Tha Hypocretin (orexin) a ’cuideachadh le duais le bhith a’ toirt droch bhuaidh air a ’bhuaidh antireward a tha aig an sgìre eas-fhuaimneach cotransmitter (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c Seòras Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Pòl J. Kenny,^b agus Uilleam A. Carlezon, Jr.^a

Fiosrachadh ùghdarraichte ► Fiosrachadh mu chòraichean agus ceadachd ►

Tha hypocretin (orexin) agus dynorphin nan neuromodulators aig a bheil pàirt cudromach ann a bhith a ’riaghladh buaidh agus togradh. Tha Orexin deatamach airson duais agus tha e an sàs ann a bhith a ’sireadh dhrogaichean, ach tha dynorphin a’ meadhanachadh faireachdainn àicheil agus tha e an sàs ann an stàitean coltach ri trom-inntinn. A ’beachdachadh air na buaidhean dùbhlanach seo, tha aithisgean gu bheil an dà pheptides air an cur an cèill anns na h-aon neurons agus gu bheil iad bunaiteach le chèile. An seo, tha sinn a ’sealltainn gu bheil orexin agus dynorphin air an co-chothromachadh taobh a-staigh na h-aon cheallan synaptic agus gu bheil buaidh mhòr aig an colocalization seo air duais, gabhail dhrogaichean, agus giùlan coltach ri ìmpidh. Tha an fhìrinn gu bheil orexin a ’toirt a-steach buaidhean antireward coltach ri trom-inntinn dynorphin ag atharrachadh gu mòr mar a tha sinn a’ coimhead air àite gnìomh orexin san eanchainn.

Tha hypocretin (orexin) agus dynorphin nan neuropeptides le gnìomhan an aghaidh giùlan brosnachail. Tha Orexin an sàs ann an stàitean tòcail agus duais, ach tha dynorphin an sàs ann an stàitean coltach ri trom-inntinn. Tha sinn a ’sealltainn, a dh’ aindeoin na gnìomhan dùbhlanach aca, gu bheil na peptidean sin air am pacadh anns na h-aon vesicles synaptic taobh a-staigh an hypothalamus. Bidh briseadh gnìomh orexin a ’sguabadh na buaidhean buannachdail a th’ aig brosnachadh hypothalamic lateral (LH), a ’cur às do chasg air cocaine, agus a’ lughdachadh fèin-rianachd cocaine. Tha aimhreit co-leanailteach de dhreuchd dynorphin a ’cur cùl ris na h-atharrachaidhean giùlain sin. Bidh sinn cuideachd a ’sealltainn gu bheil gnìomhan an aghaidh orexin agus dynorphin a thaobh excitability de neurons dopamine sgìre teascal ventral (VTA), targaid fhollaiseach de neurons anns a bheil orexin, agus gu bheil antagonism orexin taobh a-staigh VTA ag adhbhrachadh lughdachadh ann am fèin-rianachd cocaine agus fèin-bhrosnachadh LH. a tha air an tilleadh le antagonism dynorphin. Tha na co-dhùnaidhean againn a ’comharrachadh pròiseas ceallaichte sònraichte leis am faod orexin buaidh àrdachadh stairsnich duais dynorphin bunaiteach a lorg agus mar sin obrachadh ann an dòigh ceadaichte gus duais a chomasachadh.

Tha Orexin agus Dynorphin nan cotransmitters.

Dhearbh sinn co-chothromachadh orexin agus dynorphin taobh a-staigh na h-aon neurons de hypothalamus lateral, perifornical, agus dorsomedial le bhith a ’cleachdadh microscopy fluorescence (18) (Fig. 1A). Chaidh a bhith ann gu bheil neurons a tha a ’cur an cèill ioma-chraoladairean air a mhìneachadh ann an cuairtean eanchainn eile agus dh’ fhaodadh iad a bhith a ’riochdachadh a’ bhunait neòil airson dòighean sìolaidh leis am bi leigeil ma sgaoil neurotransmitters co-cheangailte aig ìrean losgaidh eadar-dhealaichte (19). A ’cleachdadh EM, fhuair sinn a-mach, ge-tà, gu bheil orexin agus dynorphin air an cruinneachadh taobh a-staigh na h-aon cheallan synaptic. Chaidh a ’mhòr-chuid de dh’ eisimpleirean de chopackaging a choimhead ann am pròiseasan axonal varicose neo-shoilleir, far an deach immunolabeling a lorg ann an no faisg air vesicles. Taobh a-staigh cuirp cealla neuronal, bha bileagan cudromach co-cheangailte ri ionad Golgi, ach cha deach gin a lorg ann an niuclasan faisg air làimh (Fig. 1 B agus C). Ann an dendrites bha bileagan co-cheangailte ri vesicle airson an dà pheptides, a ’moladh gun deidheadh ​​sgaoileadh dendritic de na luchd-sgaoilidh sin a leigeil ma sgaoil. Ghlac àireamh bheag de phròifilean microstructural crìochnachaidhean axon le bileagan airson an dà pheptidean suidhichte ann an cnàmhan mòra (∼100 nm) suidhichte taobh a-muigh sòn fuasglaidh synapses neo-riaghailteach (Fig. 1 B agus C), a ’toirt taic don cho-dhùnadh gu bheil orexin agus dynorphin ag obair mar cotransmitters agus, fo chumhachan àbhaisteach, gu bheil iad air an leigeil ma sgaoil còmhla seach gu eadar-dhealaichte mar ghnìomh de tricead losgadh cealla.

