Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 - 1511.
Air fhoillseachadh air-loidhne 2017 Cèitean 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Abstract
Amasan / beachd-bharail
Le bhith a ’faighinn thairis air geir daithead ag adhbhrachadh reamhrachd ann an daoine agus creimich. Tha sgrùdaidhean o chionn ghoirid ann an daoine agus creimich air sealltainn gu bheil tràilleachd gu geir a ’roinn inneal cumanta le tràilleachd ri deoch làidir, nicotine agus narcotics a thaobh dìth siostaman duais eanchainn. Chaidh a shoilleireachadh gu bheil daithead le geir àrd (HFD) a ’dèanamh grèim air soidhne gabhadair dopamine D2 (D2R) anns an striatum, riaghladair cudthromach san t-siostam duais eanchainn, a’ leantainn gu overeating hedonic. Dh ’innis sinn roimhe seo gun do lughdaich am ball bith-ghnìomhach γ-oryzanol donn sònraichte an roghainn airson HFD tro smachd hypothalamic. Mar sin rinn sinn sgrùdadh air a ’chomas gum biodh γ-oryzanol ag atharrachadh gnìomhachd siostam duais an eanchainn ann an luchagan.
Dòighean-obrach
Chaidh luchagan fireann C57BL / 6J a bhiadhadh HFD a làimhseachadh gu beòil le γ-oryzanol, agus chaidh ìrean striatal de mholacilean a bha an sàs ann an comharrachadh D2R a mheasadh. Chaidh sgrùdadh a dhèanamh air buaidh γ-oryzanol air methylation DNA an neach-adhartachaidh D2R agus atharrachaidhean às deidh sin ann an roghainnean airson geir daithead. A bharrachd air an sin, chaidh sgrùdadh a dhèanamh air buaidhean 5-aza-2′-deoxycytidine, neach-bacadh làidir de methyltransferases DNA (DNMTs), air roghainn bìdh, comharran D2R agus ìrean DNMTs san striatum. Chaidh na buaidhean bacaidh γ-oryzanol air gnìomhachd DNMTs a mheasadh gu enzymatically ann an vitro.
toraidhean
Ann an striatum bho luchainn a ’biadhadh HFD, chaidh cinneasachadh D2Rs a lughdachadh tro àrdachadh ann am methylation DNA ann an sgìre brosnachaidh an D2R. Lùghdaich rianachd beòil γ-oryzanol faireachdainn agus gnìomhachd DNMT, agus mar sin ag ath-nuadhachadh ìre D2Rs anns an striatum. Bha casg Pharmacology de DNMTs le 5-aza-2′-deoxycytidine cuideachd a ’lughdachadh an roghainn airson geir daithead. A ’co-chòrdadh ris na co-dhùnaidhean sin, sheall measaidhean enzymatic in vitro gun robh γ-oryzanol a’ cur bacadh air gnìomhachd DNMTs.
Co-dhùnaidhean / mìneachadh
Sheall sinn gu bheil γ-oryzanol a ’lughdachadh hypermethylation DNA a tha air a bhrosnachadh le HFD ann an sgìre an neach-adhartachaidh D2R ann an striatum luchainn. Tha am paradigm deuchainneach againn a ’cur cuideam air γ-oryzanol mar stuth gealltanach antiobesity leis an seilbh shònraichte a bhith na mhoduladair epigenetic nobhail.
Stuth leasachail dealanach
Anns an dreach air-loidhne den artaigil seo (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) tha stuth leasachail ath-sgrùdaichte le co-aoisean ach a tha ri fhaighinn do luchd-cleachdaidh ùghdarraichte.
Ro-ràdh
Bidh a bhith a ’dol thairis air daoine reamhar a’ roinn, co-dhiù ann am pàirt, uidheamachdan cumanta le tràilleachd ri deoch làidir, nicotine agus narcotics [1]. A bharrachd air riaghladh hypothalamic agus hormonal appetite, tha an siostam duais eanchainn, gu sònraichte comharran gabhadair dopamine, ceangailte gu dlùth ri giùlan biadhaidh addictive no hedonic [2]. Sheall sgrùdadh roimhe ann am radain gu robh a bhith a ’leagail an gabhadair dopamine D2 striatal (D2R) le hairpin ghoirid le meadhanachadh lentivirus a’ toirt a-steach RNA gu luath a ’toirt a-steach easbhaidhean duais coltach ri tràilleachd agus a’ sireadh biadh coltach ri èigneachadh [3]. Air sgàth an dùmhlachd D2R lùghdaichte, chan eil an striatum droma cho freagairteach ri duais bìdh an coimeas ri buidhnean smachd lean ann an daoine reamhar agus creimich [3-5]. A rèir a ’bheachd seo, tha an TaqIA allele an ANKK1 tha locus gine (còdachadh DRD2 / ankyrin ath-aithris agus fearann kinase anns a bheil 1), a lùghdaicheas cinneasachadh D2R striatal, ceangailte ri phenotype reamhar ann an daoine [6], fhad ‘s a tha buaidhean call cuideim às deidh lannsaireachd bariatrach co-cheangailte ri dùmhlachd D2R striatal àrdaichte [7]. Tha an dàta seo a ’moladh gu làidir cho cudromach sa tha D2R striatal mar thargaid therapach ùr-nodha airson làimhseachadh reamhrachd. Ach, dh ’adhbhraich cuid de dhrogaichean a chaidh an leasachadh a bha an sàs ann an siostam duais an eanchainn droch bhuaidhean mòra, a’ toirt a-steach droch dhuilgheadasan inntinn-inntinn, agus mar thoradh air an sin chaidh an toirt a-mach à clionaigean aig a ’cheann thall [8].
