Proc Natl Acad Sci US A. 2005 Gearran 1; 102(5): 1737-1742.
Abstract
Tha Cocaine, druga de dhroch-dhìol, ag àrdachadh ìrean dopamine sioncopach anns an striatum le bhith a ’sguabadh air ais dopamine aig ionadan-ràch. Thathas air a bhith a ’faighinn a-mach gu bheil kinase a tha an crochadh air cyclin-5 (Cdk5) agus a p35 gnìomhaiche, pròtainean a tha an sàs ann am fosfachadh a-mach fo-fhillidhean ann an neurons postmitotic, air an riaghladh às dèidh faighinn a-steach gu h-àrd do chocàin. Gus tuilleadh sgrùdadh a dhèanamh air buaidh Cdk5 agus p35 air inntrigidh air comharran dopamine striatal, chruthaich sinn dà loidhne luch neo-eisimeileach tar-chuir anns an deach cus-èisdeachd a dhèanamh air Cdk5 no p35 gu sònraichte ann an neurons. Tha sinn ag aithris an-seo gu bheil àrdachadh ann an gnìomhachd Cdk5, mar thoradh air p35 ach chan ann bho thar-dhrugaidheachd Cdk5, a ’toirt air lughdachadh ann an comharrachadh dopamine le cocaine. Le barrachd cdk5 fo-fhosgailte de dopamine agus fosphoprotein fo riaghailt CAMP, chaidh tomad moileciuilteach 32 kDa (DARPP-32) aig Thr-75, a sheachnadh le lùghdachadh ann an ìre dARPP-32 aig Thr-34. Ann an co-bhoinn de phosphoryleadh Cdk5-mediated de kenase samhlachail a-mach à comas all-chiallach kinase 1 aig Thr-286 chaidh a dhol an sàs ann an gnìomhachadh lùghdachaidh de kinase le inneal-sgaoilidh far-chumhachd 1 / 2. Chuir na buaidhean sin ri lughdachadh a ’chasg de phronnas co-cheangailte ri CAMP le pròtain ceangailte ri cAMP agus cuideachd casg nas lugha air c-fos anns an striatum. Tha na toraidhean sin a ’toirt taic don bheachd gu bheil gnìomhachd Cdk5 an sàs ann an riochdachadh gine ath-leasaichte às deidh dha bhith a’ nochdadh gu ìreach ann an cocaine agus mar sin a ’toirt buaidh air na h-atharrachaidhean fad-ùine ann an gnìomhachd neurononach a bhith a’ toirt cùl-dhruga dha cocain.
Bidh cocog a ’fàs ìrean dopamine synaptic anns an striatum agus a’ atharrachadh abairt na gine anns na neurons dopaminoceptive le bhith a ’toirt a-steach slighean ro-ghinealach a dh’ atharraicheas a ’chiad chomharra bhon ghabhadair dopamine D1 don nobhalas (1). Bidh ùmhlachd leantainneach do chocaine a ’riaghladh grunn fhactaran tar-chuir, a’ toirt gu buil atharrachaidhean mòra ann an abairtean gine a thathar a ’smaoineachadh a tha mar thoradh air ath-bhualaidhean neoiniach ann an tràilleachd cocain (2). ΔFosB, comharraichte mar fhactar tar-sgrìobhaidh (3), air a dhearbhadh gu bheil e a ’freagairt freagairt giùlain dha beathaichean gu cocaine (4, 5). Mar sin, thathar an dùil gun cuir comharrachadh nan ginean targaid a tha air an riaghladh le inductionFosB induction a dh ’èigneachadh le tuigse nas motha den mheur-thalmhainn air taobh a-staigh tràilleachd cocain. O chionn ghoirid, chaidh sealltainn gun d ’làimhseachadh làimhseachadh bheathaichean le cocaine a bhith a’ riaghladh an abairt de kinase a tha an urra ri cyclin-5 (Cdk5) agus a ghnìomhaiche p35 anns an striatum tro inntrigeadh ΔFosB (6, 7).
