Endocrinol frontal (Lausana). 2017; 8: 216.
Publicado en liña 2017 agosto 29. doi: 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID: PMC5581815
Julie Paradis,1 Pierre Boureau,1 Thomas Moyon,1 Sophie Nicklaus,2 Patricia Parnet,1,*† Vincent Paillé1,*†
Abstracto
O consumo materno perinatal de alimento denso en enerxía aumenta o risco de obesidade nos nenos. Isto está asociado a un consumo excesivo de alimentos saborosos que se consomen pola súa propiedade hedónica. Aínda se entende mal o mecanismo subxacente que vincula a dieta materna perinatal e a preferencia descendente pola graxa. Neste estudo, pretendemos estudar a influencia da alimentación materna rica en graxas / con alto contido de azucre [dieta occidental (WD)] durante a xestación e a lactación nas vías de recompensa que controlan a alimentación na descendencia de rata desde o nacemento ata a madurez sexual. Realizamos un seguimento lonxitudinal de descendencia de WD e Control en tres períodos críticos (infancia, adolescencia e idade adulta) e centrámonos en investigar a influencia da exposición perinatal á dieta saborosa (i) preferencia de graxa, (ii) perfil de expresión xénica. e (iii) cambios neuroanatómicos / arquitectónicos das redes dopaminérxicas mesolímbicas. Demostramos que a alimentación por TDA restrinxida ao período perinatal ten unha clara influencia de longa duración na organización de circuítos cerebrais homeostáticos e hedonicos pero non na preferencia de graxa. Demostramos un período de evolución específico da preferencia pola graxa que correlacionamos con firmas moleculares cerebrais específicas. Nos descendentes de presas alimentadas por WD, observamos durante a infancia a existencia dunha preferencia de graxa asociada a unha maior expresión do xen clave implicado nos sistemas de dopamina (DA); na adolescencia, unha preferencia rica en graxa para ambos grupos, reducida progresivamente durante a proba de días 3 para o grupo WD e asociada a unha expresión reducida do xen clave implicado nos sistemas DA para o grupo WD que podería suxerir un mecanismo compensatorio para protexelos. a partir dunha exposición máis alta en graxas; e finalmente na idade adulta, unha preferencia pola graxa que era idéntica ás ratas controladas pero asociada a unha profunda modificación en xenes clave implicados na rede de ácido γ-aminobutírica, receptores de serotonina e remodelación do hipotálamo dependente do ácido polisial. En conxunto, estes datos revelan que a EDM materna, restrinxida ao período perinatal, non ten ningún impacto sostido na homeostase enerxética e na preferencia de graxa máis tarde na vida, aínda que se produciu unha forte remodelación da vía hipostalámica homeostática e de recompensa implicada no comportamento alimentario. Serían necesarios experimentos funcionais para comprender a relevancia desta remodelación de circuítos.
introdución
O ambiente e os eventos da vida temperá agora son ben recoñecidos para contribuír á predisposición da saúde e enfermidades máis tarde na vida (1-3). Propúxose o concepto de impresión metabólica para describir como os cambios no ambiente nutricional e hormonal durante o período perinatal poden predispoñer a descendencia á obesidade e ás súas patoloxías asociadas máis adiante. Un problema importante do noso modo de vida occidental é a desnutrición como consecuencia do consumo de alimentos densos en enerxía. De feito, as persoas que están expostas ao consumo materno deste tipo de alimentos teñen un maior risco de desenvolver obesidade e síndrome metabólica (4, 5). Moitos estudos demostraron que a dieta materna con alto contido de graxa (HFD) mediante xestación e mamada ten un efecto a longo prazo no metabolismo da descendencia (6-8). Ademais das vías implicadas na regulación metabólica, os sistemas de recompensa cerebral tamén xogan un papel importante na alimentación (9, 10). A neurotransmisión de dopamina (DA) mesolímbica, intensamente estudada no contexto de recompensa e adicción, está alterada na obesidade inducida na dieta en ambos os humanos (11-13) e animais (14-16). As proxeccións de DA desenvólvense, en gran parte, posnatamente (17) e, polo tanto, o seu desenvolvemento pode verse afectado pola dieta temperá. Durante os últimos anos, experimentos sobre roedores demostraron que a inxestión de HFD materna mellora a alimentación hedonica en descendencia (18, 19). Aínda que esta observación implicou algúns cambios na función do sistema DA (20-22), hai datos limitados sobre a ontogenia e a remodelación das vías de recompensa durante a vida temperá (21). Ademais, se non está documentada a forma de sinalización non DA do sistema de recompensa como o sistema GABA (ácido γ-aminobutírico) polo estrés nutricional perinatal. De feito, as neuronas GABA parecen desempeñar un papel clave na recompensa e na aversión. Área tegmental ventral (VTA) As neuronas GABA reciben un patrón de entrada similar de diferentes áreas cerebrais (23) e recentes estudos comportamentais baseados en optogenética resaltan o papel principal do VTA GABA na aversión ao lugar condicionado (24) e en conduta consumatoria de recompensa (25). Nucleus accumbens (NAc) está constituído principalmente pola proxección das neuronas espinas do medio GABAergic e actúa como unha interface límbico-motora que integra os sinais derivados do sistema límbico e os converte en acción vía saída ao pallidum ventral (VP) e outros efectores motores (26). E finalmente, o hipotálamo que está constituído por numerosas conexións GABA en LH (27) e arquear núcleo, integra sinais de fame e saciedade (10).
Este estudo pretende identificar a influencia da inxestión materna occidental (WD) na descendencia de rata desde o nacemento ata a madurez sexual (i) na preferencia de graxa (ii) no perfil de expresión xénica do sistema DA, o sistema GABAergic e a plasticidade do hipotálamo. , e (iii) sobre os cambios neuroanatómicos / arquitectónicos das redes dopaminérxicas mesolímbicas para o mesmo período. Por tanto, avaliamos, nun estudo lonxitudinal (desde o destete, P25, ata a madurez sexual, P45 e idade adulta, P95), o efecto da DMA materna no crecemento do peso corporal e no desenvolvemento do tecido adiposo da descendencia mantida baixo pico regular despois do destete. Paralelamente, realizamos unha proba de preferencia de graxa seguida dunha análise transcriptómica dedicada e posterior análise de compoñentes principais (PCA) dunha selección de marcadores para os sistemas de regulación de elección e motivación de alimentos. Os nosos resultados enriqueceron significativamente os resultados recentes centrados na programación nutricional do sistema DA.