 

Fig. 1.

Tha Orexin agus dynorphin nan cotransmitters ann an neurons den hypothalamus. (A, Far chlì) Tha photomicrograph achadh soilleir a ’sealltainn na sgìre de hypothalamus a chaidh a sgrùdadh airson immunoreactivity orexin (dearg) agus dynorphin (uaine). (A, Far an làimh dheis) Ìomhaigh dà-sianal aonaichte ...

Tha buaidhean Threshold-Elevating de Orexin Blockade air an tilleadh le Dynorphin Blockade.

Gus sgrùdadh a dhèanamh air brìgh gnìomh a ’phàtrain shònraichte seo de dhòigh-sgaoilidh, rinn sinn sgrùdadh an urrainn do bhuaireadh ann an soidhne orexin agus dynorphin buaidh a thoirt air giùlan iom-fhillte a tha a’ nochdadh brosnachadh àbhaisteach agus neo-sheasmhach. Ann an luchagan C57BL / 6 air an trèanadh gus fèin-bhrosnachadh intracranial (ICSS) a dhèanamh air a dhaingneachadh le brosnachadh hypothalamic lateral (LH) (20), bacadh OX₁Rs le N- (2-methyl-6-benzoxazolyl) -N ″ -1,5-naphthyridin-4-yl urea (SB334867) rè na h-ìre solais ag adhbhrachadh àrdachadh ann an dòsan a bha an urra ri dòsan duais (Fig. 2A; tha aon-shlighe a-rithist a ’tomhas ANOVA airson dòs: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Tha àrdachadh ann an stairsnich ICSS a ’nochdadh lughdachaidhean air an adhbhrachadh le làimhseachadh ann am buaidh buannachdail a’ bhrosnachaidh, comharra coltach ri trom-inntinn a tha a ’nochdadh cugallachd lùghdaichte ri duais (20). Cha robh a ’bhuaidh seo mar thoradh air sedation no eas-òrdughan giùlain neo-shònraichte eile, leis nach robh buaidh air ìrean freagairt ICSS (Fig. 2B; tha aon-shlighe a-rithist a ’tomhas ANOVA airson dòs: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Fig. 2.

Tha buaidhean àrdachadh stairsneach duais de orexin air an tionndadh air ais le bacadh dynorphin. (A) Bacadh de chomharradh orexin aig OX₁Tha R le SB334867 (0 - 30 mg / kg, ip) ag àrdachadh stairsnich duais anns an deuchainn ICSS, a ’nochdadh duais nas ìsle. A ’bhuaidh seo ...

Chaidh casg a chur air àrdachaidhean ann an stairsnich duais air adhbhrachadh le SB334867 le bhith a ’ro-aithris le nor-binaltorphimine (norBNI) [ceumannan dà-shligheach ANOVA airson drogaichean (eadar factar cuspairean) × dòs SB (taobh a-staigh factar cuspairean): F_3,24 = 3.98, P <0.01], a tha a ’toirt a-mach bacadh fad-ùine de ghnìomhan dynorphin aig KORs (10). Tha an dàta seo a ’moladh gu bheil call chomharran orexin a’ nochdadh buaidhean antireward falaichte de dynorphin bunaiteach. Cha do lùghdaich rianachd norBNI leis fhèin stairsnich dhuaisean. Ged a dh ’fhaodadh a’ bhuaidh seo a bhith co-cheangailte ri pharmacodynamics sònraichte norBNI agus antagonists KOR prototypical eile (10), is dòcha gu bheil e cuideachd a ’nochdadh gu bheil call ann am pròiseasan a bhios ag atharrachadh gnìomhachd chuairtean duais eanchainn no nach eil àrdachadh mean air mhean ann an tòna orexin leis fhèin (neo-sheasmhach le dynorphin coreleased) gu leòr gus comharra duais a thoirt seachad bhon làrach brosnachaidh san hypothalamus lateral. An toiseach is dòcha gu bheil na co-dhùnaidhean sin neo-chunbhalach le obair chàich a rinn sgrùdadh air SB334867 air stairsneach ICSS aig an ìre dhorcha (21). Ach, tha fianais làidir ann gum faod lughdachadh ann an obair orexin buaidh a thoirt air a bheil beathaichean fo dheuchainn aig an ìre aotrom no dorcha aca. Mar eisimpleir, bidh biadh is uisge a ’gleidheadh ​​na buaidhean buannachdail aca ann an luchagan orexin KO nuair a thèid deuchainn a dhèanamh tron ​​ìre dhorcha ach chan ann aig ìre an t-solais (22), an ùine aig an do rinn sinn a h-uile deuchainn giùlan againn.

