Bidh Dopamine a ’toirt taic do dhuais fhaighinn le bhith a’ brosnachadh leamhachadh cluas-dùinte anns an nuumbeus accumbens (2014).

Ro-ràdh

Tha an ro-shealladh dopamine bhon sgìre reusanach fionnaidh (VTA) gu NAc na phàirt riatanach den chuairt ciorraideach a bhios ag adhartachadh giùlan a tha a ’feuchainn ri duais (Nicola, 2007). Ma thèid obair dopamine NAc a lùghdachadh gu deuchainneach, tha beathaichean nas buailtiche oidhirp a dhèanamh gus duais fhaighinn (Salamone agus Correa, 2012) agus gu tric gun a bhith a ’dèiligeadh ri sanasan duais-fàisneachd (Di Ciano et al., 2001; Yun et al., 2004; Nicola, 2007, 2010; Saunders agus Robinson, 2012). Tha na h-uireasbhaidhean seo mar thoradh air a ’lùghdachadh de phàirt sònraichte de dhuais duais: tha àrdachadh ann an dol-a-mach a dhol an sàs ann an dòigh-obrach, ach luathas an dòigh-obrach, an comas an amas a lorg agus an giùlan obrachail a dh’ fheumas a dhèanamh gus duais a chosnadh, agus an comas cha bhith a ’toirt buaidh air duais (Nicola, 2010). Feumaidh Dopamine dòigh-obrach a bhrosnachadh le bhith a ’toirt buaidh air gnìomhachd neurons NAc, ach tha nàdar na buaidh seo fhathast mì-shoilleir. Tha cuibhreannan mòra de neurons NAc air bhioran no air an casg le sanasan duais-fàisneachd (Nicola et al., 2004a; Roitman et al., 2005; Ambroggi et al., 2008, 2011; McGinty et al., 2013), agus bidh na h-ùrachaidhean a ’tòiseachadh mus do thòisich iad air giùlan dòigh-dèiligidh ciùbach agus a’ dèanamh fàisneachd air an ùine anns am faod iad a dhol air adhart (McGinty et al., 2013). Mar sin, tha na feartan aig a ’ghnìomhachd seo a tha riatanach airson comharra a tha an urra ri dopamine a bhrosnaicheas dòigh-obrach cued, ach chan eil fios a bheil e a’ dèanamh sin.

Neurons ann an dà structar a chuireas teachdaichean glutamatergic chun NAc, am BLA agus PFC medial dorsal (Brog et al., 1993), air bhioran le sanasan duais-ro-innse (Schoenbaum et al., 1998; Ambroggi et al., 2008), agus neo-ghnìomhachadh aon de na structaran sin (Ambroggi et al., 2008; Ishikawa et al., 2008) no den VTA (Yun et al., 2004) a ’lughdachadh meud excitations cue-evoked anns an NAc. Tha na beachdan sin a ’toirt fa-near gu bheil cuiridhean NAc cue-evoked air an stiùireadh le cuir a-steach glutamatergic, ach às aonais NAc dopamine, chan eil eadhon na cuir a-steach làidir excitatory sin gus àrdachadh losgaidh cue-evoked a stiùireadh. Ach, tha an co-dhùnadh seo gabhaltach. Tha cuisean a ’cur bacadh air mòran de neurons NAc (Nicola et al., 2004a; Ambroggi et al., 2011) agus chan eil fios a bheil cuiridhean no toirmeasg nas cudromaiche airson giùlan dòigh-obrach a ghnìomhachadh. A bharrachd air an sin, dh ’fhaodadh neo-ghnìomhachd VTA cuir às do bhrosnachaidhean leth-bhreith (DS) - ath-chuiridhean le grunn uidheaman neo-eisimeileach dopamine: còdachadh cue lùghdaichte anns a’ BLA agus PFC, a gheibh ro-mheasaidhean bhon VTA (Swanson, 1982); losgadh nas lugha de neurons GABAergic VTA a tha a ’pròiseict chun NAc (Van Bockstaele agus Pickel, 1995); no lughdachadh nas lugha de glutamate bho neurons dopaminergic (Stuber et al., 2010). Mu dheireadh, seach gu bheil neo-ghnìomhachd VTA a ’lughdachadh chan e a-mhàin losgadh NAc DS-evoked, ach cuideachd giùlan dòigh-obrach DS-evoked (Yun et al., 2004), Dh ’fhaodadh excitation DS a bhith àrd-sgoile seach mar chumha riatanach airson gluasad air a stiùireadh le amasan.

Gus deuchainn a dhèanamh gu dìreach air an àite a th ’aig NAc dopamine ann an losgadh le cue, dhealbh sinn probe nobhail airson a chleachdadh ann a bhith a’ giùlan radain: sreath dealain cruinn timcheall air cannula stealladh meadhanach, a leigeas le bhith a ’clàradh aig an aon àm gnìomhachd losgadh aonad agus a’ toirt a-steach antagonists gabhadair dopamine. a-steach don àite extracellular timcheall air na neurons clàraichte (du Hoffmann et al., 2011). Tha an rèiteachadh seo a ’leigeil leinn ceanglaichean a stèidheachadh eadar gnìomhachadh gabhadair dopamine, losgadh neuronal NAc, agus giùlan a tha a’ sireadh duais: ma chuireas bacadh air gabhadairean dopamine NAc bacadh air an dà chuid comharran cue-evoked agus tòiseachadh air dòigh-obrach, bheireadh seo fianais làidir gu bheil an fhreagairt neuronal an urra ri dopamine endogenous agus gu bheil feum air a ’chomharra seo airson giùlan dòigh-obrach.

Stuthan agus Dòighean-obrach

Ainmhidhean.

Fhuaireadh còig-deug radan fireann Long-Evan (275 - 300 g nuair a ràinig iad) bho Abhainn Charles agus bha iad nan aonar. Aon seachdain às deidh dhaibh ruighinn, chaidh radain a làimhseachadh airson grunn mhionaidean gach latha airson 3 d gus an toirt don neach-deuchainn. An dèidh àiteachadh, chaidh na radain a chuir air daithead cuibhrichte de 13 g de radan chow gach latha. Ad libitum chaidh biadh a thoirt seachad airson 7 d às deidh obair-lannsa, às deidh sin chaidh beathaichean a chuir air ais air an daithead cuibhrichte. Bha modhan bheathaichean co-chòrdail ri Stiùireadh Nàiseanta Institiudan Slàinte airson Cùram is Cleachdadh Bheathaichean Saotharlann agus chaidh an aontachadh le Comataidh Institiùid Cùram is Cleachdadh Bheathaichean Colaiste Leigheas Albert Einstein.

Seòmraichean obrachaidh.

Chaidh a h-uile deuchainn giùlan agus trèanadh giùlain a dhèanamh ann an seòmraichean Plexiglas a chaidh a dhèanamh gu sònraichte (ceàrnag 40 cm, 60 cm àrd). Bha iad sin suidhichte am broinn caibineatan meatailt a bha nan cèidsichean Faraday; bha caibineatan air an lìnigeadh le foam fuaimneach agus bha fuaim geal air a chluich gu leantainneach tro neach-labhairt sònraichte gus an cluinnear fuaim a-muigh san t-seòmar. Bha seòmraichean obrachaidh air an uidheamachadh le gabhadan duais air aon bhalla le luamhanan a ghabhas toirt air ais air gach taobh dheth. Chaidh photobeam air feadh aghaidh a ’ghabhadain a chleachdadh gus amannan inntrigidh is fàgail a thomhas. B ’e an rèiteachadh ùineail den t-siostam smachd giùlan (Med Associates) 1 ms.

Gnìomh DS.

Chaidh beathaichean a thrèanadh air a ’ghnìomh DS a’ leantainn mhodhan coltach ris an fheadhainn a chaidh a chleachdadh roimhe (Nicola et al., 2004a,b; Ambroggi et al., 2008, 2011; Nicola, 2010; McGinty et al., 2013). Chaidh dà chuing a thaisbeanadh aon aig an aon àm, an dàrna cuid DS ro-innseach no brosnachadh neodrach (NS). Bha na dùirn sgrùdaidh a ’gabhail a-steach tòna dùdach (a bha a’ rothaireachd ann an tricead bho 4 gu 8 kHz thairis air 400 ms) agus tòna eadar-shoilleir (tòn 6 kHz air airson 40 ms, dheth airson 50 ms); chaidh sònrachadh tòna sònraichte don DS no NS air thuaiream thar radain. Chaidh amannan eadar-ghnèitheach (ITIan) a thaghadh air thuaiream bho chuairteachadh eas-chruthach truncated le cuibheas de 30 s agus 150 s aig a ’char as àirde. Bha an NS an-còmhnaidh air a thaisbeanadh airson 10 s; chaidh pàipearan-naidheachd luamhan a chlàradh tron ​​NS ach cha robh buil prògramaichte aca. Chaidh luamhanan “gnìomhach” agus “neo-ghnìomhach” a thoirt seachad air thuaiream do luamhan clì is deas airson gach radan aig toiseach an trèanaidh agus cha robh iad ag atharrachadh às deidh sin. Chuir freagairt luamhan air a ’luamhan gnìomhach rè DS crìoch air a’ bheachd, agus dh ’adhbhraich a’ chiad inntrigeadh gabhadain às deidh sin duais sucrose 10% a thoirt a-steach gu tobar a bha suidhichte anns a ’ghabhad. Chaidh taisbeanaidhean DS nuair nach do fhreagair am beathach a thoirt gu crìch an dèidh 10 s. Chaidh freagairtean rè an ITI (eadar taisbeanaidhean cue) agus freagairtean air an luamhan neo-ghnìomhach a chlàradh ach cha tug iad seachad duais. Chaidh beathaichean a thrèanadh air a ’ghnìomh DS gus an do fhreagair iad> 80% de DSs agus <20% NS ann an seiseanan trèanaidh 2 h.

