% gliocról. Ansin rinneadh na homaiginí a bhruith le haghaidh min 2 agus iad a ghlanadh trí lártheifneoiriú ag 15 × g le haghaidh 15 min. Rinneadh measúnú ar chomhchruinniú próitéine sna maoir a bhí mar thoradh air ag baint úsáide as measúnacht próitéine BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Chun 32P lipéadú ar chealla saothraithe, X24 h tar éis an ionfhabhtaithe / na haistrithe, glanadh cealla dhá nó trí huaire le meán saor ó fhosfáit agus rinneadh iad a ghoradh sa mheán seo le haghaidh ∼1 h. Tar éis na tréimhse gortaithe seo, 0.2 – 0.3 mCi de 32PH3PO4 (PerkinElmer) a cuireadh le gach tobar, agus lipéadaíodh na cealla le haghaidh 4-12 h ag brath ar an gcineál turgnamh (féach Figs. 1 – 7 le haghaidh sonraíochtaí). Ansin, glanadh na cealla trí huaire le PBS agus cuireadh ar oighear iad le haghaidh 15 min le 50 μl de mhaolán RIPA a fhorlíonadh. Bailíodh Lysates trí scríobadh agus ritheadh iad in amanna 10 trí shnáthaid 25 ga DNA lomadh, bruite le haghaidh 10 min, agus lártheifneofar ag 15,000 rpm le haghaidh 15-30 min ag 4 ° C. Aistríodh na líonta (glantóirí) glanta chuig feadán nua agus rinneadh measúnacht próitéine BCA (Pierce). Taispeánann na figiúirí uile de na turgnaimh seo méideanna comhchosúla próitéiní cineál fiáin (WT) agus S27A BFosB chun comparáidí a dhéanamh ar a gcuid leibhéil fosfaireata coibhneasta.
Cóireálacha ceimiceán agus cultúr ceall.
Díscaoileadh aigéad Okadaic (OA; Sigma-Aldrich) in eatánól agus úsáideadh é ag tiúchan deiridh 100 ng / ml. Díscaoileadh 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) i sulfoxide démheitil (DMSO; Sigma-Aldrich) agus baineadh úsáid as i gcultúr na gceall ag tiúchan deiridh 50 μm. Díscaoileadh spermine (Sigma-Aldrich) in uisce agus úsáideadh é ag tiúchan deiridh 200 μm. Díscaoileadh Calphostin-C (Biomol) i DMSO agus úsáideadh é ag 0.2 asm, ach díscaoileadh phorbol 12-myristate 13-aicéatáit (PMA; Promega, Madison, WI) i DMSO agus baineadh úsáid as ag 0.1 μm. peptide coisctheach a bhaineann le myristoylated-autocamtide-2 (m-AIP; Biomol) a thuaslagadh in uisce agus a úsáideadh ag tiúchan deiridh 1 agus 10 μm. Díscaoileadh na coscairí kinase próitéine leathan-speictrim H-7 agus H-8 (Biomol) in uisce agus úsáideadh iad ag tiúchan deiridh 150 agus 200 μm, faoi seach. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) agus epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) a dhíscaoileadh araon i DMSO agus a úsáid ag tiúchan deiridh de 12.5 agus 7.5 ,m, faoi seach. I ngach turgnamh, cuireadh DMSO (feithicil) le cealla de réir mar ba ghá chun méid leanúnach DMSO a choinneáil thar chóireálacha. Do 32P turgnaimh lipéadaithe, cuireadh na drugaí díreach roimh an lipéad agus coinníodh iad don chuid eile den tréimhse lipéadaithe. Maidir le turgnaimh chase Pulse, cuireadh drugaí ag an am “ocras,” a coinníodh tríd an tréimhse lipéadaithe, agus ansin cuireadh ar ais iad isteach i meán an chase. Rinneadh na coscairí próitéineacha a spíceadh gach 3-4 h ar fud an tseilg chun cúiteamh a dhéanamh ar láimhdeachas tapa na peiptídí seo.
IpitationFo-imdhíonadh FBB, imdhíondhíonadh, agus uathriagrafaíocht.
Le haghaidh imdhíonachta, caolaíodh líontáin 1: 5 le gnáth-RIPA chun an tiúchan SDS a thabhairt síos go 0.1% roimh dhul ar aghaidh le himdhíonadh (IP). Chun an nonspecific ceangailteach a theorannú, rinneadh na líonta a ghlanadh den chéad uair trí imdhíonadh le IGG nonimmune agus próitéin G-Sepharose (Sigma-Aldrich) ar feadh 4 h ar a laghad. Rinneadh imdhíonadh ar BFosB as na líonta glanta ag baint úsáide as antashubstaint gabhar polyclonal a aithníonn epitope inmheánach i FosB agus ΔFosB (SC-48G; Biteicneolaíocht Santa Cruz, Santa Cruz, CA) ag 0.5-1 μg IgG in aghaidh an 10 μg de phróitéin lysate (50 – 300 μg de phróitéin iomlán) i méid iomlán 0.5 ml. Bhí IPs measctha go réidh ag 4 C ar rótar le haghaidh 8 h ar a laghad agus ansin cuireadh 15 μl próitéine G-Sepharose leis agus bhí IPs measctha le haghaidh 4 h eile ar a laghad. Rinneadh na IPanna a mhilleadh trí shníomh ag 3000 × g le haghaidh 3-5 min ag 4 C, nite trí huaire le 0.5 ml de fuar plain RIPA agus dhá uair le fuar PBS ina bhfuil 0.1% Tween 20. Ina dhiaidh sin athchóiríodh IPanna i 0.5 ml de PBS fuar, a aistríodh, a scagadh i bhfeadán nua, agus ansin scriosadh na próitéiní imdhíonachta trí 15-25 μl 2 × a laghdaigh maolán sampla próitéine Laemmli. Mar thoradh ar an bprótacal IP seo bhí deascadh sonrach agus éifeachtach beagnach gach ceann den ΔFosB sa lysate. Cuireadh na próitéiní imdhíonghlanta faoi réir SDS-PAGE tríd an IP iomlán a luchtú ar ghreilleán Critéir 12.5 Tris-HCl (Bith-Rad, Earcail, CA), agus ansin aistríodh go PVDF nó nitrocellulose iad. Tar éis an aistrithe, bhí an scannán triomaithe san aer agus 32P- agus 35Chonacthas uathriagrafaíocht bandaí próitéine S-radiolaibithe ag baint úsáide as scannán uathrialaitheach Kodak (Rochester, NY), chomh maith le fosfathúchán ag baint úsáide as Storm (Bitheolaíochtaí Amersham, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Braitheadh iomlán (neamhphosfalaithe agus fosfaictrithe) BFosB i liosáití cille nó homaiginí inchinne trí phróitéin imdhíonachta a imdhíonadh (ag baint úsáide as an scannán céanna a úsáideadh chun na 32Próitéin P-lipéadaithe), nó méideanna comhionanna próitéine lysate / homogenate atá faoi réir SDS-PAGE agus a aistríodh ar PVDF nó nitrocellulose. Cuireadh bac ar an scannán den chéad uair trí ghiúdach le bainne tirim 1 (w / v) nonfat (Bith-Rad) i PBS agus 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) leis le haghaidh 1 h ag 25 ° C. Rinneadh an membrane a imdhíonadh ansin thar oíche ag 4 ° C lenár n-antasubstaint polyclonal frith-FosB féin a ghintear i gcoinne aimínaigéid 1 – 16 de FosB / ΔFosB (a úsáidtear ag 1: 10,000). Tar éis an ghoir phríomhúil, rinneadh na seicní a ní ceithre huaire le haghaidh 5 min le maolán blocála, agus ansin iad a ghoradh ag 25 ° C le haghaidh ∼1 h le gabhar frith-choinín IgG comhcheangailte le sárocsaíd chapaill capaill (a úsáidtear ag 1: 5000 i mblocán blocála, ó Veicteoir Saotharlanna, Burlingame, CA). Ansin glanadh seicní trí huaire le haghaidh 10 min le maolán blocála agus am amháin le haghaidh 5 min le PBS. Rinneadh na bannaí próitéin TotalFosB iomlána a shamhlú ar scannán Kodak MR trí cheimimíneacht feabhsaithe (Pierce) agus / nó trí fhluaraiseacht a bhrath ag úsáid imoibrithe ECL-Plus (Amersham Biosciences) agus an Storm PhosphorImager.
Ró-phlúchadh agus íonú BFosB athfhillteach ó chealla feithidí.
Rinneadh róshamhlú ar BFosB i gcealla feithidí Sf9 mar phróitéin N-hexa-a-chlib N (a bhfuil N-a (6) BFosB) ag baint úsáide as córas na baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) agus ag leanúint treoracha an mhonaróra. Go hachomair, an ΔFosB cDNA (iarmhair 2 – 237) a raibh an chlib N-críochfoirt os a gcomhair roimhe seo, cuireadh MGHHHHHHAG isteach i veicteoir pFASTBacTM1, a úsáideadh chun bacuvíreas ath-athchuinge a ghiniúint. Ionfhabhtaíodh na cealla sf9 le víreas athchuingreach, agus bhí N-His (6) ifiedFosB íonaithe ó chillíní ag roinnt céimeanna crómatagrafaíochta lena n-áirítear crómatagrafaíocht cleamhnais ag baint úsáide as colún nicil (Qiagen, Valencia, CA), malartú anion ag úsáid mono-Q column (Amersham Bitheolaíochtaí), agus eisiamh méide ag baint úsáide as colún gló-scagacháin (Amersham Biosciences).
In vitro staidéir phosphorylation.
In vitro Rinneadh frithghníomhartha fosfaictrithe le haghaidh anailíse ar chúrsa ama agus stoichiometry i dtoirt 30 μl ina bhfuil foshraith 10 μm (N-a (6) osFosB nó substráit rialaithe dearfach), 250 μm ATP, agus 1 iCi / μl [γ-32P] ATP, an maolán a sholáthraíonn an monaróir kinase, agus ceann de na kinases seo a leanas: CK2 (20 / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 / / ;l; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) nó p70S6K (2.5 mU / ;l; Upstate). Rinneadh frithghníomhartha cúrsa ama trí dheireadh a chur le halbóim 5 solutionl ón tuaslagán imoibriúcháin ag na pointí ama ainmnithe agus toirt cothrom le 4 × ag laghdú maolán sampla próitéine Laemmli. Socraíodh paraiméadair chinéiteacha Michaelis-Menten don imoibriú CK2 faoi dhálaí líneacha seasta líneacha sainmhínithe. Rinneadh na frithghníomhartha seo le haghaidh 15 min i méid 10 μl ina bhfuil einsím 2 / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, agus N-a (6) tiúchan BFosB ó 2.5-30 μm. Rinneadh gach frithghníomh in 30 ° C i ndabhach uisce. Tar éis SDS-PAGE agus smálú na glóthaí le Bith-Sábháilte Coomassie (Bith-Rad), triomaíodh an fhoirmiú, agus 32Rinneadh measúnú ar ionchorprú P-fosfáit trí anailís fosfathúcháin (féach thíos, cainníochtú sonraí, ríomhanna agus staitisticí).
Léarscáil phosphopeptide déthoiseach agus anailís ar aigéad phosphoamino.