Tha Cdk5 na bhall den teaghlach Cdk aig kinases serine / threonine. Eu-coltach ri Cdks eile a tha nam prìomh riaghladairean air adhartas cearcall-cealla, tha Cdk5 a ’gabhail a-steach sa mhòr-chuid air fosfosadh fosglaidhean ann an neuroinich postmitotic (8). Thèid dìth sònraichte neo-dhiongmhalta de ghnìomhachd Cdk5 a choileanadh tron cheangal leis an luchd-gnìomhachaidh aige, an dara cuid p35 no p39, a tha air an cur an cèill sa mhòr-chuid ann an neuroinichean postmitotic (8). A bharrachd air an dleastanas deatamach aig Cdk5 ann an leasachadh eanchainn (9, 10), iTha e cuideachd air a bhith ceangailte ri sgaoileadh dopaminergic ann an eanchainn iar-bhreith (11, 12). Bidh casg air gnìomhachd Cdk5 a ’toirt a-mach tuilleadh dopamine a leigeil a-mach san striatum, a’ comharrachadh gu bheil comas preynaptic de Cdk5 mar riaghladair àicheil airson sgaoileadh dopamine. (11). A bharrachd air sin, bidh Cdk5 ag atharrachadh an èifeachd aig comharradh dopamine postynaptic le phosphoryro fosphoprotein a tha fo smachd dopamine-agus cAMP, tomad moileciuil 32 kDa (DARPP-32) aig Thr-75, a dh ’atharraicheas DARPP-32 gu bhith a’ toirt casg air kinase a tha an urra ri cAMP-PK (12).
Tha na beachdan sin a ’moladh gu bheil Cdk5 agus p35 nan riaghladairean sìos an t-sruth airson a bhith a’ toirt a-steach comharran dopamine fad às dèidh dha a bhith faisg air a ’chocàin agus mar sin ann an tràilleachd chocain. Gus barrachd aire a thoirt do dhreuchd Cdk5 mu chomharradh dopamine striatal, chruthaich sinn dà loidhne lucha le bhith a ’gluasad Cdk5 no p35 gu sònraichte ann an neurons fo smachd an neach-p35. Sheall na fhuair sinn gu robh obair Cdk5 air a riaghladh suas le ìrean nas àirde de p35 pròtain ach chan e Cdk5 pròtain, a tha a ’moladh gu bheil ìre p35 pròta-chuingealachadh ìre airson gnìomhachd Cdk5. Bidh sinn a ’toirt seachad an seo ann am vivo fianais gu bheil àrdachadh ann an gnìomhachd Cdk5, mar thoradh air thar-stròc p35, a ’toirt air lughdachadh ann an dopamine a tha air a chrathadh le cocaine a’ comharrachadh dhan niùclas tro thorradh de na casain PKA agus kinase (a tha air an riaghladh le comharraidhean).
Stuthan agus Dòighean-obrach
Antibodies. Chaidh antibodies polyclonal gu Cdk5 (C-8) agus p35 (C-19) a cheannach bho Biotechnology Santa Cruz. Chaidh na antibodies a tha an eisimeil air connadh-biastag agus neo-eisimeilich airson ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, agus pròtain ceangaltach ceangaltach cAMP (CREB) fhaighinn bho Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Na antibodies a dh ’fhaodar a chleachdadh airson connadh-fos-34 DARPP 32 (13), fo-thonn-connaidh-x -UTX DARPP-75 (12), làn DARPP-32 (12), agus c-fos (14) mar a chaidh a mhìneachadh. Chaidh antibody to actin a cheannach bho Sigma.
Beathaichean Deuchainneach. Chlis sinn nas tràithe an gine p35 Cdk5r1, a bhios a ’còmhdach p35 protein, agus a tha a’ comharrachadh a structar gineadach (15). Gus an luchaig tar-ghnèitheach a ghineadh le ro-atmhorachd neuronal de p35 (Tgp35), an 6-kb EcoRI-EcoChaidh am pìos RC anns a bheil roinn an àrdaiche 1.2-kb a chuir a-steach ann am pGEM9Z (-) plasmid, agus chaidh tag 45-bp a thig bho SV40 a chuir a-steach do na KpnTha mi a ’seòladh sìos an abhainn bho am poly (A+) comharra (Fig. 1A). Bha an taga a-staigh SpeTha mi a ’suidheachadh airson a bhith a’ gintinn de na beathaichean. Chaidh an criomag 6-kb a thogail leis a ’phlasmid agus an glanadh, agus an dèidh sin le in-fhuaimneachadh leis an transgene gus an luchainn tar-ghinealach a ghineadh. Sgrùdadh a dhèanamh air ìomhaigh abairte an transgene fo smachd riaghlaidh an neach-adhartachaidh 1.2-kb p35 ann am vivo, chaidh luchag dùbailte transgenic (Tgp35; p35 - / -) a ghineadh tuilleadh le bhith a ’cleachdadh ro-innleachd briodachaidh dà-cheum far an deach ath-nuadhachadh an luchag Tgp35 ann an cùl p35-null neo-dhiadhaidh. Am measg nam modailean eile a chaidh a chleachdadh anns an sgrùdadh seo bha p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/-, agus luchaig tar-chuirneach le ro-thargaid neuronal de Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Bha gineadan de na lucha sin air an dearbhadh le bhith a ’dèanamh anailis bhon phuing a deas no PCR air DNA ginteil air leth bho na biopsies earbaill. Bha luchainn air an cumail ann an cearcall dorcha 12-h / 12-h. Chaidh a h-uile cùram a thoirt seachad a ’gèilleadh ri stiùiridhean Institiudean Nàiseanta Slàinte a thaobh cùram agus cleachdadh bheathaichean obair-lann agus deuchainn.