Arrays microelectrode cannulated.

Às deidh an trèanadh tùsail, chaidh radain a chuir a-steach le microarrays cannulated air a dhèanamh suas de ochd electrodan microwire tungsten timcheall air cannula iùil microinjection meadhanach. Bha iad sin air an togail agus air an cur suas ann am microdrives dèanta mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (du Hoffmann et al., 2011). Ghluais tionndadh deiseal iomlan den sgriubha dràibhidh na dealanan agus cannula mar aonad sa bhad 300 μm (às aonais cuairteachadh nan probes), a ’toirt cothrom dhuinn clàradh bho ghrunn àireamhan sònraichte de neurons san aon bheathach.

Gus na h-àirean cannulated a chuir an sàs, chaidh radain ullachadh airson obair-lannsa agus an cur ann an ionnstramaid stereotaxic mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (du Hoffmann et al., 2011; McGinty et al., 2013). Chaidh anesthesia a thoirt a-steach agus a chumail suas le isoflurane (0.5 - 3%). Fhuair beathaichean antibiotic (Baytril) dìreach ro obair-lannsa agus 24 h post-lannsa. Chaidh arrays cannulated a chuir a-steach gu dà-thaobhach a-steach do chridhe NAc dorsal (1.4 mm anterior agus 1.5 mm fadalach bho bregma, agus 6.5 mm ventral bhon chlaigeann). Chaidh electrodes agus microdrives a cheangal ris a ’chlaigeann le sgriothan cnàimh agus acrylic fiaclaireachd, agus chaidh obturators uèir a chuir a-steach don cannulae treòrachaidh gus am biodh cinn nan obturators air an sruthadh le cinn an cannulae treòrachaidh. Às deidh lannsaireachd, chaidh an sgalp a làimhseachadh le Neo-Predef gus casg a chuir air galar agus fhuair na beathaichean seachdain 1 fhaighinn air ais mus deach iad air adhart le deuchainnean. Airson analgesia posturgery, chaidh beathaichean a thoirt dha 10 mg / kg den ketoprofen droga anti-inflammatory nonsteroidal.

Drogaichean.

Chaidh SCH23390 agus raclopride a cheannach bho Sigma. Air làithean deuchainn, chaidh drogaichean ullachadh gu h-ùr le bhith gan sgaoileadh ann an saline steril 0.9%. Chaidh drogaichean a thoirt seachad aig dòsan de 1.1 μg SCH233390 ann an 0.55 μl saline gach taobh agus 6.4 μg raclopride ann an 0.8 μl saline gach taobh. Chaidh SCH233390 agus raclopride a thoirt a-steach thairis air 12 agus 17.5 min, fa leth. Ann an deuchainnean pìleat, lorg sinn gu robh buaidhean mòra ach neo-ghluasadach aig in-ghabhail dà-thaobhach de raclopride a mhaireas 12 min air co-mheas freagairt DS. Mar sin, gus a ’bhuaidh a leudachadh mheudaich sinn fad an in-fhilleadh raclopride gus am biodh ìomhaigh ùineail a’ bhuaidh cungaidh-leigheis aige coltach ri ìomhaigh SCH23390. Cha deach ach aon in-stealladh dà-thaobhach no aon-thaobhach a dhèanamh airson gach seisean clàraidh (aon seisean san latha). Fhuair a h-uile beathach co-dhiù aon in-stealladh dà-thaobhach de aon antagonist, agus aon (no grunn) stealladh antagonist aon-thaobhach. Rè cuid de dheuchainnean antagonist aon-thaobhach, chuir sinn a-steach saline aig an aon àm mar smachd smachd carbaid ris an leth-chruinne a fhuair antagonist.

Microinjection agus modh clàraidh.

Chaidh iomradh a thoirt roimhe air an uidheamachd airson meanbh-sgrùdadh agus clàradh aig an aon àm (du Hoffmann et al., 2011). Thàinig an càball clàraidh a bha a ’dol bho àrd-ùrlar a’ chinn gu crìch ann an inneal-luachaidh dealain 24-sianal le toll-cladhaich sa mheadhan (Moog), a thug na comharran don t-siostam clàraidh electrophysiologic. Chaidh dà steallaire a chuir suas ann an aon phump syringe suidhichte taobh a-muigh an t-seòmair; lean sreathan siùbhlach bho na criathragan gu swivel fluid dà-sianal (Instech Laboratories) air a chuir suas os cionn a ’ghiùladair. Thàinig loidhnichean siùbhlach a-nuas bhon swivel tro tholl tollaidh an neach-siubhail, ruith iad air a ’chàball clàraidh, agus thàinig iad gu crìch aig dà mhicro-stealladh 33 trast-thomhas.

Ron t-seisean clàraidh, chaidh na microinjectors a lìonadh le fuasgladh dhrogaichean agus an uairsin a chuir a-steach do cannulae treòrachaidh a ’bheathaich. Leudaich na molaidhean microinjector 0.5 mm nas fhaide na an cannulae treòrachaidh gus am biodh bàrr an microinjector fo na molaidhean electrode agus ∼670 μm bho mheadhan gach electrod. Mus deach an lìonadh air ais le droga, chaidh na loidhnichean liùlach agus na meanbh-bhualaidhean a lìonadh le ola mèinnearach, agus chaidh ìre an eadar-aghaidh ola-aqueous a chomharrachadh gus a dhèanamh nas fhasa post hoc dearbhadh gun deach an droga a thoirt a-steach. Mu dheireadh, bha an àrd-ùrlar ceangailte ris a ’bheathach agus chaidh na loidhnichean liùlach a cheangal gu daingeann ris a’ chàball clàraidh gus na meanbh-bheartan a chumail nan àite fad an deuchainn. Bha cead aig beathaichean a chaidh ullachadh san dòigh seo an gnìomh DS a choileanadh airson ùine bun-loidhne de 45 min co-dhiù, nuair a chaidh gnìomhachd neural a chlàradh; an uairsin, chaidh am pumpa syringe a thionndadh air astar gus na drogaichean a thoirt a-steach don eanchainn. Cha robh feum air in-stealladh a bhith a ’làimhseachadh a’ bheathaich no a ’fosgladh doras an t-seòmair, agus lean an seisean giùlain gun bhriseadh air feadh amannan bun-loidhne, infusion agus postinfusion.

Chaidh comharran bholtachd nàdurrach a chlàradh le amplifier ìre-cinn (buannachd aonachd), amannan 10,000 leudaichte, agus a dhidsiotachadh le bhith a ’cleachdadh bathar-cruaidh is bathar-bog malairteach (Plexon). Chlàr sinn bho neurons 379 ann an seiseanan clàraidh / stealladh 38 ann an radain 15. De na seiseanan 38, chaidh 7 a thilgeil a-mach air sgàth droch ghiùlan rè ùine bun-loidhne an ro-aithris no leis nach b ’urrainn neurons sam bith a bhith air an sgaradh gu earbsach. Mar sin, chuir ar mion-sgrùdadh neural fòcas air seiseanan clàraidh / stealladh 31 anns an do chlàraich sinn bho 322 neurons a bha gu math iomallach ann an radain 12. Às deidh gach seisean clàraidh / in-stealladh, chaidh am microdrive a bha a ’giùlan na h-àirean dealain adhartach ∼150 μm (aon leth tionndadh den sgriubha microdrive) gus na dealanan a ghluasad gu èadhar gus clàradh bho shluagh ùr de neurons. Mura deach ach glè bheag de neurons (no gin) a choimhead, chaidh an raon adhartach a h-uile latha eile gus an deach neurons a lorg.

Mion-sgrùdadh.

Chaidh dàta a roinn ann an amannan ro-aithris, postinjection, agus ùine ath-bheothachaidh, a chaidh a mhìneachadh, fa leth, mar an 45 min mus deach na h-antagonists a thoirt a-steach, am min 40 a ’tòiseachadh le deireadh an in-stealladh, agus an 33 min mu dheireadh (2000 s) de gach seisean (a mhair gu h-iomlan, 2 - 3 h). Tha an ùine postinjection a ’freagairt ris an àm anns a bheil na buaidhean giùlain as motha aig drogaichean nuair a thèid an stealladh gu dà-thaobhach (Fig. 1C).

 

Figear 1.

Buaidhean antagonists gabhadair dopamine air giùlan dòigh-obrach DS-cued. A, Clàraichte de obair DS. B, Meadhan (dot) agus cairtealan meadhanach (loidhnichean dìreach) de cho-mheasan freagairt DS (orains) agus NS (gorm) anns an ùine ro-innse airson gach seisean giùlain ...