Gus buaidh rianachd siostamach SB334867 agus norBNI a dhèanamh ionadail air ICSS, chaidh buidheann de luchagan fa leth a chuir a-steach le electrodan brosnachail LH agus cannulae stiùiridh VTA. Dh'adhbhraich microinfusion de SB334867 a-steach do VTA àrdachadh mòr ann an stairsnich duais, a 'nochdadh cugallachd duais nas ìsle. Ged nach robh buaidh sam bith aig nor-intra VTA norBNI a-mhàin air stairsnich ICSS, chuir e bacadh air buaidhean àrdachadh stairsnich de fhilleadh SB334867 às deidh sin (Fig. 2C; tha aon-shlighe a-rithist a ’tomhas ANOVA airson Drogaichean: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Ged a bha dòsan de dhrogaichean intracranial buailteach a bhith a ’toirt a-mach lùghdachaidhean beaga anns na h-ìrean as àirde de fhreagairt an coimeas ri in-stealladh dhrogaichean siostamach, cha do ràinig na buaidhean sin brìgh staitistigeil (Fig. 2D; tha aon-shlighe a-rithist a ’tomhas ANOVA airson Drogaichean: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Impulsivity air a riaghladh le Orexin agus Dynorphin Transmission.

Tha impulsivity air a chomharrachadh le easbhaidhean ann a bhith a ’cur às do ghiùlan a tha a’ sireadh duais, le ìrean àrda de chasg mar fheart cumanta ann an iomadh tinneas inntinn-inntinn (23). Faodaidh drogaichean droch dhìol, a ’toirt a-steach cocaine, àrdachadh ann an neo-ghluasadachd a bhrosnachadh, a tha air a bheachdachadh gus leasachadh tràilleachd a stiùireadh (24). A ’beachdachadh air a’ phrìomh dhreuchd airson orexin bunaiteach agus dynorphin ann a bhith a ’cumail smachd air cugallachd ri buaidh buannachdail brosnachadh LH anns an deuchainn ICSS, rinn sinn beachd gum faodadh eadar-obrachaidhean eadar an dà neuropeptides seo buaidh a thoirt air neo-ghnìomhachd bun-loidhne agus easbhaidhean a tha air an adhbhrachadh le cocaine san giùlan seo. Faodar impulsivity a thomhas ann an creimich le bhith a ’tomhas freagairtean ro-luath ann an gnìomh ùine freagairt sreathach roghainn 5 (5-CSRTT) (25), modail beathach a tha coltach ris an deuchainn coileanaidh leantainneach a chaidh a chleachdadh gus aire dhaoine a sgrùdadh. Tha freagairt ro-luath san deuchainn seo buailteach a bhith ìosal fo chumhachan àbhaisteach agus tha e nas miosa le drogaichean a dh ’àrdaicheas tar-chuir DA (26). Chleachd sinn an 5-CSRTT gus sgrùdadh a dhèanamh air na tha an siostam orexin-dynorphin a ’cur ri giùlan mì-mhisneachail agus air adhbhrachadh le cocaine. Nuair a chaidh a rianachd leis fhèin, lùghdaich SB334867 tuilleadh an àireamh ìosal de fhreagairtean ro-luath (mar-thà) (Fig. 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Thachair na lughdachaidhean sin às aonais buaidh air cruinneas freagairt (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), latency trusadh pellet (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), no an àireamh de dheuchainnean brosnachaidh a chaidh a chrìochnachadh (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), a ’nochdadh nach robh iad mar thoradh air faireachas lùghdaichte no comasan motair. Ach chuir rianachd norBNI air ais buaidh SB334867 air freagairt ro-luath (Fig. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), a ’moladh gu bheil tar-chuir dynorphin neo-sheasmhach deatamach ann a bhith a’ meadhanachadh na buaidhean antiimpulsive seo. Air a thoirt seachad leotha fhèin no an co-bhonn le SB334867, cha tug norBNI buaidh sam bith air ceumannan cruinneas freagairt (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latency (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), no an àireamh de dheuchainnean brosnachaidh a chaidh a chrìochnachadh (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Chuir casg le SB334867 cuideachd casg air an àrdachadh dà-fhillte ann am freagairt ro-luath air adhbhrachadh le cocaine (Fig. 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Tha an dàta seo a ’toirt seachad fianais gum faod orexin neurotransmission giùlan mì-mhodhail a riaghladh fo chumhachan bun-loidhne agus air a bhrosnachadh le cocaine ann an dòigh a tha mothachail air dynorphin.

 

Fig. 3.

Giùlan impulsivity air a riaghladh le cothromachadh orexin agus dynorphin. (A) Tha SB334867 a ’daingneachadh freagairtean ro-luath ann am modail radan 5-CSRTT de neo-ghluasadachd motair. Chaidh tomhasan de mhearachd, latency gus am pellet bìdh fhaighinn air ais, agus an àireamh de dheuchainnean a chaidh fhàgail às ...

Bidh Dynorphin Mediates a ’lughdachadh fèin-rianachd cocaine ann an OX₁Luchagan R-Null.