Materiais e Métodos
Declaración de ética
Todos os experimentos realizáronse de acordo coas directrices do comité local de benestar animal, da UE (directiva 2010 / 63 / UE), do Institut National de la Recherche Agronomique (París, Francia) e do departamento veterinario francés (A44276). O protocolo experimental foi aprobado polo comité ético institucional e rexistrado baixo a referencia APAFIS 8666. Tomouse toda precaución para minimizar o estrés e o número de animais empregados en cada serie de experimentos.
Animais e dietas
Os animais mantivéronse nun ciclo 12 h / 12 h luz / escuro nun 22 ± 2 ° C con comida e auga ad libitum. Trinta e dúas ratas Sprague-Dawley femininas (peso corporal: 240 – 290 g) no día da xestación 1 (G1) foron adquiridas directamente en Janvier (Le Genest Saint Isle, Francia). Aloxáronse individualmente e alimentáronse nunha dieta control (CD) (graxa de vacún 5% e sacarosa 0%) para 16 deles ou un WD (21% graxa de vacún e 30% sacarosa) para 16 deles durante os períodos de xestación e lactación. (ver Táboa Táboa1: 1: composición da dieta en por cento de kcal de ABdiet Woerden, Holanda). Ao nacer, o tamaño da camada axustouse a oito crías por camada cunha proporción 1: 1 varón a muller. Mantivemos 12 fóra das presas 16 cunha camada composta por machos 4 e femias 4 para cada grupo. Ao destete (P21), as crías nacidas nas presas CD e WD mantivéronse en chow estándar ata o final do experimento (figuras (Figuras1A, B) .1A, B). O peso corporal do cachorro rexistrouse ao nacer e despois cada día en 10: 00 am ata P21 (destete). Despois do destete e ata o final do experimento, as ratas foron ponderadas cada 3 días. Presentamos datos só sobre descendencia masculina. As ratas femininas usáronse para outro estudo (Figura (Figura 11).
Comportamento (proba de elección de dúas botellas)
Estudáronse tres períodos críticos de desenvolvemento (P21 a P25: xuvenil, P41 a P45: adolescencia e P91 a P95: adulto novo). Cachorros masculinos 24n = 12 por grupo) seleccionáronse ao azar e colocáronse nunha gaiola individual para realizar unha proba gratuíta de dúas botellas (Figuras (Figuras1A, B) 1A, B) (28-30). Esta proba usouse para estudar específicamente o atractivo cara ao sabor graxo, disociandoo ao sabor doce e, na medida do posible, ao efecto metabólico da inxestión de calorías. De feito, o consumo de solución de aceite de millo 1% está asociado a unha inxestión de 0.09 kcal / ml só. Despois dun día de habituarse á presenza de dúas botellas, a proba realizouse durante 2 días en P25 e durante 4 días en P41 e P91 (Figura (Figura1A) .1A). En detalles, durante o destete (P21), os cachorros 24 foron aloxados individualmente durante 2 días (Figura (Figura1A): 1A): día 1, fase de habituación, día 2, ás ratas elixíronse de dúas botellas unha opción libre entre unha emulsión de aceite de millo 1% en goma xantana 0.3% (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, Francia) e a solución de goma xantana ( 0.3%). En P41 e P91, usáronse cachorros 24 e propúxose a elección libre de dúas botellas durante tres días consecutivos. O consumo de solución de goma xantana e solución gustativa (aceite de millo 1%) rexistrouse diariamente en 11: 00 am durante 3 días (P45 e P95). A posición das dúas botellas invertíase diariamente para evitar o sesgo de preferencia de posición. A puntuación de preferencia de graxa calculouse como a relación do volume de "solución de graxa" consumida co volume total consumido en 24 h. Todas as ratas mantivéronse baixo dieta estándar chow durante toda a proba de comportamento.
Recollida de tecidos e mostraxe de sangue
Ao día seguinte do último día da proba de libre elección de dúas botellas, a metade das ratasn = 6 por grupo) foron eutanasiados rapidamente entre as 09:00 e as 12:00 da mañá por CO2 inhalación. O sangue foi recollido en tubos con EDTA (Laboratoires Léo SA, St Quentin en Yvelines, Francia) e centrifugado a 2,500 g durante 15 min a 4 ° C. O plasma foi conxelado a -20 ° C. Os órganos e o depósito individual de graxa retroperitoneal foron diseccionados e ponderados. O cerebro eliminouse rapidamente e colocouse nunha matriz cerebral (WPI, Sarasota, FL, rata de rato USA 300 – 600 g). Primeiro foi diseccionado o hipotálamo [segundo as coordenadas do atlas de Paxinos: -1.0 a -4.5 mm de Bregma (31)] entón, para cada rata obtivéronse dúas franxas coronais de grosor 2 mm a nivel de NAc e outra a nivel de VTA. Obtivéronse rápidamente mostras da NAC dereita e esquerda e da dereita e esquerda (catro mostras en total por animal) usando dous golpes de biopsia diferentes (Stiefel Laboratories, Nanterre, Francia) (diámetro de 4 mm para o NAc e 3 mm para o cerebro medio ventral). As mostras foron conxeladas en nitróxeno líquido e almacenáronse a -80 ° C para a posterior determinación da expresión xénica por matriz de baixa densidade TaqMan (TLDA).
As outras ratas (n = 6 por grupo) foron anestesiados profundamente con pentobarbital (150 mg / kg ip) e perfundíronse cunha perfusión salina fisiolóxica transcardial seguida de paraformaldehído ao 4% en tampón fosfato (PB), con pH 7.4. Os cerebros elimináronse rapidamente, mergulláronse no mesmo fixador durante 1 h a 4 ° C e, finalmente, almacenáronse nun 25% de sacarosa PB durante 24-48 h. Os cerebros conxeláronse entón en isopentano a -60 ° C e, finalmente, almacenáronse a -80 ° C ata o seu uso. O NAc, o hipotálamo e o VTA cortáronse en seccións coronais en serie de 20 µm cun criostato (Microm, Microtech, Francheville, Francia). Realizáronse dúas ou tres series de 10 láminas de vidro que contiñan de 4 a 6 seccións para cada área cerebral. Para cada diapositiva de vidro, as seccións en serie están espazadas de 200 µm (figura (Figura 66).
Análise de plasma bioquímico
O plasma EDTA recollido en ratas P25, P45 e P95 usouse para medir a glicosa no plasma, NEFA (ácidos graxos non esterificados), insulina e leptina. A glicosa e NEFA medíronse mediante reaccións enzimáticas colorimétricas con kits específicos (kits de glucosa e NEFA PAP 150, BioMérieux, Marcy-l'Etoile, Francia). Ensayáronse as hormonas con kits específicos ELISA seguindo as instrucións do fabricante para a insulina e a leptina (kit ELISA insulina rata / rato, kit ELISA de leptina de rata, Linco Research, St. Charles, MO, EUA).