Chaidh iomallachd aonadan singilte a dhèanamh far-loidhne le Offline Sorter (Plexon) a ’cleachdadh mion-sgrùdadh prìomh phàirtean. Cha robh ach aonadan le tonnan soilleir (> 100 μV) a bha gu soilleir eadar-dhealaichte bho ìrean fuaim (<20-50 μV) air an gabhail a-steach ann an sgrùdaidhean às deidh sin. Chaidh sgaoilidhean eadar-amannan agus crois-correlograms a chleachdadh gus dèanamh cinnteach gu robh aonadan singilte air an sgaradh bho chèile agus bho fhuaim cùil (bathar-bog Neural Explorer; Nex-Tech). Chaidh stampaichean ùine de spìcean dearbhte a sgrùdadh le cleachdaidhean àbhaisteach ann an àrainneachd bathar-bog R. Chaidh histograman ùine peristimulus a chaidh a thogail timcheall air an DS agus NS, ann am bionaichean ùine 50 ms, a chleachdadh gus cuiridhean cue-falaichte a thomhas agus a lorg Figearan 2A, , 3,3, , 4,4, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, agus And1010A – C. Gus faighinn a-mach an robh neuron a ’taisbeanadh excitation mòr DS-evoked, chaidh gnìomh cuairteachaidh coltachd Poisson a thomhas airson ùine bun-loidhne 10 s ro gach cue. Bhathar den bheachd gu robh neuron air bhioran le DS nam biodh e a ’taisbeanadh àireamhan spìc cuibheasach os cionn na h-ùine misneachd 99% àrd de sgaoileadh ìrean losgadh bun-loidhne ann an aon bhionaichean 50 ms eadar 50 agus 200 ms às deidh tòiseachadh cue. Airson neurons le cuiridhean mòra DS-evoked anns an ùine bun-loidhne ro-aithris, fhuaireadh an ìre losgaidh cuibheasach ann an ùine bionaichean 50 ms glaiste gu DS agus NS airson gach ùine anns gach seisean, agus cuibheasachd agus meadhan (Figsichean. 2C - E., , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, , 1010B,C) chaidh ìrean losgadh thar neurons a choimeas. Leis gu robh neurons le excitation NS a bha furasta an lorg gu staitistigeach cha mhòr an-còmhnaidh air am brosnachadh leis an DS [nach deach a shealltainn, ach a chaidh aithris roimhe seo (Ambroggi et al., 2011)], rinn sinn mion-sgrùdadh air freagairtean NS airson a h-uile neuron le freagairt DS cudromach. Mura h-eilear ag innse a chaochladh, thèid a h-uile coimeas staitistigeil a chaidh a chleachdadh taobh a-staigh neuron Wilcoxon deuchainnean suim ìre.

 

Figear 2.

Bidh cuiridhean DS-evoked a ’ro-innse giùlan sireadh duais às deidh sin agus a’ còdachadh faisg air an luamhan. A, Histograman ùine peri-tachartas cuibheasach preinjection co-thaobhach ri toiseach an DS (lorg orains) no NS (lorg gorm) airson neurons 145 le excitatory mòr ...

 

Figear 3.

Tha eisimpleirean neurons a ’sealltainn gu bheil antagonists D1 agus D2 a’ lughdachadh excitation DS-evoked. Bidh Rasters agus histograman co-fhreagarrach a ’sealltainn losgadh ceithir diofar neurons le toileachas DS air an aon rèir ri DS. Tha dàta bho na deuchainnean 40 mu dheireadh dìreach ron toiseach ...

 

Figear 4.

Tha buaidhean in-stealladh antagonist dopamine dà-thaobhach air excitation cue-evoked a ’ro-innse na buaidhean giùlain air stèidh deuchainn-le-deuchainn. A, C, Mion-sgrùdadh deuchainn-air-deuchainn de chòdachadh neuronal de latency an radan gus an luamhan a ruighinn airson na h-aon neurons a tha air an sealltainn ...

 

Figear 5.

Tha feum air gnìomhachadh gabhadair D1 airson excitation DS-evoked. A, Histograman ùine peri-tachartas air an aon rèir ri DS a ’tòiseachadh airson neurons le excitation mòr DS-evoked anns an ùine ro-aithris. Tha lorgan agus sgòthan a ’comharrachadh ìre losgaidh cuibheasach ± ​​SEM ...

 

Figear 6.

Tha gnìomhachd gabhadair D2 riatanach airson excitation DS-evoked. A, Histograman ùine peri-tachartas air an aon rèir ri DS a ’tòiseachadh airson neurons le excitation mòr DS-evoked anns an ùine ro in-stealladh raclopride. Chaidh cuiridhean DS-evoked a lughdachadh le dà-thaobhach ...

 

Figear 7.

Chan eil feum air gnìomhachd gabhadair D1 airson excitation NS-evoked. A, Histeagraman ùine peri-tachartais air an aon rèir ri toiseach tòiseachaidh NS airson neurons le excitation mòr DS-evoked anns an ùine ro-aithris. Bidh na h-àireamhan sin gu tur a ’dol an lùib a chèile, mar sin na h-aon neurons ...

 

Figear 8.

Tha gnìomhachd gabhadair D2 riatanach airson excitation NS-evoked. A, Histeagraman ùine peri-tachartais air an aon rèir ri toiseach tòiseachaidh NS airson neurons le excitation mòr DS-evoked anns an ùine ro-aithris. Chaidh excitation NS a lughdachadh anns na suidheachaidhean dà-thaobhach agus ipsilateral ...

 

Figear 10.

Chan eil dòrtadh saline a ’toirt buaidh air excitation DS- no NS-evoked agus chan eil feum air gnìomhachadh gabhadair D1 no D2 airson ìrean losgaidh bun-loidhne a chumail suas. A, Neuron singilte le toileachas DS air a chlàradh aig àm dòrtadh saline. Tha gnàthasan co-ionann ris an fheadhainn ...

airson Figear 4, cho-dhùin sinn an robh buaidh in-stealladh dà-thaobhach antagonist air an latency gus an luamhan a ruighinn ceangailte ri buaidh nan antagonists air meud excitation DS-evoked air stèidh deuchainn-air-deuchainn. An toiseach, rinn sinn cunntas air an ìre losgaidh cuibheasach bho 100 gu 400 ms às deidh DS tòiseachadh anns a h-uile deuchainn airson a h-uile neuron clàraichte a bha a ’taisbeanadh excitation DS cudromach mus deach an dà-thaobhach a sgaoileadh. An ath rud, airson gach neuron rinn sinn cunntas air co-èifeachd co-dhàimh ìre Spearman a ’dèanamh coimeas eadar meud deuchainn-gu-deuchainn de excitation DS-evoked agus latency an radan gus an luamhan a ruighinn air deuchainnean co-fhreagarrach. Chaidh na co-cheangalan sin a dhealbhadh ann an histograman ann an Figear 4B,D. Chaidh a h-uile deuchainn DS a ghabhail a-steach san anailis seo; mura brùth am beathach an luamhan chaidh latency de 10 s (an ùine as fhaide de thaisbeanadh cue) a thoirt don deuchainn sin. Rinn sinn cunntas air na co-èifeachdan co-dhàimh sin airson na h-ùine ro-aithris mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd; leudaich sinn an ùine postinjection le 1000 s gus samplachadh nas fharsainge fhaighinn de latencies air deuchainnean anns an do fhreagair na beathaichean às deidh lionnachadh dà-thaobhach. Gus cudromachd nan dàimh fa leth a mheasadh, chleachd sinn asymptotic dà-earball t-approximation air sgàth dearbh p chan urrainnear luach a thomhas nuair a tha ceangalaichean an làthair anns an dàta inbhe. An uairsin chleachd sinn deuchainnean càraid Wilcoxon gus coimeas a dhèanamh eadar meadhan luchd-cuairteachaidh co-èifeachdan co-dhàimh ro agus às deidh dòrtadh antagonist.

Leis gu bheil ìrean losgaidh bun-loidhne ìosal aig neurons NAc le crìochan nas ìsle den eadar-ama misneachd gu tric a ’spangachadh neoni, tha e fada nas duilghe casg a lorg agus tomhas na cuiridhean. Mar sin, a bharrachd air an dòigh-obrach a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd, a chaidh a chleachdadh gus excitation a lorg, chleachd sinn mion-sgrùdadh feart obrachaidh glacadair (ROC), dòigh nas mothachaile, gus tomhas dè cho coltach ‘s a tha an ìre losgaidh ann am bionaichean ùine 50 ms às deidh cue tòiseachadh bha e eadar-dhealaichte bhon ìre losgaidh ann am bun-loidhne 10 s precue. Chaidh an anailis seo a dhèanamh air leth airson amannan ro-aithris agus postinjection. Airson gach biona, rinn sinn cunntas air an sgìre fo lùb ROC (AUC); Chan eil luachan AUC de 0.5 a ’nochdadh eadar-dhealachadh sam bith bho losgadh prìomhaid, ach tha luachan nas fhaisge air 0 no 1 a’ nochdadh barrachd coltachd gu bheil an neuron air a bhacadh no air bhioran, fa leth. Gus sealltainn ann an dòigh neo-phàirteach chaidh gnìomhachd neòil post-puist air feadh an t-sluaigh gu lèir de neurons clàraichte, ìrean losgaidh agus luachan AUC a thomhas airson bionaichean 50 ms; gus an dàta a dhèanamh rèidh, chaidh na bionaichean adhartachadh le 10 ms airson coimpiutairean AUC às deidh a chèile. Chaidh na luachan AUC rèidh an uairsin a dhealbhadh mar mhapaichean teas le rùn 10 ms (le gach luach a ’riochdachadh an AUC san ath 50 ms) ann Figearan 5B, , 66B, , 77B, , 88B, agus And1010D,E.