Tha so-leòntachd a thaobh tràilleachd air a mheudachadh gu mòr ann an daoine fa leth èiginneach, agus thathas a ’gabhail a-steach àrdachadh ann an impulsivity le cocaine gus cur ri nochdadh tràilleachd (23, 27). A bharrachd air an sin, tha sgaoileadh orexin agus sgaoileadh dynorphin air a bhith an sàs gu neo-eisimeileach ann a bhith a ’riaghladh na buaidhean buannachdail a tha aig cocaine agus drogaichean eile de dhroch dhìol (28-32). Bha sinn nar beachd gum faodadh eadar-obrachadh eadar orexin agus sgaoileadh dynorphin smachd a chumail air gabhail dhrogaichean. Gus sgrùdadh a dhèanamh air a ’chomas seo, rinn sinn sgrùdadh air fèin-rianachd iv cocaine ann an luchagan ginteil le dìth OX₁Rs (OX₁R^{- / -}). Tha luchagan den genotype seo a ’nochdadh fèin-rianachd cocaine gu math nas ìsle thar raon farsaing de dòsan (0.1 - 1 mg / kg gach infusion) ach a’ nochdadh freagairt gun atharrachadh airson duaisean bìdh fo na h-aon chlàran ath-neartachaidh (33), a ’moladh nach eil lughdachadh ann an gabhail cocaine àrd-sgoile ri easbhaidhean ann an coileanadh giùlain. A bharrachd air an sin, OX₁R^{- / -} bidh luchagan a ’nochdadh ìrean àbhaisteach de fèin-rianachd cocaine rè timcheall air trì seiseanan tùsail de ruigsinneachd cocaine ach an uairsin bidh iad a’ nochdadh lughdachadh gu luath ann an gabhail cocaine (33). Dhearbh sinn am phenotype seo aig dòs de 0.3 mg / kg gach infusion, a ’nochdadh gu bheil soidhneadh tro OX₁Tha pàirt deatamach aig Rs ann a bhith a ’stèidheachadh agus a’ cumail suas giùlan fèin-rianachd cocaine [Fig. 4; ceumannan ath-aithris dà-shligheach ANOVA, Genotype (eadar factar cuspairean) × Làimhseachadh Dhrugaichean (taobh a-staigh factar cuspairean): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Dìreach mar a chuir pretreatment le norBNI air ais ICSS àbhaisteach agus giùlan coltach ri impulsive ann an luchagan a chaidh a thoirt seachad SB334867, chuir e cuideachd air ais gu ìre fèin-rianachd cocaine ann an OX₁R^{- / -} luchainn, a ’toirt seachad eisimpleir sònraichte anns a bheil easbhaidh giùlain a chaidh a thoirt a-mach le abachadh ginteil ann an gnìomh aon shiostam neurotransmitter air a shàbhaladh le bacadh eile. Tha na co-dhùnaidhean sin a ’moladh, ann an OX₁R^{- / -} luchainn, bidh gnìomhan neo-sheasmhach dynorphin a ’lagachadh feartan buannachdail cocaine, agus mar sin a’ lughdachadh fèin-rianachd an druga. Gu inntinneach, ann an OX₁R^{+ / +} lughdaich (smachd) luchainn, norBNI gun dùil ri fèin-rianachd cocaine. Is e aon mhìneachadh a dh ’fhaodadh a bhith ann airson a’ bhuaidh seo gu bheil dynorphin a chaidh a leigeil ma sgaoil le neurons nonorexin, leithid na neurons spìosrach meadhanach dìreach “dìreach”, a ’toirt a’ bhuaidh eile air in-ghabhail cocaine agus is dòcha gun cuidich e na buaidhean buannachdail a tha aig cocaine. Bhiodh dà bhuidheann de KOR ann le dreuchdan eadar-dhealaichte ann an duais cocaine cuideachd a ’mìneachadh carson nach do chuir norBNI ach pàirt air ais na h-easbhaidhean ann an giùlan gabhail cocaine a chaidh a lorg san OX₁L lucha R KO. Air an làimh eile, tha antagonism KOR a ’lughdachadh na buaidhean casgach no cuideam a th’ ann an toirt air falbh cocaine (34), a tha a ’cur ri pàtrain in-ghabhail dhrogaichean (17). A dh ’aindeoin sin, tha an dàta seo a’ moladh gu bheil na buaidhean dubhach coltach ri dynorphin ann an dìth comharran orexin neo-iomlan, a ’toirt a-mach lughdachadh ann am buaidhean buannachdail cocaine, ach tha buaidhean orexin a’ comasachadh buaidhean buannachdail cocaine, a ’leudachadh an ùine às aonais soidhneadh dynorphin.

 

Fig. 4.

Lùghdaich fèin-rianachd cocaine ann an OX₁Tha luchagan R KO air an toirt air ais le bacadh KOR. Milleadh air soidhne orexin aig OX₁R le bhith a ’cuir às do ghinteachd an gabhadair seo a’ lughdachadh iv fèin-rianachd cocaine (0.3 mg / kg gach infusion). Tha an easbhaidh seo gu ìre ...