Inmunohistoquímica
As diapositivas de vidro que contiñan seccións VTA e NAc en serie foron bloqueadas para 3-4 h e logo incubáronse durante a noite a 4 ° C cunha mestura dos seguintes anticorpos: mouse anti-NeuN (1: 500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, EUA) e coello anti-TH (1: 1,000; Reactivos de investigación en biosiencias Millipore, Merk, EUA). Tras a incubación con anticorpos primarios e posterior lavado con PB, incubáronse seccións nunha mestura de anticorpos secundarios: burro conxugado Alexa 488 anti-rato IgM e burro conjugado Alexa 568 anti-coello IgG (1: 500; Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham , MA, USA) para 2 h. As seccións montáronse en diapositivas de sobrecofre máis de ouro (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), Secadas ao aire e cubertas con reactivo antifadio ProLong ™ Gold (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).
Contar neuronas TH en VTA
Para cada rata, contabilizáronse células positivas TH como se describiu anteriormente (32) a tres niveis rostrocaudais diferentes do VTA: ao nivel da saída do terceiro nervio (distancia con respecto a Bregma: –5.3 mm), 200 µm rostral e 200 µm caudal a este nivel (figuras (Figuras6A) .6A). Para o lado esquerdo e dereito, obtívose unha imaxe dixitalizada que comprende o VTA enteiro dende o tracto terminal accesorio medialmente ata o bordo lateral do mesencefalo usando a ampliación × 40 dun escáner de diapositivas dixital NanoZoomer-XR. C12000 (Hamamatsu, Xapón). Debuxouse unha liña arredor do perímetro do VTA para cada tramo. Elixíronse os límites examinando a forma das células e referíndose ao atlas de Paxinos e Watson. Definiuse unha neurona dopaminérxica como un corpo celular inmunoreactivo NeuN (+) / TH (+) cun núcleo claramente visible. Usando o software NIH Image J (complemento de contador de celas), as células NeuN (+) / TH (+) foron contadas por dúas persoas diferentes sen coñecemento dos grupos animais. Corrixíronse os erros de reconto de células divididas mediante a fórmula de Abercrombie (32), onde N = n[t/(t + d)] (N = número total de celas; n = número de celas contadas; t = espesor da sección; e d = diámetro da célula), e este factor de corrección foi de 0.65. Os datos exprésanse como media [NeuN (+) / TH (+) en VTA esquerda e dereita] ± SEM.
Densidade de fibra TH en NAc
O contido de proteína TH nos terminais nerviosos dopaminérxicos do NAc foi estimado mediante análises densitométricas anatómicas de seccións inmunomarcadas con TH. A densidade de fibras TH cuantificouse en tres niveis arbitrarios ao longo do eixe rostrocaudal do NAc (Bregma 2.20, 1.70 e 1.20 mm) (Figura (Figura 6B) .6B). Brevemente, unha imaxe dixitalizada que comprende todo o estriato e NAc obtida mediante a ampliación × 40 dun escáner de diapositivas dixital NanoZoomer-XR C12000 (Hamamatsu, Xapón) obtivéronse. Para un determinado NAc, deseñouse unha liña arredor de todo o núcleo para definir a área de medida de densidade óptica (OD) (Figura (Figura 6B) .6B). O valor obtido normalizouse co valor OD medido a partir dunha zona circular debuxada no corpus callosum (unha rexión non manchada para inmunoquímica TH) da mesma sección usando o software NIH Image J. Os datos exprésanse como media da relación OD (valor OD en valor NAc / OD no corpus callosum das tres seccións) ± SEM.
Expresión xénica de TLDA e TaqMan
O ARN quedou illado de NAc conxelado sen complicacións, mostras enriquecidas en VTA e hipotálamo, utilizando o kit de proteínas / proteína NucleoSpin (Macherey-Nagel, Hoerdt, Francia). O ARN total foi sometido á dixestión DNase seguindo as instrucións do fabricante, a cantidade estimouse mediante a absorbancia ultravioleta de 260 / 280 nm e a calidade avaliouse mediante o sistema de bioanalizador 2100 de Agilent, calculouse entón o número de integridade de ARN (RIN). Descartáronse as mostras cun RIN por baixo de 8. Un microgramos de ARN total foi transcrito inversamente en ADNc usando un kit de alta capacidade RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) nun volume total de 10 µl.
Como se describiu anteriormente (33), a TLDA é unha tarxeta micro-fluída fluída para o ben 384 na que se poden realizar PCRs simultáneas 384 en tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Utilizamos un TLDA deseñado especialmente para cubrir diferentes familias de xenes relevantes para a plasticidade e a regulación da inxestión de alimentos. Cada tarxeta personalizada configurouse como liñas de carga de mostras de 2 × 4 que conteñen cámaras de reacción 2 × 48 (referencia: 96a). Conxunto de xenes 92 (Táboa S1 en Material Suplementario) e catro xenes de limpeza doméstica (18S, Gapdh, Polr2a e Ppia) estudáronse. A PCR en tempo real levouse a cabo mediante reactivos TaqMan de Life Technologies e executouse no sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os datos de fluorescencia en bruto foron recollidos a través da PCR mediante o software SDS 2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), que xerou aínda máis ciclos de limiar Ct con determinación automática tanto de base como de limiar. Despois de filtrar con ThermoFisher cloud App (ThermoFisher, USA) para discriminar correr PCR aberrantes, os ensaios por mostra foron n = 6 (n = 5 para o grupo WD en P25). Os datos analizáronse despois coa aplicación ThermoFisher Cloud (ThermoFisher, EUA) para unha cuantificación relativa. A cuantificación relativa da expresión xénica (RQ) baseouse no método comparativo de Ct usando a ecuación RQ = 2−ΔΔCt, onde ΔΔCt para un xene obxectivo foi a súa propia variación Ct restada a unha mostra do calibrador e normalizada cun control endóxeno. Precisamente, determinamos o xen de mantemento da casa máis estable empregando o algoritmo geNorm (ThermoFisher Cloud App RQ, ThermoFisher, EUA). Entre os catro xenes de limpeza doméstica, Gapdh definiuse como o control endóxeno para NAc e hipotálamo, e Ppia para VTA e isto foi certo para todas as mostras dos tres períodos analizados. A representación gráfica da expresión dos xenes foi deseñada manualmente para asignar unha cor a un incremento do 10% de expresión xénica en relación ao grupo CD. Notouse unha variación significativa, usando un exame de rango de sinatura Wilcoxon non paramétrico, cun asterisco.