An ath rud, rinn sinn tomhas an robh luachan AUC, air an tomhas ann an neo-cheangail 50 bionaichean, a ’nochdadh eadar-dhealachadh mòr ann an losgadh. Airson gach biona, chruthaich sinn an toiseach 10,000 luachan AUC bootstrapped bho shuffles air thuaiream den ìre losgaidh bun-loidhne agus an ìre losgaidh anns a ’bhine postachd co-fhreagarrach. Cho-dhùin sinn an uairsin an coltachd dà-earbaill gun deach fìor luach AUC a tharraing bho bhith a ’cuairteachadh luachan bootstrapped; nam biodh an coltachd <0.05, bha sinn den bheachd gu robh an losgadh anns a ’bhine gu math eadar-dhealaichte bhon bhun-loidhne ro-innse. Mu dheireadh, chunnt sinn an àireamh de neurons le ìrean losgaidh anns gach biona a bha gu math nas motha na no nas ìsle na losgadh bun-loidhne ro-innse, agus dhealbh sinn na luachan sin mar bhloighean den t-sluagh iomlan (Figsichean. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 99B,D, , 1010F,G).

 

Figear 9.

Chan eil buaidh aig in-stealladh D1 no D2 air an aghaidh gnìomhachd neòil a tha ceangailte ri inntrigeadh duais. A, C, Tha luachan ROC AUC air an tomhas agus air an taisbeanadh mar a tha air a mhìneachadh ann an Figear 5B, ach a-mhàin gu bheil bionaichean ùine nas fhaide (200 ms) agus air an aon rèir ...

Gus coimeas a dhèanamh eadar na cuibhreannan de neurons a bha air am beò-ghlacadh no air am bacadh anns na h-amannan ro-aithris agus postinjection chleachd sinn dòigh lughdachadh dàta. An toiseach, rinn sinn cunntas air a ’chuibhreann de bhionaichean 50 ms eadar 0 agus 1 s às deidh tòiseachadh cue anns an do nochd gach neuron excitation no toirmeasg mòr. An ath rud, rinn sinn coimeas eadar na bloighean sin anns na h-amannan ro-aithris agus postinjection le deuchainn Wilcoxon càraideach. Bha neurons nach do nochd atharrachadh mòr ann am biona sam bith an dà chuid ann an amannan ro-aithris agus postinjection air an dùnadh a-mach às an anailis seo agus cha robh iad air an gabhail a-steach anns na plotaichean a ’sealltainn a’ chuibhreann meadhanach de bhionaichean cudromach (plotaichean dot agus uisge-beatha air taobh deas gach pàirt ann an Figsichean. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 1010F,G). Chuir am modh-obrach seo às do bhuaidh an t-sluaigh mhòir de neurons gun eadar-dhealachadh sam bith ann an gnìomhachd eadar an uinneag post-DS agus bun-loidhne ro-DS; chan eil mòran ùidh aig an t-sluagh seo, ach tha e a ’cur àireamh mhòr de luachan null a tha a’ biathadh an àireamh meadhanach de bhionaichean cudromach a dh ’ionnsaigh 0 agus a tha an dà chuid a’ lughdachadh agus a ’meudachadh anns a’ chuibhreann de bhionaichean cudromach às deidh a bhith air an uisgeachadh.

Chaidh mion-sgrùdaidhean den aon seòrsa a dhèanamh airson losgadh co-cheangailte ri caitheamh a ’tachairt às deidh dhaibh faighinn a-steach don ghabhad duais. Bha beathaichean buailteach fuireach anns a ’ghabhadain airson> 5 s; mar sin, gus na h-amannan ùine fada sin a ghlacadh, bidh sinn a ’sealltainn na toraidhean a’ cleachdadh bionaichean 200 ms (Fig. 9). Bha an uinneag ùine airson a bhith a ’dèanamh coimeas eadar cuibhreannan de neurons a bha air bhioran anns na h-amannan ro-aithris agus postinjection bho 0 gu 1.5 s, ach bha e bho 0 gu 5 s airson toirmeasg; chaidh uinneag anailis nas giorra a chleachdadh airson cuiridhean oir bha iad buailteach a bhith nas eadar-ghluasadach. Chaidh mion-sgrùdaidhean ROC a dhèanamh air Buidheann Coimpiutaireachd Àrd-choileanaidh Colaiste Leigheas Albert Einstein a ’cleachdadh a’ phacaid pROC airson R.

Gus coimeas a dhèanamh eadar ìrean losgaidh “bun-loidhne” a bha a ’tachairt taobh a-muigh tachartasan gnìomh, rinn sinn coimeas eadar an ìre losgaidh cuibheasach ann am bionaichean 10 s ro gach ro-aithris DS agus postinjection nan antagonists. Tha an dòigh-obrach seo co-ionann gu gnìomhach ri samplachadh air thuaiream de ìrean losgaidh bun-loidhne oir tha DSs an ìre mhath coltachd co-ionann aig àm sam bith rè seisean giùlain. Bha neurons air an seòrsachadh mar a bhith a ’taisbeanadh excitation mòr DS-evoked (mus deach drogaichean a thoirt a-steach) no nach robh, agus an uairsin chaidh ìrean losgadh bun-loidhne anns na h-amannan ro-aithris agus postinjection a choimeasachadh taobh a-staigh nam buidhnean sin le deuchainn càraid Wilcoxon (Fig. 10H,I). Rinn sinn cuideachd uidheam sreathach airson neurons le toileachas DS agus rinn sinn coimeas eadar leathad na loidhne seo agus an loidhne aonachd (leathad 1).

Nam biodh ioma-choimeas air a dhèanamh air fo-sheataichean dàta a thàinig bhon aon chuspair (Figsichean. 2C - E., , 55A,C, , 66A,C, , 77A,C, , 88A,C, , 99B,D, , 1010B,C,F,G), p chaidh luachan a cheartachadh Bonferroni; ie, an p chaidh luach iomadachadh leis an àireamh de choimeasan a bhathar a ’dèanamh. Ceartaichte p bha luachan air am meas cudromach ma bha p <0.05. Chaidh a h-uile ceartachadh a dhèanamh le factar 3 ach a-mhàin Figear 2C - E., anns an robh am bàillidh 2.

Rianachd bhidio.

Ann am fo-sheata dheuchainnean, chaidh suidheachadh an radan a thomhas a ’cleachdadh camara os cionn (30 frèam / an) agus siostam tracadh coimpiutair (Cineplex; Plexon). Bha an siostam a ’cumail sùil air an x agus y suidheachadh dà LED de dhiofar dhathan ceangailte ri àrd-ùrlar a ’chlàraidh. Mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (McGinty et al., 2013), rinn sinn cunntas air centroid a tha a ’toirt cunntas air a’ phuing meadhan eadar suidheachadh LED airson gach frèam bhidio. Chaidh puingean dàta a dh ’fhalbh suas ri 10 frèamaichean às deidh sin a lìonadh a-steach le eadar-ghluasad sreathach; anns na h-amannan ainneamh far an robh> 10 frèama a dhìth, chaidh an dàta a thoirt a-mach. Airson gach frèam bhidio, rinn sinn cunntas air SD nan astaran eadar suidheachadh an centroid san fhrèam sin agus ann an uinneag ùine ± 200 ms. Tha na tomhasan SD seo a ’dèanamh suas clàr-amais locomotor (LI) airson an fhrèam sin den bhidio. Chaidh LIs a chaidh an cruth-atharrachadh a sgaoileadh gu dà-thaobhach, le stùc nas ìsle a ’riochdachadh prìomh ghluasadan le glè bheag de ghluasad agus stùc àrd a’ riochdachadh locomotion (Drai et al., 2000). Bidh sinn an uairsin a ’freagairt dà dhreuchd Gaussianach air cuairteachadh LI, agus a’ dearbhadh na stairsnich gluasaid mar a ’phuing far an robh na gnìomhan sin a’ dol thairis air an ìre as lugha.

Chaidh gluasadan a mhìneachadh mar co-dhiù ochd frèaman leantainneach le LIs os cionn stairsneach an locomotor. Gus faighinn a-mach dè an ùine a thòisich an gluasad, chuir sinn cuingealachadh air an anailis gu deuchainnean DS anns an robh am beathach fhathast aig toiseach tòiseachaidh agus an uairsin rinn sinn cunntas air an ùine mu dheireadh eadar cue agus a ’chiad fhrèam anns an deach an LI thairis air an ìre gluasad (Figsichean. 1D – F, , 22B,D). Mura deach gluasad so-aithnichte a thomhas air deuchainn, chaidh latency na deuchainn sin a mhìneachadh mar> 10 s (fad an taisbeanaidh cue, Fig. 1D). Fhuaireadh toraidhean co-ionann nuair a chaidh deuchainnean mar seo fhàgail às an anailis (cha deach dàta a shealltainn). Chaidh na sgaoilidhean latency gluasad DS-cued an uairsin a thoirt còmhla thar radain agus chaidh na meadhanan a choimeas ri deuchainn Wilcoxon. Gus tomhas a dhèanamh air latency chun astar as luaithe agus astar cuibheasach gluasadan stiùirichte le luamhan DS, chleachd sinn a h-uile deuchainn a thàinig gu crìch le preas luamhan eadhon ged a bhiodh an radan a ’gluasad aig toiseach DS (Fig. 1E,F).

Eachdraidh.

