A 'dùmhlachadh cuairtean neònach a tha a' riaghladh lorg sòbhraidh co-èigneachail (2015) (BINGE MECHANISM)

Gus a bhith a ’comharrachadh neurons LH a bheir seachad cur-a-steach monosynaptic don VTA in vivo agus a’ cumail sùil air a ’ghnìomhachd aca rè giùlan a tha a’ gluasad gu saor, chleachd sinn ro-innleachd dà-bhìoras gus channelrhodopsin-2 (ChR2) a chuir an cèill gu roghnach ann an neurons LH a ’toirt a-steach monosynaptic don VTA (Figearan 1A agus S1). Chuir sinn a-steach vectar viral co-cheangailte ri adeno (AAV₅) a ’giùlan ChR2-eYFP ann am frèam leughaidh fosgailte dà-inverted Cre-recombinase-eisimeil (DIO) a’ togail a-steach don LH gus gabhaltach a thoirt do somata ionadail agus a ’stealladh bhìoras herpes simplex a bha a’ siubhal air ais (HSV) a ’giùlan Cre-recombinase a-steach don VTA. Bha ath-mholadh às dèidh sin a ’ceadachadh opsin agus abairt fluorophore gu roghnach ann an neurons LH a’ toirt seachad cur-a-steach monosynaptic don VTA. Gus an dòigh-obrach againn a dhearbhadh, rinn sinn clàraidhean clamp-clamp làn-cealla ex vivo ann an sliseagan eanchainn còmhnard anns a bheil an LH agus chlàraich sinn bho neurons a ’cur an cèill ChR2-eYFP, a bharrachd air neurons LH nàbaidh a bha ChR2-eYFP àicheil (Figear 1B). Bha latencies spike aotrom, air a thomhas bho bhith a ’tòiseachadh buille aotrom gu mullach an comas gnìomh, eadar 3–8 ms (Figear 1C). Fhuair sinn a-mach cuideachd nach robh gin de na ceallan nach robh a ’cur an cèill (ChR2-àicheil) a chaidh a chlàradh a’ nochdadh freagairtean excitatory gu photostimulation (n = 14; Figear 1C), a dh ’aindeoin cho faisg air ceallan ChR2-expressing.

Gus dealbh-aithneachadh meadhanaichte optogenetically a dhèanamh ann an vivo, chaidh optrode a chuir a-steach don LH gus gnìomhachd neuronal a chlàradh rè gnìomh a bha a ’sireadh sucrose. Anns an aon seisean clàraidh, thug sinn grunn phàtranan de photostimulation gus ChR2 a ’cur an cèill neurons LH-VTA (Figearan 1D agus S1). Rinn sinn sgrùdadh air sgaoileadh latencies photoresponse excitatory thar gach neuron LH a ’nochdadh atharrachadh glaiste-tìm ann an ìre losgaidh mar fhreagairt air soillseachadh agus chunnaic sinn cuairteachadh bimodal (Figear 1E). Chunnaic sinn sluagh de neurons rè chlàran in vivo le latencies ann an raon 3–8 ms. Bha seo co-ionann ris an raon latency a chaidh a lorg ann an ChR2-a ’cur an cèill neurons LH-VTA nuair a chlàraich sinn ex vivo. Thug sinn aonadan “Type 1” air na h-aonadan sin (Figearan 1C, 1E, agus 1F). A bharrachd air an sin, bha sluagh sònraichte de cheallan le latencies photoresponse ∼100 ms (Figearan 1E agus 1G), agus thug sinn na h-aonadan “Type 2” mar ainm orra. Chunnaic sinn cuideachd neurons a bha air am bacadh mar fhreagairt do photostimulation de neurons LH-VTA (Figear S2), agus thug sinn na h-aonadan “Type 3” mar ainm orra. Rinn sinn coimeas eadar an ùine gnìomh a dh ’fhaodadh a bhith ann (mar a chaidh a thomhas bho mhullach gu cas) agus ìrean losgaidh cuibheasach aonadan Type 1 agus Type 2 a bharrachd air an fheadhainn nach do sheall photoresponse (Figear 1H). Sgaoileadh ùine gnìomh a dh’fhaodadh a bhith ann de Type 1 (Figear 1I) agus Seòrsa 2 (Figear 1Tha aonadan J) a ’sealltainn gu bheil comas gnìomh aig a’ mhòr-chuid de na h-aonadan Type 1 nas lugha na 500 μs (84%; n = 16/19, cuairteachadh binomial, p = 0.002).

Ged a tha aonadan Type 1 a ’freagairt air slatan-tomhais àbhaisteach airson a bhith air an seòrsachadh mar ChR2 a’ cur an cèill (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), cha robh e soilleir an robh na photoresponse latency nas fhaide de aonadan Type 2 mar chomharra air neurons a bha a ’cur an cèill ChR2 a fhreagair nas slaodaiche gu photostimulation, no an robh a ’bhuaidh seo mar thoradh air gnìomhachd lìonra. Leis gu robh am pròiseact neurons LH ChR2-expressing (Type 1) LH gu dìreach chun VTA, b ’e aon chothrom a bh’ ann gu robh neurons Type 2 a ’faighinn fios air ais bhon VTA (Figear 1K). B ’e comas eile a bh’ ann gun deach neurons Type 2 a ghnìomhachadh le co-thaobhan axon bho neurons Type 1 (Figear 1L). Gus eadar-dhealachadh a dhèanamh eadar an dà mhodail cuairteachaidh a dh ’fhaodadh a bhith ann, chuir sinn bacadh air an VTA ann an co-bhonn ri photoidentification anns an LH.