Mion-sgrùdadh Blot a-Deas. Chaidh DNA ginteil air a thoirt à bith-chnothan earbaill a chladhach le EcoRI agus SpeI, air a chuir ag obair le dealan air glùin agarose 0.9%, agus air a ghluasad gu meamon nylon. Chaidh an meamrann a ghluasad a-mach le tuairmeas air thuaiream 32Probe P-leubail aig 42 ° C tron oidhche. Chaidh an tòimhseachan 485-bp airson gintopadh de p35 knockout (p35 - / -) agus Tgp35 lucha a ghineadh le PCR le bhith a ’cleachdadh na boillsgean a leanas: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ agus 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3 ′. Chaidh am membrane tar-chinealach a sguabadh dà uair ann an 2 × SSC / 0.1% SDS aig 42 ° C airson min 10, agus dà uair ann an 0.1 × SSC / 0.1% SDS aig 65 C airson mionaid 20, agus fosgailte do fhilm x-gha.
Làimhseachadh dhrugaichean. Chaidh Cocaine (Sigma) a thoirt à bith ann an salann neo-ghrinn. Chaidh beathaichean a spìonadh le ioc le cocaine (15 mg / kg) no àireamh co-ionann de shalainn aig aois 3 mìosan agus a mharbhadh le decapitation aig diofar amannan ama (15, 30, 60, agus 120 min) às dèidh an ann-stealladh. Chaidh brains a thoirt air falbh gu luath agus am fuarachadh ann am PBS fuar-deighe. An uair sin chaidh an striata a thoirt a-mach agus a dhol tro sgrùdadh blot a tuath no an iar. Airson mion-sgrùdadh immunohistochemical, fhuaireadh earrannan striatal bho luchagan 2 h an dèidh an ann-stealladh.
Mion-sgrùdadh Blot a Tuath. Chaidh RNA iomlan a thoirt às an striata leis an reachd clòzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) agus fo sgrùdadh blot a Tuath mar a chaidh a mhìneachadh (18). Airson c-fos mRNA a lorg, chaidh criomag 189-bp de luch c-fos cDNA a chleachdadh mar deuchainn mar a chaidh a mhìneachadh (19). Chaidh ìrean c-fos mRNA a thomhas le bhith a ’tomhas dùmhlachd optamach a’ chòmhlain shònraichte le bhith a ’cleachdadh siostam sgrùdadh dhealbhan le bathar-bog nih image, Version 1.62.
Mion-sgrùdadh Blot an Iar. Chaidh meinigean Striatal a chuir an gnìomh ann an LSA 1% agus air an goil airson mionaid 10. Chaidh an dùmhlachd pròtain anns gach sampall a dhearbhadh le measail pròtain BCA (Pierce). Bha sùimean de phròtain air an sgaradh le SDS / PAGE mus deach an gluasad gu meamrann nitrocellulose. Chaidh na seicichean a bhacadh ann an 1 × PBS anns an robh bainne sgim 5% agus 0.05% Tween 20 agus chaidh an gintinn le prìomh antibodies tron oidhche aig 4 ° C. Chaidh gintinn le in-luchag no coineanach le peroxidase a ’dèanamh IgG (Sigma) a dhèanamh aig teòthachd seòmar airson 60 min. Chaidh comharra a lorg le ceimigeachd nas fheàrr (Pierce), agus chaidh tomhas de na bannan a rèir mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.