Chaidh beathaichean a thoirt a-steach gu domhainn le Euthasol agus air an cuir a-steach gu intracardially le saline agus 4% formalin. Chaidh sruth dhìreach (15 μA) a thoirt tro gach aon de na dealanan anns na h-àirean airson ∼30 s gus lotan a ghineadh. Chaidh brains a thoirt air falbh agus an stòradh ann an formalin gus an deach an giullachd. Mus deach a ghearradh le cryostat, chaidh brains a chrioptachadh le bogadh ann an sucrose 30% airson grunn làithean. Chaidh earrannan (50 μm) a smàladh airson susbaint Nissl gus sùil a thoirt air slighean agus lotan cannula agus electrode (Fig. 11).

 

Figear 11.

Ath-thogail histological de làraich in-stealladh antagonist. Tha am figear a ’nochdadh dà roinn crùnaidh de eanchainn radan a tha a’ toirt a-steach a ’mhòr-chuid den ìre anterior-posterior den NAc (0.8 mm - 2.8 mm anterior bho bregma). Tha dotagan dubha a ’riochdachadh ...

toraidhean

Thug sinn dà bhrosnachadh sgrùdaidh do radain aig amannan caochlaideach le cuibheas de 30 s: DS ro-innseach duais agus NS (Fig. 1A; Nicola et al., 2004a,b; Ambroggi et al., 2008, 2011; McGinty et al., 2013). Chuir preas luamhan rè an DS crìoch air a ’chomhairle, agus chaidh droplet de shiùcar a lìbhrigeadh nuair a chaidh thu a-steach don ghabhad duais; mura do fhreagair beathaichean taobh a-staigh 10 s, chaidh an cue a thoirt gu crìch gun lìbhrigeadh duais agus thòisich an ùine eadar-ghnèitheach. Cha robh buaidh prògramaichte aig freagairtean san eadar-ama seo agus rè an NS. Bha NSs an-còmhnaidh 10 s. Beathaichean le trèanadh, a fhreagair a ’mhòr-chuid de DS ach glè bheag de NS (Fig. 1B), air an cuir a-steach le arrays cannulated air an cuimseachadh gu cridhe NAc. Rè deuchainnean, rinn beathaichean an obair an toiseach airson ùine ro-aithris 45 min nuair a chaidh gnìomhachd neural NAc a chlàradh. An ath rud, chaidh an antagonist gabhadair D1 SCH23390 no an raclopride antagonist D2 / 3 a thoirt a-steach gu dà-thaobhach no gu aon-thaobhach a-steach don NAc; dh'fhuirich beathaichean san t-seòmar le gnìomhan tuiteamach ann an gnìomh air feadh an fhionnaidh agus airson co-dhiù 75 min às deidh sin.

Co-chòrdail ri sgrùdaidhean roimhe (Yun et al., 2004; Nicola, 2010), lùghdaich in-ghabhail dà-thaobhach de gach antagonist a-steach do chridhe NAc gu mòr a ’chuibhreann de DSn ris an do fhreagair am beathach (Fig. 1C, lorgan dorcha glas) agus mheudaich an cianalas gus locomotion a thòiseachadh mar a chaidh a thomhas le tracadh bhidio ann am fo-sheata de sheiseanan (Fig. 1D, lorgan dashed liath). An coimeas ri sin, cha robh buaidh aig dòrtadh aon-thaobhach de na h-aon dòsan air co-mheas freagairt DS (Fig. 1C, lorgan liath aotrom), cianalas airson gluasad a thòiseachadh às deidh DS tòiseachadh (Fig. 1D, lorgan aotrom orains), agus latency gus an luamhan no astar gluasaid a ruighinn rè dòighean luamhan ((Fig. 1E,F). Tha an dàta giùlain seo a ’sealltainn gu bheil NAc dopamine ann an aon leth-chruinne gu leòr airson giùlan a chumail suas ged a tha bacadh de gabhadairean D1 no D2 / 3 anns an dà leth-chruinne a’ cur bacadh mòr air freagairt. Tha an sgaradh seo a ’tabhann buannachd dheuchainneach èiginneach, leis gu bheil e a’ leigeil leinn deuchainn a dhèanamh air buaidhean antagonists dopamine air gnìomhachd neural nuair a tha giùlan air a lagachadh (in-stealladh dà-thaobhach) agus nuair nach eil e (in-stealladh aon-thaobhach), mar sin a ’riaghladh a-mach an dearbhadh a dh’ fhaodadh atharrachadh sam bith a chaidh fhaicinn. ann an gnìomhachd neural às deidh infusion antagonist àrd-sgoile gu atharrachaidhean ann an giùlan.

Chlàr sinn bho neurons 322 NAc ann an seiseanan clàraidh / stealladh 31 ann am radain 12. Bha timcheall air 45% de na neurons clàraichte air am brosnachadh gu mòr le taisbeanadh DS. Bha na cuiridhean sin a ’taisbeanadh thogalaichean coltach ris an fheadhainn a chaidh aithris roimhe (Yun et al., 2004; Nicola et al., 2004a; Ambroggi et al., 2011; McGinty et al., 2013; Moireasdan agus Nicola, 2014): bha iad na bu mhotha na an fheadhainn a chaidh an cuir a-mach le NS (Fig. 2A); thòisich iad aig ìre ghoirid an dèidh tòiseachadh cue (∼120 ms) agus thachair iad mus do thòisich iad air gluasad fo stiùir luamhan (Fig. 2B); agus bha an meud aca ceangailte ri coltachd freagairt giùlain, cianalas tòiseachaidh gluasad, agus cho faisg air an luamhan ((McGinty et al., 2013; Fig. 2C - E.).

Dh ’adhbhraich dòrtadh dà-thaobhach an dara cuid an antagonist D1or D2 / D3 lùghdachadh geur ann am meud excitation DS-evoked. Mar a chithear ann an dà eisimpleir neurons (Fig. 3A,C), bha a ’bhuaidh seo nas fhollaisiche anns na mionaidean dìreach às deidh an in-fhilleadh, a rèir an lughdachadh as motha ann an giùlan dòigh-làimhseachaidh cue air adhbhrachadh leis na h-in-stealladh (Fig. 3A,C, creachadairean gorma agus histograman). Nuair a fhuair a ’bhuaidh giùlain air ais, fhuair am freagairt losgaidh seachad cuideachd (Fig. 3A,C, creachadairean dubha agus histograman). Bha am pàtran toraidhean seo co-chòrdail thar neurons a bha air an togail le cue (Figsichean. 5A, , 66A, Histeagraman dà-thaobhach agus plotaichean uisge-beatha). A ’toirt taic don bheachd gu bheil na cuiridhean sin a’ suidheachadh spionnadh gluasad dòigh luamhan, bha meud an excitation cue-evoked rè ùine an ro-aithris a ’ro-innse latency an ainmhidh a’ ruighinn an luamhan ((Fig. 4A,C, clì). Às deidh in-stealladh dà-thaobhach D1 no D2, chaidh na latencies sin a ghluasad gu luachan nas àirde, gu tric cho àrd is nach robh freagairt idir idir taobh a-staigh taisbeanadh 10 s cue (Fig. 4A,C, sgaoilidhean latency clì is deas). Gu h-iongantach, eadhon ged a chaidh losgadh le cue air a lughdachadh leis na h-antagonists, lean e air adhart a ’ro-innse spionnadh an fhreagairt giùlain anns na h-amannan postinjection agus ath-bheothachaidh (Fig. 4A,C, plotaichean raster ceart). Tha an amharc seo a ’sealltainn gun deach na buaidhean giùlain is neòil aig an druga a cheangal a-rèir deuchainn: mar as motha an lughdachadh ann an losgadh air adhbhrachadh le antagonist dopamine, is ann as motha a bhios an latency gus an luamhan a ruighinn agus nas ìsle an coltachd gum bi an ràinig beathach an luamhan idir.

Gus cunbhalachd a ’cho-dhàimh deuchainn-le-deuchainn seo a mheasadh, rinn sinn cunntas, airson gach neuron làn-inntinneach, co-dhàimh ìre Spearman eadar meud an excitation agus an latency gus an luamhan a bhrùthadh. Shònraich sinn latency de 10 s gu deuchainnean anns nach robh freagairt ann; mar sin bha latency anns na deuchainnean sin ceangailte aig an ìre as àirde. (Fhuaireadh toraidhean co-ionann ma chaidh deuchainnean às aonais freagairt luamhan DS-cued fhàgail às an anailis; cha deach dàta a shealltainn.) Nuair a rinn sinn coimeas eadar na co-èifeachdan co-dhàimh anns an ùine ro-aithris leis an fheadhainn anns an ùine postinjection / ath-bheothachaidh còmhla, lorg sinn gu robh cha mhòr na h-uile bha na co-èifeachdan àicheil san dà ùine. A bharrachd air an sin, cha robh buaidh mhòr aig na h-antagonists air a ’cho-èifeachd meadhanach no ghluais iad an sgaoileadh a dh’ ionnsaigh luachan eadhon nas àicheil (Fig. 4B,D). Mar sin, chan e a-mhàin gu bheil an àireamh de neurons le cue a ’ro-innse gu earbsach an latency freagairt giùlain, ach tha an àrdachadh ann an latency freagairt air adhbhrachadh le antagonist air deuchainn sònraichte air a ro-innse gu làidir le buaidhean an antagonist air excitation cue-evoked air an deuchainn sin. Tha na co-dhùnaidhean sin a ’toirt seachad fianais làidir airson dreuchd adhbharach airson dopamine endogenous ann a bhith a’ suidheachadh spionnadh an fhreagairt a tha a ’sireadh duais don chiw: bidh dopamine a’ meudachadh excitation cue-neurons de NAc neurons, a tha e fhèin ag adhbhrachadh dòigh-obrach geàrr-ùine airson an luamhan.