Rinneadh an dá anailís seo de réir mar a thuairiscigh Ploegh agus Dunn (2000). Go hachomair, tá blúirí glóthaí tirim iontu 32P-lipéadaithe BFosB (as in vitro imoibrithe nó ó imdhíon-fhrith-fhrithghníomhartha cealla a bhfuil lipéad meitibileach orthu, a sceitheadh, a athhiodráitíodh, a nite, agus a bhí faoi réir díleá tryptic. Rinneadh an t-ollmhódóir ina raibh na táirgí díleá tryptic a lyophilized agus nite an lyophilate arís agus arís eile agus athchóiríodh é i 10 μl de mhaolán leictreafóiréis, pH 1.9. Chonacthas sampla (3 μl) ar phláta crómatagrafaíochta tanaí ciseal ceallalóis (TLC) (Analtech, Newark, DE) agus scartha é i dtoise amháin trí leictreafóiréis agus an ghné eile trí TLC ardaitheach. Rinneadh na léarscáileanna phosphopeptide a tháinig as sin a shamhlú le autoradiography agus le fosfathú. Maidir le hanailís ar aigéad phosphoamino, rinneadh hidrealú HCl ag 2 ° C le haghaidh 105 m HCl faoi N2 atmaisféar. Stopadh an t-imoibriú le caolú sé huaire in uisce, agus cuireadh an meascán i liophilized. Cuireadh an lyophilate i bhfeidhm arís i 5 μl de mhaolán leictreafóiréis, pH 1.9, agus breathnaíodh é ar phláta TLC ceallalóis chomh maith le caighdeáin phospho-Ser, -Thr, agus -Tr. Rinneadh leictreafóiréis os cionn leath fhad an phláta TLC ag baint úsáide as maolán leictreafóiréis, pH 1.9, agus ansin aistríodh an pláta isteach sa mhaolán pH 3.5, agus cuireadh leictreafóiréis i gcrích. Rinneadh na caighdeáin aigéid phosphoamino a léirshamhlú trí thuaslagán ninhydrin 1 (v / v) i aicéatón a spraeáil leis an bpláta TLC. 32Rinneadh samplaí aimínaigéid P-lipéadaithe a shamhlú le autoradiography agus le fosfathú araon.
cK2α siocair-spreagtha.
D'úsáideamar modh cur isteach RNA chun leibhéil CK2 a laghdú go roghnach (Di Maira et al., 2005). Rinneadh cillíní PC12 a phlandáil ar phlátaí sé-chumhdacha a bhí brataithe le I-I chun comhchuibheas% ∼70-80 a bhaint amach an lá dár gcionn, nuair a aistríodh iad go neamhbhuan le 20 nm (tiúchan deiridh) de siRNA nontargeting nó siRNA dírithe i dtreo mRNA an chatalaíoch α fotheideal Rat CK2, ag baint úsáide as 5 μl den ghníomhaire aistrithe SilentFectin (Bith-Rad) agus ag leanúint treoracha an déantóra. Thart ar 24 h ina dhiaidh sin, aistríodh cealla go neamhbhuan le ΔFosB plasmid, mar a luadh thuas. Thart ar 24 h ina dhiaidh sin (∼48 h tar éis aistriú siRNA), rinneadh cealla 32P lipéadú meitibileach nó anailís ar chase Pulse mar a thuairiscítear thuas. Baineadh úsáid as na ceithre cinn seo a leanas de na siRNAs CK2α le torthaí cosúla: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3 ′, 5′P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ′, 5′P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 ′ (Dharmacon, Lafayette, CO). Mar rialú diúltach, d'úsáid muid Silencer rialú diúltach #3 siRNA ó Ambion (Austin, TX). Rinneadh faireachán ar mhéid CK2 le cnagadh trí imdhíonadh ag baint úsáide as antasubstaint polyclonal frith-CK2 (catalóg # 06-873 ó Upstate) thar oíche ag caolú 1: 1000. Baineadh úsáid as β-Tubulin mar rialú lódála agus aimsíodh é le antashubstaint monachlólach (catalóg # 05-661 ó Upstate) thar oíche ag caolú 1: 20,000.
Mutagenesis atá dírithe ar an suíomh.
Baineadh amach Idirbheart Ser27 go Ala nó asp ag baint úsáide as trealamh Só-mhaisithe Atheagraithe Thapa ar an Suíomh (Stratagene, La Jolla, CA) agus lean treoracha an déantóra. Chun na sócháin Ser27 a thabhairt isteach sa luch proteinFosB protein, baineadh úsáid as na primers seo a leanas. Ser27 le Ala: (príomhphréascóir) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 go dtí asp (réamhphraghasir) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Tá na bunáiteanna murtáilte i gcló trom, agus tá an codón Ser27 i gcló iodálach.
Bithfhaisnéisíocht.
Chuathas i mbun suíomhanna féideartha fosfathúcháin agus kinases le haghaidh BFosB a chuardach trí sheicheamh próitéine luch a chur isteach chuig bunachair shonraí speisialaithe lena n-áirítear ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), agus NetPhosK (Blom et al., 2004).
Cainníochtú sonraí, ríomhanna agus staitisticí.
Rinneadh an méid próitéine a bhí i láthair sa scannán PVDF nó i nitrocellulose a chainníochtú ag baint úsáide as Storm PhosphorImager agus as na bogearraí ImageQuant a bhí ag gabháil leis (Eolaíochtaí Amersham / Dinimic Mhóilíneach). I gcultúr na gcillíní agus staidéir phosphorylation slice inchinne, na luachanna a fhaightear don 32Ansin, roinneadh próitéin P-lipéadaithe ar na luachanna a fuarthas le haghaidh BFosB iomlán, agus cuireadh in iúl iad mar chóimheas. Sa in vitro staidéir phosphorylation, an méid 32Ríomhtar lipéadú P BFB in aghaidh an mhóilín ΔFosB (stoichiometry) mar a thuairiscítear roimhe seo é (Sahin et al., 2004). Tógadh na tomhais go léir laistigh de raon líneach na hionstraime a úsáideadh. Ríomhadh paraiméadair chinéiteacha trí úsáid a bhaint as samhail Michaelis-Menten, trína ndearnadh V = VMax[S] / ([S]+KM) Agus VMax = k2[EIomlán]. An leathré (t1/2) de ΔFosB agus FosB a measadh ó na ceapacha bíog-chase (ag baint úsáide as an aischéimniú neamhlíneach a d'fheidhmigh na pointí sonraí ab fhearr) agus a fhreagraíonn don am a bhfuil an próitéin atá fágtha 50% den bhunleagan. I ngach figiúr, tá na torthaí a thaispeántar ionadaíoch ar dhá nó trí thurgnamh neamhspleácha ar a laghad. I ngach graf, is meáin iad na sonraí a thaispeántar ± SEManna (3 n ≤16). Rinneadh measúnú ar thábhacht staitistiúil na ndifríochtaí trí úsáid a bhaint as neamhdhearadh t tástáil, ceartaithe le haghaidh ilchomparáidí, agus léiríonn na réiltíní p ≤ 0.05.
An Roinn Roimhe SeoAn Roinn Ar Aghaidh
Torthaí
Is fachtóir trascríobh neamhghnách cobhsaí é BFosB
Cé go bhfuil tuairimíocht déanta againn roimhe seo gur fachtóir trascríobh réasúnta seasmhach é BFosB (Nestler et al., 2001), níor comhlíonadh anailís dhíreach ar phróifíl láimhdeachais an phróitéin go dtí seo. Chun aghaidh a thabhairt ar an gceist seo, rinneamar turgnaimh chase-chase ag baint úsáide as cealla PC12, a úsáideadh go forleathan mar chilllíne cosúil le néaróin, inar cuireadh BFosB in iúl go neamhbhuan le hionfhabhtú le víreas athchúrsála deir deir (HSV-ΔFosB). Rinneadh lipéadú meitibileach ar phróitéiní nua-shintéalaithe 35S-Met / Cys, agus an patrún díghrádaithe de 35BFosB (lipéadaithe le lipéad S)35Rinneadh monatóireacht ar S-ΔFosB) trí í a imdhíonadh ó líocha cille a fuarthas ag amphointí éagsúla tar éis na haigéid aimín-radalaithe a bhaint. Léirigh anailís ar na himdhíonta ag SDS-PAGE agus autoradiography go bhfuil leathré ofFosB i gcealla PC12 ∼10 h (Fig. 1). Taispeánann na torthaí seo go bhfuil leathré ΔFosB níos airde ná an chuid is mó de na fachtóirí trascríofa (féach Plé), lena n-áirítear FosBaimseartha, ar tuairiscíodh go bhfuil a leathré i gcultúr na gceall min90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Chomh maith leis sin, is fiú a thabhairt faoi deara nach n-oireann díghrádú ΔFosB do chuar lobhadh easpónantúil den chéad chéim, ach go bhfuil sé biphasach, ag tosú le ráta díghrádaithe níos moille. Tugann sé seo le tuiscint go bhfuil níos mó ná speiceas amháin BFosB ann agus / nó níos mó ná cosán díghrádaithe amháin.
Féach leagan níos mó:
Figiúr 1.
Is fachtóir trascríobh neamhghnách cobhsaí é BFosB. Tá leathré ofFosB ∼10 h i gcultúr na gcillíní. Cuireadh ΔFosB in iúl i gcealla PC12 trí ionfhabhtú le HSV-ΔFosB nó le haistriú neamhbhuan le plasmid ina bhfuil BFosB-ann, agus cuireadh turgnaimh chuisle faoi réir cealla in Ábhair agus Modhanna. Fuarthas torthaí coibhéiseacha beag beann ar an modh a úsáideadh chun róshaothrú a dhéanamh ar BFosB. Taispeánann an figiúr an t-amchlár (agus an t-uiríoll ionadaíoch) a bhaineann le díghrádú BFosB. Is iad na sonraí a bhreacadh ná meán ± SEM de phointí sonraí aonair ar a laghad a fhaightear ó chúig thurgnamh neamhspleácha ar a laghad. Ar mhaithe le comparáid a dhéanamh, léirítear an leathré tuairiscithe a bhaineann le FBM iomlán.
Is fosfaphrotein é brainFosB san inchinn
Táimid tar éis hipitéisiú a dhéanamh go bhféadfadh modhnú iar-aistritheach BFosB cur lena chobhsaíocht dealraitheach. Toisc go bhfuil sé léirithe go bhfuil modhnú na bhfachtóirí trascríobh modhnaithe i mórán bealaí ar mhodh fosfaictrithe, lena n-áirítear a gcobhsaíocht (le haghaidh athbhreithnithe, féach Desterro et al., 2000; Whitmarsh agus Davis, 2000, rinneamar imscrúdú ar cé acu is fosfaphrotein é BFosB. Chuige seo, bhí ΔFosB léiriú spreagtha in inchinn francach ag baint úsáide as ECS ainsealach, cóireáil ar eol di leibhéil arda ΔFosB a spreagadh, go háirithe i gcorta tosaigh (Hope et al., 1994a). Lá amháin i ndiaidh na cóireála ECS deireanach, nuair a fhanann leibhéil BFosB ard, ullmhaíodh slisní tanaí cortical tosaigh agus lipéadaítear iad go meitibileach le 32P-orthophosphate. Níor cuireadh sraith slisní le chéile go raidiuil, agus baineadh úsáid astu chun leibhéil BFosB iomlána a bhrath. Tar éis imdhíonadh le hantasubstaint shonrach frith-FosB / ΔFosB agus scaradh na bpróitéiní imdhíonachta ag SDS-PAGE, fosfaictrithe 32Braitheadh autosdiography ar lipéadú P BFosB, agus aimsíodh BFosB san iomlán trí imdhíonadh. Léirigh an anailís seo go bhfuil BFosB phosphorylated in inchinn, mar is léir ó shonra 32Tá banda P-lipéadaithe ∼35 kDa i láthair sna samplaí inchinne cóireáilte go hainsealach, ach tá sé beagnach neamh-inbhraite sna rialuithe scamchóireáilte (Fig. 2A). Tá sé seo i gcomhréir leis an bhfíric, in éagmais spreagadh ainsealach, go bhfuil leibhéil bhunúsacha ΔFosB an-íseal. Léirítear sainiúlacht an imoibrithe imdhíonachta ag an easpa comhartha sa deascán nonimmune IgG.