Stèidhichte air na modalan cuairteachaidh againn, bhiodh dùil againn nach biodh buaidh aig in-bhacadh distal air na photoresponses de ChR2-expressing LH neurons. Ach, ma bha photoresponsive, ach neo-shoilleir, bha neurons LH an urra ri fios air ais bhon VTA gus freagairt glaiste-ùine fhaighinn airson soillseachadh (Figear 1K), bhiodh dùil againn gum biodh lughdachadh photoresponses anns na neurons sin air casg VTA. Chuir sinn an cèill ChR2 ann an ceallan LH-VTA mar gu h-àrd, ach an turas seo cuideachd chuir sinn an cèill halorhodopsin 3.0 (NpHR) leasaichte anns an VTA agus chuir sinn a-steach fiber optic anns an VTA a bharrachd air an optrode ann an LH (Figear 2A). Lìbhrig sinn na h-aon phàtranan soillseachaidh gorm-aotrom anns an LH airson na trì prìomh ach chuir sinn cuideachd dealbh air an VTA le solas buidhe san dàrna epoch (Figear 2A).

Cha robh buaidh aig photoinpition den VTA air na photoresponses de aonadan Type 1 gu soillseachadh gorm-aotrom anns an LH, a tha co-chòrdail ri abairt ChR2 ann an neurons Type 1 LH-VTA (Figear 2B). An coimeas ri sin, sheall a ’mhòr-chuid de dh'aonadan Type 2 (87%; n = 13/15, cuairteachadh binomial, p = 0.004) lùghdachadh mòr de photoresponses gu buillean gorm-aotrom a chaidh a lìbhrigeadh san LH nuair a chaidh photoinhibition de neurons VTA a thogail. Bha freagairtean aonadan Type 1 agus Type 2 rè photoinhibition VTA gu math eadar-dhealaichte (chi-square = 7.64, p = 0.0057; Figearan 2B agus 2C). Chithear na h-eadar-dhealachaidhean sin cuideachd anns na sgòran max Z rè na h-ìrean fa leth (Figear 2D) agus leis an epoch buidhe-ON air a dhèanamh àbhaisteach don epoch buidhe-OFF (Figear 2E). Tha an dàta seo a ’moladh gum faigh neurons Type 2 LH a-steach (gu dìreach no gu neo-dhìreach) bhon VTA (Figear 1K) seach tro cho-thaobhan axon ionadail (Figear 1L).

An dèidh dhuinn an dà sheòrsa sònraichte de neurons LH a chomharrachadh anns an lùb LH-VTA, bha sinn airson sgrùdadh a dhèanamh air gnìomhachd neural a bha a ’tachairt gu nàdarra rè gnìomh fèin-rianachd sucrose (Figear 3A). Chaidh luchagan an trèanadh gus freagairtean sròine a dhèanamh airson cue a ’ro-innse lìbhrigeadh sucrose aig port faisg air làimh (mar ann an Tye et al., 2008). Gus leigeil leinn eadar-dhealachadh a dhèanamh air freagairtean neòil don t-sròin agus an cue, chaidh an cue agus sucrose a lìbhrigeadh air clàr ath-neartachaidh pàirt, far an deach 50% de phògan sròin a pharadh le lìbhrigeadh cue agus sucrose.

Sheall aonadan Type 1 freagairtean mean air mhean mu inntrigeadh puirt sucrose, mar a chithear ann an aonad riochdaire Type 1 (Figear 3B), a bharrachd air an dàta sluaigh airson gach aonad Type 1 (Figear 3C). Ach bha na freagairtean mean air mhean ann an aonadan Type 2 a ’nochdadh freagairtean don chnap ro-innseach duais (Figearan 3D agus 3E). Tha na pàtrain losgaidh àbhaisteach de gach neuron clàraichte (n = 198, air an roinn ann an Seòrsa 1, 2, 3, agus aonadan neo-freagairteach) air an taisbeanadh airson gach co-phàirt gnìomh: pògan sròin air am pathadh leis a ’chiw, sròinean às aonais an cue, agus inntrigeadh port sucrose (Figear 3F). Bha a h-uile aonad Type 1 a sheall atharrachaidhean mean air mhean ann an gnìomhachd (74%; n = 14/19) an dàrna cuid air am brosnachadh gu ìre no air am bacadh le inntrigeadh port sucrose, le àireamh bheag cuideachd a ’nochdadh casg mean air mhean air an t-sealladh ro-innse duais (Figearan 3B, 3C, agus 3G). An coimeas ri sin, bha aonadan Type 2 nas ioma-ghnèitheach, le neurons a bha mothachail air gnìomhan a ’còdachadh a’ chiw gu roghnach (35%), an t-inntrigeadh port sucrose gu roghnach (26%), no an dà chuid inntrigeadh cue agus port (12%; Figearan 3D, 3E, agus 3H). Gus neart freagairtean aonadan Type 1 agus Type 2 a nochdadh gu tachartasan co-cheangailte ri gnìomhan, dhealbh sinn gach cealla air plota trì-thaobhach a rèir sgòr Z (Figear 3I). Gus sgaoileadh atharrachaidhean mean air mhean ann an losgadh gu iomadh tachartas co-cheangailte ri gnìomhan a nochdadh aig ìre càileachdail, dhealbh sinn an àireamh de cheallan de gach seòrsa photoresponse a bha ann an roinn sònraichte (Figear 3J).