Cdk5 Kinase Assay. Chaidh lòsan Striatal ullachadh le bufair lysis a ’toirt a-steach 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM MALA / 5% TRTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride / 1 mlg / ml aprotinin / 1 μg / casg leupeptin / phosphatase (measgachadh tobair neach-phosphatase I agus II, Sigma). Chaidh na lysates a thoirt a-steach le antibodies anti-Cdk5 (C-8) no anti-p35 (C-19). Chaidh an Cdk5 immunoprecipitates ullachadh le guir 300 μl den lysate (a ’co-fhreagairt ri 300 proteing de phròtain) le antibody anti-Cdk5 (3 μg) tron oidhche aig 4 ° C agus le sin guir eile le 25 μl de ghloinichean A-agose Protein (50 % sgiodair anns a ’chrannchur lysis; Biotechnology Santa Cruz) airson 3 h aig 4 ° C. Airson a bhith ag ullachadh p35 immunoprecipitates, chaidh 500 μl den lysate (a ’co-fhreagairt ri 1 mg de phròtain) a ghoirteachadh le antibody anti-p35 (3 μg) mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd. Chaidh a ’immunoprecipitates a sguabadh dà uair leis a’ bhufair lysis agus dà uair le bufair kinase a ’toirt a-steach 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, air ath-shuidheachadh ann an 60 μl den bhufair kinase. Chaidh gnìomhachd Kinase a thomhas le bhith a ’cleachdadh histone H1 mar fho-fhilleadh (18).
Immunohistochemistry. Bha luchagan air an sàrachadh le inp insteintean de avertin (250 mg / kg, Fluka) agus le bhith air an gearradh às na chèile le bufair sodium phosphate 0.1, pH 7.4, air a leantainn le Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), leasachadh nach robh tarraingeach. Chaidh an eanchainn a chaidh a thoirt a-mach a shuidheachadh nas fhaide san aon cheart-chopaidh tron oidhche aig 37 ° C. An uair sin, bha eanchainn air am fighe a-steach do pharafain, air an gearradh ann an earrannan crùnaidh 5-μm-tiugh agus a ’dol gu immunohistochemistry le bhith a’ cleachdadh modh iom-fhillte aingin-biotin-peroxidase (Vector Laboratories) le diaminobenzidine mar fho-ionad. Chaidh na h-earrannan a ghoid le antibody polyclonal ceangailte ri dlùthachadh an aghaidh c-fos thar oidhche aig 4 ° C. Chaidh an suaicheantas glanaidh a mheas le bhith a ’fàgail na prìomh antibody.
toraidhean
Ginealach de luchagan tar-ghinealach le ro-thargaid Neuronal air p35. Bha an transgene a chaidh a chleachdadh gus barrachd riochdachaidh neuronon de p35 a choileanadh a ’dèanamh suas criomag 6-kb de ghine p35 na luchaige anns a bheil an 1.2-kb agus an sreath còdachaidh iomlan de p35 (Fig. 1 A). Bha na gineadan de luchainn air an dearbhadh le mion-sgrùdadh Southern Blot le bhith a ’cleachdadh deuchainn a chaidh a dhealbh gus eadar-dhealachadh a dhèanamh eadar p35 - / - agus luchagan Tgp35 à luchagan fiadhaich (Fig. 1 A agus B). Gus sgrùdadh a dhèanamh air an abairt transgene fo smachd an neach-àrdachaidh 1.2-kb p35, chruthaich sinn luchagan tar-dhùbailte dùbailte (Tgp35; p35 - / -) anns an deach abairt p35 a dhraibheadh ach bhon transgene. An abairt p35 ann an Tgp35; p35 - / - cha robh luchainn air fhaicinn ach san eanchainn (Fig. 1C), far an robh am pàtran deasachaidh spàsail coltach ris an ìre de luchagan fiadhaich (Fig. 1D). Chaidh dearbhadh nach eil cion p35 a ’adhbharachadh gu bheil structar neo-àbhaisteach air a chuir air adhart ann an cortex cerebral agus hippocampus de luchainn (10). Ach, sheall an Tgp35; p35 - / - luchag làn-teasairginn den p35-/ - phenotype eanchainn (Fig. 1E). Tha na dàta sin a ’sealltainn gun robh an neach-àrdachaidh 1.2-kb p35 a’ riaghladh an abairt den transgene le pròifil abairt coltach ris sin aig p35 bhon ghine p35 in-ghnèitheach.