Féach leagan níos mó:
Figiúr 2.
Is fosfaphrotein é brainFosB san inchinn. A, PhFosfóirítear BFosB san inchinn. Tharla ΔFosB inchríochnaitheach in inchinn francach trí chóireáil ainsealach ECS mar a thuairiscítear in Ábhair agus Modhanna. Rinneadh lipéadú meitibileach ar na slisní cortical tosaigh 32PH3PO4 ar feadh roinnt uaireanta an chloig. Tar éis na slisní a homaiginiú, rinneadh ΔFosB a imdhíonadh, agus fosfar é ΔFosB (32D'aithin autoradiography (barrphainéal) P-ΔFosB). Braitheadh iomlán ΔFosB in imdhíon-imdhíonta neamh-fhrithghníomhacha trí imdhíonadh (painéal bun). Mar rialuithe diúltacha, taispeántar imdhíon-fhritháireamh ainmhí sham-cóireáilte agus IGG nonimmune. B, Fuarthas trí shuíomhanna bithfhformáideacha suíomhanna fosfaictrithe agus kinases iarrthóirí le scóir réamhaisnéise comhfhreagracha don ord proteinFosB próitéin mouse. Leagtar béim ar na suíomhanna is iarrthóirí leis na scóir réamh-mheasta níos airde sa seicheamh próitéine agus liostáiltear sa tábla iad. Tá an fearann ceangailteach DNA (bunúsach) agus zipper leucine i gcló trom san ord próitéine. C, D, Méadaítear ΔFosB phosphorylation ag OA an tsealbhóra / an coscaire flosphatase OA. C, 32Braitheadh uathriagrafaíocht leibhéil P-ΔFosB in imdhíon-fhrith-fhrithchuimiltí ó slisní cortical tosaigh atá lipéadaithe in éagmais (Ctr) nó láithreacht 100 ng / ml OA (graf agus barrphainéal). Taispeánann an painéal íochtarach go bhfuil ΔFosB iomlán a bhraitear in imdhíon-fhrith-fhrithghníomhartha ó slisní gan lipéad trí imdhíonadh. D, Bhí cealla PC12 ionfhabhtaithe le HSV-ΔFosB nó HSV-LacZ (veicteoir) agus lipéadaithe go meitibileach le 32PH3PO4 in éagmais (Ctr) nó láithreacht 100 ng / ml OA. 32Braitheadh autoradiography (graf, barrphainéal) leibhéil P-ΔFosB in imdhíon-imdhíonadh. Taispeánann an painéal bun an totalFosB iomlán a bhraitear sa chill trí líontáin imdhíonachta.
Mar chéad chéim i dtreo a shoiléiriú cé acu kinase (í) agus an láithreán / na láithreáin atá bainteach le ΔFosB phosphorylation, chuireamar a sheicheamh aimínaigéid faoi réir roinnt anailísí bithfhaisnéise. Léirigh sé seo, cé nach bhfuil aon suíomhanna iarrthóra de chuid phosphorylation i dTír B in BFosB, go bhfuil go leor suíomhanna comhthoilithe Ser / Thr kinase ann, lena n-áirítear trí shuíomh CaMKII, trí shuíomh CK2, agus dhá shuíomh PKC a bhfuil scóir réamh-mheasta fosfaile an-ard acu (Fig. 2B). Más rud é, mar atá tuartha trí bhithfhaisnéisíocht, nach ndéantar ach ΔFosB a phosphorylated ach amháin ar iarmhair Ser nó Thr, ansin ba chóir go mbeadh modhnú fosfaictheachta go mór ag gníomhaíocht Phosphatases Ser / Thr. Chun an hipitéis seo a thástáil, rinneamar lipéid ar slisní cortical tosaigh 32P-orthophosphate i láthair nó neamh-OA, inhibitor phosphatase próitéin Ser / Thr. Mar a thaispeántar i Figiúr 2C, Ba chúis le OA méadú mór (∼2.5-huaire) isteach 32P-ΔFosB. D'eascair méadú beag freisin ar leibhéil BFosB iomlána, atá comhsheasmhach le tuairiscí roimhe seo a nascann éifeachtaí carcanaigineacha OA lena chumas chun roinnt géinte luatha láithreacha a spreagadh, lena n-áirítear próitéiní Fos (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Is é an toradh glan ná méadú suntasach foriomlán (∼60%) i leibhéil BFosbón fosfalaithe.
Rinneamar imscrúdú ansin ar cé acu, i gcillíní PC12, atá níos éasca le cúbláil thurgnamhach, thaispeáin BFosB patrún fosfaireachais cosúil leis an gceann a fheictear san inchinn. Chuireamar BFosB in iúl i gcealla PC12 trí ionfhabhtú le HSV-osFosB agus na cealla a bhfuil lipéad meitibileach orthu. 32P-orthophosphate i láthair nó gan OA a bheith ann. Taispeántar léiriú rathúil agus imdhíonadh na próitéine ó chealla HSV-ΔFosB-ionfhabhtaithe sa láithreacht araon sa imdhíonghlacadh (Fig. 2D, painéal bun) agus an autoradiograph (painéal barr) de bhanda ∼35 kDa, as láthair sna cealla atá ionfhabhtaithe le veicteoir. Mar a breathnaíodh san inchinn, ba é an toradh a bhí ar OA ná méadú beag ar leibhéil ΔFosB san iomlán ach méadú i bhfad níos airde (thart ar dhá cheann) i 32P-ΔFosB, as a leanann méadú mór (∼50%) i phFosB phosphorylation. Ina theannta sin, i gcomhréir leis na tuar bithfhaisnéise, níor tháinig athruithe suntasacha ar chóireáil cealla PC12 le cosantóir Phosphatase Tyr 32Leibhéil P-ΔFosB (ní thaispeántar na sonraí). Le chéile, léirigh na torthaí seo go bhfuil BFosB phosphorylated ar iarmhair Ser agus / nó Thr san inchinn agus i gcealla PC12 agus dheimhnigh siad gur córas cultúir cille maith é chun staidéar a dhéanamh ar phróifílí fosfathúcháin agus díghrádaithe ΔFosB.
CK2 ach ní PKC ná CaMKII phosphorylates BFosB in vitro
Mar a luadh thuas, léirigh anailís ar ord acidFosB aimínaigéad scóir tuar arda do shuímh phosphorylation CK2, PKC, agus CaMKII. Chun a fháil amach cé acu de na kinases seo a fhéadann fosú a dhéanamh ar BFosB, rinneamar sraith de in vitro imoibrithe phosphorylation ag baint úsáide as kinases íonaithe agus ath-iompaithe íonaithe ΔFosB. Mar a thaispeántar i Figiúr 3A, as na trí kinases iarrthóra, níl ach CK2 phosphorylated BFosB ar bhealach suntasach. Ina theannta sin, tástáladh roinnt kinases eile (m.sh., GSK3 agus p70S6K) ach theip orthu fosfathú go mór BFosB (níor taispeánadh na sonraí). Léirigh tréithriú breise ar an imoibriú CK2 trí anailís ar chúrsa ama gur féidir leis an kinase seo ionchorprú ∼0.5 mol fosfáite in aghaidh an mhóilín ΔFosB a chatalúFig. 3B). Ós rud é gur féidir le CK2 fosfar a dhéanamh BFosB in vitro go bhfuil an-chuid stoichiometry (∼50%) le tuiscint go bhfuil imoibriú ábhartha ó thaobh fiseolaíochta de. Rinneamar staidéar ansin ar chinéitic an imoibrithe seo trí CK2 a ghoradh i láthair méideanna méadaithe ΔFosB íonaithe, agus shocraíomar go ndéanann CK2 fosforylates BFosB le Vmax de 5.8 pmol min-1 · .G-1 einsím, a KM de 18.4 μm, agus a kconas de 0.2 / s (Fig. 3C). Tacaíonn na luachanna a fhaightear le haghaidh na bparaiméadar cinéiteach seo le hábharthacht fiseolaíoch an imoibrithe seo. Mar shampla, KM de CK2 do DARPP32, ceann de na foshraitheanna is fearr aithne air, ná 3.4 μm, agus is é kconas ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); an KM do raonta ATP ó ∼10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), agus i gcás raonta cáiséine ó ∼10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Le chéile, léiríonn na sonraí seo go bhfuil rateFosB ina fhoshraith bona fide do CK2 in vitro.
Féach leagan níos mó:
Figiúr 3.
CK2 ach ní PKC ná CaMKII phosphorylates BFosB in vitro. Taispeánann an autoradiograph (barrphainéal) an táirge phosphorylated, agus taispeánann an ghlóthach dhaite Coomassie (an painéal bun) iomlán an FBB atá i láthair san imoibriú. A, Athchúrsáil íonaithe ΔCuireadh an Bord faoi réir in vitro fosfathú ag kinases iarrthóra éagsúla (taispeántar trí cinn díobh). B, Léiríonn anailís amchláir agus stoichiometric gur féidir le CK2 fosfar a dhéanamh lateFosB in vitro le stoichiometry de ∼50%. C, Léirigh anailís chinéiteach ar an imoibriú CK2 go bhfuil BFosB ina bona fide in vitro tsubstráit. Taispeántar líneáil an imoibrithe i bplota cómhalartach dúbailte (bun), ach díorthaíodh na paraiméadair chinéiteacha ó chuar Michaelis-Menten (barr).
Déanann CK2 modhnú ar fhosfathúchán agus ar chobhsaíocht BFosB i gcealla slán
Chun measúnú a dhéanamh ar ábharthacht fiseolaíoch fosfathúchán CK2-tedFosB, rinneamar mapáil phosphopeptide comparáideach ag úsáid in vitro phosphorylated agus PC12-cell-phosphorylated BFosB. Tar éis SDS-PAGE agus elution fhoirmiú 32P-ΔFosB (ón in vitro imoibrithe nó as an imdhíon-fhrithghníomh 32Cealla lipéadaithe P), díleádh an próitéin le trypsin, agus cuireadh scaradh déthoiseach ar na fosfaphíopídí a bhí mar thoradh air. Léirigh an anailís seo gur imigh an phríomh phosphopeptide ón imoibriú CK2 le ceann amháin de dhá fhosfaphíteasdáit mhóra ó ΔFosB phosphorylated i gcealla PC12 (Fig. 4A), cé nach raibh an t-imoibriúcháin a bhí mar thoradh ar an PKC nó CaMKII (na sonraí a thaispeántar). Bhí an dara phosFosf phosphopeptide i láthair sa léarscáil ó chealla PC12, ach mar gheall ar an neamhábaltacht a bhí ag aon cheann de na kinases a thástálamar chun phosphopeptide den chineál céanna a ghiniúint in vitro, níl a fhios againn faoi láthair an bhfuil suíomh fosfaireachais ag an dara fosfóipíd seo atá difriúil ón bhfosfaphítimíd eile nó an ionann é agus peiptíd tryptic ar leith ina bhfuil an suíomh fosfaireachais céanna.