Faodaidh Orexin agus Dynorphin buaidh chothromach a chuir an gnìomh air Excitability de Neurons VTA DA.

Tha structaran eanchainn a tha a ’faighinn a-steach bho orexin hypothalamic orexin agus dynorphin neurons fosgailte don dà pheptides, agus mar sin fo ùmhlachd na buaidhean dùbhlanach aca air excitability neuronal (35, 36). Tha an ìre gu bheil buaidh aon peptide a ’faighinn thairis air an fheadhainn eile a tha buailteach a bhith an urra ri grunn fhactaran, a’ gabhail a-steach pailteas coimeasach gach peptide, fad-beatha anns an àite extracellular, agus abairt gabhadain ann an diofar àireamhan de neurons targaid, a bharrachd air eadar-obrachaidhean eadar na gabhadairean agus na h-innealan comharrachaidh intracellular aca ann an ceallan postynaptic. Tha impulsivity agus duais cocaine air an riaghladh, co-dhiù ann am pàirt, le DA neurons anns an VTA (26), targaid fhollaiseach de cheallan hypothalamic orexin (37). A bharrachd air an sin, tha dòrtadh orexin a-steach don VTA a ’neartachadh sireadh dhrogaichean (6). Gus measadh a dhèanamh air tabhartasan buntainneach gach peptide air gnìomhachd neurons VTA, rinn sinn clàran electrophysiologic bho cheallan DA ann an sliseagan eanchainn lucha C57BL / 6 a bha fosgailte do orexin agus dynorphin air an cur an sàs leotha fhèin no còmhla. Mar a bhiodh dùil, nuair a chaidh a chuir an sàs air leth, bha orexin gu ìre mhòr excitatory, ach cha robh dynorphin a ’toirt a-mach ach buaidhean bacaidh (Fig. 5 A agus B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). Anns an àireamh de neurons DA a chaidh a chlàradh, fhreagair a ’mhòr-chuid ri dùmhlachdan sùghaidh den dà pheptidean, ged a bha beag-chuid beag a’ freagairt gu roghnach a-mhàin air orexin no dynorphin (Fig. 5B). Gu h-iongantach, nuair a chaidh an dà pheptides a chuir an sàs anns na neurons dà-freagairteach (n = 10), cha robh buaidh lom air ìre losgaidh (Fig. 5A), a ’moladh gum bi buaidhean an aghaidh gach peptide aig dùmhlachdan sùghaidh gu h-èifeachdach a’ cuir às do chèile air corelease. Sheall ceithir de na 10 neurons casg fàbharach le dynorphin a dh ’aindeoin làthaireachd orexin, ach bha aon chealla air a bhrosnachadh gu fàbharach (> atharrachadh 1.5-fhillte) le orexin a dh’ aindeoin gu robh dynorphin ann (Fig. 5 A agus C). Gu h-iomlan, ged a bha barrachd cheallan a ’freagairt orexin na dynorphin, cha robh atharrachadh lom aig na ceallan sin a bha a’ freagairt air an dà pheptides nuair a chaidh orexin agus dynorphin a cho-chothromachadh, a ’moladh gun robh na buaidhean dùbhlanach aig gach peptide air an cothromachadh taobh a-staigh seata VTA DA neurons air an sgrùdadh.

 

Fig. 5.

Bidh Orexin agus dynorphin a ’toirt buaidh chothromach ach dùbhlanach air neurons VTA DA. (A, Clì) Chan eil orexin co-cheangailte agus dynorphin a ’leantainn gu atharrachadh lom ann an ìre losgaidh neurons VTA DA (n = 10). An sàs gu h-aonar, bha dynorphin bacach agus bha orexin excitatory. ...

Gus tuilleadh soilleireachadh a dhèanamh air na h-eadar-obrachaidhean orexin-dynorphin a dh’fhaodadh a bhith ann an taobh a-staigh neurons VTA DA a bha mothachail air an dà chuid orexin agus dynorphin, dh ’fheuch sinn, air an làimh eile, cur ris na buaidhean bacaidh a th’ aig dynorphin air an cleachdadh le amar le làimhseachadh le SB334867 (Fig. S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) no gus buaidh excitatory orexin air a chuir an sàs ann an amar a mheudachadh le bhith a ’làimhseachadh le norBNI (Fig. S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). Anns an dà dheuchainn, OX₁Cha do shoirbhich le bacadh R agus KOR na buaidhean sin a thoirt gu buil, a ’moladh nach eil SB334867 agus norBNI a’ toirt buaidh tro ghnìomhan neo-shònraichte. Nas cudromaiche, tha an dàta seo a ’moladh nach eil tòna gach peptide in vitro gu leòr airson buaidh a thoirt air a bhith a’ cleachdadh antagonists beaga-molecule mar SB334867 agus norBNI. Tha an lorg seo co-chòrdail ri obair a rinneadh roimhe a ’sealltainn nach bi exocytosis de chnàthan mòra, peptide mar as trice a’ tachairt ach aig triceadan losgaidh àrd nach àbhaist a bhith an làthair ann an ullachadh sliseag (38).

