પ્રો નેટ નેટ એકેડ સાયન્સ યુએસ એ. એપ્રિલ 29, 2014; 111 (17): 6455-6460.
ઑનલાઇન એપ્રિલ 15 પ્રકાશિત, 2014. ડોઇ: 10.1073 / pnas.1404323111
પી.એમ.સી.આઈ.ડી.
ન્યુરોસાયન્સ
ટેરોકો ડેનજો,a કેંજી યોશીમી,b કાઝુઓ ફનબાકી,a સતોશી યવાતા,a અને શિગેટાડા નાકનીશીa,1
આ લેખ છે દ્વારા સૂચવાયેલ પી.એમ.સી. માં અન્ય લેખો.
મહત્ત્વ
વેન્ટ્રલ ટેગમેન્ટલ એરિયા (વીટીએ) માં ડોપામાઇન (ડીએ) ચેતાકોષ મોટાભાગે ક્ષણિક ચિત્તભ્રમણા દ્વારા વિપુલ ઉત્તેજના તરફ પ્રતિક્રિયા આપે છે. તે અસ્પષ્ટ છે કે શું આ પ્રતિક્રિયા સીધા ઉંદર વર્તનમાં પ્રતિકૂળ પ્રતિસાદો લાવે છે. અમે આ પ્રશ્નનો તપાસ VTA માં ડીએન ન્યુરોન્સને ઑપ્ટોજેનેટિકલી નિયંત્રિત કરીને શોધી કાઢ્યો છે અને ડીએન ચેતાકોષના નિષ્ક્રિયકરણને પ્રતિકૂળ પ્રતિસાદ અને શિક્ષણમાં પરિણમ્યું છે. વીટીએ ડીએન ન્યુરોન્સનું મુખ્ય આઉટપુટ ન્યુક્લિયર, ન્યુક્લિયસ ઍક્યુમ્બન્સ (એનએસી), આ પ્રતિસાદ માટે જવાબદાર માનવામાં આવતું હતું, તેથી અમે તપાસ કરી હતી કે એનએસીમાં કયા મૂળભૂત માર્ગો D1 અથવા D2 રીસેપ્ટર નોકડાઉનનો ઉપયોગ કરીને આ વર્તણૂક માટે મહત્વપૂર્ણ હતા, અને શોધી કાઢ્યું કે આ વર્તણૂંક માટે D2 રીસેપ્ટર-વિશિષ્ટ પાથવે નિર્ણાયક હતું.
અમૂર્ત
વેન્ટ્રલ ટેગમેન્ટલ એરિયા (વીટીએ) માંથી ડોપામાઇન (ડીએ) ટ્રાન્સમિશન બંને ફાયદાકારક અને અપ્રિય વર્તનને નિયંત્રિત કરવા માટે નિર્ણાયક છે. ડી.એન. ચેતાકોષોનું ક્ષણિક શાંત કરવું એ ઉત્તેજક ઉત્તેજનાની પ્રતિક્રિયાઓમાંનું એક છે, પરંતુ તેના પરિણામો અને નકામી પ્રતિક્રિયાઓ અને લર્નિંગ વિશેના ન્યૂરલ મિકેનિઝમ્સ મોટેભાગે પ્રપંચી રહ્યા છે.. અહીં, અમે અહેવાલ આપીએ છીએ કે વીએટીએ ડીએન ન્યુરોન્સના ઓપ્ટોજેનેટિક નિષ્ક્રિયકરણને તરત જ ડાઉન-રેગ્યુલેટેડ ડીએ સ્તર અને ન્યૂક્લિયસ ઍક્યુમ્બન્સ (એનએસી) માં ન્યુરલ પ્રવૃત્તિના અપ-નિયમનને પ્રેરિત કરે છે.) ફોસ અભિવ્યક્તિ દ્વારા મૂલ્યાંકન. ટીડીએન ન્યુરોન ફાયરિંગના તેના ઓપ્ટોજેનેટિક દમનને તરત જ અગાઉ પસંદ કરેલા ઘેરા રૂમમાં પ્રતિકૂળ પ્રતિભાવો ઉઠાવવામાં આવ્યા હતા અને તે ઓપ્ટોજેનેટિકલી કંડિશન કરેલા સ્થાને વિપરિત શીખવાની તરફ દોરી ગયો હતો. મહત્ત્વની વાત એ છે કે, આ સ્થળની આડઅસર ડોપામાઇન ડીએક્સટીએક્સએક્સ રીસેપ્ટર્સને નકામા કરીને નાબૂદ કરવામાં આવી હતી પરંતુ એનએસીમાં ડીએક્સટીએક્સએક્સ રીસેપ્ટર્સ દ્વારા નહીં.. વીએટીએમાં ડીએન ન્યુરોન્સને સિલેન્સિંગ એ એનએસીમાં ડોપામાઇન ડીએક્સટીએક્સએક્સ રીસેપ્ટર્સ દ્વારા વિપરિત પ્રતિક્રિયાઓ અને શીખવા માટે અનિવાર્ય હતું.