Tha atharrachaidhean epigenetic deatamach chan ann a-mhàin airson leasachadh agus eadar-dhealachadh, ach cuideachd air sgàth gu bheil iad ag èirigh mar thoradh air atharrachaidhean àrainneachd, a ’gabhail a-steach daithead agus dòigh-beatha [9]. Tha methylation DNA na phrìomh thachartas epigenetic airson seasmhachd faireachdainn gine [9]. Ann am radain, bidh eòlas màthaireil air daithead làn geir (HFD) eadar-ghinealach ag atharrachadh methylation DNA taobh a-staigh an t-siostam duais meadhanach anns a ’chlann, a’ leantainn gu cus cus de HFD leis na cuileanan [10]. Gu sònraichte, tha pàirt deatamach aig DNA methyltransferases (DNMTs) ann an riaghladh an dà chuid giùlan biadhaidh agus gnìomhachd chorporra [10, 11], a ’moladh gum faodadh DNMT a bhith a’ gealltainn targaidean leigheasach airson leigheas reamhrachd-tinneas an t-siùcair. Gu cudromach, tha fios gu bheil cuid de stuthan nàdarra a thig bho bhiadh, a ’toirt a-steach searbhag caffeic agus epigallocatechin, mar luchd-dìon DNMT [12, 13].
Tha sinn air sealltainn o chionn ghoirid gu bheil am pàirt bith-oryzanol bith-ghnìomhach donn, γ-oryzanol, measgachadh de ester aigéad ferulic agus grunn phytosterols, a ’daingneachadh an roghainn airson geir daithead tro lùghdachadh ann an cuideam hypothalamic endoplasmic reticulum (ER) [14]. Ann an luchagan agus coineanaich, chaidh γ-oryzanol a bha air a rianachd gu beòil a thoirt a-steach gu luath bhon bhroinn agus a sgaoileadh sa mhòr-chuid don eanchainn [15, 16]. Le bhith a ’toirt na co-dhùnaidhean sin còmhla, dh’ fhaodadh toraidhean nàdarra a thig bho bhiadh a tha ag obair air an t-siostam nearbhach meadhanach a bhith na dhòigh eile air giùlan biadhaidh le reamhrachd a lughdachadh gu sàbhailte. Anns a ’cho-theacsa seo, rinn sinn deuchainn air a’ bheachd-bheachd gum biodh γ-oryzanol ag atharrachadh inbhe methylation DNA ann an siostam duais an eanchainn, a ’leantainn gu lùghdachadh ann an roghainn HFD ann an luchagan.
Dòighean-obrach
Animals
Chaidh luchagan fireann C57BL / 6J seachd seachdainean a chaidh fhaighinn bho Charles River Laboratories Iapan (Kanagawa, Iapan) a chumail (3–4 gach cèidse) ann an suidheachaidhean sònraichte gun pathogen aig 24 ° C fo sholas 12 h / 12 h / cearcall dorcha. Às deidh seachdain de acclimatization, chaidh luchagan 8-seachdain a mhaidseadh le cuideam agus a roinn ann an dà no trì buidhnean gus a dhol tro gach deuchainn. Bha cead aig na luchagan faighinn gu biadh agus uisge an-asgaidh. Chaidh a h-uile deuchainn beathach aontachadh le Comataidh Beusachd Deuchainn Bheathaichean Oilthigh Ryukyus (àireamhan 5352, 5718 agus 5943).
Rianachd γ-oryzanol agus 5-aza-2′-deoxycytidine
Gus measadh a dhèanamh air an roghainn airson an HFD, chaidh γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Iapan) a rianachd gu luchagan 8-seachdain-bliadhna le gavage rè an deuchainn roghainn bìdh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [14, 17]. Airson na deuchainnean eile, chaidh HFD (D12079B; Diets Rannsachaidh, New Brunswick, NJ, na SA) anns a bheil 0.4% γ-oryzanol a dhèanamh mar pheilearan. Tha na pàirtean den daithead air an sealltainn ann an Clàr stuthan leasachail dealanach (ESM) 1. Às deidh 12 seachdainean de bhiadhadh, chaidh clò a chruinneachadh bhon striatum agus hypothalamus. Bha an in-ghabhail làitheil de γ-oryzanol, air a thomhas bho thomhas cuibheasach bidhe nan luchagan, timcheall air cuideam corp 320 μg / g. Chaidh na dòsan de γ-oryzanol a dhearbhadh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [14]. Chaidh an 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, na SA) a thoirt a-steach gu intraperitoneally (cuideam bodhaig 0.25 μg / g) trì tursan san t-seachdain airson 12 seachdainean [18].
Tomhas air an roghainn airson geir daithead
Gus measadh a dhèanamh air roghainnean airson geir daithead, thug deuchainnean bìdh roghainn eadar chow agus HFD (D12450B agus D12451; Diets Rannsachaidh) mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [14]. Tha na pàirtean daithead air an sealltainn ann an Clàr ESM 1. Ann an ùine ghoirid, fhuair na luchagan cothrom an-asgaidh air chow agus HFD. Chaidh tomhas de chow agus HFD a thomhas gach seachdain agus air an sgrùdadh airson atharrachaidhean ann an roghainn geir geir. Chaidh roghainn HFD a thomhas a rèir na foirmle: roghainn HFD = [(in-ghabhail HFD / in-ghabhail bìdh iomlan) × 100].