Gus dearbhadh nach tug norBNI buaidh air giùlan tro ghnìomhan “far-targaid” gu dìreach aig OX₁Rs, rinn sinn sgrùdadh a-rithist air buaidh an antagonist seo air OX₁R a ’comharrachadh. Gu sònraichte, chleachd sinn assay leughadair plàta ìomhaighean fluorometric (FLIPR) gus faighinn a-mach comas orexin A, SB334867, no norBNI a chaidh a chuir an sàs ann an amar gus gluasadan calcium intracellular a bhrosnachadh ann an ceallan CHO cultarach a ’cur an cèill OX daonna₁Rs. Ged a thug orexin A a-mach na h-àrdachaidhean ris am biodh dùil ann an calcium intracellular (EC₅₀ = Leudaich dòs 0.01 μM) agus SB334867 a rèir na buaidh seo (EC₅₀ = 0.035 μM), cha do shoirbhich le norBNI buaidh sam bith a thoirt air àrdachadh bun-loidhne no orexin A-evoked ann an calcium intracellular. Tha seo a ’moladh gu bheil buaidhean norBNI air fio-eòlas neuronal VTA DA dìreach tro dhòighean comharrachaidh KOR a chaidh a mholadh agus chan eil buaidh dhìreach aig an droga aig OX₁R (39) (Fig. S3 A-C).

Bidh eadar-obrachaidhean Orexin - Dynorphin ann an VTA a ’riaghladh fèin-rianachd cocaine.

Tha na sgrùdaidhean electrophysiology againn a ’sealltainn gu bheil eadar-obrachaidhean fiùghantach eadar orexin agus dynorphin a’ riaghladh gnìomhachd VTA DA, agus gu bheil coltas ann gu bheil neurons VTA a ’frithealadh mar phrìomh substrate airson buaidhean an t-siostam orexin-dynorphin air giùlan brosnachail. Gus an ro-bheachd seo a dhearbhadh gu dìreach, rinn sinn sgrùdadh air buaidhean in-VTA de SB334867 air fèin-rianachd iv cocaine ann am radain. An coimeas ri lionnachadh carbaid taobh a-staigh VTA, dh ’adhbhraich SB334867 taobh a-staigh VTA lùghdachadh mòr de ghabhail a-steach cocaine a chaidh a bhacadh le norBNI (Fig. 6; ANOVA aon-shligheach: F_3,24 = 11.56, P <0.01), a ’moladh gum bi gnìomhan dynorphin neo-sheasmhach taobh a-staigh an raon eanchainn seo a’ lughdachadh duais cocaine. Tha coltas gu bheil na toraidhean sin eadar-dhealaichte leis an fheadhainn a tha air dearbhadh nach robh taobh a-staigh VTA SB334867 air fèin-rianachd cocaine ann an clàran ath-neartachaidh co-mheas 1 (FR1) le oidhirp ìosal (FRXNUMX).40). Ach, tha grunn aithisgean air sealltainn mar a tha iarrtasan obrach a ’dol am meud, gu bheil SB334867 nas èifeachdaiche ann a bhith a’ lughdachadh gabhail dhrogaichean (2, 33). Leis gu robh radain san deuchainn seo a ’coileanadh clàr oidhirp nas àirde FR5, tha na co-dhùnaidhean làithreach a rèir an litreachais seo. Tha an dàta seo a ’toirt seachad fianais dhìreach gum faodadh nàdar an aghaidh orexin agus dynorphin air eòlas-inntinn neuronal VTA DA buaidh mhòr a thoirt air giùlan stèidhichte air duais.

 

Fig. 6.

Eadar-obrachaidhean Orexin - dynorphin ann an gabhail dhrogaichean VTA. Tha fèin-rianachd cocaine air a lùghdachadh le SB334867 taobh a-staigh VTA (3 μg gach taobh), ach tha a ’bhuaidh seo air a thionndadh air ais le ro-aithris le norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < ...

Ainmhidhean.

Bha na luchagan fireann inbheach C57BL / 6J (8 wk de dh ’aois; Saotharlann Jackson) a chaidh a chleachdadh ann an deuchainnean EM air an cumail ann am buidhnean (trì gu còig gach cèidse); bha an fheadhainn a chaidh a chleachdadh airson ICSS a ’fuireach leotha fhèin às deidh obair-lannsa. Chaidh radain fireann inbheach (350 g) Sprague - Dawley (Charles River Laboratories) a chleachdadh ann an deuchainnean fèin-rianachd 5-CSRTT agus cocaine agus bha iad a ’fuireach ann am buidhnean de cheathrar. Chaidh na luchagan fireann inbheach C57BL / 6J (làithean iar-bhreith 19 - 21) a chaidh a chleachdadh airson na deuchainnean electrophysiology a chumail ann am buidhnean (trì gu còig gach cèidse). An OX1^{- / -} luchainn agus an OX1 aca^{+ / +} chaidh sgudal-sgudail (6 wk de dh ’aois) a chaidh a chleachdadh airson na sgrùdaidhean fèin-rianachd fhaighinn bho Laboratory Jackson agus chaidh an toirt air ais còrr is seachd ginealaichean gu luchagan C57BL / 6. Bha na luchagan sin ann an taigh buidhne (dhà gach cèidse). Bha a h-uile beathach a ’fuireach fo chumhachan fo smachd teothachd air cearcall solais / dorcha 12-h, agus chaidh deuchainnean giùlain 4 - 5 h a-steach don chearcall solais; bha biadh is uisge rim faighinn ad libitum mura h-eilear ag ràdh a chaochladh. Chaidh modhan a chumail a rèir Institiudan Nàiseanta na Slàinte Stiùireadh airson Cùram agus Cleachdadh Ainmhidhean Laboratory (50) agus chaidh an aontachadh le Comataidhean Institiùdail Cùram is Cleachdadh Bheathaichean Ospadal MhicIllEathain, Oilthigh British Columbia, agus Scripps Florida.