મેસોલિમ્બિક ડોપામિનેર્જિક સિસ્ટમ પ્રેરણા અને શીખવાની વિશાળ શ્રેણીમાં માત્ર એક મહત્વની ભૂમિકા ભજવે છે (1-3), પરંતુ પાર્કિનસન રોગ, સ્કિઝોફ્રેનિઆ અને ડ્રગ વ્યસનમાં દાખલા તરીકે ગંભીર નિયોરોસાયકિયાટ્રિક ડિસઓર્ડર્સમાં તેની તકલીફ પણ ફેલાયેલી છે. વેન્ટ્રલ ટેગમેન્ટલ એરિયા (વીટીએ) માં ડોપામાઇન (ડીએ) ચેતાકોષ ફાસિક ફાયરિંગ દ્વારા પ્રદાનશીલ ઉત્તેજના પર પ્રતિક્રિયા આપે છે, અને આ ફાયરિંગના મુખ્ય કાર્યને "ઇનામની પૂર્વાનુમાન ભૂલ" ને એન્કોડ કરવા માટે થિયોરાઇઝ્ડ કરવામાં આવે છે, જે આગાહી કરેલ પુરસ્કાર અને મૂલ્ય વચ્ચેના મૂલ્યમાં તફાવત વાસ્તવિક પુરસ્કાર (4). ઉત્તેજક પુરસ્કારની પ્રતિક્રિયામાં વિપરીત, ઉત્તેજક ઉત્તેજના પ્રત્યેની તેમની પ્રતિક્રિયાઓ હોમોલોજિકથી ઘણી દૂર છે; એટલે કે, કેટલાક ડી.એન. ન્યુરોન્સ વિપરિત ઉત્તેજનાની પ્રતિક્રિયામાં સક્રિય થાય છે, જ્યારે મોટાભાગના અન્ય લોકો તેમના ગોળીબારમાં દબાવીને પ્રતિક્રિયા આપે છે. (5-9). હકીકતમાં, તાજેતરના અભ્યાસોએ જાહેર કર્યું છે કે જીએએએએએર્ગેજિક ન્યુરોનની ઓપ્ટોજેનેટિક સક્રિયકરણ અને ડી.એન. ન્યુરોન્સના પરિણામસ્વરૂપ નિષ્ક્રિયકરણને પુરસ્કારના વપરાશને દબાવી દે છે અને પ્રતિકૂળ પ્રતિભાવને પ્રેરિત કરે છે (10, 11). જો કે, તે મોટાભાગે વંચિત રહ્યું છે કારણ કે વીએટીએમાં ડીએ ચેતાકોષના નિષ્ક્રિયકરણને પગલે અને નબળા વર્તનને અટકાવવા તરફ અને વર્તણૂંક વર્તણૂંકને પ્રેરિત કરવા માટે વર્તણૂકીય પ્રતિસાદોને કેવી રીતે નિયંત્રિત કરવામાં આવે છે તેનાથી વિપરિત શીખવાની પ્રાપ્તિ માટે ન્યુરલ સર્કિટ્સમાં કઈ પદ્ધતિઓ આવશ્યક છે.
સંચિત પુરાવાઓએ જાહેર કર્યું છે કે હકારાત્મક અને નકારાત્મક ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં પ્રેરણાત્મક અને જ્ઞાનાત્મક શિક્ષણ મોટા ભાગે નસલ સર્કિટ્સ દ્વારા નિયમન કરવામાં આવે છે જેમાં બેસલ ગેંગલિયા (12), જે મિડબ્રેનથી ડોપામાર્જિક પ્રક્ષેપણની મોટી માત્રા પ્રાપ્ત કરે છે. સ્ટ્રાઇટમમાં, બે મૂળભૂત ન્યુરલ સર્કિટ્સ સ્પષ્ટ મધ્યમ કદના સ્પાઇની ન્યુરોન્સ (એમએસએન) દ્વારા રચવામાં આવે છે, પ્રત્યેક અલગ પ્રકારનું ડીએ રીસેપ્ટર (13).
- એક સર્કિટ સીધો રસ્તો છે, જેમાં એમએસએન સીધી રીતે બાસલ ગેંગ્લિયાના આઉટપુટ ન્યુક્લી, પ્રોજેઆ નિગ્રા પાર્સ રેટિક્યુલાટા (એસએનઆર), અને મુખ્યત્વે ડોપામાઇન ડીએક્સટીએક્સએક્સ રીસેપ્ટર્સ (D1Rs) દર્શાવતા હોય છે,.
- બીજું તે પરોક્ષ માર્ગ છે, જેમાં એમએસએનનો સમાવેશ થાય છે કે જે પરોક્ષ રીતે ગ્લોબસ પૅલિડસ દ્વારા SNr અને મુખ્યત્વે એક્સપ્રેસ ડોપામાઇન D2 રીસેપ્ટર્સ (D2Rs) દ્વારા પ્રોજેક્ટ કરે છે.