Leis gu bheil àite soilleir aig an VTA ann am mearachd ro-innse duais (me, lughdachadh mean air mhean de losgadh DA neuron mar fhreagairt air dearmad duais ris nach robh dùil agus an lasachadh mean air mhean mar fhreagairt air lìbhrigeadh duais ris nach robh dùil) (Schultz et al., 1997), rinn sinn sgrùdadh an dèanadh LH neurons còd a-mach às nach robh dùil duais sucrose. Gus seo a dhèanamh, chlàraich sinn gnìomhachd neural neurons photoresponsive rè an aon ghnìomh duais airson cue ann am beathaichean le deagh thrèanadh ach chuir sinn air falbh 30% de lìbhrigeadh sucrose air thuaiream às deidh a ’chomhairle (Figear 4A).

Bha a ’mhòr-chuid de na h-aonadan Type 1 (88%; n = 15/17, cuairteachadh binomial, p = 0.001) neo-mhothachail gus dearmad a dhèanamh air dearmad (Figearan 4B agus 4D), ach sheall fo-sheata mhòr de dh'aonadan Type 2 (67%; n = 12/18) freagairt gu math eadar-dhealaichte ri deuchainnean duais-duais agus duais air fhàgail às (Figearan 4C agus 4D). Cho-dhùin sinn gu robh neurons LH-VTA (Type 1) a ’còdachadh a’ ghnìomhachd a thaobh a bhith a ’dol a-steach don phort, leis gu robh na freagairtean inntrigidh port sin seasmhach eadhon nuair a chaidh an duais fhàgail air falbh.Figear 4D), an coimeas ri aonadan Type 2 (chi-square = 10.9804, p = 0.0009).

Gus faighinn a-mach an robh freagairtean Type 1 mu inntrigeadh puirt gu fìrinneach a ’còdachadh an fhreagairt chumhaichte (CR), an taca ri giùlan duais no sgrùdadh coitcheann, chlàraich sinn ann an luchagan gun trèanadh nach d’ fhuair an gnìomh fhathast. Ann an luchagan gnìomh-naive, lìbhrig sinn sucrose chun phort às aonais cue ro-innse (lìbhrigeadh duais gun dùil) agus lorg sinn nach do sheall aonadan Type 1 freagairtean mean air mhean a thaobh inntrigeadh puirt (Figearan 4E, 4F, agus 4I), a rèir a ’mhodail gu bheil neurons Type 1 a’ còdachadh an CR (Figear 4J).

An ath rud, gus faighinn a-mach a bheil gnìomhachd aonad Type 2 co-chòrdail ri pròifil freagairt coltach ri mearachd ro-innse duais, chlàraich sinn cuideachd na neurons sin ann am beathaichean le deagh thrèanadh rè lìbhrigeadh duais gun dùil (Figear 4G). Fhuair sinn a-mach gun robh fo-sheata de dh'aonadan Seòrsa 2 a ’freagairt lìbhrigidh sucrose gun dùil (50%; Figearan 4G - 4I). Air an toirt còmhla, tha fo-sheataichean de aonadan Type 2 mothachail air dearmad duais ris nach robh dùil (Figearan 4C agus 4D) agus lìbhrigeadh duais gun dùil (Figearan 4G - 4I), co-chòrdail ri pròifil freagairt coltach ri mearachd ro-innse duais.

Mar a tha sinn air sealltainn gu h-àrd, tha aonadan Type 1 a ’riochdachadh co-dhàimh neural de CR. Gu cudromach, bidh an àrdachadh ann an ìre losgaidh a ’tòiseachadh ro CR, ag èirigh suas gus am bi an CR air a chrìochnachadh (Figearan 3B, 3C, agus 4B). Gus faighinn a-mach an gabhadh gnìomhachd an t-slighe LH-VTA adhartachadh CR, bha sinn airson deuchainn a dhèanamh air comas gnìomhachd LH-VTA ann a bhith a ’draibheadh ​​CR an aghaidh droch thoradh. Ann an luchagan seòrsa fiadhaich, chuir sinn an cèill ChR2-eYFP no eYFP leotha fhèin ann an cuirp cealla LH agus chuir sinn a-steach fiber optic thairis air an VTA (Figearan 5A agus S4). Air an làimh eile, gus deuchainn a dhèanamh air àite slighe LH-VTA ann a bhith a ’meadhanachadh giùlan CR no giùlan co-cheangailte ri biathadh, chuir sinn an cèill gu dà-thaobhach NpHR-eYFP no eYFP leis fhèin ann an ceallan LH agus chuir sinn a-steach fiber optic os cionn an VTA (Figearan 5A agus S4).

Dhealbhaich sinn gnìomh fuarachaidh Pavlovian anns am feumadh luchagan le dìth bìdh a dhol tarsainn air cliath clisgeadh gus duais sucrose fhaighinn air ais (Figear 5B). Anns a ’chiad epoch“ bun-loidhne ”(leis a’ ghriod clisgeadh), dhearbh sinn gu robh gach luchag air gnìomh dòigh-obrach cumhaichte Pavlovian fhaighinn. Anns an dàrna linn (“Shock”), lìbhrig a ’ghriod clisgeadh casan socair gach dàrna fear. Mu dheireadh, anns an treas epoch (“Shock + Light”), chùm sinn oirnn a ’lìbhrigeadh buillean coise ach cuideachd solais LH air an soilleireachadh anns an VTA le solas gorm (10 Hz) ann an luchagan a’ cur an cèill ChR2 agus a ’maidseadh smachdan eYFP agus solas buidhe (seasmhach) airson luchainn a ’cur an cèill NpHR agus na smachdan eYFP aca (Figear 5B).