Féach leagan níos mó:
Figiúr 4.
Déanann CK2 modhnú ar fhosfathúchán agus ar chobhsaíocht BFosB i gcealla slán. A, CK2 ach níl PKC cosúil le fosfáitiú BFosB i gcealla. Léarscáileanna phosphopeptide déthoiseacha de ΔFosB a fosfar le CK2 nó PKC in vitro nó trí chealla slán PC12. Taispeánann na saigheada go bhfuil an peiptíd CK2-phosphorylated ach gan an ceann PKC-phosphorylated a bhfuil ceann de na phFosphopeptides a fhaightear ó chealla PC12. B, Méadaítear ΔFosB phosphorylation i gcealla PC12 trí chóireáil le cealla leis an spermine (SP) gníomhaire CK2 agus laghdaítear é trí chóireáil leis an gcosc CK2 DRB. I gcodarsnacht leis sin, ní raibh tionchar ag cóireáil le gníomhaire PKC (PMA) ná leis an inhibitor PKC-cal (Calph) le cealla PKC i gcealla PC12. Taispeántar autoradiogram ionadaíoch (barrphainéal) agus immunoblot (painéal bun). C – F, Éifeacht ghníomhaíocht CK2 ar ΔFosB cobhsaíocht. Taispeánann na figiúirí an t-amchlár (agus uathrialach ionadaíoch) ationFosB díghrádú. Cealla PC12 á gcur in iúl go neamhbhuan ΔDéantar tástáil ar chase Pulse a chur i gcrích in FB nuair a bhí an coscaire CK2 DRB as láthair nó gan a bheith i láthairC), an spermine gníomhaire CK2 (D), nó an coscaire kinase speictream leathan H-8 (E), a úsáideadh chun éifeachtaí neamhriachtanacha DRB a rialú. F, Éifeacht an fho-aonad catalaíoch de CK2 a leagan síos ar chobhsaíocht BFosB. Aistríodh cealla PC12 le siRNA nontargeting (Ctr) nó siRNA ag díriú ar francach CK2α agus 24 h a aistríodh ina dhiaidh sin le ΔFosB plasmid. Léirítear sa phainéal uachtarach imdhíonanna na gciséal uile-chille a thaispeánann éifeacht an siRNA CK2 ar leibhéil próitéine CK2 agus ΔFosB. Taispeántar an imdhíonach comhfhreagrach do β-tubulin mar rialú lódála.
Chun aghaidh a thabhairt ar ábharthacht fiseolaíoch CK2 mar inFosB kinase, dhéileálamar le ΔFlash-chur in iúl cealla PC12 le dhá dhruga a mhodhnaíonn gníomhaíocht CK2. Mar a thaispeántar i Figiúr 4B, Laghdaíodh ΔFosB phosphorylation trí chóireáil a dhéanamh ar chealla PC12 leis an gcosc-tréscaoilteoir CK2 cille DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), agus a mhéadú trí chóireáil leis an spermine polaimíneach, ar eol gur gníomhaire cumhachtach CK2 é (Cochet agus Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). I gcodarsnacht leis sin, cóireáil cealla PC12 leis an gcosc PKC calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) nó PMA gníomhaire PKC (Schmidt agus Hecker, 1975; Beh et al., 1989) nár tharla athruithe suntasacha ar phFosB phosphorylation. I gcás PMA, tá an méadú beag (agus nach bhfuil suntasach) ann 32D'fhéadfaí cuntas a thabhairt ar P-ΔFosB trí mhéadú ar na leibhéil BFosB iomlána de bharr an druga seo; i ndáiríre, tuairiscíodh go spreagann eistir phorbol léiriú roinnt próitéiní teaghlaigh Fos, lena n-áirítear FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Ina theannta sin, cóireáil na gceall leis an m-AIP inchuardaithe CaMKII ar leith atá tréscaoilteach (Ishida agus Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) níor laghdaíodh an phosphorylation ΔFosB (sonraí nár taispeánadh). Le chéile, tá na torthaí seo ag teacht lenár dtorthaí in vitro torthaí agus a léiriú go bhféadann CK2 breosfailsiú BFosB, ach ní PKC ná CaMKII. Ós rud é nach gcuireann cosc CK2 cosc ar completelyFosB phosphorylation go hiomlán, léiríonn sé go bhfuil láithreáin bhreise phosphorylation sa phróitéin.
Scrúdaíomar an gcéad dul síos an bhfuil ról ag CK2 i láimhdeachas osFosB agus dá bhrí sin ina chobhsaíocht. Chuige seo, rinneamar turgnaimh chase-chase ag úsáid cellsFosb-chur in iúl cealla PC12 cóireáilte leis an gcosc CK2 nó an gníomhaire CK2 a úsáidtear sa staidéar fosfaireachais. Mar a thaispeántar i Figiúr 4C, bhí éifeacht shuntasach ag cóireáil cealla leis an gcosc CK2 ar ráta láimhdeachais BFosB, a léirigh an t-athrú i gcruth a chuar díghrádaithe, ó bhiphasic go cuar atá níos gaire do mheath easpónantúil. Os a choinne sin, ba chúis le láithreacht spermine an ghníomhaire CK2 laghdú suntasach ar ráta díghrádaithe ΔFosB, a raibh carnadh na próitéine ann le linn chéad uair an chase (Fig. 4D).
Mar is amhlaidh le go leor gníomhaithe agus coscairí kinase, is féidir le spermine agus DRB éifeachtaí meitibileacha a bheith acu lasmuigh de mhodhnú ghníomhaíocht CK2. Go deimhin, tá sé léirithe go bhfuil bac ag DRB ar an bhfachtóir trascríobh IIH (TFIIH) - kinase comhcheangailte (Yankulov et al., 1995), a bhfuil de thoradh air go dtoirmisctear trascríobh RNA polaiméaráise II-idirghabhála. Toisc go bhféadfadh an éifeacht seo difear a dhéanamh do chobhsaíocht BFosB, rinneamar anailís ar éifeacht an speictrim leathan kinase inhibitor H-8 (Hidaka agus Kobayashi, 1992) ar láimhdeachas BFosB ag tiúchan (200 μm) ar eol dó bac a chur ar kinase a bhaineann le TFIIH ach nach bhfuil CK2 (Yankulov et al., 1995). Mar a léirítear i Figiúr 4E, níor chuir cóireáil le H-8 isteach ar ráta láimhdeachais ΔFosB. Fuarthas torthaí cosúla le H-7, cosantóir kinase speictrim leathan eile, a úsáideadh ag tiúchan a choisceann kinase a bhaineann le TFIIH ach nach bhfuil CK2 (sonraí gan a bheith léirithe). Tacaíonn na sonraí seo níos mó leis an léirmhíniú gur dócha gur inchurtha le CK2 an laghdú ar chobhsaíocht stabilityFosB de bharr DRB.
Chun ról CK2 i láimhdeachas ΔFosB a bhunú a thuilleadh, rinneamar imscrúdú ar na hiarmhairtí a bhain le CK2 a leagan síos trí siRNA. Rinneamar na turgnaimh seo ag baint úsáide as cealla PC12 a aistríodh ar dtús le rialú (nontargeting) siRNA nó siRNA a dhíríonn ar mRNA an fhoghnó catalaíoch francach CK2 (CK2α) agus 24 h a aistríodh ina dhiaidh sin le ΔFosB. Mar a thaispeántar i Figiúr 4F, aistríodh an t-aistriú leis an siRNA CK2α go héifeachtach agus go sonrach agus leagadh síos leibhéil próitéine CK2α gan difear a dhéanamh do leibhéil osFosB (barrphainéal). Léirigh anailís pulse-chase go raibh méadú suntasach ar ráta láimhdeachais BFosB mar thoradh ar dhíghrádú níos tapúla an phróitéin mar thoradh ar CK2 a leagan síos. Ós rud é go méadaíonn an cosc ar ghníomhaíocht CK2 (trí chóireáil DRB nó siRNA) an láimhdeachas BFosB agus go n-imíonn comhábhar ráta mall an chuar biphasic ar ceal, ach cuireann CK2 gníomhachtú le céim mall an chuar, soláthraíonn sé tacaíocht láidir do an smaoineamh go bhfuil ról ag CK2 maidir le cobhsaíocht BFosB a rialáil.
Déanann CK2 fosforylates ΔFosB ar Ser27
Chun tús a chur leis an suíomh / na suíomhanna ar BFosB a phosphorylated ag CK2 a shainaithint, rinneamar anailís ar aigéad fosfair-aimín ar binFosB phosphorylated ag CK2 in vitro agus ΔFosB phosphorylated i gcealla PC12. Léirigh na turgnaimh seo go raibh phospho-Ser (an t-aon aigéad fosfarach a aimsíodh sa dá chás)Fig. 5A). An toradh seo, mar aon leis an stoichiometry a fuarthas don CK2 in vitro imoibriú phosphorylation (∼50%) (Fig. 3B) agus gan ach láthair shuntasach amháin a bheith i láthair ar léarscáil phosphopeptide CK2 (Fig. 4A), molann sé gur dócha go bhfuil foscorylation KFosB CK2 teoranta d’iarmhargadh amháin. Tá an chonclúid seo ag teacht leis an anailís ar shuíomhanna comhdhearcaidh maidir le fosfaireachas (Fig. 2B), nár thuar ach d’iarratasóir amháin, ie, Ser27, do CK2. Léirigh anailís thacsanomaíoch go bhfuil Ser27 caomhnaithe go mór trí éabhlóid i measc baill den teaghlach altrama (Fig. 5B), ag moladh go bhféadfadh feidhm fhiseolaíoch thábhachtach a bheith aici.
Féach leagan níos mó:
Figiúr 5.
CK2 Phosphorylates ΔFosB ar Ser27. A, Anailís ar aigéad Phosphoamino de CK2-phosphorylated (in vitro) agus PC12 cille-phosphorylated ΔFosB a thaispeánann, sa dá chás, go bhfuil an t-iarmhar mór a fhostaíodh fosfaireataithe mar sheánra. B, Léirigh anailís tras-speiceas ar sheicheamh aimínaigéid FosB / ΔFosB caomhnú ard Ser27 i measc baill teaghlaigh Fos ó dhaoine go zebrafish (buaicphointe dorcha). Mar sin féin, ní chaomhnaítear an t-iarmhar aigéadach ag suíomh + 3, atá ag teastáil don suíomh comhdhearcaidh CK2 (buaicphointe solais). C, Aistríodh cealla HeLa go díomuan le typeFos (WT) nó ΔFosB den chineál fiáin ina raibh claochlú pointe chun Ser27 a chur in ionad Ala (S27A). Rinneadh lipéadú meitibileach ar chealla 32PH3PO4 agus a chóireáil le feithicil nó le spermine (SP) chun CK2 a ghníomhachtú. Taispeántar autoradiogram ionadaíoch (barrphainéal) agus immunoblot (painéal bun) den ΔFosB-imdhíontaí B a fhaightear. Taispeántar imdhíonadh na gceall bréige-aistrithe (veicteoir).