Análise Estatística
Os resultados exprésanse en media ± SEM en táboas e cifras. A proba non paramétrica de Mann – Whitney utilizouse para a análise do peso corporal en diferentes momentos, preferencias de graxa e relación OD obtidos da inmunohistoquímica.
Para avaliar o significado das preferencias de graxa dos días 3, realizamos unha análise estatística de columna para cada día. Para cada grupo, probouse o consumo de solución de graxa e solución de control utilizando a proba de rango asinado non paramétrico de Wilcoxon. Comparamos o valor medio de preferencia co valor hipotético de 50% (liña vermella punteada). Notouse unha variación significativa cun asterisco vermello. Empregamos a mesma proba para a análise de valor qPCR RQ; comparamos o valor medio de RQ co valor hipotético de 1. Notouse unha variación significativa cun asterisco (Figura (Figura 44).
Para a análise de mostra de plasma, realizamos unha proba non paramétrica de Mann e Whitney. Analizouse o número de células positivas TH cun ANOVA bidireccional e o p calculouse o valor Debido á multiplicidade das probas implementadas, un Bonferroni post hoc A corrección aplicouse só despois desta proba. A análise estatística realizouse mediante o software Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.).
Un PCA non supervisado realizouse por primeira vez en parámetros 130 (TLDA, comportamento e datos de plasma) en diferentes momentos para cada golpe de biopsia cerebral (VTA, NAc e hipotálamo) para visualizar a estrutura xeral do conxunto de datos (é dicir, tres PCA globais por punto de tempo). A PCA pódese definir como a proxección ortogonal dos datos a un espazo lineal dimensional inferior, de xeito que a varianza dos datos proxectados se maximice no subspacio. Filtramos primeiro xenes que non están expresados ou lixeiramente expresados (figura (Figure5) .5). Os valores da descendencia das presas alimentadas por CD e das presas alimentadas por WD apareceron de diferentes cores en tramas PCA individuais para visualizar se estes dous grupos experimentais están ben separados polos compoñentes PCA non supervisados. Esta análise segrega os grupos de xenes que se expresan diferencialmente entre os dous grupos de descendencia. Posteriormente, os PCA enfocados fixéronse en diferentes agrupacións de marcadores de ARNm: plasticidade (adhesión celular, citoesqueleto, factor neurotrófico, sinaptogénese e regulación da transcrición), vía DA, vía GABAergic, moduladores epigenéticos (histona deacetilase e histona acetil transferase). Estes PCAs centrados permiten visualizar simultaneamente a correlación entre as dietas maternas e algúns marcadores e as correlacións entre xenes familiares específicos. Utilizouse unha escala cualitativa para a análise da PCA e PCA centrada: +++: separación moi boa; ++: boa separación cunha rata no lado incorrecto da separación PCA; +: separación bastante boa con dúas ratas (unha de cada grupo) do lado incorrecto, -: sen separación clara.
Resultados
Peso corporal e crecemento
A inxestión de WD materna durante a xestación (de G1 a G21) non afectou o peso corporal dos fillos ao nacer (Figura (Figura 2) 2) (CD: 6.55 ± 0.07 g vs WD: 6.54 ± 0.05 g p = 0.9232) (Figuras (Figuras2A, B) .2A, B). A ganancia de peso corporal desde o nacemento ata o destete foi 21% máis alta nos fillos nacidos de presas WD que descendentes de presas de CD cun peso corporal significativamente máis elevado ao desmame dos fillos nacidos de presas WD (36.19 ± 0.90 g vs 47.32 ± 1.48 g p <0.001) (Figura (Figura 2C) .2C). Dende o destete ata o final do experimento (P95), as ratas alimentáronse con dieta estándar e o peso corporal permaneceu máis elevado para os descendentes das presas WD que a descendencia de CD. En detalles: durante a adolescencia (P39) (Cifras (Figuras2A, D), 2A, D), CD: 176.8 ± 3.3 g vs WD: 192.2 ± 3.3 g p = 0.0016 e en P93 (adulto novo) (Figuras (Figuras2A, E) 2A, E) CD: 478 ± 9.9 g vs WD: 508.6 ± 10.3 g p = 0.0452.
Hormonas e marcadores metabólicos no período de tempo diferente
As concentracións de leptina, insulina, glicosa e NEFA plasmáticas foron medidas en P25, P45 e P95. En todas as idades, os niveis de glicosa plasmática, NEFA e leptina de descendencia WD non eran estatisticamente diferentes dos descendentes de CD (táboa) (Table2,2, n = 6 por grupo). Observamos un aumento significativo na deposición de graxa (relación de masa de graxa retroperitoneal) en descendencia de presas alimentadas con WD só en P25 (p = 0.0327, proba de Mann e Whitney).
Impacto da DEP perinatal nas preferencias de graxa desde o destete ata a idade adulta
Para explorar o impacto da WD na preferencia de graxa, usamos un paradigma de elección de dúas botellas en tres momentos diferentes durante o crecemento. Esta proba foi utilizada para estudar específicamente a preferencia polo sabor das graxas evitando o máximo posible o efecto metabólico da súa inxestión. Amosamos que as diferenzas no consumo "extra" de calorías da botella (en P25, P45 e P95) non son estatisticamente significativas. entre grupos (figuras) S1A – C no material complementario). Ademais, a diferenza de consumo da solución de aceite de millo 1% resulta nun aumento de calorías por 1% para as ratas WD en P25 (WD: 4.9% vs CD: 3.9% de calorías inxeridas) e 0.5% para ratas de CD en P45 (WD: 2% vs CD: 2.5% de calorías inxeridas) (Cifras S1D – F no material suplementario). En P25, os fillos das presas de CD non teñen preferencia pola graxa (44.87 ± 9.8%, p = 0.339); no contrario, as ratas WD presentan unha preferencia pola graxa (75.12 ± 8.04%, p = 0.039 despois da proba de rango asinado de Wilcoxon, asterisco vermello). Ademais hai unha diferenza estatística entre os dous grupos con p = 0.0347 (proba de Mann e Whitney, etiqueta negra de hash) (Figura (Figura 33A).