Chunnaic sinn àireamh gu math nas àirde de dh ’inntrigidhean puirt gach cue rè an àm Shock + Light agus sgòr eadar-dhealachaidh gu math nas àirde (Shock + Light epoch - epock Shock-only) ann an luchagan ChR2 an coimeas ri luchagan eYFP (Figear 5C agus Film S1). An coimeas ri sin, dh ’adhbhraich photoinhibition de shlighe LH-VTA lùghdachadh mòr ann an inntrigidhean puirt gach cue agus sgòran eadar-dhealachaidh anns na luchagan NpHR an coimeas ri luchagan eYFP (Figear 5D agus Film S2). Sheall deuchainnean a chaidh à bith taobh a-staigh seisean far nach robh taisbeanaidhean cue air an leantainn le lìbhrigeadh sucrose gluasadan coltach ri chèile ann an èifeachd (Figear S4).

Gu cudromach, bha sinn airson faighinn a-mach an robh na h-atharrachaidhean ann an giùlan sucrose a fhuair sinn air adhbhrachadh le atharrachaidhean ann an giùlan co-cheangailte ri biathadh no cugallachd ri pian. Chunnaic sinn gu robh photoactivation de ro-mheasadh LH-VTA a ’meudachadh gu mòr an ùine a chaidh a chaitheamh a’ biadhadh ann an luchagan le deagh bhiadh anns a ’bhuidheann ChR2 (Figear 5E). Ach, cha do rinn photoinhibition den t-slighe LH-VTA lùghdachadh mòr air biathadh (Figear 5F), eadhon ged nach robh biadh aig na beathaichean sin gus cur ris a ’chomas againn lughdachadh a lorg an coimeas ris an epoch bun-loidhne (dèan coimeas ri beathaichean saillte ann an Figear 5E). Anns an dàrna cuid an ChR2 (Figear 5G) no buidheann NpHR (Figear 5H) an do choimhead sinn air eadar-dhealachadh ann an cianalas airson tarraing earball a-mach à uisge teth (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto agus Sulman, 1967), a ’nochdadh nach robh a bhith a’ làimhseachadh ro-mheasadh LH-VTA ag atharrachadh analgesia.

Gus sgrùdadh a dhèanamh air co-dhèanamh nan co-phàirtean tar-chuir luath de chuir a-steach LH chun VTA a bha a ’faighinn a-mach na buaidhean sin, rinn sinn clàraidhean clamp-clamp làn-cealla bho neurons VTA ann an ullachadh sliseag gheur fhad‘ s a bha sinn a ’gnìomhachadh cuir-a-steach LH gu optigeach a’ cur an cèill ChR2-eYFP (Figearan 6A agus S5). Leis gu bheil heterogeneity stèidhichte taobh a-staigh an VTA, a ’toirt a-steach ∼65% DA neurons, ∼30% neurons GABA, agus ∼5% neurons glutamate (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al., 2007), lìon sinn ceallan le biocytin fhad ‘s a bha sinn a’ clàradh gus leigeil le seòrsa cealla a chomharrachadh a ’cleachdadh immunohistochemistry post-hoc airson tyrosine hydroxylase (TH; Figear 6B), a bharrachd air a bhith a ’clàradh an t-sruth cation hyperpolarization-activated (I._h) agus mapadh àite cealla (Figearan 6B agus S5).

An toiseach, chlàraich sinn ann an clamp gnàthach aig àm photostimulation de ChR2-expressing LH a ’cur an cèill agus chunnaic sinn gu robh 23 de 27 neurons a’ nochdadh freagairt glaiste ùine gu photostimulation de chuir a-steach LH (Figear 6C). Fhuair a ’mhòr-chuid de neurons DA a chaidh an samplachadh anns an VTA cuir a-steach glan bhon LH (56%), ach sheall fo-sheata eile casg lom (30%; Figear 6C). Tha an sgaoileadh spàsail de na neurons DA sin air a mhapadh air atlas airson sliseagan còmhnard anns a bheil an VTA (Figear 6D).

Gus tabhartas monosynaptic cuir a-steach LH a stèidheachadh do neurons VTA DA, chleachd sinn mapadh cuairteachaidh le taic ChR2, far an deach clàraidhean bholtadh-clamp a dhèanamh an làthair tetrodotoxin (TTX) agus 4-aminopyridine (4AP; Petreanu et al., 2007) . Co-chòrdail ris na beachdan againn bho chlàran gnàthach-clamp, chunnaic sinn gun d ’fhuair a’ mhòr-chuid de neurons VTA DA clàraichte a-mhàin cuir a-steach monosynaptic excitatory bhon LH (67%), an coimeas ri neurons VTA DA a fhuair a-mhàin cur-a-steach monosynaptic bacaidh (11%), no an dà chuid (22%; Figearan 6E agus S6).