મિડબ્રેનથી ડીએ સંકેતો D1Rs અને D2Rs દ્વારા વિપરીત રીતે આ બંને સમાંતર માર્ગોને ગતિશીલ રીતે મોડ્યુલેટ કરે છે અને આ મોડ્યુલેશન પ્રેરણાત્મક શિક્ષણને સરળ બનાવવા માટે માનવામાં આવે છે (3, 14).
- લાભદાયી ઉત્તેજના માટે, લાભદાયી સંકેતો દ્વારા પ્રેરિત અપગ્રેડેડ ડીએ (DA) સ્તરો ડીએક્સએનએક્સએક્સઆરને સક્રિય કરવા માટે માનવામાં આવે છે અને આમ મુખ્યત્વે ન્યુક્લિયસ એસેમ્બન્સ (એનએસી) માં સીધો માર્ગ સરળ બનાવે છે..
- બીજી બાજુ, વિપરીત ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં ડી.એન. ન્યુરોન ગોળીબારના દમનથી એનએસીમાં ડીએ સ્તરમાં ઘટાડો થાય છે; અને આ પ્રતિક્રિયા સક્રિય D2Rs દ્વારા પરોક્ષ પાથવેમાં સિગ્નલ ટ્રાન્સમિશનને ખાસ પ્રોત્સાહન આપવાનું માનવામાં આવે છે.
જોકે ફાર્માકોલોજિકલ વ્યૂહરચનાઓ અને રીવર્સિબલ ન્યુરોટ્રાન્સમિશન બ્લૉકીંગ (આરએનબી) પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને અભ્યાસોએ એનએસીમાં નિયમનની આ પદ્ધતિને ટેકો આપ્યો છે (15, 16), તે અજાણ્યા માર્ગની પ્રવૃત્તિને પ્રોત્સાહન આપવા માટે અને ત્યારબાદ અવગણના વર્તનને પ્રેરિત કરવા માટે ડીએન ન્યુરોન ફાયરિંગનું દમન પૂરતું છે કે કેમ તે અજ્ઞાત રહ્યું છે. આ વર્તમાન અભ્યાસમાં, અમે આ સમસ્યાને વીએટીએમાં પસંદગીયુક્ત નિષ્ક્રિય ડીએન ન્યુરોન્સ દ્વારા નિષ્ક્રિય કરીને સંક્ષિપ્તમાં કલા-હાઇપરપોલરાઇઝિંગ આર્ક પ્રોટીન (મેપ્રેન-હાયપરપોલ્રાઇઝાઇઝિંગ આર્ક પ્રોટીન)17) અને સ્પષ્ટ રીતે દર્શાવ્યું હતું કે વીટીએમાં ડીએ ચેતાકોષોના દમનને પરિણામે એનએસીમાં ડીએના સ્તરોમાં ઘટાડો થયો છે અને પ્રતિકૂળ પ્રતિક્રિયા અને શીખવાની પ્રેરણા મળી છે. આ ઉપરાંત, અમે આ પ્રતિક્રિયાના નિયમનની પદ્ધતિઓની તપાસ કરી અને જાહેર કર્યું કે આ પ્રતિકૂળ પ્રતિક્રિયા ખાસ કરીને એનએસીમાં ડીએક્સએનએક્સએક્સઆર દ્વારા નિયંત્રિત કરવામાં આવી હતી.
પરિણામો
ડીએન ન્યુરોન્સ બ્લોક્સની ડાટો-રૂમ પસંદગીની ઓપ્ટોજેનેટિક નિષ્ક્રિયતા.
ડી.એન. ચેતાકોષના ફિરિંગ્સને નિષ્ક્રિય કરવા માટે, અમે ક્રાઇ-ઇન્સ્યુસિબલ એડિનો-સંકળાયેલ વાયરલ રચના એન્કોડિંગને આર્ક-ઇજીએફપી [એએવી-ડબલ-ફ્લોક્સ્ડ ઇન્વર્ટેડ ઓપન રીડિંગ ફ્રેમ (ડીઆઈઓ) -આર્ચ] દાખલ કર્યું છે.17) પુખ્ત ટાયરોસિન હાઇડ્રોક્સાઇલેસ (TH) - ક્રે ઉંદર (વી)18) અને વાઇલ્ડ-ટાઇપ (ડબ્લ્યુટી) કર્કરોગ કરનાર અને વીટીએ ઉપર ઓપ્ટિકલ ફાઇબર મૂકવામાં આવ્યા હતા (ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ A અને C). શસ્ત્રક્રિયા પછી બે અઠવાડિયા, વીએટીએમાં આર્કી-ઇજીએફપીને સીમિત રીતે શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું (ફિગર એસએક્સએનટીએક્સB). અમે ઇલેક્ટ્રોફિઝિઓલોજિકલ રેકોર્ડિંગ દ્વારા આર્ક પ્રોટીનની હાઇપરપોલરાઇઝિંગ અસરનું પરીક્ષણ કર્યું છે અને એએવી-ડીઆઈઓ-આર્ક સાથે ઇન્જેક્ટેડ TH-Cre ઉંદરના વીટીએના ઓપ્ટીકલ ઉત્તેજનાની અસરને માપવામાં આવી છે. એનેસ્થેટીઝ્ડ TH-Cre ઉંદરના વીએટીએ (VTA) ના ઇલેક્ટ્રોફિઝિયોલોજિકલ રેકોર્ડિંગ્સમાં જાહેર કરવામાં આવ્યું છે કે પટ્ટાત્મક ડી.એન. ચેતાકોષોની ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના તેમના ગોળીબારમાં અવરોધિત છે.ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ), સૂચવે છે કે ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજનાએ આર્ક-વ્યક્ત કરતી ડીએ કોશિકાઓની કલા વીજસ્થિતિમાનને પર્યાપ્ત રીતે હાઇપરપોલરાઇઝ્ડ કર્યું છે અને આમ તેમના સ્વયંસંચાલિત ફાયરિંગને અટકાવી દીધું છે.