En P45 e P95, os dous grupos teñen unha preferencia significativa para a graxa, é dicir, significativamente diferente do valor teórico de 50% (en P45, CD: 80.68 ± 2.2%) p = 0.0005 e WD: 78.07 ± 3.25% p = 0.0005; en P95, CD: 74.84 ± 8.4% p = 0.0425 e WD: 69.42 ± 8.9% p = 0.109 despois da proba de rango asinado de Wilcoxon, asterisco vermello) (Figura (Figura3A) .3A). Os valores para os dous grupos non se podían distinguir despois dun día de presentación do gusto (en P45 p = 0.7857 e en P95 p = 0.9171 proba de Mann – Whitney) (Figura (Figura 33A).
Para saber como as ratas regulan o seu consumo de graxa co paso do tempo, repetimos a presentación de graxa durante tres días consecutivos en P45 e P95 (cifras) (Figuras3B, C) .3B, C). Curiosamente en P45, só os machos das presas WD perderon progresivamente a preferencia pola solución de graxa (figura (Figura 3B) 3B) (terceiro día: 53.12 ± 8.36% p = 0.851 despois da proba de rango asinado de Wilcoxon). Non obstante, en P95 (idade adulta) todos os animais preferiron a graxa sen evolución durante a proba de 3 días (Figura (Figura 33C).
En resumo, neste modelo observamos, na fase inicial (infancia), a preferencia pola graxa na rata alimentada polas presas de WD cun desinterese progresivo no tempo durante a adolescencia. Non observamos ningunha diferenza entre os dous grupos de ratos na idade adulta.
Sinatura molecular de plasticidade do cerebro e circuítos de GABA remodelación nos camiños de hipotálamo e recompensa
Para determinar se a inxestión materna de WD durante a xestación e a lactación ten un impacto no hipotálamo e as vías de recompensa da descendencia, medimos a expresión relativa de varios factores clave da plasticidade cerebral, a modelaxe cerebral e os marcadores de circuítos neuronais implicados na inxestión de alimentos e na epigenética. reguladores. Usamos TLDA para analizar a súa abundancia en diferentes áreas do cerebro (é dicir, hipotálamo, VTA e NAc) (táboa) S1 en material suplementario) nos tres períodos de tempo. A detección realizouse despois das probas de selección de dúas botellas en P25, P45 e P95 (figura) (Figura 1) 1) en seis machos nacidos de presas alimentadas con WD e seis machos nacidos de presas alimentadas por CD.
En P25 no hipotálamo, cinco xenes de trece categorías diferentes mostraron un nivel de expresión de ARNm significativamente menor principalmente nos marcadores de plasticidade e marcadores de GABA comprendidos entre −20% (Gfap) e −40% (Gabra5) en crías de WD alimentados con presas en comparación con ratos de Presas alimentadas por CD. En biopsias de vía de recompensa (VTA e NAc), dous xenes mostraban niveis estatísticos de expresión de ARNm máis elevados (D2R e Gabra1), é dicir, sinais de DA e receptores de GABA e un xene unha expresión máis baixa (Hcrtr2) (é dicir, receptor de orexina 2) en NAc , mentres que catro xenes mostran un nivel de expresión de ARNm significativamente superior (Map2, Gabara1, Hcrtr1 e Hcrtr2) (é dicir, marcadores de plasticidade, receptores GABA e receptores serotoninérxicos) na VTA (Figura) (Figura 44).
En P45 no hipotálamo, cinco xenes de trece categorías diferentes mostraron un nivel máis baixo de expresión de ARNm que varía entre −20% (Fos) e −50% (FosB) en crías de presas alimentadas con WD en comparación con ratos de presas alimentadas por CD. En P45 en biopsias de rutas de recompensa, catro xenes mostran un nivel de expresión de ARNm máis elevado (Gfap, Dat, Cck2r e Kat5) e dous xenes cunha expresión máis baixa (Fos e FosB) en NAc mentres que tres xenes mostran un nivel de expresión de ARNm inferior (Arc, FosB e Th) e un xene a un nivel superior (Gabrg2) en VTA.
En P95 no hipotálamo, os xenes 20 de trece categorías diferentes mostraron un nivel de expresión de ARNm máis alto que varía entre + 20 e + 40% (Syt4 a Gjd2) e os xenes 3 mostraron unha expresión de ARNm inferior (FosB, D1r e Gabarb1) en crías de WD Presas alimentadas en comparación con ratos de presas alimentadas por CD. En P95 en biopsias de rutas de recompensa, os xenes 12 mostran un nivel de expresión de ARNm máis alto que varía entre + 20 e + 40% (Syn1 a Hcrt1) e xene 1 unha expresión máis baixa (Th) en NAc, os xenes 6 mostraron un nivel de expresión de ARNm máis alto (Ncam1). Os xenes Gja1, Gjd2, Gabra5, Htr1a e Htr1b) e 6 mostraron un nivel de expresión de ARNm máis baixo (Cntf, Igf1, Fos, Socs3, Gabrb2 e Hdac3) en VTA.
A continuación realizamos tres PCA sen supervisión correspondentes ás tres biopsias cerebrais utilizando todos os parámetros cuantificados (é dicir, a dose de plasma, datos de comportamento e variacións de expresión do ARNm). Só se obtivo unha separación clara dos dous grupos en P95 para NAc e VTA (táboa (Table33).
De acordo co círculo de correlación PCA e os datos de TLDA (que representan a maioría das variables incluídas neste PCA), definimos as familias de xenes que poderían ser responsables da segregación e realizaron unha PCA enfocada. (Figuras5A, B, 5A, B, por exemplo). A PCA enfocada revelou que nos marcadores de P25 DA nos marcadores de NAc e de plasticidade no hipotálamo podían separarse os dous grupos de descendentes (táboa) (Table33 para resumo). Non se obtivo esa discriminación en P45. Non obstante, a mesma análise en P95 revelou que os distintos marcadores do sistema GABA en NAc e hipotálamo, ademais dos marcadores de plasticidade (no hipotálamo, NAc e VTA) e reguladores epigenéticos (só en NAc) contribúen a separar os dous grupos de animais ( Figura (Figura 5; 5; Táboa Táboa33).
Esta análise revela a influencia duradeira da dieta perinatal nos marcadores GABAérxicos, así como a plasticidade e os marcadores epixenéticos tanto na vía homeostática coma na recompensa implicados no comportamento da alimentación.