Seicheamh bisulphite airson methylation DNA
Chaidh DNA a ghlanadh le bhith a ’cleachdadh Kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Tokyo, Iapan). Chaidh am fuasgladh DNA a mheasgachadh le 3 mol / l NaOH, air a bhrosnachadh aig 37 ° C airson 15 min agus air a chuir ri 5.3 mol / l urea, 1.7 mol / l sodium bisulphite agus 4.9 mmol / l hydroquinone. Chaidh am fuasgladh a chuir fo 15 cearcall de dì-ghalarachadh aig 95 ° C airson 30 s agus guir aig 50 ° C airson 15 mion [19]. Chaidh an DNA a chaidh a làimhseachadh le bisulphite a ghlanadh le bhith a ’cleachdadh Kit Purnaidh MinElute PCR (QIAGEN) agus air a mheudachadh le PCR a’ cleachdadh KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) agus primers timcheall air làrach CpG ann an sgìre brosnachaidh D2R . Bha na sreathan primer mar a leanas: air adhart primer, 5’-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; reverse primer, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. An ath rud, chaidh na sreathan adapter a chur ris agus a ghlanadh a ’cleachdadh Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, na SA). Chaidh sampaill an uairsin a thoirt còmhla agus an luchdachadh air GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Iapan) airson an òrdachadh a rèir protocol an neach-dèanamh. Chaidh an ìre methylation a chuir an cèill mar an àireamh sa cheud de cytosines methylated anns a h-uile fuigheall cytosines.
Measadh gnìomhachd DNMT
Chaidh assay gnìomhachd enzymatic DNMT a dhèanamh a ’cleachdadh Kit EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibition Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) agus pasgan EPIgeneous Methyltransferase Assay (Cisbio Japan, Chiba, Iapan) a rèir protocalan an neach-dèanamh.
Gus measadh a dhèanamh air gnìomhachd bacaidh gach todhar air methylation DNA, cruthachadh S-adenosyl-l-homocysteine (SAH) air a thomhas an làthair gach todhar (20 μmol / l airson measaidhean sgrìonaidh), S-adenosyl methionine (SAM; 10 μmol / l) agus substrate DNMT (4 ng / μl) aig 37 ° C airson 90 min. Gus measadh a dhèanamh air cineatachd Michaelis - Menten, chaidh DNMT1 (20 μmol / l) a bhrosnachadh le γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) agus an dùmhlachd comharraichte de poly dI-dC aig 37 ° C airson 90 min. Chaidh DNMT3a (100 μmol / l) agus DNMT3b (100 μmol / l) a bhrosnachadh le γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) agus an dùmhlachd comharraichte de poly dG · dC aig 37 ° C airson 120 min. Chaidh na measaidhean a dhèanamh ceithir-cheàrnach. Chaidh pròtain a chaidh a thoirt a-mach (0.75 mg / ml) a thoirt a-steach le SAM (5 μmol / l), poly dI-dC (5 μg / ml), agus poly dG · dC (5 μg / ml) aig 40 ° C airson 120 min, agus Chaidh cruthachadh SAH a thomhas.
Assay gnìomhachd receptor-γ co-cheangailte ri estrogen
Chaidh a ’ghnìomhachd antagonistic a dh’fhaodadh a bhith aig γ-oryzanol air an gabhadair-γ co-cheangailte ri estrogen (ERRγ) a mheasadh le bhith a’ cleachdadh Siostam Assay Neach-aithris Gamma Receptor Co-cheangailte ri Estrogen Daonna (INDIGO Bioscience, Colaiste na Stàite, PA, na SA) a rèir protocol an neach-dèanamh. Ann an ùine ghoirid, bha ceallan neach-aithris mamalan neo-dhaonna a bha gu gnìomhach a ’cur an cèill ERRγ gnìomhach fosgailte do na dùmhlachdan comharraichte de gach todhar airson 24 h ann an trì-fhillte.
Blotadh an iar
Chaidh seo a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [20] le antibodies an aghaidh D2R (1: 500, coineanach), neach-còmhdhail dopamine (DAT; 1: 500, coineanach), tyrosine hydroxylase (TH; 1: 1000, coineanach) (AB5084P, AB1591P agus AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, Na SA), transducer comharran agus gnìomhaiche tar-sgrìobhadh 3α (STAT3α; 1: 1000, coineanach), DNMT1 (1: 1000, coineanach), DNMT3a (1: 1000, coineanach) (àireamhan 8768, 5032 agus 3598; Teicneòlas Comharradh Cell, Tokyo, Iapan), DNMT3b (1 μg / ml, coineanach), ERRγ (1: 1000, coineanach) agus β-actin (1: 10,000, luchag) (ab16049, ab128930 agus ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).
PCR fìor-ùine cainneachdail
Chaidh sgrùdadh gine a sgrùdadh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [14]. Chaidh ìrean mRNA a dhèanamh àbhaisteach gu Rn18s (18S rRNA). Tha geàrr-chunntas air na seataichean primer a chaidh a chleachdadh airson mion-sgrùdaidhean cainneachdail PCR fìor-ùine ann an Clàr ESM 2.