Chun a fháil amach an bhfuil phosxory an phosphorylated Ser27 i ΔFosB, rinneamar an t-iarmhar seo a mhalartú le Ala, agus rinneamar anailís ar na hiarmhairtí ar stádas fosfaireachais an phróitéin. Chuige sin, d'úsáid muid cealla HeLa (ar féidir iad a aistriú le héifeachtúlacht níos airde) chun mutant WT nó S27A ΔFosB a chur in iúl go neamhbhuan. Thart ar 24 h tar éis an aistrithe, rinneadh lipéadú meitibileach ar na cealla 32Ullmhaíodh p-orthophosphate, agus líonta uile-chille. Tar éis imdhíonachta agus SDS-PAGE, 32Baineadh amach P-ΔFosB ag autoradiography agus ΔFosB iomlán trí imdhíonadh. Mar a thaispeántar i Figiúr 5C (painéal bun), níor braitheadh ΔFosB sna cealla a aistríodh le veicteoirí, cé gur éirigh le cealla a aistríodh le WT nó S27A mutant ΔFosB an próitéin a léiriú. Fuaireamar amach gur tháinig laghdú suntasach (∼27%) ar shóchán S30A 32Leibhéil P-ΔFosB (Fig. 5C, barrphainéal agus graf), ag léiriú go bhfuil ΔFosB phosphorylated i Ser27 i gcealla beo. In iarracht a dhéanamh amach an bhfuil CX27 fosfaicthe go deimhin i Ser2, rinneamar comparáid idir cumas spermine an ghníomhaire CK2 chun fosfaríocht WT agus S27A ΔFosB a mhodhnú. Mar a chonaiceamar roimhe seo i gcealla PC12 (Fig. 4B), cóireáil HeLa cealla a bhfuil méadú mór tagtha ar an bhfosféarú próitéin WT. Ós rud é gur laghdaigh an sóchán S27A an éifeacht seo go mór (Fig. 5C) a thacaíonn leis an léirmhíniú gur foshraith fhiseolaíoch é CX27 i SerBNXX in BFosB.
Rialaíonn fosfluachadh Ser27 cobhsaíocht BFosB
Tar éis a dheimhniú go laghdaítear cobhsaíocht BFosB nuair a chuirtear cosc agus feabhsú ar CK2 nuair a chuirtear CK2 i ngníomh (Fig. 4(b), agus go ndéanann CK2 fosforylates BFosB ar Ser27 (Fig. 5), bhíomar ag dúil go ndéanfadh cosc an fhosfair ar an láithreán seo an próitéin a dhíchobhsú. Léirigh turgnaimh Pulse-chase a rinneadh le cealla HeLa a chuir WT nó S27A mutant in iúl go sealadach ΔFosB, de réir mar a tuaradh, gur tharla sóchán suntasach i ráta díghrádaithe ΔFosB, agus laghdú comhchéimneach i leathré an phróitéin mar thoradh ar shóchán S27A. (Fig. 6A). Scrúdaíomar ansin an dtarlaíonn an mheicníocht rialála seo freisin sa líne chill PC12 atá níos mó ná néaróin. Léirigh na turgnaimh seo, mar a thugamar faoi deara i gcillíní HeLa, go bhfuil laghdú suntasach tagtha ar leathré BFosB i gcealla PC27 (ó ∼12 go ∼11 h) i sóchán pointe S4A (Fig. 6B). Ós rud é go bhfuil an díchobhsú seo cosúil leis an díchobhsú sin de bharr toirmeasc CK2 nó cnagadh síos (Fig. 4) cuireann sé tacaíocht bhreise ar fáil don smaoineamh go rialaíonn fosfathúchán CX2-idirghabhála Ser27 cobhsaíocht BFosB. Fuarthas fianaise bhreise maidir le ról rialála phosphorylation Ser27 ar láimhdeachas próitéine BFosB ag baint úsáide as fosfafimetic Ser27 le sóchán asp (S27D). Meastar go bhfuil an sóchán S27D fosfóimeiteach, mar cuireann sé grúpa mór (carbocsaile) atá luchtaithe go diúltach ag aigéad aimín 27 agus dá bhrí sin déanann sé aithris ar pháirtíocht fosfactú Ser27 go páirteach. Mar a thaispeántar i Figiúr 6C, ba é an sóchán S27D ba chúis le héifeacht an tsócháin S27A agus bhí próitéin i bhfad níos cobhsaí ná an próitéin WT mar thoradh air. Mar an gcéanna leis an éifeacht a fhaightear tar éis gníomhachtú CK2 (Fig. 4D), mar thoradh ar an sóchán S27D rinneadh carnadh agus mhéadaigh ΔFosBanna mar sin le linn na chéad uair an chloig sa tóir.
Féach leagan níos mó:
Figiúr 6.
Rialaíonn fosfluachadh Ser27 cobhsaíocht BFosB. A, C, Anailís Pulse-chase ina dtaispeántar éifeacht phosphorylation Ser27 ar ráta láimhdeachais ΔFosB. Taispeántar próifíl díghrádaithe agus leathré measta na bhfear-cineál typeFos (WT), an Ser27 go mutant Ala (S27A), agus an fosfóimetic Ser27 go dtí asp mutant (S27D). Fuarthas na torthaí céanna i gcealla HeLaA) agus cealla PC12 (B, C).
Cobhsaíonn fosfaictíocht Ser27 BFosB trí chosc a chur ar a dhíghrádú próitéineach
Chun tús a chur leis an meicníocht trína ndéantar fosúchán Ser27 a chobhsú ΔFosB, scrúdaíomar cumas na gcosantóirí próitéineacha MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) agus epoxomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) ráta díghrádaithe mutant WT agus S27A ΔFosB a mhodhnú. Rinneadh turgnaimh pulse-chase ag baint úsáide as cealla PC12 atá ionfhabhtaithe le HSV athchuingreach a chuir WT nó S27A BFosB in iúl agus a ndéileáiltear leo le DMSO nó le ceann den dá chosantóir cosanta. Léirigh na turgnaimh seo cé go bhfuil ráta díghrádaithe an phróitéin WT neamhíogair le láithreacht ceachtar den dá choscóir cosanta (Fig. 7A), go bhfuil an tsóiteáin S27A íogair do na drugaí seo (Fig. 7B). Léiríonn sé seo, murab ionann agus an próitéin WT, gur sprioc de dhíghrádú próitéamaíoch é mutant S27A. Go deimhin, rinne cóireáil cealla le MG132 nó le epoxomicin aisiompú iomlán ar an sóchán S27A ar an ráta díghrádaithe ΔFosB, arna léiriú ag méadú i leathré an tsóiteáin S27A ó ∼4 go ∼9 h do MG132 agus ∼ 12 h le haghaidh epoxomicin (Fig. 7B). Le chéile, léiríonn na torthaí seo go gcosnaíonn fosfónú lationFosB ar Ser27 an próitéin ó dhíghrádú próitéineach agus mar sin tá sé riachtanach dá chobhsaíocht neamhghnách.
Féach leagan níos mó:
Figiúr 7.
Coinníonn osfosfathúchán Ser27 BFosB trína chobhsú ar a dhíghrádú próitéineach. A, B, Anailís Pulse-chase le cealla PC12 atá ionfhabhtaithe ag HSV a thaispeánann próifíl díghrádaithe agus leathré measta de chineál fiáin ΔFosB (A) nó S27A ΔFosB (B(b) in éagmais nó i láthair ceachtar de na dhá choscóir próitéiní [MG132 agus epoxomicin (Epoxo)]. Tabhair faoi deara go bhfuil éifeacht shuntasach ag ceachtar druga ar láimhdeachas typeFosB den chineál fiáin, ach gur choinnigh cóireáil cealla a raibh ceachtar cosantóir próitéamaigh orthu S27A ΔFosB a chobhsú. C, Múnla do ról phosphorylation Ser27 i gcumas BFosB chun plasticity fadtéarmach inchinne a idirghabháil. Nuair a spreagtar é, déantar cuid de ΔFosB a chobhsú in inchinn ag an bhfosfathúchán CK2-idirghabhála S27. Fágann sé seo go bhfuil carnadh ann, rud as a dtagann athruithe fadtréimhseacha ar léiriú géine. Cuireann na hathruithe cobhsaí seo ar léiriú géine le hoiriúnuithe iompraíochta cobhsaí. Os a choinne sin, is é an toradh a bhíonn ar dhí-theoiriciú S27 ag an Phosphatases Ser / Thr PP1 agus / nó PP2A ná díchobhsú na próitéine agus a phróiseála ag an innealra cosanta.
An Roinn Roimhe SeoAn Roinn Ar Aghaidh
Plé
Sa staidéar seo, taispeánann sé go bhfuil leathré saoil ag osFosB culture10 h i gcultúr na gceall, rud a fhágann go bhfuil sé seasmhach i gcomparáid leis an FosB lán-fhad agus an chuid is mó de na tosca tras-aistrithe eile, ar féidir a leathré i gcultúr na gceall a bheith chomh gearr mar cúpla nóiméad agus is annamh a sháraíonn siad 3 h (Hann agus Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts agus Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Ina theannta sin, feicimid go bhfuil ΔFosB phosphorylated san inchinn agus go bhfuil a phosphorylation íogair do aigéad inhibitor PP1 / PP2A. Léiríonn ár staidéir ar chultúr na gceall go bhfuil cobhsaíocht BFosB modhnaithe ag CK2, agus cobhsaíonn gníomhaíocht CK2 níos airde an próitéin. Mar fhocal scoir, tugann ár dtorthaí le fios go ndéanann CK2 phosphorylates ΔFosB ar shearbhall foirceannaithe N (S27) agus go dtaispeánann sé go gcosnaíonn fosfaríocht S27 BFosB ó dhíghrádú próitéamaíoch. Molaimid, dá bhrí sin, samhail trína bhfeabhsaíonn KFosB ar S27 ag CK2 meicníocht rialála chriticiúil de láimhdeachas ΔFosB (Fig. 7C). Tá cobhsú den chineál tedFosB 'a bhfuil idirghabháil phosphorylation den sórt sin tábhachtach ó thaobh feidhme de, toisc go bhfuil sé léirithe go bhfuil leibhéil mhéadaithe osFosB i réigiúin inchinne go háirithe ag rialú go leor géinte néaróineacha in vivo agus chun éifeachtaí iompraíochta láidre a chur i bhfeidhm i múnlaí ainmhithe de roinnt neamhoird neuropsychiatric (féach Réamhrá).
Cé gur bealach tapaidh inchúlaithe é an fosfaireachas chun gníomhaíocht trascríofa fachtóirí áirithe trascríobh a rialáil, mar shampla CREB (próitéin eilimint freagartha cPP ceangailteach) (Bohmann, 1990), má dhéantar modhnú ar dhíghrádú na bhfachtóirí trascríobh soláthraíonn sé foirm rialála atá níos cumhachtaí fós (nach bhfuil inchúlaithe go héasca) (Desterro et al., 2000). I measc na bhfachtóirí trascríobh a bhfuil a ngníomhaíocht feidhme á rialú ag leibhéal a ndíghrádaithe tá NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), agus c-Fos (Ferrara et al., 2003), i measc daoine eile. I mórán cásanna, is é an fosfathú an príomh-rialtóir ar chobhsaíocht an fhachtóra trascríobh, mar a léiríodh do c-Fos (Okazaki agus Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995,, Antigen-1 a bhaineann le Fos (Fra-1) (Vial agus Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), agus p53 (Buschmann et al., 2001). Dá bhrí sin cuireann ár gcuid staidéir BFosB leis an liosta seo de na tosca trascríobh a ndéantar a ngníomhaíocht fheidhmiúil a rialáil trína chobhsaíocht atá ag brath ar fosfailsiú.