Immunohistochemistry agus Microscopy.

Chaidh fluorescence agus immunolabeling òr le àrdachadh airgid airson orexin A no prodynorphin a dhèanamh air earrannan eanchainn luch mu seach a rèir modhan a chaidh aithris roimhe (51), agus air an giullachd a rèir protocolaidhean EM àbhaisteach. Chaidh roinnean neo-cheangailte de stuth dìonach an uairsin a thaghadh air thuaiream agus dealbhan a thogail dhiubh airson tomhas de ghràineanan a ’cleachdadh bathar-bog ImageJ (Institiudan Nàiseanta Slàinte) (Stuthan agus Dòighean SI, Immunohistochemistry agus Microscopy).

Electrophysiology.

Chaidh pìoban paiste (3 - 5 MΩ) a lìonadh le gluconate potasium 143 mM, Hepes 10 mM, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (le pH de 7.2), agus 270 - 280 mM mOsmol. Chaidh dàta fhaighinn aig 20 kHz agus air a shìoladh aig 2 kHz a ’cleachdadh bathar-bog pClamp 10.0 (Innealan Molecular). An dèidh rèiteachadh làn-cealla fhaighinn, chaidh ceallan a chuir an sàs aig bholtadh aig −70 mV agus chaidh sreath de cheumannan bholtachd (250 ms, bho −60 gu −130 mV ann an ceumannan 10-mV) a chuir an sàs gus hyperpolarizing a lorg (I_h) sruthan. I_h air a dhearbhadh mar an atharrachadh san t-sruth eadar ∼30 ms agus 248 ms às deidh ceum a ’bholtachd a chuir an sàs. Chaidh gnìomhachd gnèitheach de neurons VTA DA a thomhas ann am modh gnàthach-clamp. Thòisich deuchainnean nuair a chaidh ìre losgaidh bun-loidhne seasmhach a choileanadh; chaidh fo-stratan an uairsin a chuir a-steach airson min 5 agus an uairsin a nighe a-mach le lionn cerebrospinal fuadain. Chaidh an 3 min mu dheireadh de gach earrann 5-min a chleachdadh airson mion-sgrùdadh dàta. Chaidh Dynorphin A (1 - 17; 200 nM) agus orexin A (100 nM) fhaighinn bho Peptide Ameireagaidh agus a sgaoileadh ann an uisge grùide. Fhuaireadh a-mach roimhe seo gun tug na dùmhlachdan sin buaidh shàthaichte air gnìomhachd cealla VTA (5, 52). Chaidh Thiorphan (1 μM) agus bestatin (10 μM) fhaighinn bho Sigma - Aldrich, air an sgaoileadh ann an uisge grùide, agus air an cur an sàs còmhla ri dynorphin A (Stuthan agus Dòighean SI, Electrophysiology).

FLIPR Assay.

OX₁Chaidh gnìomhachd R a mheasadh le bhith a ’tomhas ìrean calcium intracellular le assay FLIPR mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (53) (Stuthan agus Dòighean SI, Measadh Leughadair Pleit Ìomhaigh Fluorometric).

ICSS.

Chaidh luchagan a chuir a-steach le electrodes brosnachail monopolar no cannulae (PlasticsOne) fo ketamine / xylazine (80 agus 10 mg / kg, fa leth, ip; Sigma) air an stiùireadh gu stereotactically chun an LH (18) agus / no VTA contralateral [bho bregma: anteroposterior (AP), −3.2 mm; mediolateral (ML), −0.5 mm; dorsoventral (DV), −4.7 mm bho dura]. Às deidh ùine ath-bheothachaidh 7-d, chaidh luchagan an trèanadh gus freagairt airson brosnachadh eanchainn mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (18). Chaidh an tricead as ìsle a bha a ’toirt taic do fhreagairt (stairsneach) a thomhas a’ cleachdadh mion-sgrùdadh loidhne-de-cheàrn as fheàrr. Nuair a choilean luchagan slatan-tomhais seasmhachd airson stairsnich ICSS (± 10% thairis air làithean leantainneach 5), chaidh buaidhean leigheasan dhrogaichean a thomhas. Chaidh carbad SB334867 (Scripps Florida) no DMSO a thoirt seachad gach dàrna latha a ’cleachdadh syringe Hamilton (0.1 mL / kg ip), agus chaidh stairsnich a thomhas sa bhad ann an seiseanan deuchainn 15-min. Chaidh an norBNI (10 mg / kg ip; Sigma) a thoirt seachad ann an saline (10 mL / kg) 48 h mus do thòisich deuchainn ICSS.