Inmunohistoquímica das células TH. Análise de transcrición confirmada
Porque observamos algunha variación no ARNm TH en NAc e VTA nos distintos períodos de desenvolvemento, buscamos correlacionar estes resultados coa inmunotinción de TH. O número de células positivas TH / NeuN foi analizado no VTA onde se localizan os corpos celulares dopaminérgicos e cuantificouse a OD de inmunolabelización de TH nas terminacións nerviosas localizadas no NAc. As células TH (+) eran menos abundantes no VTA do WD en comparación cos ratos CD só en P45 (cifras) (Figuras6A, C, E; 6A, C, E; Figura S2A no material suplementario). Non houbo interacción significativa entre o nivel de sección e a cuantificación de TH / NeuN nos tres períodos (P25) p = 0.9991, P45 p = 0.9026 e P95 p = 0.9170). Só en P45, obtívose unha diferenza estatística entre os dous grupos de descendencia (p = 0.0002) (Figura (Figure6E) .6E). Ademais, non se observou ningunha diferenza en OD de inmunotinción de TH no NAc en P25 e P45 entre os dous grupos (valores de relación de OD en P25: 1.314 ± 0.022 en CD vs 1.351 ± 0.026 en WD, p = 0.2681; Valores de relación OD en P45: 1.589 ± 0.033 en CD fronte a 1.651 ± 0.027 en WD, p = 0.1542). Non obstante, atopouse unha diminución significativa do OD das terminacións nerviosas TH en NAc do grupo WD en P95 (valores da relación OD en p95: 1.752 ± 0.041 en CD fronte a 1.550 ± 0.046 en WD, p = 0.0037) (Figuras (Figuras6B, D, F; 6B, D, F; Figura S2B no material suplementario).
Conversa
Neste estudo, temos a hipótese de que a gobernanza perinatal materna influirá no programa de desenvolvemento de vías de recompensa implicadas na homeostase enerxética, a elección de alimentos e na inxestión de alimentos dos fillos. Examinamos extensamente o impacto da inxestión materna en TFD desde o nacemento ata o destete nas vías GABA, serotonina e DA de áreas específicas do cerebro (VTA, NAc e hipotálamo) na descendencia, desde a infancia ata a idade adulta. Os nosos resultados suxiren que o uso dunha dieta rica en graxa e doce, restrinxido estreitamente ao período perinatal, ten un impacto na preferencia de graxa temperá (infancia) na descendencia correlacionada co cambio no perfil de expresión xénica e os cambios neuroanatómicos / arquitectónicos do mesolímbico redes dopaminérxicas. Non obstante, cando os fillos mantivéronse baixo dieta chow, observamos en adolescentes ratas alimentadas con WD unha perda progresiva de atracción cara á graxa que se correlacionaba cunha expresión reducida dos xenes do sistema DA e unha lixeira redución das neuronas TH-positivas no VTA. . A preferencia de graxa máis tarde na vida non era diferente entre os grupos, aínda que se identificou unha importante plasticidade das redes GABAérxicas e da rede de homeostase enerxética do hipotálamo en ratos de presas alimentadas con WD (figura) (Figura 77).
O primeiro impacto da ingesta perinatal-WD que observamos neste estudo é o aumento do peso corporal da descendencia no destete, pero non hai diferenza no nacemento. De feito, os animais do grupo WD gañan 21% máis peso que o CD ao final do período de succión. Estudos anteriores proporcionaron resultados conflitivos en canto ao cambio no peso ao nacer das descendentes de presas alimentadas con WD: un maior peso corporal (19, 34), un menor peso corporal (18, 21, 35) ou ningunha diferenza (6, 22). Os nosos datos están en consonancia cunha recente análise de meta-regresión (36) realizado en publicacións experimentais de 171 que concluíron que a exposición materna á HFD non afectou ao peso do nacemento dos fillos, pero que induciu un aumento do peso corporal ao final do período de lactación. O peso corporal máis elevado da descendencia de WD probablemente reflicte un cambio na composición da leite e / ou na produción de leite que se ilustrou en publicacións anteriores (37, 38). De acordo co seu maior peso corporal, a proporción de graxa retroperitoneal da descendencia de WD foi significativamente maior que a do descendente de CD ao final do período de lactación (P25, Table Table2), 2), que tamén é consistente cos estudos anteriores (18, 21). Non obstante, a adiposidade máis alta non persistiu en P45 e P95, e outros parámetros metabólicos como insulina, NEFA e plasma de glicosa non foron diferentes entre grupos. Os nosos resultados demostraron que sen unha obesidade materna clara durante a xestación e a lactación, a dieta por si só non é suficiente para inducir efectos metabólicos duradeiros na descendencia (22, 39, 40).
Informouse de que a inxestión de HFD perinatal correlaciona positivamente coa preferencia de descendencia para un alimento agradable.41). No noso estudo realizamos un estudo lonxitudinal que ten como obxectivo probar a preferencia de graxa nos fillos que se destetean no chow regular.
Impacto da DEP perinatal na infancia (despois do destete)
Os catorres de roedores comen alimentos sólidos 19 – 20 días despois do nacemento (42) cando as súas vías de recompensa cerebral aínda non están maduras (17). Por iso, foi moi interesante estudar a súa preferencia moi cedo para a graxa e correlacionar esta preferencia precoz coa análise de transcricións cerebrais. Xusto despois do destete observamos a preferencia pola graxa na descendencia de WD que non se evidenciaba en ratas de CD. Isto está en consonancia con outros informes que mostran unha conexión entre a desnutrición perinatal e as preferencias alimentarias saborosas e unha baixa preferencia pola graxa na idade temperá para as ratas de control (43).
A ACP global non permitía discriminar ao grupo de crías con respecto á dieta materna nesa idade. Non obstante, cando se realizou unha PCA dirixida, restrinxida aos marcadores DA, obtivemos unha boa segregación dos grupos. De feito, hai un marcado aumento na expresión do ARNm do receptor D2 no NAc dos cachorros de WD. Esta sobreexpresión postsináptica de D2 no NAc podería estar implicada en parte nunha motivación máis alta para a graxa (44). Poucas outras transcricións son modificadas en crías WD en comparación cos cachorros de CD, como o aumento da subunidade 1 GABAA alfa en NAc e VTA e unha diminución da subunidade alfa 5 GABAA no hipotálamo que suxire unha reorganización dos receptores GABAA nestes núcleos.
Impacto da DEP perinatal na adolescencia
En P45, observamos unha preferencia similar de alta graxa para os dous grupos o primeiro día de presentación pero, curiosamente, as ratas WD progresivamente perderon o seu interese por graxa despois de repetidas presentacións. A adolescencia é un período crítico de reorganización neurocomportamental necesaria para o procesamento cognitivo durante toda a vida (45), e varios estudos mostraron unha marcada vulnerabilidade ao efecto cognitivo prexudicial dunha dieta gorda (46-48). Este resultado está en aparente contradición co traballo anterior do grupo de Muhlhausler (21, 35) en que os ratos xuvenís (semanas 6) mostraron unha clara preferencia por comida lixo. Non obstante, nas súas publicacións o paradigma experimental era diferente xa que as ratas tiñan acceso gratuíto tanto ao chow estándar como á comida chatarra do destete ao sacrificio (semanas 6).