Is Ser / Thr kinase uileláithreach agus gníomhach go gníomhach é CK2 a bhfuil> 300 foshraith airbheartaithe aitheanta go dtí seo agus atá bainteach le próisis bhitheolaíocha iomadúla, lena n-áirítear bás cille agus maireachtáil (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), freagairtí struis cheallaigh (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), agus deisiú DNA agus athmhúnlú crómatin (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Is próitéiní iad níos mó ná trian de na foshraitheanna putative de CK2 a bhfuil baint acu le sloinneadh géine a rialáil (Meggio agus Pinna, 2003). Go deimhin, tá sé léirithe go bhfuil CK2 ina kinase núicléach feiceálach (Krek et al., 1992) (le haghaidh athbhreithnithe, féach Yu et al., 2001) agus idirghníomhú le réimsí bZIP roinnt fachtóirí trascríobh (Yamaguchi et al., 1998). Tá sé léirithe freisin go bhfuil fosfaictéar CK2-idirghabhála modhnaithe ar dhíghrádú (a fheabhsaíonn nó a laghdaíonn é) go leor próitéiní, lena n-áirítear IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres agus Pulido, 2001), cónasc lionsa (Ceann et al., 2000), próitéin chromatin-bhainteach HMG1 (Wisniewski et al., 1999), agus roinnt fachtóirí trascríobh ar nós HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), agus c-Myc (Channavajhala agus Seldin, 2002). Tá CK2 níos inchinne in inchinnAlcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), agus tá a ghníomhaíocht ceangailte le go leor gnéithe d'fheidhm na hinchinne, lena n-áirítear marthanacht néaróin (Boehning et al., 2003), idirdhealú (Nuthall et al., 2004), feidhm cainéal ian (Jones agus Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), agus poitéinsil fhadtéarmach agus plasticity neuronal (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman and Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
In ainneoin na fianaise méadaithe seo ar ról CK2 maidir le feidhm neuronal a rialáil, is beag atá ar eolas faoi cad a rialaíonn a ghníomhaíocht. Ceaptar go bhfuil CK2 gníomhach go bunúsach, agus rialáil á dhéanamh ar a chumas foshraitheanna sonracha a fhosfáitiú ag brath go príomha ar athruithe ina logánú intracellular (m.sh., cytosol vs núicléas) (Ahmed agus Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Ardaíonn an fhaisnéis seo ceist thábhachtach maidir leis na comharthaí is gá chun FosB carnadh in inchinn a spreagadh tar éis spreagadh ainsealach (Fig. 7C). Riachtanas amháin is ea gníomhachtú an athuair fosB géine agus ionduchtú ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Léiríonn ár gcuid sonraí go bhfuil fosfathúchán CK2 de BBOSB ríthábhachtach dá chobhsaíocht, rud a thugann le tuiscint go mb'fhéidir go mbeidh an dara comhartha ag teastáil le haghaidh éifeachtaí fadtéarmacha BFosB ar léiriú géine, eadhon, comhartha a spreagann fossúchán próitéine ag CK2. D’fhéadfadh sé seo a bheith i gceist le gníomhachtú CK2 trí mheicníocht éigin anaithnid nó a tras-aistriú chuig an núicléas. Mar mhalairt air sin, is féidir go mbeidh fosfathúchán CK2 osFosB ina bhunreacht, mar go n-aistrítear proteinFosB protein mar fhreagra ar gach spreagadh, go bhfaigheann cuid de phosphorylated agus go ndéantar é a chobhsú, ionas go dtarlaíonn sé le spreagadh arís agus arís eile go leibhéil arda i néaróin lena mbaineann.
Taispeánann ár dtorthaí nach dócha gurb é CK2 agus S27 an t-aon kinase agus an suíomh atá freagrach as phFosB phosphorylation, toisc nach raibh aon chosc ar CK2 ná an tsóchán S27A in ann phFosB phosphorylation a chosc go hiomlán. Ar an gcaoi chéanna, áitíonn toradh an tsócháin S27A go dtiocfaidh laghdú 30% ar phospho-ΔFosB go bhfuil S27 ina shuíomh mór fosfaictrithe ar an bpróitéin. Táimid, mar sin féin, ag fiosrú suíomhanna eile kinases tochailte agus fosfaictrithe ar ΔFosB. I ndeireadh na dála, beidh sé tábhachtach anailís a dhéanamh ar fhosúchán S27 agus ar aon shuíomhanna eile fosfaictrithe in BFosB in inchinn in vivo tar éis cineálacha éagsúla spreagtha ainsealaí, mar shampla, trí úsáid a bhaint as mais-speictriméadracht nó as antasubstaintí fosfaoscúla.
Mar a luadh thuas, tá S27 in BFosB caomhnaithe go mór le linn éabhlóid agus i measc próitéiní eile teaghlaigh Fos. Mar sin féin, níl an suíomh comhdhearcaidh do CK2: mar a thaispeántar i Figiúr 5B, níl ach iarmhar aigéadach ag + 2 ag FosB / ΔFosB (agus ag an xenolog iascach), ach ní ag c-Fos nó Fra-3, príomhchinntitheach i bhfosfathú CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Dá bhrí sin, d’fhéadfadh an easpa fosfaiceála CK2 ar S27 a mhíniú cén fáth nach bhfuil próitéiní eile de chuid teaghlaigh fos chomh seasmhach le ΔFosB. Mar sin féin, ní mhíníonn sé seo an fáth nach bhfuil an FosB lán-fhad, a bhfuil an suíomh comhdhearcaidh CK2 céanna aige mar ΔFosB, cobhsaithe mar an gcéanna. Níl a fhios againn an bhfuil CIC2 fosfaictrithe ag Foshan Fad-Fad ar an iarmhar caomhnaithe seo. Na tuairiscí amháin ar FosB (Skinner et al., 1997) agus c-Fos (Okazaki agus Sagata, 1995; Chen et al., 1996(d) cur síos a dhéanamh ar shuíomhanna i réigiún an C-chríochfoirt de na próitéiní seo, atá as láthair in BFosB. Tá gá le himscrúdú díreach ar an bhfosfailt fhéideartha a bhaineann le FosBón lán-fhad agus próitéiní eile de chuid teaghlaigh Fos ag CK2. Mar sin féin, fiú má dhéantar iad a phosphorylated, is eol go bhfuil móitífeanna ag a dtéarma C a dhíríonn ar na próitéiní chun díghrádú tapa a dhéanamh ar na próitéiní Fos-teaghlaigh eile.Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Mar shampla, léiríodh go bhfeidhmíonn stráice de ues21 iarmhair atá i gcríochfort gach próitéiní teaghlaigh Fos, ach atá as láthair i ΔFosB, mar fhearann díchobhsaithe do c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Fuaireamar amach, cé go ndéanann an seicheamh seo an FosB ar fad a dhíchobhsú mar an gcéanna (Carle et al., 2004), níl cuntas iomlán ar a chobhsú mar gheall ar easpa an fhearainn seo in BFosB. Ina ionad sin, is cosúil go gcuireann an teaglaim de neamhláithreacht an fhearainn chríochnaithe C seo agus fosfaireachais Ser27 go hiomlán leis an difríocht thart ar chúig oiread i stabilityFosB agus FosB.
Cé go bhfuil sé casta próitéiní teaghlaigh Fos a dhíghrádú agus nach dtuigtear go hiomlán iad, is cosúil gurb é díghrádú próitéamaíoch an príomhbhealach atá i gceist (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Áitíonn na sonraí a chuirtear i láthair anseo, nach n-athraíonn coscairí próitéamaíocha ráta ationFosB díghrádú go suntasach, go bhfuil BFosB ag seachaint próitéiní an 26S, murab ionann agus próitéiní eile de chuid teaghlaigh Fos, agus tá ról lárnach aige seo maidir lena chobhsú. Dá bhrí sin molaimid scéim ina bhfuil cobhsaíocht fheabhsaithe BFosB inchurtha i leith an teaglaim de dhá phríomhfhachtóir: (1) nach bhfuil fearann díchobhsúcháin C-críochfoirt agus (2) fosfactú S27 ag CK2.
Go hachomair, soláthraíonn an staidéar reatha léargas meicniúil ar an bhfáth ΔFosB, táirge den ghéin luath luath fosB, murab ionann agus gach ball eile den teaghlach Fos, próitéin measartha fadchónaithe. Cé go meastar go gcuireann próitéiní eile de chuid teaghlaigh Fos cúplála spreagtha-trascríobh mear ach neamhbhuanMorgan agus Curran, 1995), tugann cobhsaíocht choibhneasta ΔFosB an cumas dó athruithe trasghearrtha níos fadtéarmaí a spreagann spreagadh ainsealach a idirghabháil. Tacaíonn sé seo leis an tuairim go bhfeidhmíonn BFosB mar athrú móilíneach leanúnach san inchinn, ag athrú de réir a chéile freagraí géara in oiriúnuithe ainsealacha. Osclaíonn sainaithint fosfaireachais Ser27 mar mheicníocht lárnach do chobhsaíocht BFosB bealaí nua chun modhanna a fhorbairt chun feidhm BFosB a rialáil agus dá bhrí sin a éifeachtaí fadtéarmacha ar plasticity néarach agus iompraíochta a mhodhnú.
An Roinn Roimhe SeoAn Roinn Ar Aghaidh
Nótaí nótaí
- Faighte Samhain 21, 2005.
- Athbhreithniú faighte i mí Feabhra Feabhra 21.
- Glactha Aibreán 2, 2006.
- Thacaigh an Comhaontas Náisiúnta um Thaighde ar Scitsifréine agus Gradam Imscrúdaitheora Óg an Storm leis an obair seo do PGU, Gradam Seirbhíse Taighde Náisiúnta na hInstitiúide um Dhrochúsáid Drugaí (NIDA) do PGU, agus deontais ón Institiúid Náisiúnta Meabhairshláinte agus NIDA go EJN Gabhaim buíochas leis an Dr. James Bibb as a chabhair leis an in vitro measúnachtaí fosfathúcháin, an Dr. Ming-Hu Han as a chabhair le hullmhú slisní inchinne a úsáidtear chun lipéadú meitibileach a dhéanamh, agus an Dr. Rachael Neve as a cabhair le pacáistiú na HSVanna ath-iompaithe.
- Seoladh reatha G. Rudenko: Institiúid na nEolaíochtaí Beatha agus an Roinn Cógaseolaíochta, Ollscoil Michigan, 210 Ascaill Washtenaw # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Ba chóir comhfhreagras a sheoladh chuig Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. Ríomhphost: [ríomhphost faoi chosaint]
tagairtí
Acquaviva C, Brockly F, P Ferrara, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Sainaithint móitíf tripeptide C-teirminéil a bhfuil baint aici le rialú díghrádaithe tapa próitéamaigh proto-oncoprotein c-Fos le linn idirthréimhse chéim G (0). oncogene 20:7563–7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Conairí il-díghrádaithe do phróitéiní teaghlaigh Fos. Ann NY Acad Sci 973:426–434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Meicníocht maidir le rialáil intracellular ar kinase próitéine CK2: ról an chomhlachais subnuclear spreagtha-spreagtha. Mol Mol Biol Res 40:539–545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Nós imeachta íonaithe feabhsaithe agus airíonna cáiséine kinase II ón inchinn. Res Neurochem 13:829–836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Cúrsa ama de imdhíonta imdhíonachta deilte DeltaFosB agus cosúil le prodynorphin tar éis deireadh a chur le cóireáil dopaminomimetic ainsealach. Eur J Neurosci 17:661–666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Léirítear le scáileáin slonn ar fud an géanóim ról domhanda do kinase próitéine CK2 maidir le hathmhúnlú crómatin. J Cell Sci 116:1563–1577.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Taispeánann dhá iseatóm PKC a fhaightear i gcealla HL-60 difríocht i ngníomhachtú ag an eistir phorbol TPA. FEBS Lett 249:264–266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, JP Adelman, Fakler B (2004) Tá próitéin kinase CK2 comhcheangailte le seoltacht bheag Ca (2 +) - cainéil ghníomhachtaithe K + agus rialaíonn sé gathanna cainéal. Néaróin 43:847–858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Léiriú fadtéarmach antaigine a bhaineann le Fos agus léiriú neamhbhuan de delta FosB a bhaineann le hurghabhálacha sa francach hippocampus agus striatum. J Neurochem 68:272–279.