આ ઉંદરનો ઉપયોગ કરીને, અમે પછીથી તપાસ કરી હતી કે વીટીએમાં ડી.એન. ચેતાકોષોની ઓપ્ટિકલ નિષ્ક્રિયતા વર્તણૂકલક્ષી શીખવાની પ્રતિકૂળ સંકેત તરીકે કામ કરી શકે છે. ઉંદરને ઘેરા વાતાવરણને પસંદ કરવા માટે જન્મજાત વલણ ધરાવે છે (19). અમે વર્તણૂંક સાધન બનાવ્યું છે જેમાં ઉંદર અંધારાના રૂમને ખુલ્લી રીતે શોધી શકે છે અને તેજસ્વી જગ્યા ખુલ્લી કરી શકે છે (ફિગ 1A). વસવાટ પછી, ડબલ્યુટી (PT) ઉંદર ડાર્ક ઓરડામાં ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના સાથે અથવા તેના વગર કાળી રૂમમાં પ્રાધાન્યયુક્ત રહી.ફિગર એસએક્સએનટીએક્સD), તેની ખાતરી કરવી કે ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજનાનું તેમના ડાર્ક-રૂમ-પ્રેફરિંગ વર્તન પર કોઈ પ્રભાવ નથી. અમે તેમના વર્તન પર ડી.એન. ન્યુરોન્સના ઓપ્ટિકલ નિષ્ક્રિયકરણની અસર ચકાસવા માટે પ્રાણીઓના વર્તણૂકલક્ષી પ્રયોગનું નિર્ધારણ કર્યું છે (ફિગર એસએક્સએનટીએક્સE). વસવાટ અને પ્રચંડ પછી, જ્યારે તેઓ ડાર્ક રૂમમાં હતા ત્યારે વીટીએમાં ડીએન ચેતાકોષોને ઉત્તેજક રીતે ઉત્તેજિત કરીને ઉંદરને શરત આપવામાં આવી હતી. કન્ડીશનીંગના પહેલા 5 મિનિટ દરમિયાન પણ, થ-ક્રાઈસ ઉંદર અગાઉ પસંદ કરેલા ઘેરા રૂમમાંથી બહાર રહ્યો હતો અને સતત કન્ડીશનીંગ દરમિયાન ઘેરા રૂમને ટાળ્યો હતો (ફિગ 1B). થા-ક્રાઈસ ઉંદરએ અંધારાના રૂમની સામે તેમની અવગણનાને ઉલટાવી ન હતી, પછી ભલે તેઓ પોસ્ટટેસ્ટમાં કોઈ ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના મેળવી શક્યા ન હતા (ફિગ 1C). આ ડેટા સૂચવે છે કે ડી.એન. ન્યુરોન્સના હાઇપરપોલરાઇઝેશનથી માત્ર ક્ષણિક પ્રતિકૂળ વર્તણૂંકને જ પ્રેરણા મળી નથી, પણ તે ડાર્ક રૂમ સામે વિવેકી શીખવાની સિગ્નલ તરીકે પણ સેવા આપે છે અને તે પણ દર્શાવે છે કે ડી.એન. ચેતાકોષના નિષ્ક્રિયકરણમાં ક્ષણિક વર્તણૂંક વર્તણૂંક અને લાંબા સમય સુધી વિખરાયેલા અભ્યાસમાં એક મહત્વની ભૂમિકા ભજવી હતી.
એનએસીમાં ડીએ લેવલની ઓપ્ટોજેનેટિક ડાઉન-રેગ્યુલેશન.