Is e mìneachadh eile de na toraidhean sin gu bheil excitation lùghdaichte cue mar thoradh air freagairt giùlan nas lugha - is dòcha air sgàth ‘s gu bheil an excitation dìreach a’ tracadh (no an dùil) freagairt giùlain ach nach eil e adhbharach dha. Nam biodh seo mar sin, cha bu chòir a bhith a ’cuir a-steach na h-antagonists ann an dòigh gus nach toir iad buaidh air giùlan a bhith a’ leantainn gu excitation cue-evoked nas lugha. Ach, mar a chithear ann an dà eisimpleir neurons (Fig. 3B,D), le in-stealladh aon-thaobhach de dh ’antagonist D1or D2 / D3 gu mòr a’ lughdachadh meud excitation cue ged nach do dh ’atharraich stealladh aon-thaobhach coileanadh giùlain. Fhuaireadh toraidhean co-ionann nuair a chaidh cuibheasachd fhaighinn thairis air cuiridhean cue-evoked a chaidh a chlàradh anns an NAc a chaidh a stealladh (Figsichean. 5A, , 66A, Histograman Ipsilateral); A bharrachd air an sin, tha an dàta cuibheasach a ’sealltainn nach robh buaidh sam bith aig cuiridhean cue-evoked ann an neurons a chaidh a chlàradh ann an co-thaobhadh NAc ris an stealladh (Figsichean. 5A, , 66A, Histograman contrarra). Gus faighinn a-mach gum faodadh an lùghdachadh ann an excitation cue-evoked ipsilateral ris na h-in-steallaidhean mar thoradh air eadar-dhealachaidhean beaga ann an coltachd freagairt giùlain, rinn sinn a-rithist an anailis às deidh a bhith a ’dùnadh a-mach a h-uile deuchainn anns nach do rinn am beathach freagairt naidheachd luamhan; chaidh toraidhean co-ionann fhaighinn (cha deach dàta a shealltainn; p <0.05 airson an dà chuid antagonists D1 agus D2, Wilcoxon). Tha na co-dhùnaidhean sin a ’sealltainn nach eil an lùghdachadh a tha air a bhrosnachadh le antagonist ann an excitation cue-evoked buailteach a bhith mar thoradh air coileanadh giùlan lag.

Ged a bha na feartan temporal de excitation cue-evoked gu math coltach thar neurons, bha casg air tòiseachadh cue nas eadar-mheasgte, mar as trice a ’nochdadh cùrsaichean tòiseachaidh nas fhaide air adhart agus nas lugha de stereotyped na cuiridhean (Figsichean. 5B, , 66B). Mar sin is dòcha gum bi mion-sgrùdaidhean de chasgan (agus, gu ìre, cuiridhean) a tha ag amas air uinneag aon-ùine ag ionndrainn cuid mhath den chomharra. A bharrachd air an sin, chan urrainn do dhòighean lorg staitistigeil àbhaisteach lughdachadh gu cunbhalach aithneachadh bho ìrean losgadh basal glè ìosal, a ’toirt a-steach mòran de neurons NAc. Gus faighinn seachad air na cùisean sin, ghabh sinn dòigh-obrach nas in-ghabhaltach anns an do thomhais sinn, airson bionaichean ùine post 50 ms anns a h-uile neuron clàraichte, an ROC AUC a ’riochdachadh an eadar-dhealachadh eadar losgadh sa bhine agus bun-loidhne an t-seallaidh. Mapaichean teas de luachan AUC ann am bionaichean ùine ceangailte ri DS nuair a thòisich iad (Figsichean. 5B, , 66B) dearbhadh gun deach lughdachadh ann an excitation DS-evoked às deidh in-stealladh dà-thaobhach agus ipsilateral (ach chan e contralateral) de antagonists D1 agus D2 a nochdadh anns cha mhòr a h-uile neuron a bha air a bhrosnachadh le cue agus thachair e rè cùrsa ùine iomlan an excitation. An coimeas ri sin, cha deach casg a chuir air às deidh tòiseachadh DS. Gus tomhas a dhèanamh air na buaidhean sin, cho-dhùin sinn an robh gach luach AUC a ’nochdadh eadar-dhealachadh mòr bhon bhun-loidhne le bhith a’ dèanamh suas luach p bootstrapped a ’riochdachadh an coltas gun deach an AUC a shamplachadh bho bhith a’ cuairteachadh AUCan a chaidh a ghineadh bho ìrean losgaidh bun-loidhne air thuaiream agus sgudal bin (faic Stuthan agus Dòighean). Mar a chithear le plotaichean den chuibhreann de neurons a tha a ’taisbeanadh mòran (p <0.05) leisgeul no toirmeasg anns gach biona a rèir DS a ’tòiseachadh (Figsichean. 5C, , 66C, plotaichean clì anns gach colbh), chaidh a ’chuibhreann de chuiridhean, ach chan e toirmeasg, a lughdachadh le in-stealladh dà-thaobhach agus ipsilateral de na h-antagonists. Chaidh an eadar-mhìneachadh seo a dhearbhadh gu staitistigeil le bhith a ’dèanamh coimeas eadar cuibhreannan de bhionaichean a bha air am beò-ghlacadh agus air am bacadh air feadh na h-uinneig 1 s post-DS gu lèir (Figsichean. 5C, , 66C, dotagan). Mar sin, chaidh cuiridhean às deidh tòiseachadh DS a lughdachadh le in-stealladh antagonist D1 agus D2, ach cha deach casg a chuir air.

Gu dearbh, chaidh an àireamh de neurons a bha a ’nochdadh casg mòr àrdachadh an dèidh cuid de sheòrsan stealladh (Figsichean. 5B,C, , 66B,C). Tha e coltach nach do chuir na bacaidhean èiginn sin ri buaidh giùlain in-ghabhaltasan antagonist dà-thaobhach leis nach robh iad cunbhalach (me, thachair iad às deidh in-stealladh dà-thaobhach agus contralateral, ach chan e in-stealladh antagonist D1 ipsilateral agus às deidh in-stealladh antagonist D2 dà-thaobhach) agus mar sin chan eil iad a ’mìneachadh buaidhean giùlain nan antagonists. A bharrachd air an sin, bha na bacaidhean fadalach sin as follaisiche ∼600 ms às deidh DS a thòiseachadh, àm far an deach, ann an staid smachd, ∼50% de ghiùlan dòigh-làimhseachaidh amas-amas a thòiseachadh mu thràth (Fig. 2B). Mar thoradh air an sin, chan eil e coltach gun do chuir bacaidhean èiginneach ris an àrdachadh a dh ’adhbhraich antagonist ann an latency tòiseachaidh dòigh-obrach no lùghdachadh ann an coltachd freagairt. Gu h-inntinneach, thachair a ’mhòr-chuid de thoirmeasg èiginn ann an neurons le toileachas DS, mar as trice faisg air deireadh an excitation (antagonist dà-thaobhach D1: neurons 14 / 17, 82%; antagonist D2 ipsilateral: 11 / 16 neurons, 69%; Figsichean. 5B,C, , 66B,C), co-chòrdail ris a ’chomas gun deach an lughdachadh leis an fhreagairt excitatory a bha air am brosnachadh le antagonist agus a’ toirt taic don bheachd-smuain gu bheil losgadh neurons le toileachas DS na adhbhar airson giùlan dòigh-obrach a thòiseachadh.

Taisbeanaidhean NS, a bha glè ainneamh a ’faighinn freagairtean luamhan-naidheachd (Fig. 1B), dhùisg excitation beag ach cunbhalach anns na h-aon neurons a bha air am brosnachadh leis an DS (Fig. 2A). Gu h-iongantach, cha deach cuiridhean NS-evoked a lughdachadh leis an antagonist D1, an dàrna cuid ann am meud (Fig. 7A) no ann an àireamh de neurons togarrach (Fig. 7B,C). An coimeas ri sin, lùghdaich in-stealladh antagonist D2 an dà chuid meud agus àireamh de chuiridhean NS-evoked (Fig. 8). Cha deach casg air NS-evoked a lughdachadh le aon chuid antagonist (Figsichean. 7B,C, , 88B,C). Mar sin, fo na cumhaichean seo tha feum air gnìomhachadh gabhadair D1 airson neurons NAc cuir a-mach meudan mòra mar fhreagairt do bhrosnachaidhean ro-innse duais, ach tha feum air gnìomhachadh gabhadair D2 airson freagairtean an dà chuid brosnachaidh ro-innse agus neodrach.