Ìre Ìre Prìosain p35 A bheil Ìre-chuingealachaidh ann airson Smachd aig Cdk5. Rinn sinn sgrùdadh air buaidh gine-dosage nan ginean a ’nochdadh p35 agus Cdk5 air abairt pròtain ann an earrannan striatal bho p35 - / -, p35 +/-, seòrsa fiadhaich, Tgp35, Cdk5 +/-, agus TgCdk5 lucha aig aois 3 mìosan. Bha na h-ìrean p35 agus Cdk5 pròtain co-ionann gu math ris na dosgean gine, fa leth (Fig. 2 A agus B). Nochd Tgp35 lucha meudachadh ≈1.6-ìre ann an ìre pròtain p35 an coimeas ri luchagan fiadhaich, ach cha robh buaidh aig na diofar ìrean de phròg p5 air ìrean pròtain Cdk35. Nochd TgCdk5 luchagan meudachadh ≈1.9-ìre ann an ìre pròta Cdk5 an coimeas ri luchagan fiadhaich, ach cha robh buaidh aig na diofar ìrean de phròtain Cdk35 air ìrean pròtain p5. Gus sgrùdadh a dhèanamh air buaidhean diofar mhionaidean de p35 pròtain air gnìomhachd Cdk5, chaidh Cdk5 a thoirt a-steach às às ùr-dhuilleagan le gnìomhan an-aghaidh Cdk5 agus chaidh gnìomhachd kinase a thomhas. Mar an ceudna, airson sgrùdadh a dhèanamh air buaidh diofar mhìrean de phròcal Cdk5 air gnìomhachd kinase, chaidh p35 a thoirt a-steach às às ùr-dhuilleagan le stràcan ant-p35, agus chaidh gnìomhachd kinase a thomhas. Bha gnìomhachd Cdk5 co-cheangailte gu math ri ìre pròta p35 ach nach robh le ìre pròtain Cdk5 (Fig. 2 C agus D). Tha na toraidhean seo a ’sealltainn gu bheil na tha ann am p35 pròtain na fhactar a tha a’ cur casg air reat airson gnìomh Cdk5. Mar sin chleachd sinn Tgp35 luchagan gus sgrùdadh a dhèanamh air buaidh gnìomhachd nas àirde Cdk5 air comharran dopamine striatal.
Tha Phosphorylation de Chocaine a chaidh a dhèanamh le DARPP-32 aig Thr-34 air a mhagadh ann an Tgp35 Mice. Bidh dreuchd DARPP-32 an crochadh air an staid fosphorylation aige aig iomadh làrach (20). Pos phosphorylates PKA DARPP-32 aig Thr-34, ach Cdk5 phosphorylates DARPP-32 aig Thr-75. Mar sin, rinn sinn sgrùdadh air staid fosphorylation DARPP-32 ann an earrainnean striatal bho seòrsa fiadhaich agus luchainn Tgp35. Bha an ìre de phosphos-Thràth-75 DARPP-32 nas àirde ann an luchaichean Tgp35 (Fig. 3A; 1.6 ± 0.2-fillte os cionn luach luchagan fiadhaich. Rinn sinn measadh a-rithist air buaidh gnìomhachd nas àirde Cdk5 air comharran dopamine striatal. Rinn sinn sgrùdadh air gnìomhachadh PKA a chaidh a bhrosnachadh le cochall ann an Tgp35 luchainn le bhith a ’dèanamh mion-sgrùdadh air staid phosphorylation de DARPP-32 aig Thr-34. Chaidh an ìre de phosphos-Thr-34 DARPP-32 a mheudachadh ann an luchagan fiadhaich-seòrsa 15 mionaid an dèidh an in-stealladh cocàin (Fig. 3B; 1.8 ± 0.2-fillte os cionn na h-ìre bunasach). Ach, bha buaidh coileach air fo-fhineadh Thr-34 de DARPP-32 air a mhalachadh ann an luchag Tgp35 (1.2 ± 0.3-fillte os cionn na h-ìre bunail). Tha na toraidhean seo a ’sealltainn gun do mheudaich àrdachadh de ghnìomhachd Cdk5 an gnìomhachadh PKA a’ toirt a-steach le bhith a ’fàs tron bhosfraidh DARPP-32 aig Thr-75 (6, 12). Tha e comasach cuideachd gu bheil àrdachadh ann an gnìomhachd Cdk5 presynaptic a ’toirt air falbh le sgaoileadh dopamine nas ìsle, agus gu bheil seo a’ cur ris a ’bhuaidh lùghdaichte a th’ aig cocaine. Gu sònraichte, cha tug aon stealladh de chocàin buaidh air ìrean p35 agus Cdk5 pròtain cho math ris an obair kinase (Fig. 3 C agus D). Tha seo ann an coimeas ri sgrùdadh a chaidh a dhèanamh roimhe far a bheilear a ’sealltainn gu bheil dìth dubhaig air cocaine a’ seasamh an-àirde cleachdadh p35 agus Cdk5 (6).