અમે આગલી તપાસ કરી હતી કે વીટીએમાં ડીએન ન્યુરોન્સને નિષ્ક્રિય કરવાથી વાસ્તવમાં તેના મુખ્ય લક્ષ્યાંક ક્ષેત્ર, એનએસીમાં ડીએના એકાગ્રતામાં ફેરફાર થયો છે. અમે એન.એચ.સી. માં ફાસ્ટ-સ્કેન સાયક્લિક વોલ્ટેમેમેટ્રી (એફએસસીવી) દ્વારા એનએસીમાં ડી.એચ. સ્તરને માપ્યાં હતાં, જે એએચવી-ડીઆઈઓ-આર્ક સાથે તેમના વીટીએમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. એનએસીમાં ડીએ (DA) સ્તરોને વીટીએ (વીટીએ) ના વિદ્યુત ઉત્તેજના દ્વારા તાત્કાલિક ઉન્નત કરવામાં આવ્યા હતા અને વીએટીએના એક સાથે ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના દ્વારા વિકસિત ડી.એ.ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ). અમે પછી પરીક્ષણ કર્યું કે શું વીએટીએના ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના એનએસીમાં ટૉનિક ડીએ સ્તરને ઘટાડી શકે છે. સમાન પ્રાયોગિક સેટિંગ્સમાં, અમે નોંધ્યું છે કે એનએસીમાં ડીએ (DA) સ્તરને વીટીએ (OTA) ના ઓપ્ટીકલ ઉત્તેજનાના 20 ઓ દ્વારા ધીરે ધીરે ઘટાડો થયો હતો (ફિગ 2), જે ઉશ્કેરણીજનક ઉત્તેજના સામે અહેવાલ એફએસસીવી પ્રતિક્રિયા સાથે સુસંગત છે (20). આ ડેટા દર્શાવે છે કે વીએટીએનું ઑપ્ટિકલ ઉત્તેજન વીએટીએ ડીએન ન્યુરોન્સને નિષ્ક્રિય કરવા અને વર્તણૂક પ્રયોગ દરમિયાન એનએસીમાં ડીએ સ્તરને ઘટાડવા માટે અસરકારક હતું.
વીટીએમાં ડી.એ. ન્યુરોન્સના ઓપ્ટિકલ નિષ્ક્રિયકરણ દ્વારા ફૉસ જીન એક્સપ્રેશનનું અપ-રેગ્યુલેશન.
વીએટીએમાં ડી.એન. ચેતાકોષના કન્ડીશનીંગ નિષ્ક્રિયતાને કારણે વર્તણૂંક ફેરફાર દ્વારા સૂચવવામાં આવ્યું છે કે ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના સીધા જ ન્યુરલ પ્રવૃત્તિમાં ફેરફાર કરે છે અને તેના પરિણામે વર્તણૂકીય કામગીરીમાં ફેરફાર થયો છે. તેથી અમે પછીના વિસ્તારોની તપાસ કરી જેમાં નૌકા પ્રક્રિયાને તાત્કાલિક પ્રારંભિક જનીન, ફોસની અભિવ્યક્તિની તપાસ કરીને ડી.એન. ચેતાકોષોની શરત નિષ્ક્રિયતા દ્વારા ઉન્નત કરવામાં આવી. કન્ડીશનીંગ પરીક્ષણોમાં કન્ડીશનીંગ કરવામાં આવ્યું તે પછી તરત, ઉંદર હાઈબ્રીડાઇઝેશન વિશ્લેષણમાં જથ્થાત્મક દ્વારા ફૉસ અભિવ્યક્તિની માત્રા નક્કી કરવા માટે ઉંદરને ઝડપથી પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી (ફિગ 3 અને ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ). એનએસી, વીએટીએ (DTA) ના મોટા પ્રમાણમાં ડોપામિનેર્જિક પ્રોજેક્શન્સ મેળવે તે પ્રદેશ, TH-Cre ઉંદરમાં નોંધપાત્ર રીતે વધેલી ફૉસ અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે (ફિગ 3). આ અપ-નિયમન ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજનાના વિરોધી બાજુમાં પણ શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું, જે માનવામાં આવે છે કે તે બાજુમાં નાના પ્રમાણમાં વાયરસ ચેપ થયો હતો. જો કે, ઓપ્ટિકલ સ્ટીમ્યુલેશનના વિરોધાભાસી બાજુની સરખામણીમાં અપ્સિગ્યુલેશન બહુ ઊંચું હતું, સૂચવે છે કે ડીએન ન્યુરોન્સના ઓપ્ટિકલ નિષ્ક્રિયકરણને એનએસીના ન્યુરલ પ્રવૃત્તિ પ્રત્યે સીધા જ નિયંત્રિત કરવામાં આવે છે. વધેલા ફોસ અભિવ્યક્તિને અન્ય મગજ ક્ષેત્રોમાં પણ જોવા મળ્યું હતું જેમાં સ્ટ્રેટમના સેપ્ટમ, પેરીવેન્ટ્રિક્યુલર પ્રદેશો, બેસોલેટલ એમીગડાલા (બીએલએ), અને લેટરલ હાયપોથાલમસ, પણ પાછળના હાબેન્યુલા અથવા મેડીઅલ પ્રીફ્રન્ટલ કોર્ટેક્સ (એમપીએફસી; ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ). આ પરિણામો સૂચવે છે કે ડી.એન. ચેતાકોષોની ઓપ્ટિકલ નિષ્ક્રિયતા દ્વારા સક્રિય પ્રદેશો વીએટીએ ડીએન ન્યુરોન્સના સીધી લક્ષિત પ્રદેશો સુધી મર્યાદિત નથી, પરંતુ તે વિસ્તારોમાં સમાવેશ થાય છે જે ન્યુરલ સર્કિટ-આશ્રિત રીતે પરોક્ષ રીતે સક્રિય થઈ શકે છે. આ નિરીક્ષણ સૂચવે છે કે ડીએન ન્યુરોન્સના ઓપ્ટિકલ નિષ્ક્રિયકરણથી સર્કિટ-વાયર ન્યુરોનલ પ્રવૃત્તિમાં ફેરફાર થયો છે અને તે માત્ર પ્રતિકૂળ પ્રતિક્રિયા પેદા કરી શકશે નહીં પરંતુ ચિંતા, ડર અને તાણના જવાબો જેવા અન્ય મગજ કાર્યોને પણ ટ્રિગર કરશે (21).