Chomharraich sinn neurons VTA GABA le bhith a ’stealladh fluorophore Cre-eisimeil (AAV₅-DIO-mCherry) a-steach don VTA de VGAT :: Cre luchagan agus a ’cleachdadh abairt mCherry gus clàradh neurons VTA GABA a stiùireadh (n = 24; Figear 6F). Fhreagair ceathrad ’s a sia sa cheud de neurons VTA GABA le excitation lom, ach fhreagair 54% le in-chasg lom, ri photostimulation de ChR2-expressing LH a’ cur a-steach (Figear 6G). Tha cuairteachadh farsaingeachd nan ceallan sin air a shealltainn ann an Figear 6H. Nuair a chaidh sgrùdadh a dhèanamh air cur-a-steach monosynaptic bhon LH (mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd), fhuair sinn a-mach gun d ’fhuair 18% de neurons GABA a chaidh an samplachadh cur-a-steach excitatory a-mhàin agus fhuair 9% a-mhàin cuir-a-steach bacaidh (Figear 6I). Ach, an coimeas ri neurons VTA DA, lorg sinn gu robh barrachd neurons VTA GABA a ’faighinn an dà chuid excitatory AMPAR-mediated agus inhibitory GABA_ACuir a-steach monosynaptic R-meadhanaichte bhon LH (73%; chi-square = 5.0505, p = 0.0246; Figearan 6I agus S6).

Leis gun tug na clàraidhean ex vivo againn fianais a ’toirt taic do chuir a-steach làidir bho gach cuid ro-mheasaidhean GABAergic agus glutamatergic LH chun VTA, rinn sinn sgrùdadh a-rithist air àite gach co-phàirt gu neo-eisimeileach. Gus seo a dhèanamh, chleachd sinn loidhnichean luch transgenic a ’cur an cèill Cre-recombinase ann an neurons a chuir an cèill an dàrna cuid còmhdhail glutamate vesicular 2 (VGLUT2) no neach-còmhdhail GABA vesicular (VGAT). Chuir sinn a-steach AAV₅-DIO-ChR2-eYFP no AAV₅-DIO-eYFP a-steach don LH de VGLUT2 :: Cre agus VGAT :: Cre luchagan agus chuir iad a-steach fiber optic thairis air an VTA (Figear S7). Bha na beathaichean sin an uairsin air an ruith air gach aon de na measaidhean giùlain a chithear ann Figear 5.

Cha do choimhead sinn ri eadar-dhealachaidhean so-fhaicsinneach anns an àireamh de dh ’inntrigidhean puirt a chaidh a dhèanamh gach cue eadar luchagan a’ cur an cèill ChR2 no eYFP anns an LH^glutTeilgeadh -VTA (Figear 7A) no anns an LH^GABATeilgeadh -VTA (Figear 7B). Ach air mion-sgrùdadh bhidio, mhothaich sinn giùlan gnawing neo-sheasmhach san LH^GABA-VTA: Buidheann ChR2 air soillseachadh gorm-aotrom (faic Filmichean S3 agus S4). Ann an LH^glut-VTA luchainn, ged a bha gluasad a dh ’ionnsaigh lùghdachadh ann am biadhadh air photostimulation sa bhuidheann ChR2 an coimeas ris a’ bhuidheann eYFP, cha robh seo cudromach gu staitistigeil (Figear 7C). An coimeas ri sin, chunnaic sinn àrdachadh làidir san ùine a chaidh a chaitheamh a ’biadhadh ann an luchagan saillte air soillseachadh san LH^GABA-VTA: Buidheann ChR2 an coimeas ri smachdan (Figear 7D agus Film S3). Cha robh buaidh brosnachaidh solais anns gach buidheann de bheathaichean anns a ’assay tarraing air ais earball (Figearan 7E agus 7F).

Rè an obair beathachaidh, mar a rinn sinn tron ​​obair sireadh sucrose, mhothaich sinn a-rithist sreathan motair co-cheangailte ri biadhadh nach robh air an stiùireadh gu biadh. Rinn sinn filmeadh luchag riochdachail san LH^GABA-VTA: Buidheann ChR2 ann an seòmar falamh falamh, agus air photostimulation 20 Hz, chunnaic sinn sreathan motair appetitive annasach mar licking agus gnawing an làr no àite falamh (Film S4). Rinn sinn tomhas air na giùlan “gnawing” sin rè an obair beathachaidh anns an t-seòrsa fiadhaich LH-VTA (Figear 7G), LH^glut-VTA (Figear 7H), agus LH^GABA-VTA (Figear 7I) buidhnean agus sheall iad gu robh LH^GABA-VTA: Luchagan ChR2 air an cnagadh nas motha na seòrsa fiadhaich no LH^glut-VTA: Luchagan ChR2 nuair a thèid an photostimulated, an taca ris na buidhnean eYFP aca (Figear 7J). Bheachdaich sinn an gabhadh na giùlan beathachaidh aberrant a sgaradh bho bhiadhadh le stiùireadh iomchaidh aig triceadan nas ìsle. Ach, nuair a rinn sinn deuchainn air an LH^GABA-VTA: Buidheann ChR2 le trèanaichean 5 Hz agus 10 Hz de sholas gorm, chunnaic sinn dàimh co-roinneil eadar tricead brosnachaidh agus gach cuid biadhadh agus cnagadh (Figear 7K).