Leudachadh air Cdk5 Gnìomhachd ag Àrdachadh Luchd-gnìomhachaidh Cocaine-ERK1 / 2. Tha fianais o chionn ghoirid a ’sealltainn gu bheil gnìomhachadh dopamine anns an striatum cuideachd a’ cur air adhart casganan comharrachaidh eile, a ’gabhail a-steach slighe ERK (21, 22), aig a bheil àite cudromach ann am freagairt giùlain dha cocaine (23). Mar sin rannsaich sinn an robh gnìomh Cdk5 a ’toirt buaidh air gnìomhachadh cothroim a chuir air slighe ERK. Chaidh gnìomhachadh an t-slighe ERK an sgrùdadh an dèidh stealladh a ’chocàin ann an earrainnean teann bho luchagan fiadhaich, mar a chithear le barrachd iteach de MEK1 / 2 aig Ser-217 agus Ser-221 (1.5 fold 0.2-fillte os cionn ìre na bun-ìre) agus de ERK1 / 2 aig Thr-202 agus Tyr-204 (ERK2 phosphorylation: 1.5 ± 0.2-fillte os cionn na h-ìre bunail) (Fig. 4 A agus B). Ach, chaidh brìgh cothroim MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2) os cionn a ’ìre basal agus ERK1 / 2 (ERK2 phosphorylation: 1.2 ± 0.2-fillte os cionn ìre na bun-ìre) a lùghdachadh ann an luchag Tgp35 (Fig. 4 A agus B). A bharrachd air an sin, bha na h-ìrean basphos-ERK1 / 2 nas ìsle ann an luchagan Tgp35 (0.8 ± 0.2-huaire fo luach luchagan fiadhaich), ach cha robh an gluasad seo cudromach gu staitistigeil. Dh'fhaodte gun tèid an toradh mu dheireadh seo a chur às leth fosfair le Cdk5-MEX1 aig Thr-286, a dh'adhbhraicheas lùghdachadh na gnìomhachd catalaíoch (24). Gus measadh a dhèanamh air a ’chomas seo, rinn sinn sgrùdadh air staid fhosfair anns a bheil MEK1 aig Thr-286 agus fhuair sinn a-mach gun robh ìrean nas àirde de fhosphos-Thr-286 MEK1 an làthair ann an earrannan às-teallach bho luchag Tgp35 (Fig. 4C; 1.3 ± 0.1-fillte os cionn luach luchagan fiadhaich. A bharrachd air an sin, cha deach atharrachadh a dhèanamh air staid fosfair le MEK1 aig Thr-286 le aon ann-stealladh de chocàin, co-chòrdail ris an lorg nach robh buaidh aig an làimhseachadh air gnìomhachd Cdk5 (Fig. 3D).
Iomadachadh Dopamine Tha bhith a ’comharrachadh comharran don Nucleus air a mhaothachadh le barrachd Cdk5. Le bhith a ’dèanamh a-mach gu bheil cromagan a’ toirt a-steach a dh ’a ghnothach le Cocaine a’ toirt a-steach PKA agus ERK, bidh am briathar tar-chuir CREB anns a ’niùclas a chuir air adhart às deidh sin le bhith ga chuir a-mach gu Ser-133 (22, 25). Gus sgrùdadh co-dhiù am faodadh na h-èifeachdan casg Cdk5-mediated air casaidean gnìomhachaidh PKA agus ERK buaidh fhaighinn air dùsgadh brèige CREB anns an niùcras, rinn sinn sgrùdadh air staid fhosfair anns a bheil CREB aig Ser-133 ann an earrainnean striatal bho seòrsa fiadhaich agus luchainn Tgp35. Bha ìre bhunaiteach phosphos-CREB nas ìsle ann an luchag Tgp35 (0.7 ± 0.1-fillte de luach luchagan fiadhaich) (Fig. 5). Ann a bhith a ’toirt seachad stealladh de chocàin, chaidh an ìre de phosphos-CREB àrdachadh ann an striatum luchagan fiadhaich (1.5 ± 0.1-pasg os cionn ìre na bun-ìre), ach chaidh an fhreagairt seo do chocàin a lùghdachadh ann an luchag Tgp35 (1.2 ± 0.1- a ’dol thairis air an ìre ìseal (Fig. 5).