Bheachdaich sinn air a ’chomas gum faodadh giùlan nas lugha a bhith a’ sireadh duais às deidh in-ghabhail dà-thaobhach a bhith mar thoradh air briseadh air pròiseas neòil co-cheangailte ri daingneachadh no giollachd hedonic de dhuais. Faodaidh pròiseasan leithid seo a bhith a ’toirt a-steach fo-dhaoine de neurons NAc a tha air am bacadh no air am beò-ghlacadh le bhith a’ caitheamh sucrose (Nicola et al., 2004b; Roitman et al., 2005; Taha agus achaidhean, 2005). Leis gu robh beathaichean a ’leantainn air adhart a’ cosnadh duais às deidh in-fhilleadh antagonist aon-thaobhach, bha e comasach dhuinn faighinn a-mach an robh gnìomhachd neuronal co-cheangailte ri caitheamh duais an urra ri gnìomhachd gabhadair dopamine. Rinn sinn sgrùdadh air losgadh rè na 5 s às deidh don bheathach a dhol a-steach don ghabhad duais, an ùine anns am bi caitheamh duais mar as trice (Nicola, 2010). A ’cleachdadh mion-sgrùdadh ROC, rinn sinn coimeas eadar losgadh ann am bionaichean 200 ms taobh a-staigh na h-uinneige seo gu bun-loidhne dùmhail 10 s; chan eil mapaichean teas de na luachan AUC a tha mar thoradh air a ’sealltainn mòran buaidh de in-stealladh antagonist an dàrna cuid ipsilateral no contralateral ris an stealladh (Fig. 9A,C). Cha tug na h-antagonists buaidh air a ’chuibhreann de neurons togarrach is toirmisgte (Fig. 9B,D), a ’moladh gu làidir nach eil cuiridhean agus toirmeasg co-cheangailte ri caitheamh an urra ri dopamine. Fhuaireadh toraidhean co-ionann nuair a rinn sinn an aon anailis a ’cleachdadh bionaichean 50 ms (cha deach dàta a shealltainn).

Gus faighinn a-mach gum faodadh na toraidhean a chaidh fhaicinn a bhith mar thoradh air feart air choreigin ach an antagonist (me, dragh corporra air adhbhrachadh leis an stealladh no cuid de phàirt den charbad dhrogaichean) chuir sinn a-steach saline ann an cuid de dheuchainnean. Mar a chithear le eisimpleir neuron (Fig. 10A) agus leis an excitation cuibheasach thar neurons a tha air an togail le cue (Fig. 10B), Cha deach cuiridhean DS-evoked atharrachadh le in-stealladh saline; Cha deach buaidh a thoirt air cuiridhean NS-evoked cuideachd (Fig. 10C). A bharrachd air an sin, cha tug in-stealladh saline buaidh air na cuibhreannan de neurons a bha a ’nochdadh excitation agus toirmeasg mòr às deidh DS no NS tòiseachadh (Fig. 10D - G.).

Mu dheireadh, dh ’fhaighnich sinn am faodadh gnìomhachd gabhadair dopamine a bhith ceadaichte airson giùlan dòigh-làimhseachaidh cued le bhith a’ cur ri ìrean losgadh bun-loidhne de neurons NAc. Gu neo-chunbhalach leis a ’bheachd seo, cha robh buaidh mhòr sam bith aig an antagonist D1 no D2 air ìrean losgadh bun-loidhne an dàrna cuid DS-bhrosnaichte no neurons NAc eile (Fig. 10H,I).

Deasbaireachd

Tha na co-dhùnaidhean sin a ’moladh dòigh anns am bi NAc dopamine a’ brosnachadh giùlan a tha a ’sireadh dhuaisean air a bhrosnachadh le brosnachaidhean àrainneachd: bidh gnìomhachd gabhadair dopamine a’ comasachadh cuiridhean cue-evoked, a tha e fhèin a ’brosnachadh tòiseachadh geàrr-ùine air dòigh-obrach a thaobh nithean co-cheangailte ri duais. Tha an co-dhùnadh seo a ’faighinn taic làidir bhon amharc gu robh in-stealladh dà-thaobhach dopamine antagonist an dà chuid a’ meudachadh latency gus gluasad a thòiseachadh (Fig. 1D) agus lughdaich meud excitations cue-evoked (Figsichean. 33Default-6). Chan fhaod lughdachadh excitation cue-evoked a bhith air a bhith mar thoradh air giùlan mì-chothromach oir cha do dh ’atharraich in-stealladh aon-thaobhach giùlan DS-cued (Fig. 1C – F), ach air a lughdachadh gu mòr excitation DS-evoked anns an t-seann stealladh (Figsichean. 3B,D, , 5,5, , 6) .6). B ’e na cuiridhean sin prìomh fhreagairt neural anns an NAc (a’ tachairt ann an 45% de na neurons clàraichte), agus bha an dithis aca ro thoiseach gluasad (Fig. 2B) agus dùil ri gluasad tòiseachaidh gluasad le barrachd losgadh air deuchainnean le latency nas giorra (Fig. 2D) (McGinty et al., 2013; Moireasdan agus Nicola, 2014). Mar sin, tha excitation cue-evoked an dà chuid an urra ri dopamine agus riatanach airson a bhith a ’sireadh duais làidir.

Tha na co-dhùnaidhean againn a ’sealltainn gu bheil excitation cue-evoked, no cruth sam bith eile de ghnìomhachd neural anns an NAc, dualtach a bhith na chomharradh èiginneach anns a’ chuairt neural a tha a ’suidheachadh latency gluasadan air an stiùireadh le amasan. Tha an co-dhùnadh seo a ’leantainn bhon bheachd gu robh na h-antagonists a’ lughdachadh excitation cue-evoked gun a bhith a ’lughdachadh toirmeasg cue-evoked, losgadh co-cheangailte ri caitheamh, no ìrean losgadh bun-loidhne. A bharrachd air an sin, b ’e na deuchainnean anns an robh in-stealladh dà-thaobhach de na h-antagonists as èifeachdaiche ann a bhith a’ lughdachadh an excitation an fheadhainn anns an do dh ’adhbhraich iad an duilgheadas giùlain as motha (Fig. 4), ag argamaid gu làidir an aghaidh a ’chomais gur e atharrachadh neo-aithnichte eile ann an còdachadh neuronal a bu choireach ris na buaidhean giùlain. Mar sin, tha an dàta againn gu daingeann a ’ceangal gnìomhachd gabhadair dopamine anns an NAc, meud an excitation cue-evoked, agus cho duilich sa tha am beathach a bhith a’ sireadh duais.

Sheall obair a rinneadh roimhe gun robh neo-ghnìomhachd VTA a lughdaich cuiridhean agus toirmeasg bho NAc cue cuideachd a ’cur casg air beathaichean bho bhith a’ nochdadh giùlan làimhseachaidh cued (Yun et al., 2004). Ach, cha do chuir an sgrùdadh sin às don chomas gur e buaidh cuairteachaidh neo-dhìreach a bh ’anns na h-atharrachaidhean sin. An seo, tha sinn a ’dearbhadh gu bheil gabhadairean dopamine ionadail do na neurons clàraichte riatanach airson excitation cue-evoked, a’ cur às don chomas gu bheil na buaidhean antagonist mar thoradh air gnìomh de dopamine suas an abhainn den NAc. An coimeas ri sin, eadhon ged a chaidh casg air cue-evoked a lùghdachadh le neo-ghnìomhachd VTA (Yun et al., 2004), cha deach an lughdachadh le in-stealladh antagonist dopamine ionadail, agus mar sin chan eil coltas ann gu bheil na toirmeasg sin mar thoradh air gnìomh dìreach de dopamine taobh a-staigh an NAc.

Bha buaidhean nan antagonists D1 agus D2 air an dà chuid giùlan dòigh-obrach DS agus losgadh DS-evoked gu math coltach. Tha na beachdan sin co-chòrdail ri loidhne fhada de dheuchainnean microinjection NAc anns an tug antagonists D1 agus D2 buaidh giùlain nach gabh aithneachadh aig dòsan coltach ris an fheadhainn againn (Hiroi agus geal, 1991; Ozer et al., 1997; Koch et al., 2000; Eiler et al., 2006; Pezze et al., 2007; Lex agus Hauber, 2008; Liao, 2008; Nicola, 2010; Shin et al., 2010; Haghparast et al., 2012). Tha na toraidhean sin, còmhla ris an eadar-dhealachadh eadar dùmhlachd antagonist anns an injectate a dh ’fheumar gus buaidhean (mm) agus dàimh nan drogaichean airson na targaidean aca (nm) a choimhead, a’ togail ceist a bheil buaidhean an druga sònraichte. Ged a tha coltas ann gu bheil an dùmhlachd èifeachdach aig an gabhadair gu math nas ìsle na an dùmhlachd stealladh mar thoradh air sgaoileadh, metabolism, agus oxidation nan drogaichean, chan eil fios dè cho èifeachdach ‘sa tha cùrsa agus ùine nan pròiseasan sin. Mar sin, is e aon chothrom foirmeil gu bheil gach cuid buaidhean giùlain agus electrophysiologic SCH23390 agus raclopride mar thoradh air an dà dhroga a ’ceangal aon no barrachd gabhadan nach eil air an ceangal le dopamine idir. Tha grunn nithean ag argamaid an aghaidh seo. Tha giùlan dòigh-obrach cue air a bhacadh chan ann a-mhàin le SCH23390 agus raclopride, ach cuideachd le bhith a ’stealladh an antagonist gabhadair dopamine speactram farsaing flupenthixol a-steach don NAc (Di Ciano et al., 2001; Saunders agus Robinson, 2012), le bhith a ’dèanamh neo-ghnìomhachadh den VTA (Yun et al., 2004) agus le lesion an NAc le 6-hydroxydopamine (Parkinson et al., 2002), a bhios gu roghnach a ’marbhadh snàithleanan catecholaminergic. A bharrachd air an sin, tha in-stealladh NAc de neach-bacadh ath-ghabhail dopamine, agonist gabhadair D1 no D2, no an amphetamine releaser dopamine a ’meudachadh coltachd dòigh-làimhseachaidh cued (Wyvell agus Berridge, 2000; Nicola et al., 2005; du Hoffmann agus Nicola, 2013). Mu dheireadh, tha fèin-bhrosnachadh optogenetic de neurons dopamine VTA (giùlan gun teagamh air a chumail suas le gnìomhachadh dopamine neuron) air a lughdachadh le in-stealladh SCH23390 no raclopride a-steach don NAc aig dòsan coltach ris an fheadhainn a tha air an cleachdadh an seo (Steinberg et al., 2014). Tha e duilich a bhith a ’smaoineachadh air uidheamachd sìmplidh a dh’ fhaodadh a bhith a ’toirt cunntas air gach aon de na toraidhean sin gun a bhith a’ suidheachadh gu bheil SCH23390 agus raclopride a ’bacadh dòigh-obrach le bhith a’ cur bacadh air buaidhean dopamine endogenous.