Mion-sgrùdadh staitistigeil
Tha dàta air a chuir an cèill mar mheadhan ± SEM. Chaidh ANOVA aon-shligheach agus ANOVA ath-cheumannan air a leantainn le ioma-dheuchainnean coimeas (dòigh Bonferroni-Dunn) a chleachdadh far an robh sin iomchaidh. Oileanach t chaidh deuchainn a chleachdadh gus eadar-dhealachaidhean eadar dà bhuidheann a sgrùdadh. Bha eadar-dhealachaidhean cudromach aig p <0.05.
toraidhean
Lughdaich casg cungaidh-leigheis DNMTs le 5-aza-dC an roghainn airson geir daithead ann an luchagan
Ann an luchagan a ’biathadh an HFD, chaidh àrdachadh mòr a dhèanamh air methylation DNA ann an roinn brosnachaidh D2R anns an striatum an coimeas ri luchainn a’ biadhadh daithead chow (Fig. (Fig.1a) .1a). Air an làimh eile, bha coltas ann gu robh methylation DNA hypothalamic ann an roinn brosnachaidh D2R nas àirde na sin anns an striatum fo dhaithead chow (p <0.01) (Fig. (Fig.1a, 1a, f) agus cha deach atharrachadh leis an HFD (Fig. (Fig.1f) .1f). Ann an luchagan a ’biathadh an HFD, chaidh am methylation DNA leasaichte ann an roinn brosnachaidh D2R anns an striatum a dhèanamh àbhaisteach le làimhseachadh le 5-aza-dC, inhibitor DNMT làidir (Fig. (Fig.1a) .1a). An coimeas ri sin, cha deach methylation DNA ann an roinn adhartachaidh D2R anns an hypothalamus atharrachadh gu mòr le làimhseachadh le 5-aza-dC (Fig. (Fig.1f) .1f). Anns an striatum de luchainn fireann 20-seachdain a ’biathadh an HFD airson 12 seachdainean, chaidh ìrean mRNA agus pròtain D2R a lughdachadh gu mòr (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). An coimeas ri sin, ìrean de gabhadairean dopamine D1 (D1Rs, air an còdachadh le Drd1), a bhios ag obair ann an dòigh eadar-dhealaichte ri D2Rs air adenylyl cyclase agus comharran intracellular cAMP-mediated, gun atharrachadh (Fig. (Fig.1c) .1c). A bharrachd air an sin, cha robh atharrachadh sam bith anns na h-ìrean de mholacilean eile co-cheangailte ri soidhneadh D2R, leithid TH agus DAT aig ìre mRNA agus / no pròtain (Fig. (Fig.1d, 1d, e, k, m). Air an làimh eile, cha deach atharrachaidhean follaiseach fhaicinn anns an hypothalamus, a ’toirt a-steach D2R (Fig. (Fig.1g - m) .1g - m). Gu sònraichte, bha ìrean pròtain de D2R agus TH ann an hypothalamus mòran nas ìsle na an fheadhainn anns an striatum (Fig. (Fig.1l, 1l, m), is dòcha a ’nochdadh cho cudromach sa tha soidhneadh gabhadair dopamine ann an siostam duais an eanchainn an coimeas ris an hypothalamus.
Gus sgrùdadh a dhèanamh air an atharraicheadh methylation DNA ann an roinn brosnachaidh D2R an roghainn airson geir daithead, chaidh giùlan beathachaidh luchainn 5-aza-dC a sgrùdadh. Mar a bhiodh dùil, mheudaich 5-aza-dC gu mòr ìrean mRNA agus pròtain airson D2R anns an striatum de luchagan le biadh HFD (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l). Air an làimh eile, cha robh buaidh sam bith air ìrean de Drd1, Th agus Slc6a3 (a ’còdachadh DAT) anns an striatum, no air ìrean de Drd2, Drd1, Th agus Slc6a3 anns an hypothalamus (Fig. (Fig.1c - e, 1c - e, g - m). Ged a b ’fheàrr le luchagan le làimhseachadh carbaid an HFD, chaidh roghainn airson an HFD a lughdachadh gu mòr ann an luchagan le làimhseachadh 5-aza-dC (88% de na luachan airson luchagan le làimhseachadh carbaid) (Fig. (Fig.1n) .1n). Mar thoradh air an sin, lughdaich làimhseachadh le 5-aza-dC an buannachd ann an cuideam bodhaig (Fig. (Fig.11o).
Bidh γ-oryzanol a ’lughdachadh ìrean de DNMTs ann an striatum de luchagan le biadh HFD
Mar a thuirt sinn roimhe [14], thug rianachd beòil γ-oryzanol gu luchagan fireann le gavage lùghdachadh mòr air an roghainn airson HFD (93% de na luachan airson luchagan le làimhseachadh carbaid) (Fig. (Fig.2a), 2a), a ’leantainn gu lùghdachadh follaiseach ann an àrdachadh cuideam bodhaig (Fig. (Fig.2b) .2b). Mar sin rinn sinn sgrùdadh air a ’bhuaidh a dh’ fhaodadh a bhith aig γ-oryzanol air modaladh epigenetic de D2Rs anns an striatum.