Bidh phosphorylation de CREB aig Ser-133 a ’cur ris a’ ghnìomhachd tar-sgrìobhaidh aige tro eileamaid freagairt CAMP anns an roinn adhartachaidh de ghinean sònraichte, a ’gabhail a-steach gine c-alt (26). Mar sin rinn sinn sgrùdadh air inntrigidh c-fos ann an striatum de seòrsa fiadhaich agus luchagan Tgp35 às deidh stealladh cnòcain. Ann an luchagan fiadhaich, dh'èirich ìre c-fos mRNA gu luach luachmhor (1.8 ± 0.2-pasg os cionn ìre na bun-ìre) 30 min às deidh stealladh de chocàin, agus an uairsin air a thilleadh chun ìre basal le 120 min às deidh an stealladh (Fig. 6 A agus B). Ach, bha ìrean c-fos mRNA ≈30% nas ìsle ann an luchagan Tgp35 na ann an luchagan fiadhaich gu 30 mionaid às deidh an ann-stealladh (Fig. 6 A agus B). Bha barrachd inntrigidh dha c-Foster ann an luchag Tgp35 air a dhaingneachadh a-rithist le immunohistochemistry (Fig. 6 C-F). Mheudaich rianachd cocaine immunoreactivity c-fos, gu mòr ann am pàirtean dorsomedial-dorsocentral an striatum agus gu lag anns na pàirtean taobhach, anns an dà chuid fiadhaich agus luchainn Tgp35. Ach, bha an àrdachadh ann an àireamh nan ceallan c-fos-immunopositive air a sparradh gu ìre mhòr air am mùchadh ann an striatum luchagan Tgp35 (Fig. 6G). Còmhla, tha na toraidhean sin a ’sealltainn gun deach casg a chuir air adhartas dopamine stròc a tha a’ cleachdadh cocaine ri bhith a ’toirt comharra ann an Tgp35 luchainn, toradh coltach ri bhith ag àrdachadh Cdk5 gnìomh.
Deasbaireachd
Chaidh Cdk5 agus an gnìomhaiche p35 aige aithneachadh mar ghineadan targaid a tha air an riaghladh le bhith a ’nochdadh gu bhith cràbhach do chocàin (6). Tha sinn ag aithris an seo gu bheil fianais ann gun tàinig àrdachadh air gnìomhachd Cdk5, mar thoradh air riaghladh p35 suas-suas seach Cdk5 suas-riaghlaidh, gu lasachadh air comharran dopamine a tha co-cheangailte ri cocain ann an neurons striatal. Gus sgrùdadh a dhèanamh air na buaidhean bhon chainnt air a bheil riaghailt suas de Cdk5 no p35 air comharran dopamine striatal, chaidh sgrùdadh a dhèanamh air dà loidhne luchaig tar-luinge, TgCdk5 agus Tgp35 luchagan. Lorg sinn gun robh gnìomhan Cdk5 air an riaghladh suas ann an co-rèir ri ìre nas àirde de phrotag p35 ach nach robh buaidh aig ìre nas àirde de phròtain Cdk5 air. Tha an aithisg mu dheireadh againn cuideachd air sealltainn gun robh gnìomhachd Cdk5 ann an TgCdk5 mouse brain na bu lugha na ann an eanchainn luch-fhiadhaich nuair a chaidh an gnìomhachd a thomhas le bhith a ’cleachdadh Cdk5 immunoprecipitates (17), a ’moladh gu bheil Cdk5 thar-dhuilgheadas a’ toradh ann an ìre nas àirde de Cdk5 à taobh a-muigh ma tha ìre p35 nas motha. Tha na toraidhean seo a ’sealltainn gun robh ìre p35 pròtain na fhactar aig reat-ìre airson gnìomh Cdk5.
Nochd Tgp35 luchaichean an toirt a-steach nas lugha an dà chuid de phosphorylation CREB agus c-fos san striatum às deidh faighinn a-steach gu faiceallach bho chocàin, a 'moladh gun do chuir gnìomh Cdk5 casg air an fhreagairt striatal ri cocaine. Tha e coltach gun deach lughdachadh air comharran dopamine cocaine ann an Tgp35 mice a thoirt gu buil tron chasg bho Cdk5-mediated de dh'iomadh casgan comharrachaidh a tha a ’toirt a-steach DARPP-32, PKA, agus ERK. Chuir rianachd Cocaine suas PKA phosphorylation de DARPP-32 aig Thr-34 ann an luchagan fiadhaich, ach chaidh am freagairt seo a lughdachadh ann an luchainn Tgp35. Chaidh a dhearbhadh gun cuir phosphorylation à DARPP-32 aig Thr-34 bacadh air gnìomhachd phosphatase pròtain 1 (PP1), an einsím a tha an urra ri dephosphorylation de Ser-133 de CREB (27). Mar sin, cha bhiodh gnìomhachd PP1 air a ghlaodadh tro shlighe DARPP-32 / PP1 ann an Tgp35 luchainn.