Concomitantemente, medimos un incremento do ARNm de dat na NAc e unha diminución do ARNm Th na VTA que foi confirmada pola inmunohistoquímica que mostrou un número reducido de células TH (+) no VTA das ratas WD. Despois dunha elevada actividade transcriptómica para o sistema DA ao desmamados, a actividade reducida en P45 pode explicar o baixo interese para o alimento saboroso observado nas nosas ratas WD. Tamén debe observarse que a diminución sistemática da expresión de ARNm de Fos e FosB nos distintos núcleos que analizamos podería ser unha marca dunha actividade cerebral reducida despois da exposición materna a WD.
As ratas WD adolescentes mostraron un desinterese máis rápido para a graxa que é oposto ao seu comportamento anterior. O uso dunha dieta "normal" durante a infancia parece "protexelos" cara a unha preferencia de graxa esaxerada na adolescencia. Pola contra, cando as ratas teñen acceso gratuíto á comida lixo despois do destete, como en Ref. (21, 35), demostran na adolescencia unha forte preferencia pola graxa. Este resultado suxire que a dieta chow de 3 semanas despois do destete podería reprogramar os circuítos e facer que a descendencia adolescente sexa menos sensible a un reto agudo de graxa.
Impacto da DEP perinatal en adultos
As ratas adultas xa non mostran diferenzas de preferencia por graxa, mesmo despois da presentación de graxa repetida como xa se describiu (22, 35). Concomitantemente, observamos unha diminución do ARNm e da proteína Th no NAc, e unha tendencia a unha expresión reducida do ARNm de Dat na VTA. Naef e compañeiro de traballo (20) xa informou dunha baixa actividade do sistema DA en ratas adultas alimentadas en período perinatal cunha HFD, cunha resposta de DA franqueada á anfetamina medida con microdiálisis e un aumento de motivación para a recompensa de graxa (ver táboa que resumiu os datos recentes de qPCR neste modelo, Táboa S2 en material suplementario). Unha limitación da cuantificación de TH (mRNA e inmunohistoquímica) na NAc provén do feito de que as células NAc tamén podían expresar o ARNm e a proteína Th e entón podían polarizar a cuantificación das fibras DA.49, 50). Non obstante, o uso de imunodexina TH en NAc revelou principalmente os terminais de axóns densos procedentes das neuronas DA do cerebro medio (VTA e SNc). Normalmente, as TH que expresaban neuronas no estriado e NAc só podían ser discernidas en animais altamente lesionados DA.51) e, polo tanto, podería ser difícil de detectar nas nosas inmuno-seccións. Neste estudo tamén se observou un forte aumento no receptor de opiáceos mu en NAc cando outros grupos, con diferentes modelos, mostraron unha diminución da expresión no estriado ventral da rata expostos tempranamente a HFD (durante a lactación e a xestación) (19, 21) ou ningún cambio (35). Estas modificacións, medidas só a nivel de ARNm, poderían reflectir unha lixeira hiperactividade dos circuítos DA asociados a unha maior sensibilidade aos opioides (52) que probablemente non sexan suficientes para ter un impacto na proba de comportamento que realizamos. Estas suposicións deben confirmarse mediante enfoques funcionais. Nun artigo recente, cun modelo similar, Romani-Perez et al., Non puideron observar un aumento significativo de motivación en caixas de acondicionamento operante para descendentes de HFD pero observaron unha latencia máis curta para alcanzar un cadro de obxectivos nun paradigma de proba de pista (22). A pesar da ausencia de preferencia de graxa duradeira nas nosas condicións experimentais, descubrimos que a inxestión materna WD de WD ten un efecto duradeiro noutros circuítos cerebrais principalmente mediados por remodelación de GABA en NAc e hipotálamo. Considérase NAc como un "sentinela sensorial" para o comportamento consumatorio.52). Estudos recentes demostraron que a inxestión de alimentos foi suprimida pola inhibición das neuronas LH liberadoras de GABA (53). O'Connor et al. mostraron que as neuronas NAc D1R (neuronas que proxectan GABAergic) inhiben selectivamente as neuronas VGAT de LH para deter a inxestión de alimentos (54). Estes experimentos revelan un circuíto GABA (NAc / Hypothalamus) que pode ser responsable do control da resposta comportamental. Este sistema ventral estrato-hipotalámico complementa outro circuíto que involucra o núcleo da cama stria terminalis VGAT neurona que proxecta a glutamato liberando neuronas Vglut LH e inhibición directa de LH vglut2 provoca alimentación (55). Outro compoñente importante do circuíto regulador do apetito que implica a shell de NAc é unha proxección inhibidora de liberación de GABA ao VP56). Estes datos resaltan o papel crucial da sinalización do GABA na interacción entre o hipotálamo ea NAc para promover a alimentación. No noso estudo non fomos capaces de discriminar a poboación de neuronas implicadas na remodelación de GABA e como estas modificacións podían alterar as redes. Non obstante, o papel central dos circuítos GABA merece máis interese. En particular, sería moi interesante realizar máis experimentos funcionais destes circuítos GABA utilizando enfoques electrofisiolóxicos (57). Tamén observamos unha regulación global superior da transcrición do ARNm para os receptores 5HT1a e 5HT1b nos tres núcleos estudados. A maioría das fibras de serotonina proxectadas proveñen do núcleo de raphe dorsal (DRN) e do núcleo raphe medio (MRN). Datos recentes de in vivo as gravacións e os estudos de imaxe mostraron un papel positivo de 5HT en recompensa (58). As fibras 5HT da DRN están implicadas no control de impulsividade (59). Aumentar 5HT1a en VTA e NAc podería ser un mecanismo compensatorio que podería controlar a impulsividade. No hipotálamo, os estudos farmacolóxicos suxiren que os subtipos do receptor 5HT1a poden suprimir o comportamento alimenticio inducido pola estimulación da serotonina (60, 61). O aumento dos receptores 5HT1a e b no hipotálamo podería potenciar a acción de supresión da alimentación da serotonina e, polo tanto, podería constituír un mecanismo compensatorio. Estas hipóteses deben verificarse realizando experimentos funcionais adecuados.