Blom N, T Sicín-Ponten, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Ag tuar glycosylation iar-aistritheach agus fosfathúchán próitéiní ón ord aimínaigéid. Próitéamaíocht 4:1633–1649.
Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Neurotransmission aonocsaíde carbóin arna chur i ngníomh ag CK2 phosphorylation de ocsaiginéas-2 cró. Néaróin 40:129–137.
Bohmann D (1990) Fosfaictéar an fhachtóra trascríobh: nasc idir traschur comhartha agus rialú léiriú géine. Cealla Ailse 2:337–344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Meitheamh Tá phosphorylation kinase NH2-críochfort p53 ar Thr-81 tábhachtach do chobhsú p53 agus gníomhaíochtaí trascríobh mar fhreagra ar strus. Mol Cell Biol 21:2743–2754.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Cuireann easpa fearainn caomhnaithe C-teirminéil teaghlaigh Fos le cobhsaíocht uathúil deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
P Channavajhala, Seldin DC (2002) Idirghníomhaíocht fheidhmiúil kinase próitéine CK2 agus c-Myc i lymphomagenesis. oncogene 21:5280–5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Rialáil deilt FosB agus próitéiní cosúil le FosB trí urghabháil leictreacólaigh agus cóireálacha cóicín. Mol Pharmacol 48:880–889.
Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Ainmhithe ainsealacha ainsealacha: athruithe cobhsaí de ΔFosB a spreagadh san inchinn le cóireálacha ainsealacha. J Neurosci 17:4933–4941.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Feabhsaíonn an fosfáitiú c-Fos ag an C-terminus a ghníomhaíocht athraithe. oncogene 12:1493–1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Méadaíonn an t-aigéad inkadaic phosphatase próitéine 1 / 2A phosphorylation CREB agus Elk-1 agus léiriú c-fos sa striatum in vivo francach. J Neurochem 89:383–390.
Cochet C, EM Chambaz (1983) Fosfaireictreacha próitéine polaimíne-idirghabhála: sprioc fhéideartha le haghaidh gnímh polaimíne intracellular. Mol Cell Endocrinol 30:247–266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Airíonna catalaíocha agus móilíneacha cáiséine cáiséine an-íonaithe de chineál as fíochán scamhóige bólachta. Biochim Biophys Acta 743:1–12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Cuireann an ró-ísliú de chineál cille Striatal de DeltaFosB go mór le dreasacht do chóicín. J Neurosci 23:2488–2493.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Méadaíonn féin-riarachán cóicín preprodynorphin, ach ní méadaíonn c-fos, mRNA i striatum francach. NeuroReport 4:543–546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Rialáil fachtóirí trascríobh trí dhíghrádú próitéine. Cell Mol Life Sci 57:1207–1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Gníomhaíocht den chineál kinase cíteaplasma a mhéadú II a ghabhann leis an bhfásach néarógach tar éis toirmeasc sintéise DNA i gcealla neuroblastoma NIA-103. J Neurochem 58:1820–1828.
Di Maira, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Próitéiní kinase phosphorylates CK2 agus upregulates Akt / PKB. Bás Cell Difriúil 12:668–677.
An P, An Chúlra, An Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Is gníomhaithe trascríofa i dtáirgí snáithíní iad an dá tháirge den ghéin altrama, FosB agus a fhoirm ghearr, FosB / SF. Mol Cell Biol 11:5470–5478.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Tá difríocht idir na deitéarmanaint struchtúracha atá freagrach as díghrádú próitéamaíoch próitéine c-Fos de réir na gcoinníollacha léirithe. oncogene 22:1461–1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Spriocdhírithe ag brath ar an bhfosfáitiú de gach uile lá de mhí an Mheithimh ag Meitheamh N-kinase. oncogene 13:1531–1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun Díríonn kinases NH2-teirminéil ar athláithreacht na dtosca a bhaineann leo. J Biol Chem 272:32163–32168.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Tá cobhsaíocht an fhachtóra traiseolta ATF2 á rialú ag phosphorylation agus dephosphorylation. J Biol Chem 275:12560–12564.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
JA Girault, Hemmings HC Jr, Williams KR, AC AC, Greengard P (1989) Phosphorylation de DARPP-32, fosfaphrotein atá faoi rialú dopamine agus cAMP, ag cáiséin kinase II. J Biol Chem 264:21748–21759.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
JA Girault, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Saintréith de chinéal serine DARPP-32 arb ionann é agus cáiséin kinase II. J Neurochem 55:1772–1783.
Hanada, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, gníomhaire antitumor nua de thionscnamh miocróbach. J Antibiot (Tokyo) 45:1746–1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Próitéiní atá ionchódaithe ag an duine c-myc oncogene: léiriú difreálach i gcealla neoplaisteacha. Mol Cell Biol 4:2486–2497.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Hemmings HC Jr, JA Girault, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, fosfaphrópán AMP-rialaithe (an tUas = 21,000) a dhéantar a shaibhriú i réigiúin inchinne dopamine-istigh. Seicheamh aimínaigéid an tsuímh a fostaíodh ag AMP timthriallach i gcealla slán agus staidéir chinéiteacha ar a fhosfathúchán in vitro. J Biol Chem 264:7726–7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Cógaseolaíocht coscairí próitéin kinase. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377–397.
Hirata H, Bessho Y, Ar Ais go Barr, Yamada, Yamada, Lewis J, Kageyama R (2004) Tá neamhdhóthanacht próitéine Hes7 ríthábhachtach don chlog deighilte. Nat Genet 36:750–754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Cothaíonn cóireálacha neuroleptic neamhthipiciúla agus tipiciúla cláir ar leith de léiriú fachtóra trascríobh sa striatum. J Comp Neurol 374:70–83.
Dóchas B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Rialáil a dhéanamh ar an léiriú géine luath agus AP-1 atá ceangailteach sa chócó ainsealach núicléas francach. Proc Natl Acad Sci Stáit Aontaithe Mheiriceá 89:5764–5768.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Mar thoradh ar chóireáil cóireáil ainsealach leictrea-ocsaileach (ECS) cuirtear coimpléasc fadtréimhseach AP-1 in iúl san inchinn le comhdhéanamh agus tréithe athraithe. J Neurosci 14:4318–4328.
Dóchas BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Ionduchtú coimpléasc fadtréimhseach AP-1 ina bhfuil próitéiní comhchosúla athraithe san inchinn trí chóicín ainsealach agus cóireálacha ainsealacha eile. Néaróin 13:1235–1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Próitéin kinase II atá ag brath ar chailminín a chobhsú tríd an bhfearann uathrialaitheach. J Biol Chem 270:2163–2170.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Meicníochtaí casta maidir le c-fos agus díghrádú c-jun. Mol Biol Rep 24:51–56.
Jones S, Yakel JL (2003) Rialaíonn Casein kinase ii (ck2 kinase próitéine) feidhm chainéil serotonin 5-ht (3) i gcillíní ng108-15. Néarchórais 119:629–634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) Is CK2 Cin-C-críochfort IkappaB atá freagrach as gníomhachtú NF-kappaB le linn an fhreagra UV. Mol Cell 12:829–839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Féin DW, Tkatch T, Baranauskas G, DJ Surmeier, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Léiriú ar an bhfachtóir trascríobh deltaFosB san inchinn a rialaíonn íogaireacht cóicín. Cineál 401:272–276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Toirmeasc próitéiní ag na táirgí nádúrtha epoxomicin agus dihydroeponemycin: léargas ar shainiúlacht agus láidreacht. Bioorg Med Chem Lett 9:3335–3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Tá Calphostin C (UCN-1028C), cumasc miocróbach núíosach, ina choscóir an-láidir agus sonrach ar phróitéin kinase C. Res Resort Biochem Biophys 159:548–553.
Krek W, Maridor G, ÚE Nigg (1992) Is einsím núicléach den chuid is mó é Casein kinase II. J Cell Biol 116:43–55.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Próitéiníonn kinase próitéin CK2 próitéin próitéiní fearainn SSRP1 an ghrúpa ardghluaiseachta, ag tabhairt aitheantas DNA DNA a ndéantar damáiste dó. J Biol Chem 278:12710–12715.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Kumar A, Choi KH; (2005) Is príomh-mheicníocht é athmhúnlú crómatin atá mar bhunús le plasticity a spreagann cóicín i striatum. Néaróin 48:303–314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Rialaíonn Casein kinase-II feidhm chainéil NMDA i néaróin hippocampal. Nat Neurosci 2:125–132.
Litchfield DW (2003) Próitéin kinase CK2: struchtúr, rialachán agus ról i gcinntí ceallacha na beatha agus an bháis. Biochem J 369:1–15.
Tú, Bain úsáid as, Nakamichi N, A K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Díghrádú próitéine c-Fos arna shloinneadh ag N-meitil-d-aspartic aigéad i gcodáin núicléacha de murine hippocampus. Brain Res 905:34–43.
Mandelzys A, MA Gruda, Bravo R, Morgan JI (1997) Neamhláithreacht antigen cothaithe a bhaineann le cothú 37 ardaithe agus gníomhaíocht DNA-AP-1 atá cosúil le hainmhithe na lucha nimh a bhfuil cóireáil aigéadach kainic orthu. J Neurosci 17:5407–5415.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Sainiúlacht suímh cháiséin kinase-2 (TS) ó chíteosól ae francach. Staidéar le foshraitheanna peiptíde samhail. Eur J Biochem 160:239–244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Rialáil léiriú géinteiripe agus cóicín ag CREB agus DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208–1215.
McClung CA, Ulery PG, LI Perrotti, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: athrú móilíneach d’oiriúnú fadtéarmach san inchinn. Brain Res Mol Brain Res 132:146–154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Foshraitheanna aon-mhíle agus aon cheann de phróitéin kinase CK2? FASEB J 17:349–368.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Phosphorylation de chodáin cáiséin ag ae francach 'phosvitin kinase.'. FEBS Lett 75:192–196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Déanann autophosphorylation de chineáil cháis 2 TS a chneasú ag a alúmanaim agus ag a béite-fotheidil. Tionchar éifeachtóirí difriúla. FEBS Lett 160:203–208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Díorthaigh rafofuranosyl-benzimidazole mar choisc ar cháiséin kinase-2 agus ar cháiséin kinase-1. Eur J Biochem 187:89–94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Sainiúlacht tsubstráit kinase próitéine CK2. Mol Mol Biol Res 40:401–409.
Miller C, Zhang M, Sé, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Ionduchtú trascríofa géine cyclooxygenase-2 trí chosc ar aigéad okadaic ar ghníomhaíocht phosphatase i chondrocytes daonna: comh-spreagadh próitéiní ceangailteach núicléacha AP-1 agus CRE. J Cell Biochem 69:392–413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Athruithe ar leibhéal an líonra i gcur in iúl próitéiní Fos-Jun inducible sa striatum le linn cóireála agus aistarraingthe ainsealaí. Néaróin 17:147–156.