Chaidh gnìomhachadh brosnachail Cocaine de ERK1 / 2 a ghluasad cuideachd ann an luchainn Tgp35. Tha grunn uidheaman sònraichte ann leis am faodadh Cdk5 casg a chuir air gnìomhachadh co-cheangailte ri cocaine ERK1 / 2. An toiseach, dh ’fhaodadh fo-fhactaraidh de DARPP-5 aig Thr-32 casg a chuir air PKA, a’ leantainn air adhart gu casg air gnìomhachd MEK75 / 1 le PKA a tha riatanach airson gnìomhachadh ERK2 / 1. Tha sgrùdadh a chaidh a dhèanamh o chionn ghoirid cuideachd air faighinn a-mach gu bheil feum air fosphosadh DARPP-2 aig Thr-32 airson gnìomhachd ERK34 / 1 le measgachadh de chocain tro ioma shlighean a tha a ’toirt a-steach riaghladh neo-dhìreach a’ ghnìomhachadh MEK a bharrachd air a bhith a ’toirt a-steach riaghladh phosphatase le striatal-saibhrithe, tyrosine phosphatase a tha ag obair gu dìreach air ERK2 / 1 (28). Tha taic don chomas seo air a mholadh leis an toradh gun deach cuir às do phosphorylation de MEK1 / 2 a dh'adhbhraich cocain ann an Ser-217 agus Ser-221 ann an luchainn Tgp35. Tha slighe eile a ’dol tro fosphorylation de MEK5 aig Thrd-1, a dh'adhbhraicheadh lùghdachadh air a ghnìomhachd catalaíoch agus a ghluaiseas gnìomhachd ERK286 / 1 (24).
Chaidh a dhearbhadh gu bheil casg air gnìomhachd Cdk5 anns an striatum a ’neartachadh buaidh giùlain co-dhruga chocaine ann am beathaichean (6). A ’co-chòrdadh ris an beachd-bharail gum faod riaghladh Cdk5 a bhith ga riaghladh gu bhith a’ dèanamh atharrachadh neuronon airson a bhith a ’dol an-aghaidh buaidh rianachd riaghailteach a’ chocain (6), fhuair sinn a-mach gun chuir cdk5-phosted phosphorylation de DARPP-32 agus MEK1 ri lughdachadh ann an gnìomhachadh co-cheangailte ri cocaine de ERK1 / 2, agus mar thoradh air an toirt a-steach nas lugha de phosphationing CREB agus c-fos san striatum. Tha na toraidhean againn a ’toirt taic don bheachd gum faod gnìomh Cdk5, mar thoradh air p35-up, atharrachadh abairt gine atharrachadh anns an striatum às deidh dha bhith faisg air a bhith faisg air cocaine. Dh ’fhaodadh seo tachairt tro atharrachaidhean ann an gnìomhan nam factaran tar-sgrìobhaidh leithid CREB agus c-fos. Mar sin, faodaidh an p5 gnìomhaiche Cdk35, mar thoradh air a bhuaidh aig cuingealachadh ìre air gnìomhachd Cdk5, cur ri atharrachaidhean maireannach ann an gnìomhachd neurononach a ’bhunaiteachadh ana-caitheamh cocain.
Acknowledgments
Tha sinn a ’toirt taing do Drs. Màiri Jo Danton, Philip Grant, agus Sashi Kesavapany airson leughadh riatanach den làmh-sgrìobhainn. Chaidh taic a thoirt don obair seo le Institiud Nàiseanta nan Tabhartasan Slàinte Z01DE00664-05 (gu ABK), Tabhartas Seirbheis Slàinte Poblach na SA DA10044, agus tabhartasan bho Urras Simons, Stèidheachd Peter J. Sharp, agus Bunait Picower (gu PG).
Notaichean
Giorrachaidhean: Cdk5, cyclin-depend kinase 5; ERK, kinase air a riaghladh le suaicheantasan; DARPP-32, fosphoprotein air a riaghladh le copP agus cAMP, tomad moileciuil 32 kDa; PKA, cAMP-dependin kinase; MEK, ERK kinase; CREB, pròtain ceangaltach cAMP-freagairt.
iomraidhean
;