Ann am mamalan, tha trì prìomh DNMT ann - DNMT1, 3a agus 3b. Tha DNMT1 ag obair gus methylation DNA a chumail suas, agus tha pàirt aig DNMT3a agus 3b ann a bhith a ’comasachadh methylation DNA de novo [21]. Gus sgrùdadh a dhèanamh air a ’bhuaidh a dh’ fhaodadh a bhith aig γ-oryzanol air DNMTs in vivo, rinn sinn measadh air ìrean de DNMTs ann an eanchainn luchainn le biadh HFD. Ged nach robh buaidh sam bith aig an HFD per se air mRNA agus ìrean pròtain DNMT anns an dàrna cuid an striatum no an hypothalamus, lùghdaich àrdachadh le γ-oryzanol ìrean DNMT gu mòr anns an striatum ach chan ann anns an hypothalamus (Fig. (Fig.2c - e, 2c - e, g - i, k - n). Tha an dàta seo a ’togail a’ chothruim gum faodadh γ-oryzanol ìrean DNMT a riaghladh ann an dòigh a tha sònraichte do striatum. Anns an aon dòigh, lùghdaich 5-aza-dC ìrean mRNA de DNMT3a agus 3b gu fàbharach san striatum (ESM Fig. 1a - d).
Air bunait sgrùdadh roimhe a ’sealltainn gun deach an ìre mRNA de DNMT1 a riaghladh gu deimhinneach, co-dhiù ann am pàirt, leis an gabhadair niùclasach ERRγ [22], rinn sinn sgrùdadh air a ’bhuaidh a dh’ fhaodadh a bhith aig γ-oryzanol air gnìomhachd ERRγ. Ann an ceallan mamalan neo-dhaonna gu gnìomhach a ’cur an cèill ERRγ gnìomhach, 4-hydroxy tamoxifen, agonist neo-dhruim làidir de ERRγ, lùghdaich e gu mòr gnìomhachd ERRγ. Gu dearbh, lùghdaich γ-oryzanol gu ìre gnìomhachd ERRγ (lùghdachadh timcheall air 40% den luach inneach) (Fig. (Fig.3a) .3a). Gu cudromach, chaidh ERRγ a chuir an cèill gu mòr anns an striatum ach chan ann anns an hypothalamus (Fig. (Fig.3b - d) .3b - d). An aghaidh an t-suidheachaidh airson an striatum, mheudaich γ-oryzanol ìrean pròtain de DNMT1 gu mòr anns an hypothalamus a-mhàin (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Dh ’fhaodadh na toraidhean sin a bhith air am mìneachadh, gu ìre co-dhiù, le ar lorg gu bheil STAT3α, riaghladair adhartach aig ìre DNMT1 [23], air a chuir an cèill gu pailt anns an hypothalamus ach chan ann anns an striatum (Fig. (Fig.33e - g).
Gus tuilleadh measadh a dhèanamh air buaidh γ-oryzanol air gnìomhachd DNMTs in vivo, chaidh cruthachadh SAH, byproduct de methylation DNA agus cuideachd inhibitor potent de DNMTs, a mheasadh ann an luchagan le làimhseachadh γ-oryzanol a ’biathadh an HFD. Cha robh atharrachaidhean mòra ann an cruthachadh SAH anns an dàrna cuid an striatum no an hypothalamus eadar luchagan le biadh HFD agus biadhadh chow (Fig. (Fig.2f, 2f, j). Gu follaiseach, lùghdaich γ-oryzanol gu mòr cruthachadh SAH anns an striatum (Fig. (Fig.2f) 2f) ach chan ann anns an hypothalamus (Fig. (Fig.2j), 2j), a ’moladh gum faodadh γ-oryzanol gnìomhachd DNMT a chumail fodha ann an dòigh sònraichte le striatum ann an luchagan le biadh HFD.
Mion-sgrùdaidhean enzymatic air togalaichean bacaidh γ-oryzanol airson DNMTs in vitro
An uairsin rinn sinn measadh air buaidh γ-oryzanol air gnìomhachd DNMTs in vitro. Chaidh na comasan bacaidh γ-oryzanol, searbhag ferulic, 5-aza-dC, haloperidol (antagonist D2R riochdaire), quinpirole (agonist riochdaire D2R) agus SAH an aghaidh DNMTs a mheasadh. Mar smachd adhartach, mheudaich SAH gu làidir gnìomhan DNMT ann an dòigh a bha an urra ri dòsan (Fig. (Fig.4a - f) .4a - f). Mar a bhiodh dùil, cha do sheall haloperidol agus quinpirole buaidh sam bith air gnìomhachd DNMTs (ESM Fig. 2). Gu follaiseach, chuir γ-oryzanol bacadh mòr air gnìomhachd DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) agus 3b (an casg as àirde 57%) (Fig. (Fig.4d - f) .4d - f). An coimeas ri sin, bha gnìomhachd bacaidh searbhag ferulic, metabolite de γ-oryzanol, mòran nas ìsle na gnìomhachd γ-oryzanol (Fig. (Fig.44d - f).