Morgan JI, Curran T (1995) Géinte luath-luath: deich mbliana ar aghaidh. Treochtaí Neurosci 18:66–67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Foirm theasctha de FosB a tharlaíonn go nádúrtha a choisceann gníomhaíocht trascríobh Fos / Jun. Cell 64:751–759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: athrú móilíneach leanúnach ar andúil. Proc Natl Acad Sci Stáit Aontaithe Mheiriceá 98:11042–11046.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Tabhairt isteach an fhotheidil 1 don ghabhdóir glutamate isteach i néaróin mótair in vitro agus in vivo ag baint úsáide as víreas athchúrsála deir deir. Néarchórais 79:435–447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Tá tábhacht ag baint le fosfarféarú serine 239 de Groucho / TLE1 le próitéin kinase CK2 maidir le toirmeasc ar dhifreáil néaróin. Mol Cell Biol 24:8395–8407.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Okazaki K, Sagata N (1995) Déanann an cosán kinase Mos / MAP c-Fos a chobhsú ag fosforylation agus cuireann sé lena ghníomhaíocht athraithe i gcealla NIH 3T3. EMBO J 14:5048–5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Teastaíonn an bealach ubiquitin-proteasome chun próitéin réamhtheachtaí NF-kappa B1 a phróiseáil agus gníomhachtú NF-kappa B. Cell 78:773–785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Díghrádú spriocdhírithe ar c-Fos, ach ní v-Fos, trí chomhartha a bhfuil spleáchas aige / aici ar c-Meitheamh. Eolaíocht 258:1941–1944.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Peakman MC, Colby C, LI Perrotti, P P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stoc JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Laghdaítear in íogaireacht, in iúl réigiún-sonrach ar leith de mutant diúltach ceannasach c-Meitheamh i lucha transgenic íogaireacht cóicín. Brain Res 970:73–86.
LI Perrotti, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Ionduchtú DeltaFosB i struchtúir inchinne a bhaineann le luach saothair tar éis strus ainsealach. J Neurosci 24:10594–10602.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Léiriú fachtóra trascríobh Brain: éifeachtaí amfataimín géara agus ainsealaí agus strus insteallta. Brain Res Mol Brain Res 20:91–100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Modhnú iar-aistritheach: fosfathúchán agus fosfáisí. I: Prótacail reatha in eolaíocht próitéine (Dunn BM, ed.) Pp. 13.01–13.02. Nua-Eabhrac: Wiley and Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Airíonna catalaíocha agus móilíneacha de chineál ard-íonaithe poitéiní / cáiséine kinase cineál II ó chealla epithelial daonna i gcultúr (HeLa) agus maidir le kinase próitéine ecto. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215–227.
Reikhardt BA, Comhghleacaithe OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Stádas an chórais “kinase próitéine” CK2-HMG14 in amnesia a bhaineann le haois i bhfrancaigh. Neurosci Behav Physiol 33:799–804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Díscaoileadh an ghabhdóra dé-ocsaine fearainn dé-ocsaíde fearainn Helix-lúb-helix / Per-ARNT-Sim tríd an gconair ubiquitin / proteasome. J Biol Chem 274:36351–36356.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Rost B, an G, Liu J (2004) An freastalaí PredictProtein. Res Aigéid Núicléasacha 32:W321–W326.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Spriocanna Ap-1 san inchinn. Tosaigh Biosci 9:8–23.
Sahin B, Kansy JW, AC Nairn, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Tréithriú móilíneach a dhéanamh ar kinase adenosine luch athchuingreach agus meastóireacht mar sprioc le haghaidh fosfaictrithe próitéine. Eur J Biochem 271:3547–3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) An bhfuil iolracha próitéineacha ann a chuireann le c-Fos, c-Jun agus díghrádú próitéine p53 in vivo? Mol Biol Rep 26:45–51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Díthuasú eistir phorbol faoi ghnáthchoinníollacha stórála. Athrú Ailse 35:1375–1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Is iondúil go dtarlaíonn fosfathúchán bunreachtúil IkappaBalpha le cáiséin kinase II ag serine 293: an riachtanas le haghaidh díghrádú IkappaBalpha saor in aisce. Mol Cell Biol 16:3554–3559.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Cuireann Ras le cobhsaíocht próitéine Myc. Mol Cell 3:169–179.
MA MAO-Neto, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Fosfáitiú núicléasach núicléasach cioglach neamhspleách le kinase cáiséine II íonaithe ó oocytes Rhodnius prolixus. Mol Feithid Bochem Biol 32:847–857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Wisdom R (1997) Éilíonn gníomhachtú agus claochlú trascríofa ag próitéin FosB fosfar go bhfeabhsófar an fearann gníomhachtaithe críochfoirt charbocsaile. Mol Cell Biol 17:2372–2380.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Próitéiní kinase CK2 a dhéanann próitéiní de chrómasóm ardghluaisteacht arbhar Indiach B (HMGB) próitéiní a mhodhnú a n-idirghníomhaíochtaí cobhsaíochta agus DNA. J Biol Chem 277:1092–1098.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Sainaithint cyk, ciclin B2 kinase, mar phróitéin kinase II atá ag brath ar chailciam / calmodulin agus a ról le linn aibithe Xenopus laevis oocyte. Res Cell Exp 252:303–318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Rialáil léiriú g-c agus c-jun géine ag lipopolysaccharide agus cytokines i bpríomh-astrocytes saothraithe: éifeacht bhealaí PKA agus PKC. Arch Pharm Res 27:396–401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Fosfaiféarú difreálach próitéiní aigéadacha ribosómacha ó chill giosta ag dhá kinases próitéine ingineacha: casein kinase-2 agus 60S kinase. Acta Biochim Pol 42:357–362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Comhdhúile Calphostin (UCN1028) agus comhdhúile a bhaineann le calphostin, aicme nua coscairí sonracha agus láidre próitéine kinase C. Res Ail-Messenger Phosphoprotein Adv 24:497–501.
Torres J, Pulido R (2001) Is é an kinase próitéine CK2 an próitéin meite PTEN a phosphorylated ag a fhoirceann C. Impleachtaí do chobhsaíocht PTEN chun díghrádú próitéamaíoch idirghabhála. J Biol Chem 276:993–998.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Tsubuki S, Saito, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Toirmeasc difreálach ar ghníomhaíochtaí calpain agus proteasome ag aildéid de peiptileil di-leucine agus trí-leucine. J Biochem (Tóiceo) 119:572–576.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
An C, An NÍL, TÁ, TÁ NÁ, CÓNAITHEOIRÍ, FÉIDIR, TÁIRGÍ CÓRÁLA, MÍN EAGARTHA, Okazaki K, Sagata N (1995) Déantar díghrádú c-Fos ag próitéiní 26S a luathú ag c-Jun agus kinases ilphróitéin. Mol Cell Biol 15:5682–5687.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Cosnaíonn próitéin CK2 mar rialtóir marthanais cille: impleachtaí do theiripe ailse. Spriocanna Drugaí Curr Ailse 4:77–84.
Vial E, Marshall CJ (2003) Tugann gníomhaíocht ardaithe kinase ERK-MAP cosaint do bhall teaghlaigh FOS FRA-1 i gcoinne díghrádú próitéamaigh i gcealla carcanaoma idirstad. J Cell Sci 116:4957–4963.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) Rialaíonn BFosB reáchtáil rothaí. J Neurosci 22:8133–8138.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Rialáil fheidhm an fhachtóra trascríobh trí fhosfathúchán. Cell Mol Life Sci 57:1172–1183.
Geimhreadh B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Tá dhá shuíomh próitéine próitéiní CK2 próitéiní putative tábhachtach do ghníomhaíocht Myf-5. Biol Chem 378:1445–1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Déanann fosfathú frithpháirteach eireabaill aigéadach an ghrúpa ardghluaiseachta próitéiní 1 ag cáisín kinase II athrú ar a gcumhacht, a gcobhsaíocht, agus a sainiúlacht ceangailteach DNA. J Biol Chem 274:20116–20122.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Méadaigh sé, Téann sé, Tugtha F, T, T (1998) Idirghníomhaíonn Casein kinase II le réimsí bZIP roinnt fachtóirí trascríobh. Res Aigéid Núicléasacha 26:3854–3861.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Phosphorylation próitéine struis A170 ag gníomhaíocht cosúil le cáiséin cháiséine II i macrophages. Res Resort Biochem Biophys 241:157–163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) An cosantóir fadúcháin trasghearrtha 5,6-dichloro-1-beta-d- cuireann cosc ar phróitéin kinase próitéine a bhaineann le IIH le cosc a chur ar an bhfrithchúpláil. J Biol Chem 270:23922–23925.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Yen J, Wisdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) Is foirm mhalartach eile de FosB é rialtóir diúltach gníomhachtaithe agus claochlaithe trascríobh ag próitéiní Fos. Proc Natl Acad Sci Stáit Aontaithe Mheiriceá 88:5077–5081.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Ceann X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Casein kinase II phosphorylates lionsa connexin 45.6 agus tá baint aige lena dhíghrádú. J Biol Chem 275:6850–6856.
Téacs Iomlán Abstract / SAOR IN AISCE
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Ionduchtú comhpháirteanna fachtóra trascríobh AP-1 le linn gníomhachtaithe T-chill ag interleukin 1 agus eistir phorbol. Fás Cell Difriúil 3:677–684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Iarmhairtí CK2 ag léiriú don mhaitrís núicléach. Mol Bithcheimiceach 227:67–71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Díriú difreálach ar phróitéin kinase CK2 chuig an maitrís núicléach nuair a dhéantar ró-stró a fholmhú ar a fhochuideachtaí. J Cell Biochem 74:127–134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley RO, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) BFosB: ról riachtanach do BFosB sa núicléas accumbens i ngníomh moirfín. Nat Neurosci 9:205–211.
Airteagail a luaitear an t-alt seo
- Freagairtí Iompraíochta agus Struchtúracha ar Chóicín Ainsealach Éileamh a dhéanamh ar Lúb Fhorlíontach a Bhaineann le {Delta} Próitéin Fosc agus Cailciam / Calmodulin-Chleithiúnach Kinase II sa Bhlaosc Fhreagra Nucleus Iris Néareolaíochta, 6 Márta 2013, 33(10):4295-4307
- Athshuíomh Striatach de {Delta} Léiríonn FosB Gluaiseachtaí Neamhghabhálacha Ainsealacha Levodopa Iris Néareolaíochta, 26 Bealtaine 2010, 30(21):7335-7343
- Abstract
- Téacs Iomlán
- Téacs Iomlán (PDF)
- Abstract
- Téacs Iomlán
- Téacs Iomlán (PDF)
- Abstract
- Téacs Iomlán
- Téacs Iomlán (PDF)
- Abstract
- Téacs Iomlán
- Téacs Iomlán (PDF)
- Meicníochtaí transcriptional de andúil: ról {Delta} FosB Idirbhearta Fealsúnachta an Chumainn Ríoga B: Eolaíochtaí Bitheolaíochta, 12 Deireadh Fómhair 2008, 363(1507):3245-3255
- Leochaileacht buan chun athshlánú ar iompar atá ag lorg meitéadairimimín i luch mutant fachtóir neurotrófach a fhaightear ar líne glíogach An Iris FASEB, 1 Iúil 2007, 21(9):1994-2004
- An fachtóir trascríobh próitéin-1 Activator i gCarcinogenesis Riospráide Taighde Ailse Mhóilíneach, 1 Feabhra 2007, 5(2):109-120
;