Is e cothrom eile a th ’ann gum bi na h-antagonists a’ ceangal chan e a-mhàin na gabhadairean targaid aca, ach gabhadairean dopamine far-targaid cuideachd. Aig dùmhlachdan de 10 μm no nas ìsle, chan eil raclopride a ’ceangal gabhadan coltach ri D1 (Hall et al., 1986); cha deach co-chruinneachaidhean nas àirde a dhearbhadh. Mar sin, dh ’fhaodadh raclopride a bhith sònraichte airson gabhadairean D2 / D3 eadhon aig na dùmhlachdan injectate mm a bhios sinn fhìn agus feadhainn eile a’ cleachdadh, gu sònraichte às deidh aire a thoirt do sgaoileadh, metabolism, agus oxidation. Tha tuairmsean den cheangal SCH23390 seasmhach ri gabhadan coltach ri D2 eadar 1 agus 5 μm (Bourne, 2001; Mottola et al., 2002); ged a tha na luachan sin a ’moladh gu bheil SCH23390 a’ ceangal gabhadairean D2 / D3 aig na dùmhlachdan stealladh, chan eil fios dè cho èifeachdach sa tha SCH23390 ann a bhith a ’cur bacadh air gnìomhachd gabhadairean coltach ri D2 le dopamine. Tha ar n-amharc gun do lùghdaich raclopride excitation NS-evoked ach cha robh SCH23390 a ’toirt taic don bheachd gu robh na drogaichean ag obair aig diofar gabhadan, ach nach eil iad a’ nochdadh gu sònraichte an sònrachas aca. Ach a dh ’aindeoin sin, eadhon ged a bhiodh aon no an dà dhroga a’ cuir casg air an dà sheòrsa gabhadain gus lughdachadh excitation DS a lughdachadh, bhiodh seo gu tur co-chòrdail ris a ’cho-dhùnadh againn gu bheil feum air co-dhiù aon seòrsa de gabhadair dopamine a chuir an gnìomh airson excitation DS-evoked. Mar sin, ged a tha a ’cheist mu shònrachas dhrogaichean fhathast gun fhreagairt, tha a’ cheist seo dìreach a ’lagachadh ar prìomh cho-dhùnadh gu bheil dopamine a’ comasachadh dòigh-obrach cued le bhith a ’meudachadh excitation cue-evoked.

Ma tha na drogaichean ag obair gu sònraichte, tha na co-dhùnaidhean againn gu bheil antagonists D1 agus D2 / D3 gach fear a ’lughdachadh losgadh cue sa mhòr-chuid de neurons le cue a’ moladh gu bheil gnìomhachd nan gabhadairean sin a ’leantainn gu co-sheòrsach gu excitation anns na h-aon neurons. Ach tha gabhadairean D1 agus D2 rim faighinn ann an àireamhan de neurons a tha gu ìre mhòr air an sgaradh anns an NAc (Albin et al., 1989; Gerfen et al., 1990), tha cuibhreannan mòra de neurons cridhe agus sligean NAc a tha a ’cur an cèill gabhadairean D1 cuideachd a’ toirt a-steach mRNA airson gabhadairean D3 (Le Moine agus Bloch, 1996), a tha air am bacadh le antagonists D2, a ’toirt a-steach raclopride. Tha co-chothromachadh gabhadairean D1 agus D3 a ’toirt seachad uidheamachd a dh’ fhaodadh a bhith ann far am faodadh dopamine brosnachadh a bhrosnachadh ann an neurons NAc le buaidh co-aontach a bhiodh air a bhacadh le aon chuid antagonists D1 no D2 / 3 (Schwartz et al., 1998). Air an làimh eile (no a bharrachd air an sin), faodaidh an eadar-obrachadh eadar gabhadairean D1 agus D2 (agus / no D3) tachairt aig ìre cuairteachaidh ionadail (Goto agus Grace, 2005; Gerfen agus Surmeier, 2011). Mar eisimpleir, bidh dopamine ag obair aig gabhadairean D1 gus lughdachadh GABA a leigeil a-steach do neurons NAc (Nicola agus Malenka, 1997; Hjelmstad, 2004), buaidh a dh ’fhaodadh brosnachadh a bhrosnachadh ann an cuirm-chiùil le gnìomhachadh gabhadairean D2 / D3 air neurons spìosrach (Hopf et al., 2003). Gu sònraichte, tha na h-uidheamachdan sin a ’suidheachadh nach eil dopamine a’ dùsgadh neurons NAc gu dìreach, ach gu bheil iad a ’meudachadh an cuid excitability mar fhreagairt air cur-a-steach glutamatergic; mar sin, dh ’fhaodadh iad mìneachadh carson a tha cuiridhean cue-evoked air am bacadh chan ann a-mhàin le antagonists dopamine, ach cuideachd le bhith a’ dèanamh neo-ghnìomhachadh den amygdala basolateral agus cortex prefrontal (Ambroggi et al., 2008; Ishikawa et al., 2008), agus bidh an dithis aca a ’cur ro-mheasaidhean glutamatergic chun NAc (Brog et al., 1993).

Dh ’fhaodadh na h-eadar-dhealachaidhean agus eadar-dhealachaidhean eadar SCH23390 agus buaidhean raclopride a bhith mar thoradh air dà uidheamachd neural eadar-dhealaichte, a’ toirt a-steach dopamine ìreach agus tonic. Leis gu robh an dà chuid antagonists D1 agus D2 / D3 a ’lughdachadh excitation DS-evoked, ach chaidh an excitation NS-evoked nas lugha a bha a’ tachairt anns na h-aon neurons a lughdachadh dìreach leis an antagonist D2 / D3 (Figsichean. 8, , 9), 9), tha e coltach gu bheil dopamine a ’brosnachadh còdachadh luach brosnachaidh tro ghnìomhachadh gabhadairean D1, ach a’ comasachadh freagairtean losgaidh do gach cuisean (co dhiubh a tha iad co-cheangailte ri toradh luachmhor no nach eil) tro gabhadairean D2 / D3. Dh'fhaodadh seo a bhith mar thoradh air na h-eadar-ghluasadan dopamine ìre nas motha a chaidh fhaighinn anns an NAc le ro-innse duais na cuisean neodrach (Phillips et al., 2003; Roitman et al., 2004). Leis gu bheil dàimh nas àirde aig gabhadairean D2 / 3 airson dopamine na gabhadairean D1, is dòcha gum bi tar-chuiridhean dopamine beag NS-evoked gu leòr gus dìreach gabhadairean D2 / 3 a ghnìomhachadh, ach dh ’fhaodadh DSs ro-innseach duais àrdachadh dùmhlachd dopamine gu ìrean àrd gu leòr airson gabhadairean D1 a ghnìomhachadh. (Grace, 1991).

Air an làimh eile, dh ’fhaodadh meud an excitation cue-evoked a bhith air a riaghladh le tonic, seach dopamine mean air mhean. Dh ’fhaodadh ìrean dopamine tonach a bhith a’ nochdadh cosgais cothrom dìth gnìomh (Niv et al., 2007), mar sin a ’suidheachadh spionnadh coileanadh luchd-obrach. Mar sin, ma thèid ìrean dopamine tonic àrd gu leòr a choileanadh, dh ’fhaodadh gabhadairean dopamine gu leòr a bhith air an cur an gnìomh gus excitation cue-evoked a dhèanamh agus latency dòigh-obrach a tha a’ sireadh duais a lughdachadh. Faodaidh uidheamachd den aon seòrsa a bhith mar bhunait air tabhartas ainmeil NAc dopamine ann an coileanadh gnìomhan neo-cheangailte a dh ’fheumas ìre àrd oidhirp (Salamone agus Correa, 2012), anns a bheil aimhreit dopamine ag àrdachadh latencies gus a dhol faisg air an operandum (Nicola, 2010). Dh ’fhaodadh cuisean taobh a-muigh (me, sealladh den luamhan) no glaisean a-staigh (me, ag èirigh bho àm no acras) dòigh-obrach a bhrosnachadh le neurons NAc brosnachail gu ìre nas motha nuair a tha cosgaisean cothrom agus ìrean dopamine àrd.

Gu h-aithghearr, ge bith dè an dòigh sònraichte a bh ’ann airson eòlas-leighis, tha na toraidhean againn a’ sealltainn gu bheil NAc dopamine ag adhartachadh giùlan a tha a ’feuchainn ri duais le bhith a’ toirt togail air an deòin le na neurons NAc airson brosnachadh àrainneachdail. Tha meud an toileachais seo a ’suidheachadh faireachas a’ chuspair gus freagairt dòigh-obrach a thòiseachadh. Tro an dòigh seo, bidh dopamine a ’riaghladh an spionnadh agus an coltachd de bhith a’ lorg dhuaisean duaisichte.

Footnotes

iomraidhean