ડીએક્સટીએક્સએક્સઆર દ્વારા ડીએ સિગ્નલિંગ ઑપ્ટોજેનેટલીલી ઇન્ડ્યુસ્ડ કંડિશન પ્લેસ એવર્સન માટે ક્રિટિકલ છે.
વીએટીએમાંથી મોટાભાગના ડોપામિનેર્ગિક સિગ્નલ્સને એનએસીમાં એમએનએમાં ડીએ રિસેપ્ટર, ડીએક્સટીએક્સએક્સઆર અને ડીએક્સટીએક્સએક્સ દ્વારા પ્રસારિત કરવામાં આવે છે. ડીએક્સટીએક્સએક્સઆર એ પદાર્થ પી (એક્સએક્સએક્સએક્સએક્સ જીન દ્વારા કોડેડ કરેલા) - એક્સપ્રેસિંગ એમએસએનમાં લગભગ એક્સક્લુઝિવ રીતે વ્યક્ત થાય છે, અને D1R મુખ્યત્વે એન્કેફાલિન (પેનક જીન દ્વારા કોડેડ) માં એક્સપ્રેસ કરે છે - એમએસએન એક્સપ્રેસ કરતી વખતે; દરેક પ્રકારના એમએસએન અનુક્રમે સીધા અને પરોક્ષ માર્ગો બનાવે છે, જે એનએસીમાં (અનુક્રમે)3). D2R (μM ઑર્ડર) કરતાં DA ની XXXR (NM ઑર્ડર) માટે DA ની લાગણી ઘણી વધારે છે.22, 23), ડીએના સ્તરોમાં ઘટાડો જીના નિષ્ક્રિયકરણમાં પરિણમે છેi-ડેપ્લડ D2R પરંતુ D1R પર કોઈ પ્રશંસનીય અસર નથી (3, 24), આથી ચેતાતંત્રની પ્રવૃત્તિને ખાસ કરીને પરોક્ષ માર્ગમાં અપ-નિયમન કરે છે. તદુપરાંત, પેસ - અથવા ડીએક્સએક્સ્યુએનએક્સ (D2R) -એક્સપ્રેસિંગ કોષોમાં પેક - અથવા ડીએક્સએક્સએનએક્સએક્સ (D2R) - એક્સ્પ્રેસિંગ કોષો કરતાં ફોસ સક્રિયકરણ વધુ મહત્ત્વપૂર્ણ રીતે જોવા મળ્યું હતું (ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ). આ અવલોકનોના આધારે, અમે અનુમાન કર્યો હતો કે ડીએક્સ્યુએનએક્સએક્સઆર દ્વારા ડીએ સંકેત આપેલ અવલોકનક્ષમ કન્ડીશનીંગમાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવી શકે છે.
આ પૂર્વધારણાને ચકાસવા માટે, અમે ત્રણ-ચેમ્બર કન્ડીશન પ્લેસ એવર્સન (સીપીએ) પરીક્ષણ કર્યું હતું (ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ). અમે એક વર્તણૂકલક્ષી સાધન તૈયાર કર્યું જેમાં વર્ચ્યુઅલ સમાન સંજોગો અને એક નાનો કોરિડોર ધરાવતો બે ચેમ્બર છે. સીપીએ પરીક્ષણમાં આ નિષ્પક્ષ વાતાવરણની સ્થિતિએ અમને ચકાસ્યું કે વીટીએ ડીએન ન્યુરોન્સની નિષ્ક્રિયતા ડાર્ક રૂમ પસંદગીને અવરોધિત કરવા ઉપરાંત પ્રતિકૂળ પ્રતિક્રિયા અને શીખવાની પ્રેરણા આપે છે. જ્યારે પ્રાણીઓને સમગ્ર તંત્રની આસપાસ મુક્ત રીતે ફરવા જવાની છૂટ આપવામાં આવી ત્યારે મોટાભાગના લોકો બે ભાગમાં રોકાયા અને કોઈ પણ સામાન્ય વર્તન વિનાના તફાવતો વિના. ઓપ્ટિકલ કન્ડીશનીંગ પછી એક નિયત ચેમ્બર સાથે ઓપ્ટીકલ ઉત્તેજના જોડી બનાવીને રજૂ કરવામાં આવી હતી. કન્ડીશનીંગ માટે જ્યારે કોઈ પણ ચેમ્બરનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો ત્યારે પણ, ટી-ક્રાઈસ ઉંદર સતત અને નોંધપાત્ર રીતે કન્ડીશનીંગ અને પોસ્ટસ્ટેસ્ટ દરમિયાન ઓપ્ટિકલી કંડિશન કરેલ ચેમ્બરમાં રહેવાથી ટાળ્યું હતું (ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ B-E). સ્ટેટિસ્ટિકલ એનાલિસિસે ડબલ્યુટી ઉંદર (યુ.એસ.ટી.) માટે રહેતા સમયની તુલનામાં પોસ્ટટેસ્ટમાં ઓપ્ટિકલી કંડિશન કરેલ ચેમ્બરમાં ટી-ક્રાઈસ ઉંદરના સમયના સમયમાં નોંધપાત્ર ઘટાડાને માન્ય કરી હતી.ફિગર એસએક્સએનટીએક્સF).