An 5-CSRTT.

Bha radain air an cuingealachadh ri biadh (gu 85% de chuideam biadhaidh an-asgaidh) agus air an trèanadh ann an seòmraichean obrachaidh fo smachd coimpiutair a bha am broinn caibineatan fionnaraichte, fuaim-attenuating (Med Associates), agus modhan 5-CSRTT mar a chaidh a mhìneachadh (25). Chaidh SB334867 (ann an DMSO, 0.1 mL / kg) agus / no cocaine (ann an saline, 1 mL / kg; Sigma) a thoirt seachad le in-stealladh ip 10 min mus deach a dhearbhadh, mar ann an deuchainnean eile, agus chaidh norBNI a thoirt seachad co-dhiù 48 h ron àm toiseach deuchainn (Stuthan agus Dòighean SI, Tha 5-Tasgadh ùine freagairt freagairt sreathach).

Fèin-rianachd IV cocaine.

Chaidh radain agus luchainn a thoirt a-steach le measgachadh bhalbhaichean ogsaidean isoflurane (1 - 3% vol / vol) agus air an ullachadh le lannsaireachd le cathearan Silastic (VWR Scientific) anns an vein jugular a rèir modhan stèidhichte (54). Dìreach às deidh implantachadh catheter anns na radain, chaidh cannulae treòrachaidh stàilinn stainless dà-thaobhach (23 trast-thomhas, 17 mm de dh'fhaid) a chuir a-steach anns an VTA (bho bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, −7.5 mm bho dura ). Chaidh deuchainnean a dhèanamh le SB334867 no norBNI rè seiseanan làitheil 60-min às deidh coileanadh seasmhach cocaine a choileanadh (<eadar-dhealachadh 20% ann a bhith a ’freagairt airson 3 latha leantainneach; Stuthan agus Dòighean SI, Fèin-rianachd IV Cocaine).

Staitistig.

Tha dàta air a chuir an cèill mar mheadhan ± SEM. Airson deuchainnean ICSS, chaidh ceumannan dà-shligheach ANOVA a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar dòighean air an làimhseachadh le SB334867 agus norBNI + SB334867. Chaidh ceumannan aon-shligheach ANOVA le deuchainnean post-hoc Newman-Keuls a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar dòighean taobh a-staigh cumhaichean SB334867 agus norBNI + SB334867. Chaidh ceumannan aon-slighe ath-aithris ANOVA agus Newman-Keuls a chleachdadh cuideachd gus coimeas a dhèanamh eadar dòighean anns a h-uile deuchainn 5CSRTT. Chaidh ceumannan dà-shligheach a-rithist ANOVA a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar dòighean eadar buidhnean làimhseachaidh ann an deuchainnean fèin-rianachd cocaine le OX₁L lucha R KO. Chaidh ceumannan aon-shligheach ath-aithris ANOVA agus Newman-Keuls a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar freagairtean cuibheasach do orexin agus dynorphin le neurons VTA DA. Chaidh ceumannan aon-shligheach ANOVA agus Newman-Keuls a chleachdadh cuideachd gus coimeas a dhèanamh eadar dòighean faighinn a-steach cocaine ann am radain a chaidh an làimhseachadh le SB334867 agus norBNI. Bha eadar-dhealachaidhean air am faicinn cudromach ma bha P <0.05.

Tha sinn a ’toirt taing don Dr Garrett Fitzmaurice airson beachdan cuideachail air an làmh-sgrìobhainn agus Miranda S. Gallo agus Melissa Chen airson cuideachadh le cruinneachadh dàta. Fhuair an obair seo taic bho Thabhartasan Institiud Nàiseanta Tabhartasan Slàinte F32-DA026250 agus K99-DA031767 (gu JWM), F32-DA024932 agus K99-DA031222 (gu JAH), R01-DA023915 (gu. PJK), agus R01-to ) agus le tabhartas lorg Comhairle Rannsachaidh Saidheansan Nàdarra agus Innleadaireachd (gu SLB).

Aithris mu strì eadar com-pàirt: Tha WAC a ’cumail peutant (US Patent 6,528,518; Assignee: Ospadal McLean) co-cheangailte ri bhith a’ cleachdadh antagonists kappa-opioid airson làimhseachadh eas-òrdugh trom-inntinn. Chan eil na h-ùghdaran eile ag ainmeachadh com-pàirtean ionmhasail sam bith.

Is e PNAS Direct Submission an t-artaigil seo.

Faic Aithris air duilleag 5765.

Tha an artaigil seo a ’toirt seachad fiosrachadh taice air-loidhne aig www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.