Rinn sinn tuilleadh sgrùdaidh air na togalaichean bacaidh aig γ-oryzanol air DNMTs. Chaidh cruthachadh SAH a thomhas gus measadh a dhèanamh air gnìomhachd bacaidh γ-oryzanol air DNMTs in vitro. Tha dàta mu chruthachadh SAH rè methylation DNA DNMT-meadhanaichte a ’nochdadh pàtran dòigheil de chinetics Michaelis-Menten airson an dà chuid làthaireachd agus neo-làthaireachd γ-oryzanol (Fig. (Fig.4g - i) .4g - i). Ann am methylation DNA DNMT1-meadhanaichte, sheall sgrùdadh Eadie - Hofstee nach do sheall γ-oryzanol buaidh sam bith air an V max de chruthachadh SAH (carbad, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), agus a rèir coltais mheudaich γ-oryzanol an K m (carbad, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Tha na toraidhean sin a ’moladh gu bheil γ-oryzanol a’ cur bacadh air DNMT1 co-dhiù ann am pàirt ann an dòigh farpaiseach. Air an làimh eile, airson methylation DNA DNMT3a- agus 3b-mediated, lùghdaich γ-oryzanol an V max de chruthachadh SAH (DNMT3a: carbad, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: carbad, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) agus, mar an ceudna, an K m airson an ath-bhualadh seo (DNMT3a: carbad, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: carbad, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig.4k, 4k, l). Tha na toraidhean sin a ’moladh gu bheil γ-oryzanol a’ cur bacadh air DNMT3a agus 3b co-dhiù ann am pàirt ann an dòigh neo-fharpaiseach.
Bidh γ-oryzanol a ’meudachadh ìrean de D2R ann an striatum de luchagan le biadh HFD
An uairsin rinn sinn deuchainn air a ’chomas gum biodh γ-oryzanol ag àrdachadh susbaint D2R striatal tro chasg air DNMTs. Ann an luchagan le biadh HFD, lùghdaich rianachd beòil γ-oryzanol gu mòr methylation DNA striatal ann an roinn brosnachaidh nan D2Rs (Fig. (Fig.5a), 5a), ach cha do rinn e seo anns an hypothalamus (Fig. (Fig.5f) .5f). Ann an co-rèir ris na co-dhùnaidhean sin, chaidh ìrean mRNA agus pròtain de D2R a mheudachadh gu dà-thaobhach (Fig. (Fig.5b, 5b, g, k, l). Coltach ris an dàta air làimhseachadh le 5-aza-dC (Fig. (Fig.1), 1), cha robh buaidh sam bith ri fhaicinn air an RNA agus ìrean pròtain de Drd1, Th agus Slc6a3 (DAT) san striatum, agus gun bhuaidh sam bith air ìrean de Drd1, Th agus Slc6a3 anns an hypothalamus (Fig. (Fig.5c - e, 5c - e, h - k, m).
Tha sgrùdaidhean roimhe air sealltainn gu bheil ìrean D2R agus DNMT1 air an riaghladh le cuideam ER agus sèid co-dhiù gu ìre tro NF-κB [17, 24, 25]. Mar sin rinn sinn sgrùdadh air na h-ìrean de ghinean co-cheangailte ri cuideam ER agus sèid. Mar a chaidh a dhearbhadh roimhe [26], mheudaich an HFD barrachd faireachdainn de na ginean a bha a ’còdachadh TNF-α (Tnfa), pròtain chemoattractant monocyte - 1 (MCP-1) (Ccl2), Pròtain homologous C / EBP (Chop), ER-ionadail DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) agus an cruth spliced de phròtain ceangail X-box 1 (Xbp1s) anns an hypothalamus ach chan ann anns an striatum (Fig. (Fig.6) .6). Gu sònraichte, lùghdaich cur-ris an HFD le γ-oryzanol gu mòr an abairt leasaichte de Ccl2, Chop, Dnajb9 agus Xbp1s a-mhàin anns an hypothalamus ach chan ann anns an striatum (Fig. (Fig.66).
Deasbaireachd
Is e am prìomh cho-dhùnadh san sgrùdadh seo gu bheil γ-oryzanol ag obair mar neach-dìon DNMT làidir ann an striatum luchainn, mar sin a ’lughdachadh, gu ìre co-dhiù, an roghainn airson HFD tro atharrachadh epigenetic de striatal D2R. Ann an striatum bho luchagan le biadh HFD, chaidh ìrean D2R a lughdachadh gu mòr, ach cha deach ìrean D1R, TH agus DAT atharrachadh (Fig. (Fig.1b - e, 1b - e, k - m). Tha an dàta seo co-chòrdail ris a ’bheachd gu bheil pàirt deatamach aig dysregulation de D2R striatal ann a bhith a’ faicinn duais bìdh nuair a tha e air HFD, a ’leantainn gu cus caitheamh hedonic de HFD ann am beathaichean reamhar [3]. Anns an sgrùdadh làithreach, mheudaich làimhseachadh luchagan le biadh HFD le 5-aza-dC ìrean de D2R striatal (Fig. (Fig.1b, 1b, k, l) is dòcha tro lùghdachadh ann an ìre methylation DNA ann an roinn brosnachaidh D2R (Fig. (Fig.1a), 1a), agus mar thoradh air sin lughdaich e an roghainn airson geir daithead (Fig. (Fig.1n) .1n). Tha an lorg seo cuideachd a ’toirt taic do dhreuchd deatamach D2Rs striatal ann a bhith a’ faicinn duais bìdh nuair a tha iad air HFD.