Estes cambios nas redes están asociados con modificacións dos marcadores de plasticidade como ARNm de Ncam. No hipotálamo de ratas adultas, observamos un aumento nas transcricións de Ncam1 e St8sia4 que suxiren e aumentan a sinalización de ácido polisialico (PSA). O PSA é un glican de superficie celular que modula as interaccións célula-célula. A polisialilación das proteínas de adhesión celular está implicada en diversos procesos dependentes da plasticidade sináptica no sistema nervioso central e informouse de que é necesaria para a plasticidade sináptica adaptativa dos circuítos de alimentación durante o balance de enerxía aguda positiva (33, 62). Ademais, outros reguladores da interacción e sinaptogênese da célula poden estar implicados nesta plasticidade hipotalámica.
En conclusión (Figura (Figure7), 7), a inxestión materna de WD ten unha influencia duradeira na organización dos circuítos homeostáticos e hedónicos que regulan o comportamento alimenticio na descendencia. Pola análise de tres períodos críticos de tempo, fomos capaces de mostrar unha evolución clara para a preferencia de graxa correlacionada con firmas moleculares específicas do cerebro. Durante a infancia, a preferencia pola graxa podería correlacionarse cunha maior actividade do sistema DA. A adolescencia, caracterizada por unha inversión de graxa preferida, asociouse cunha menor expresión dos marcadores do sistema DA que suxiren un mecanismo compensatorio. Un punto moi interesante de notificar é que, neste modelo, unha dieta equilibrada despois do destete pode protexer a rata adolescente de hábitos de alimentación deletéreos reducindo o desexo de graxa. Aínda que na idade adulta os dous grupos teñen unha preferencia similar por graxa, as ratas das presas alimentadas con WD mostraron unha profunda remodelación dos circuítos GABA. Cales son as consecuencias desta duradeira plasticidade? Un consumo exagerado de dieta obesogénica durante a adolescencia reactivará este sistema de recompensa sen problemas? Tales preguntas poderían ser relevantes no seguimento nutricional dos recentemente nados e dos nenos subidos nos países occidentalizados.
Declaración de ética
Todos os experimentos realizáronse de acordo coas directrices do comité local de benestar animal, da UE (directiva 2010 / 63 / UE), do Institut National de la Recherche Agronomique (París, Francia) e do departamento veterinario francés (A44276). O protocolo experimental foi aprobado polo comité ético institucional e rexistrado baixo a referencia APAFIS 8666. Tomouse toda precaución para minimizar o estrés e o número de animais empregados en cada serie de experimentos.
Contribucións do autor
JP e PB realizaron un experimento e participaron na discusión e escritura. TM realizou a PCA e participou en discusións e redaccións. SN contribuíu ao deseño do experimento e participou na discusión. O PP contribuíu ao deseño do experimento, participou nas discusións e escribiu o manuscrito. O VP deseñou e realizou os experimentos, analizou os datos e escribiu o manuscrito.
Declaración de conflitos de intereses
Os autores declaran que a investigación foi realizada en ausencia de relacións comerciais ou financeiras que puidesen interpretarse como un potencial conflito de intereses.
Grazas
Os autores queren recoñecer a Guillaume Poupeau e Blandine Castellano por coidar dos animais ao longo do estudo, Anthony Pagniez pola súa axuda na extracción de ARNm e TLDA, Isabelle Grit pola axuda na análise de mostras de plasma, e Alexandre Benani e Marie-Chantal Canivenc. pola súa discusión e deseño TLDA.
Notas ao pé
Financiamento. Esta investigación foi apoiada pola concesión PARIMAD (VP) da rexión dos pagos da loira, subvención de fundación LCL (VP e PP), fundación SanteDige (VP) e DIDIT do metaprograma INRA (SN, VP, PP).
Material complementario
O material suplementario deste artigo pódese atopar en liña en http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
Figura S1
A inxestión total de enerxía do aceite de millo que contén botella (A) A inxestión de calorías desde a botella de aceite de millo para 24 h en P25 en crías de xemelgas alimentadas con dietas occidentais (WD) e crías de presas alimentadas con dieta de control (CD). (B) A inxestión de calorías da botella de aceite de millo para 24 h en P45 (o terceiro día de proba de botella). (C) A inxestión de calorías da botella de aceite de millo para 24 h en P95 (o terceiro día de proba de botella). Para paneis (A – C), os datos exprésanse como media ± SEM, ningunha diferenza estatística (p > 0.05) observouse, despois da proba non paramétrica de Mann e Whitney, a todas as idades. (D) Porcentaxe de inxestión de calorías procedentes da botella de aceite de millo en comparación coa inxestión total de calorías (botella de aceite de millo + dieta estándar) para 24 h en P25 en crías WD e CD. (E) Porcentaxe de inxestión de calorías procedentes da botella de aceite de millo en comparación coa inxestión total de calorías (botella de aceite de millo + dieta estándar) para 24 h en P45 (o terceiro día de proba de botella) en cachorros WD e cachorros de CD. (F) A porcentaxe de inxestión de calorías procedente da botella de aceite de millo compárase co consumo total de calorías (botella de aceite de millo + dieta estándar) para 24 h en P95 (o terceiro día de proba de botella) en cachorros e CD. Para paneis (D, E), os datos exprésanse en porcentaxe da inxestión total de calorías sen diferenza estatística (p > 0.05) observouse, seguindo o chi cadrado coa corrección de Yates, a todas as idades.
Figura S2
Fotomicrografías representativas da inmunotinción de TH no núcleo accumbens (NAc) e na área tegmental ventral (VTA) en tres diferentes momentos. (A) Fotomicrografía de inmunotinción TH / NeuN a nivel de VTA, −5.30 mm de Bregma. A etiqueta vermella é para NeuN e verde para TH. A frecha branca mostra a saída do terceiro nervio. (B) Fotomicrografía de inmunotinción de TH a nivel do NAc, + 1.70 mm de Bregma. A etiqueta verde é para TH. A frecha branca mostra a comisura anterior.
Táboa S1
Lista de xenes de matrices de baixa densidade TaqMan cos códigos correspondentes das tecnoloxías da vida correspondentes.
Táboa S2
Resumo dos datos publicados sobre a expresión das transcricións de vías de dopamina. Os personaxes vermellos corresponden ao período da infancia, os azuis á adolescencia e os negros ao adulto. =: correspóndese cunha expresión de transcrición similar entre grupos, +: corresponde a unha expresión de transcrición máis alta en crías de dieta alta calórica [junk food, dieta occidental (WD), ou dietas ricas en graxa (HFD)] alimentadas, e -: corresponde a unha expresión de transcrición máis baixa en crías de encoros alimentados con dieta alimentaria de alta calor (junk food, WD ou HFD).
References
;