ત્યારબાદ અમે એનએસીમાંના દરેક ડીએ રીસેપ્ટર્સને દબાવીને આ આક્રમક વર્તણૂંકમાં શામેલ ડીએ રીસેપ્ટર પેટા પ્રકારોનો ઉલ્લેખ કરવાનો પ્રયાસ કર્યો (ફિગ 4 અને ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ). અમે લેન્ચિવિરલ વેક્ટર્સને ડિઝાઇન અને માન્ય કર્યું છે જેમાં ટૂંકા વાળના આરએનએ (શીએનએનએ) શામેલ છે જે દરેક ડીએ રીસેપ્ટર માટે વિશિષ્ટ અભિવ્યક્તિ સાથે એમચેરી અભિવ્યક્ત કરે છે. એનએસીમાં લેન્ટિવાયરસને ઇન્જેક કર્યાના ત્રણ અઠવાડિયા પછી, એમએચેરીની મજબુત અભિવ્યક્તિ એનએસીમાં સ્થાનિકીકૃત કરવામાં આવી હતી (ફિગ 4B). પ્રત્યેક રીસેપ્ટરની એમઆરએનએ અભિવ્યક્તિની અસરકારક નોકડાઉન જથ્થાત્મક રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર વિશ્લેષણ (ફિગ. એસએક્સ્યુએનએક્સએક્સ) દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.A). વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા પ્રોટીન સ્તરોને માપવાથી એ પણ જાણવા મળ્યું છે કે દરેક લેન્ટિવાયરસના ઇન્જેક્શનએ તેના લક્ષ્ય પ્રોટીન ઉત્પાદનને ઘટાડીને ડીએ રીસેપ્ટરના અન્ય પેટા પ્રકારની અભિવ્યક્તિને અસર કર્યા વગર ઘટાડી દીધી છે.ફિગ 4C અને ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ B-G). ShD1R- અને shD2R-expressing લેન્ટિવાયરસસે નિયંત્રણ લક્ષ્ય માટેના સ્તરની તુલનામાં અનુક્રમે, તેમના લક્ષ્ય પ્રોટીન સ્તરને 46.2 ± 1.1% અને 38.4 ± 4.9% સુધી ઘટાડ્યા છે.ફિગ 4C). આ પરિણામોએ ચકાસો કે D1R અને D2R માટે વિશિષ્ટ SHRNA દર્શાવતા લેન્ટિવાયરલ વેક્ટર્સ પસંદગીયુક્ત અને પૂરતા પ્રમાણમાં તેમના લક્ષ્યાંક આરએનએને દબાવ્યા છે અને સંબંધિત પ્રોટીન ઉત્પાદનોની ઓછી નિયમન કરે છે. અમે એ પણ પુષ્ટિ આપી છે કે વીટીએમાં મૅચેરીની વાઇરસ-મધ્યસ્થીની અભિવ્યક્તિ મળી નથી, લેન્ટિવાયરસ-મધ્યસ્થી શઆરએનએ સીધી રીતે વીટીએ પર અસર પાડી હતી તેવી શક્યતાને બાદ કરતાં.