Sheall ar assay in vitro gu robh coltas ann gu robh gnìomhachd bacaidh γ-oryzanol an aghaidh DNMTs nas làidire na an t-searbhag ferulic metabolite aige (Fig. (Fig.4d - f), 4d - f), a ’moladh cho cudromach sa tha structar iomlan γ-oryzanol airson a ghnìomhachd bacaidh air DNMTs. Ann an luchagan le biadh HFD, tha na sgrùdaidhean againn a ’moladh, às deidh rianachd beòil, gu bheil γ-oryzanol a’ ruighinn an eanchainn mar structar iomlan agus a ’lughdachadh ìrean agus gnìomhan DNMT gu fàbharach san striatum, le lùghdachadh mar thoradh air sin ann am methylation DNA ann an sgìre an neach-adhartachaidh de D2R anns an striatum. A bharrachd air an sin, tha na sgrùdaidhean in vitro againn air dearbhadh gu bheil γ-oryzanol ag obair mar phàirt de antagonist an aghaidh ERRγ, a tha sa mhòr-chuid a ’frithealadh mar riaghladair adhartach airson riochdachadh DNMT1 [22], agus mar thoradh air sin lughdaich gnìomhachd DNMT1 (Fig. (Fig.3a) .3a). Gu dearbh, chaidh ERRγ a chuir an cèill gu mòr anns an striatum ach chan ann anns an hypothalamus ann an luchagan (Fig. (Fig.3b) .3b). Tha an dàta seo a ’moladh gu bheil comas aig γ-oryzanol ìre mRNA DNMT1 a lughdachadh, co-dhiù ann am pàirt, tro bhith a’ toirmeasg ERRγ. An coimeas ri striatum, cha do sheall γ-oryzanol buaidh sam bith air ìre D2R ann an hypothalamus bho luchagan le biadh HFD (Fig. (Fig.5g, 5g, k, l).
Air an làimh eile, sheall sinn gun do mheudaich γ-oryzanol ìrean DNMT1 gu mòr anns an hypothalamus ach chan ann anns an striatum (Fig. (Fig.2k, 2k, l). Chaidh a dhearbhadh gu bheil STAT3 a ’meudachadh susbaint DNMT1 ann an ceallan T-lymphoma malignant [23]. Gu sònraichte, sheall sinn roimhe gun do mheudaich γ-oryzanol gu mòr fosphorylation STAT3 air a bhrosnachadh le leptin ann an hypothalamus bho luchagan le biadh HFD [14]. Bu chòir a thoirt fa-near cuideachd gun deach STAT3α a chuir an cèill gu mòr anns an hypothalamus ach chan ann anns an striatum anns na luchagan (Fig. (Fig.3e - g) .3e - g). Tha an dàta seo gar tàladh gu bhith a ’dèanamh a-mach gum faodadh an eadar-dhealachadh follaiseach ann am buaidh γ-oryzanol air ìrean DNMT1 eadar an hypothalamus agus an striatum a thoirt, co-dhiù ann am pàirt, air susbaint sgìreil STAT3α agus ERRγ ann an eanchainn luchainn ( Fig. (Fig.3b - g) .3b - g). Còmhla, tha e coltach gu bheil pàtran cainnte de ERRγ agus STAT3α eadar an striatum agus an hypothalamus ann an luchagan. Air bunait nan toraidhean againn, mar sin tha e reusanta tuairmeas a dhèanamh ann an striatum, far a bheil cinneasachadh ERRγ pailt, gum faodadh γ-oryzanol ìre mRNA agus gnìomhachd enzyme DNMT1 a lughdachadh mar riaghladair àicheil de ERRγ. An coimeas ri sin, anns an hypothalamus, far a bheil smachd air riochdachadh STAT3α, is dòcha gum b ’fheàrr le γ-oryzanol ìrean DNMT1 a mheudachadh.
Sheall sgrùdadh o chionn ghoirid gu bheil lughdachadh comharrachaidh D2R striatal air a bhrosnachadh le HFD a ’dysregulates giùlan biadhaidh [3], a ’moladh cho cudromach sa dh’ fhaodadh casg DNMTan striatal a bhith ann airson làimhseachadh reamhrachd. Air an làimh eile, sheall sgrùdadh roimhe comas gum faodadh inbhe methylation DNA den ghine receptor melanocortin 4 a chaidh a chuir an cèill ann an niuclasan hypothalamic sònraichte cruth-atharrachadh a dhèanamh air reamhrachd ann an luchagan buidhe agouti [27]. Ged a tha feum air tuilleadh sgrùdaidhean gus soilleireachadh a dhèanamh air na h-innleachdan bunaiteach, tha na sgrùdaidhean sin a ’moladh cho cudromach sa tha methylation DNA a tha sònraichte ann an clò, gine agus òrdugh ann am pathophysiology reamhrachd air a bhrosnachadh le HFD.