Chaidh an ro-mheasadh LH chun VTA a sgrùdadh le sgrùdaidhean bualadh brosnachaidh dealain (Bielajew agus Shizgal, 1986) agus tha beachd air a bhith ann o chionn fhada a bhith a ’cluich pàirt ann an giullachd dhuaisean (Hoebel agus Teitelbaum, 1962, Margules and Olds, 1962), ach a’ comharrachadh seo dreuchd air a bhith na dhùbhlan. An seo, tha sinn a ’toirt seachad mìneachadh mionaideach air mar a bhios pàirtean fa leth den lùb LH-VTA a’ giullachd diofar thaobhan de ghnìomh co-cheangailte ri duais.

Tro bhith a ’cleachdadh phototagging meadhanaichte optogenetic (Figear 1), tha sinn air dà bhuidheann de neurons LH a chomharrachadh: ceallan a chuireas ro-mheasaidhean chun VTA (Type 1) agus ceallan a gheibh fios air ais bhon VTA (Type 2; Figear 2) - ged nach fheum na h-àireamhan sin a bhith an eisimeil a chèile, oir tha e comasach gum faodadh LH neurons an dà chuid cuir a-steach agus a-steach chun VTA agus bhuaithe. Gu h-inntinneach, fhuair sinn a-mach nach robh ach glè bheag de neurons photoresponsive taobh a-muigh an sgaoileadh bimodal a ’gabhail a-steach an dà shluagh sin (Figearan S2B agus 1E). Air sgàth seo, an co-bhonn ris an dàil latency fada ann an photoresponses Type 2 (∼100 ms), tha sinn a ’dèanamh a-mach gur dòcha gu bheil aon phrìomh shlighe ann a tha a’ cur ri gnìomhachd neurons Type 2. A bharrachd air an sin, seach gu bheil DA a ’ceangal gabhadairean ceangailte ri pròtain G, tha an cineòlas nas slaodaiche na a’ mhòr-chuid de synapses glutamatergic (Girault and Greengard, 2004) agus dh ’fhaodadh iad am buidheann seo de 100 ms latency photoresponsive a mhìneachadh. Tha e comasach cuideachd gum faod an VTA fios air ais neo-dhìreach a thoirt seachad tro roinnean distal eile, tro roinnean eadar-mheadhanach excitatory leithid an amygdala, no le dì-ghalarachadh tro na niuclas accumbens (NAc) no niuclas leabaidh an stria terminalis (BNST).

Gu h-inntinneach, ged a tha photostimulation de dh'aonadan Type 1 a ’nochdadh freagairtean excitatory ann an aonadan Type 2, tha aonadan Type 1 agus 2 a’ nochdadh feartan còdaidh giùlain sònraichte. Mar eisimpleir, tha na h-àireamhan de dh'aonadan Type 1 agus Type 2 a tha a ’còdachadh gu roghnach an cue ro-innse duais gu math eadar-dhealaichte (n = 0/19 Seòrsa 1 an aghaidh n = 12/34 Seòrsa 2, chi-ceàrnag = 8.67, p = 0.003) . Dh ’fhaodadh am pàtran freagairt paradoxical seo a bhith mar thoradh air pròiseasan coimpiutaireachd aig eileamaid cuairteachaidh eadar-mheadhanach, leithid an VTA, a dh’ fhaodadh a bhith a ’cluich pàirt gnìomhach rè a’ ghnìomh giùlain ach neo-ghnìomhach rè phototagging. A bharrachd air an sin, dh'fhaodadh staid giùlain an ainmhidh buaidh a thoirt air mar a tha an dàta seo air a phròiseasadh.

Leig na deuchainnean dearmad duais againn dhuinn eadar-dhealachadh a dhèanamh eadar còdachadh neural LH den CR agus caitheamh an spreagadh neo-chumhaichte (US). Anns na deuchainnean sin, fhreagair fo-sheata de dh'aonadan Type 2 an cue ro-innse duais (CS) agus na SA agus sheall iad cuideachd lùghdachadh ann an ìre losgaidh nuair a chaidh duaisean ris an robh dùil fhàgail às. A bharrachd air an sin, tha fo-sheata de dh'aonadan Type 2 cuideachd a ’nochdadh lasachadh mean air mhean air lìbhrigeadh duais ris nach robh dùil (Figearan 4G agus 4H). Tha an dàta seo mar chuimhneachan air an dòigh anns a bheil DA neurons anns a ’VTA a’ còdachadh mearachd ro-innse duais (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Tha sinn a ’dèanamh a-mach gum faod neurons VTA comharran mearachd ro-innse duais a thar-chuir gu fo-sheata de neurons LH, a tha ann an deagh shuidheachadh gus na comharran sin fhilleadh a-steach airson toradh giùlan iomchaidh a dhearbhadh. Gu sònraichte, tha an LH eadar-cheangailte gu làidir le mòran de raointean eanchainn eile (Berthoud and Münzberg, 2011) agus tha e air a bhith ceangailte gu h-adhbharach ri stàitean homeostatic leithid cadal / arousal agus acras / satiety (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

Chaidh a ’mhòr-chuid de ghiùlan èiginneach a tha a’ sireadh dhuaisean a dheasbad ann an co-theacsa tràilleachd dhrogaichean, far an robh paradigm clasaigeach airson a bhith a ’sireadh dhrogaichean èigneachail air a bhith a’ sgrùdadh na h-ìre gu bheil giùlan sireadh dhrogaichean a ’leantainn an aghaidh droch bhuaidh, leithid clisgeadh coise (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren agus Everitt, 2004). Rinn sinn atharrachadh air a ’ghnìomh seo airson sucrose a’ feuchainn ri leigeil leinn sgrùdadh a dhèanamh an robh gnìomhachd air slighe LH-VTA gu leòr gus a bhith a ’brosnachadh sireadh sucrose èigneachail. Leis gur e eadar-dhealachadh sònraichte eadar duais dhrogaichean is duais nàdurrach nach eil feum air duaisean dhrogaichean airson a bhith beò, tha connspaid ann a thaobh dè an giùlan a bhiodh na ghiùlan èigneachail no a ’sireadh bìdh. Is e eadar-mhìneachadh eile den dàta againn gu bheil gnìomhachd an t-slighe LH-VTA dìreach a ’meudachadh spionnadh brosnachaidh no an t-ìmpidh a bhith a’ sireadh luchd-neartachadh appetitive. Mar a tha ìrean reamhrachd air a dhol suas anns na deicheadan o chionn ghoirid (Mietus-Snyder agus Lustig, 2008), tha overeating èiginneach agus tràilleachd siùcair nan suidheachaidhean cumanta a tha nan cunnart mòr do shlàinte dhaoine (Avena, 2007). Tha an giùlan beathachaidh ann an luchagan saillte (làn bhiadhadh) às deidh dhaibh a bhith a ’gnìomhachadh slighe LH-VTA a’ cur nar cuimhne na cleachdaidhean ithe a chithear ann an daoine a chaidh a dhearbhadh le eas-òrdugh overeating èigneachail (no eas-òrdugh ithe binge) (DSM-V).

Chaidh a mholadh gum bi gnìomhan a tha a ’dol air adhart a-rithist a’ leantainn gu cruthachadh chleachdaidhean, a bhios iad fhèin a ’leantainn gu duais èiginneach a tha a’ comharrachadh tràilleachd (Everitt agus Robbins, 2005). Tha an lorg againn nach eil neurons LH-VTA a ’còdachadh inntrigeadh puirt a-mhàin às deidh dhaibh a bhith a’ fuarachadh gu bheil an t-slighe seo gu roghnach a ’còdachadh freagairt le cumhachan, chan e dìreach gnìomh brosnachail. Tha seo co-chòrdail ris na beachdan againn gum faod gnìomhachadh an ro-mheasadh seo a bhith a ’brosnachadh duais èigneachail a dh’ aindeoin droch thoradh (Figear 5C), a bharrachd air às aonais feum (mar a chithear ann an luchagan saillte, Figear 5E). Tha an eadar-mhìneachadh seo air a dhearbhadh nas motha leis na fhuair sinn a-mach gu bheil photoinhibition de shlighe LH-VTA gu roghnach a ’lughdachadh sireadh sucrose èigneachail (Figear 5D) ach chan eil e a ’lughdachadh biadhadh ann an luchagan cuibhrichte le biadh (Figear 5F). Is e aon de na dùbhlain as motha a thaobh a bhith a ’làimhseachadh eas-fhulangas èigneachail no eas-òrdughan ithe-bidhe an cunnart a bhith a’ lughdachadh giùlan biadhaidh san fharsaingeachd. Bho shealladh eadar-theangachaidh, is dòcha gu bheil sinn air cuairteachadh neòil sònraichte a chomharrachadh mar thargaid a dh ’fhaodadh a bhith ann airson eadar-theachdan teirpeach a leasachadh airson overeating èigneachail no tràilleachd siùcair gun a bhith ag ìobradh giùlan biadhaidh nàdarra.

Tha sinn a ’sealltainn, a bharrachd air co-phàirt glutamatergic LH-VTA (Kempadoo et al., 2013), gu bheil pàirt GABAergic cudromach anns an ro-mheasadh (Leinninger et al., 2009), agus gu bheil neurons LH a’ synapse gu dìreach air an dà chuid DA agus Neurons GABA anns an VTA (Figear 6). Ach, tha eadar-dhealachadh ann an cothromachadh an cuir a-steach excitatory / inhibitory air VTA DA agus GABA neurons.

Fhad ‘s a chleachd sinn giollachd immunohistochemical gus dearbhadh dearbh-aithne neurons VTA, thomhais sinn cuideachd I._h, hyperpolarization-activated taobh a-staigh a ’ceartachadh sruth cation neo-shònraichte (Lacey et al., 1989, Ungless and Grace, 2012). Chaidh làthaireachd an t-sruth seo a chleachdadh gu farsaing ann an sgrùdaidhean electrophysiologic gus neurons DA a chomharrachadh, ach thathas air sealltainn nach eil e an làthair ach ann am fo-bhuidhnean de neurons DA, air am mìneachadh le targaid ro-mheasadh (Lammel et al., 2011). Ged a chaidh a mholadh roimhe seo ann an sgrùdadh le Fields agus co-obraichean gum bi “LH neurons a’ synapse air ro-mheasaidhean VTA don PFC, ach chan e an fheadhainn a tha a ’dol a-mach chun NAc” (Fields et al., 2007), tha an dàta againn a ’moladh gun tèid a’ chonnspaid seo ath-fhosgladh airson tuilleadh sgrùdaidh. Eadhon ged a choimhead sinn fo-sheata de neurons DA a fhuair excitation lom bhon LH agus aig an robh I glè bheag_h (co-chòrdail ri mPFC- no NAc medial shell-projecting DA neurons), chunnaic sinn cuideachd fo-sheata de neurons DA a fhuair cuir a-steach lom excitatory agus a sheall I mòr_h (co-chòrdail ri feartan neurons DA a tha a ’stobadh a-mach gu slige fadalach an NAc; Figear S5; Lammel et al., 2011). Air an làimh eile, sheall neurons VTA DA a fhuair cuir a-steach glan inhibitory I gu math beag_h no às aonais an t-sruth seo, a tha co-chòrdail ris a ’bheachd gu bheil an LH gu ìre mhòr a’ cur a-steach bacadh air neurons VTA DA a tha a ’stobadh a-mach chun mPFC no slige medial an NAc. Bidh sinn cuideachd a ’sealltainn gum faodar inntrigidhean LH a choimhead an dà chuid ann am VTA medial agus lateral, a’ moladh gu bheil an LH a ’toirt a-steach cuir a-steach do neurons VTA le targaidean ro-mheasaidh eadar-mheasgte, oir tha fios gu bheil targaid ro-mheasadh VTA a’ freagairt gu ìre ri àite spàsail air axis medial-lateral ( Lammel et al., 2008).