Dh ’innis sinn o chionn ghoirid gun do mheudaich HFD an ìre de D2R anns na h-eileanan pancreatic de luchainn [17, 24]. Tha coltas ann gu bheil àrdachadh mar sin air a mheadhanachadh, co-dhiù gu ìre, le cuideam ER agus sèid tro NF-κB, seach gu bheil grunn eileamaidean freagairteach NF-κB ann an sgìre brosnachaidh D2R [17, 24]. A bharrachd air an sin, tha sgrùdadh o chionn ghoirid air sealltainn gu bheil TNF-α agus IL-1β a ’meudachadh ìre agus gnìomhachd DNMT1 ann an clò adipose bho luchainn a tha air am biathadh le HFD [25]. Gu cudromach, sheall an sgrùdadh a tha ann an-dràsta gu robh HFD a ’brosnachadh cuideam ER agus sèid gu fàbharach anns an hypothalamus ach chan ann anns an striatum (Fig. (Fig.6) .6). Feumaidh uidheamachdan domhainn de mheatailt, sgìre-, agus methylation DNA sònraichte agus làrach sònraichte anns a ’pharagraf deuchainneach againn feitheamh ri sgrùdadh a bharrachd.
Còmhla ris an aithisg roimhe againn a ’sealltainn gu bheil γ-oryzanol a’ lagachadh roghainn HFD tro riaghladh hypothalamic air cuideam ER ann an luchagan [14], γ-oryzanol cuideachd a ’riochdachadh seilbh sònraichte de bhith a’ lughdachadh an dà chuid dysregulation hedonic agus metabolic de ghiùlan beathachaidh. Leis gu bheil fios gu bheil cuid de dhrogaichean antiobesity a chaidh a leasachadh ag adhbhrachadh droch bhuaidh èiginneach [8], thathas an dùil gum bi dòigh-obrach nàdarra stèidhichte air biadh a dh ’ionnsaigh siostam duais eanchainn a’ làimhseachadh syndrome reamhrachd-tinneas an t-siùcair gu sàbhailte [16]. Anns a ’phàtran seo, tha γ-oryzanol na thagraiche antiobesity gealltanach le seilbh sònraichte de bhith na mhoduladair epigenetic.
Buidheachas
Tha sinn taingeil do S. Okamoto (Oilthigh Ryukyus, Iapan) airson ath-sgrùdadh a dhèanamh air an làmh-sgrìobhainn. Tha sinn a ’toirt taing do M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato agus C. Noguchi (Oilthigh an Ryukyus, Iapan) airson taic rùnaireachd.
giorrachaidhean
| 5-aza-dC | 5-aza-2′-deoxycytidine |
| D1R | Gabhadair Dopamine D1 |
| D2R | Gabhadair Dopamine D2 |
| Dat | Neach-còmhdhail dopamine |
| DNMT | DNA methyltransferase |
| ER | Endoplasmic reticulum |
| ERR | Gabhadair co-cheangailte ri estrogen |
| HFD | Daithead àrd-geir |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocysteine |
| SAM | S-Adenosyl methionine |
| STAT3α | Transducer comharran agus gnìomhaiche tar-sgrìobhadh 3α |
| TH | Tyrosine hydroxylase |
Notaichean
Cothrom air dàta
Gheibhear dàta a chaidh a chruthachadh agus / no a mhion-sgrùdadh tron sgrùdadh làithreach bhon ùghdar iomchaidh air iarrtasan reusanta.
maoineachadh
Fhuair an obair seo taic ann am pàirt le Tabhartasan Cuideachaidh bho Chomann Iapan airson adhartachadh saidheans (JSPS; Àireamhan Tabhartais KAKENHI 15K19520 agus 24591338), a ’Chomhairle airson Saidheans, Teicneòlas agus Ùr-ghnàthachadh (CSTI), Prògram Brosnachaidh Ùr-ghnàthachadh Ro-innleachdail Tar-mhinistreil. (SIP) ‘Teicneòlasan airson àiteachas, coilltearachd agus iasgach an ath ghinealach a chruthachadh’, Stèidheachd Lotte, Stèidheachd Iapan airson Enzymology Gnìomhaichte, Buidheann Leasachaidh Cumhachd Ùr agus Teicneòlas Gnìomhachais (NEDO), am Pròiseact airson Cruthachadh Lìonra Saidheans Beatha (Raon Cungaidh-leigheis ) (Okinawa Prefecture, Iapan) agus Pròiseact Brosnachaidh Cnuasachadh Meidigeach Okinawa Prefecture, Iapan, còmhla ri tabhartas bho Okinawa Prefecture airson leigheas adhartach adhartachadh (Okinawa Prefecture, Iapan).
Duality ùidh
Tha na h-ùghdaran ag aithris nach eil dùbailteachd ùidh co-cheangailte ris an làmh-sgrìobhainn seo.
Aithris tabhartais
Dhealbhaich CK agus HM an rannsachadh. Rinn CK agus TK na deuchainnean agus rinn iad mion-sgrùdadh air an dàta. Chuir TK, CS-O, CT, MT, MM agus KA ri mìneachadh dàta. Sgrìobh CK agus HM an làmh-sgrìobhainn. Chuir na h-ùghdaran gu lèir ri mìneachadh dàta. Thàinig na h-ùghdaran uile còmhla ann a bhith ag ath-sgrùdadh an làmh-sgrìobhainn agus ghabh iad ris an dreach deireannach. Is e HM neach-urrais na h-obrach seo, bha làn chothrom aige air an dàta gu lèir agus tha e a ’gabhail làn dhleastanas airson ionracas dàta agus mionaideachd mion-sgrùdadh dàta.
Footnotes
Stuth leasachail dealanach
Anns an dreach air-loidhne den artaigil seo (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) tha stuth leasachail ath-sgrùdaichte le co-aoisean ach a tha ri fhaighinn do luchd-cleachdaidh ùghdarraichte.
iomraidhean
;