Tha àite an t-slighe LH-VTA ann a bhith a ’brosnachadh duais air a bhith air a mhìneachadh roimhe seo gu sgaoileadh glutamatergic anns an VTA (Kempadoo et al., 2013), oir thathas gu tric den bheachd gu bheil an neach-adhartachaidh CaMKIIα roghnach airson neurons teilgean excitatory. Ach, tha an dàta againn a ’sealltainn gu soilleir gu bheil a bhith a’ cur an cèill ChR2 fo smachd an neach-adhartachaidh CaMKIIα cuideachd a ’cuimseachadh air neurons ro-mheasadh GABAergic anns an LH (Figear 6).

An giùlan a chaidh a thogail le photostimulation den LH^GABABha slighe -VTA frenzied, mis-stiùirichte, agus maladaptive (Film S4). Is e aon mhìneachadh gur e gnìomhachadh an LH^GABABidh slighe -VTA a ’cur comharra chun luchag a dh’ adhbhraicheas aithneachadh ath-neartachadh appetitive. Is e mìneachadh eile gu bheil an LH^GABADh ’fhaodadh slighe -VTA a bhith a’ stiùireadh salchar brosnachaidh no dian “ag iarraidh,” a tha co-chòrdail ri comharra a tha mar bhun-stèidh le suidheachadh cumhaichte, ach aig ìre neo-fhiseòlasach a bheir a-mach an giùlan neo-sheasmhach seo co-cheangailte ri biathadh (Berridge agus Robinson, 2003). A rèir seo, tha e comasach gun tèid an LH a ghnìomhachadh^GABABidh teilgeadh -VTA gu dearbh a ’toirt a-mach faireachdainnean dian de bhith a’ sgàineadh, no a ’cur ìmpidh air a bhith a’ biathadh. Ach, tha na deuchainnean againn a ’sealltainn gun deach LH a ghnìomhachadh^GABA-VTA nach eil a ’toirt a-mach àrdachadh ann a bhith a’ sireadh sucrose èigneachail, ach tha seo dualtach mar thoradh air cus giùlan gnawing agus aberrant appetitive a tha ag amas air nithean neo-bhidhe san t-seòmar deuchainn. Ged a tha e duilich eòlas na luchaige a dhearbhadh tron ​​làimhseachadh seo, tha e soilleir gu bheil giùlan ceangailte ri biadhadh air a stiùireadh gu h-iomchaidh a ’feumachdainn gnìomhachd co-òrdanaichte an dà chuid GABAergic agus glutamatergic den t-slighe LH-VTA.

Tha làimhseachadh optogenetic agus pharmacogenetic nan innealan cumhachdach airson dàimhean adhbharach a stèidheachadh, ach a dh ’aindeoin sin chan eil iad a’ nochdadh feartan endogenous, fiseòlasach nan eileamaidean cuairteachaidh neural. Tha an sgrùdadh againn ag aonachadh fiosrachadh mun cheangal synaptic, an gnìomh endogenous a tha a ’tachairt gu nàdarra, agus àite adhbharach slighe LH-VTA, a’ toirt ìre ùr de shealladh a thaobh mar a tha fiosrachadh air fhilleadh a-steach don chuairt seo. Tha na toraidhean sin a ’soilleireachadh cho cudromach sa tha e sgrùdadh a dhèanamh air àite gnìomh neurons le ceangal, a bharrachd air comharran ginteil. Bha neurons LH-VTA a ’còdachadh gu roghnach gnìomh a bhith a’ sireadh dhuaisean ach cha do chuir iad a-steach brosnachaidhean àrainneachd, ach bha brosnachaidhean buannachdail agus glaodhan ro-innse duais air an còdachadh le sluagh air leth de neurons LH sìos an abhainn den VTA. A bharrachd air an sin, tha sinn air ro-mheasadh sònraichte a chomharrachadh a tha ceangailte gu h-adhbharach ri giùlan èiginneach sucrose agus biadhadh. Tha an ioma-ghnèitheachd ann an ro-mheasadh LH-VTA riatanach airson cothromachadh atharrachail a thoirt seachad eadar brosnachadh draibhidh agus riaghladh giùlan appetitive air a stiùireadh gu h-iomchaidh. Tha na co-dhùnaidhean sin a ’toirt a-steach seallaidhean a tha buntainneach ri suidheachaidhean pathology leithid eas-òrdugh overeating èiginneach, cuir siùcar, agus reamhrachd