ShRNA સમાવતી આ લેન્ટિવાયરસનો ઉપયોગ કરીને, અમે પરીક્ષણ કર્યું છે કે કયા પ્રકારનાં ડીએ રીસેપ્ટર ડીએ ચેતાકોષના ઓપ્ટોજેનેટિક નિષ્ક્રિયતા દ્વારા પ્રેરિત વક્રોક્તિ વર્તન માટે જવાબદાર હતા. અમે ટીઆરએ (C-Cre) ઉંદરના ડાબા વીએટીએમાં એએવી-ડીઆઈઓ-આર્ક સાથે દ્વિપક્ષીય એનએસીમાં શીએનએનએ ધરાવતી લેન્ટિવાયરસ અથવા નિયંત્રણ લેન્ટિવાયરસને ઇન્જેક્ટ કરી હતી. વીએટીએ ઉપર ઓપ્ટિકલ ફાઈબર પણ શામેલ કરવામાં આવ્યું હતું (ફિગ 4A). સર્જરી પછી ત્રણ અઠવાડિયામાં ત્રણ-ચેમ્બર સી.પી.એ. પરીક્ષણ હાથ ધરવામાં આવ્યું ત્યારે, TH-Cre ઉંદર લેન્ટિ સાથે ઇન્જેક્ટ કરાયું: shD1R-mચેરીએ હજી પણ ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના-જોડાયેલા ચેમ્બર સામે સ્પષ્ટ CPA બતાવ્યું છે જે TH-Cre ઉંદરની સાથે ઇન્જેક્ટેડ છે. નિયંત્રણ લેન્ટિવાયરસ (લેન્ટી: માચેરી). તેનાથી વિપરીત, TH-Cre ઉંદર lenti સાથે ઇન્જેક્ટેડ: shD2R-mચેરી કન્ડીશનીંગ દરમિયાન સ્પષ્ટ CPA બતાવવામાં નિષ્ફળ થયું.ફિગ 4D). TH-CRE ઉંદરની વિશિષ્ટ લર્નિંગ ડેફિસન્ટ લેન્ટી સાથે ઇન્જેક્ટેડ: shd2R-mચેરી પોસ્ટસ્ટેસ્ટ પર વિવેકપૂર્ણ લર્નિંગના વિશ્લેષણ દ્વારા વધુ સમર્થિત કરવામાં આવી હતી (ફિગ 4E). આ પરિણામો દર્શાવે છે કે ડી.એન. ન્યુરોન નિષ્ક્રિયકરણ દ્વારા શરૃ થતા સ્થાન પરના વાંધાજનક વર્તનને ખાસ કરીને D2R દ્વારા વિકસાવવામાં આવ્યું હતું, નહીં કે એનએસીમાં, D1R દ્વારા.
ચર્ચા
સ્ટ્રાઇટમમાં, અભ્યાસોએ જાહેર કર્યું છે કે જીની સક્રિયકરણs-ડેપ્લડ ડીએક્સટીએક્સએક્સ તેના ફાયરિંગની સુવિધા આપે છે, જ્યારે જીની સક્રિયકરણi-ડુપ્લડ D2R દબાવીને ફાયરિંગ કાર્યક્ષમતામાં પરિણમે છે (25). Acડીએ રીસેપ્ટર અભિવ્યક્તિની વિશિષ્ટતાને આધારે, ડી.એન. ચેતાકોષની ફાસિક ફિરિંગ્સ મુખ્યત્વે D1R દ્વારા સીધો માર્ગ સક્રિય કરે છે, જ્યારે ડી.એન. ન્યુરોન ગોળીબારમાં ક્ષણિક ઘટાડો મુખ્યત્વે ડીએક્સટીએક્સએક્સઆર દ્વારા પરોક્ષ પાથવેની સક્ષમતાને પ્રોત્સાહન આપે છે. (3, 26). નિયમનના આ મિકેનિઝમના આધારે, એવું સૂચન કરવામાં આવ્યું છે કે ડીએન ચેતાપ્રેષકોના પ્રતિભાવમાં ન્યૂરન્સને શાંત કરવાની પ્રક્રિયા મુખ્યત્વે પરોક્ષ પાથવે દ્વારા પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે અને તેના પરિણામસ્વરૂપ વર્તનમાં પરિણમે છે. (3). તાજેતરના અભ્યાસોએ બતાવ્યું છે કે પરોક્ષ પાથવેના સિનેપ્ટિક ટ્રાન્સમિશનના અવરોધને ઇલેક્ટ્રિક આંચકા દ્વારા વ્યક્ત કરાયેલી વ્યગ્ર વર્તણૂંકના સંપાદનને અધોગતિ થાય છે (15) અને તે કે આ ક્ષતિ D2R- મધ્યસ્થી સિગ્નલ ટ્રાન્સમિશનના અવરોધથી થાય છે (16). હુંn વધુમાં, પરોક્ષ પાથવેમાં ડીએક્સટીએક્સએક્સઆર-એક્સપ્રેસ કરતી MSNs ના ઓપ્ટોજેનેટિક અપ-રેગ્યુલેશન વર્તણૂકલક્ષી અવગણે છે (27). જો કે, ડીએન ચેતાકોષ ઉલટી ઉત્તેજનાની પ્રતિક્રિયામાં ઉન્નત અને દબાવેલી ગોળીબાર બંને દર્શાવે છે અને અન્ય શૉક-સંબંધિત સંવેદનાત્મક માહિતી મગજમાં એકસાથે પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે, તે હજુ પણ સ્પષ્ટ છે કે ડી.એન. ચેતાકોષને શાંત કરવાની પ્રક્રિયા સીધી પ્રતિક્રિયાશીલ પ્રતિક્રિયા અને શિક્ષણને ટ્રિગર કરી શકે છે, અને શું આ પ્રતિક્રિયા ડીએક્સએનએક્સએક્સઆર-એક્સપ્રેસ એમએસએન દ્વારા પરોક્ષ પાથવેમાં નિયમન થાય છે.
આ અભ્યાસમાં, અમે બે વર્તણૂક પરીક્ષણોમાં ડીએન ન્યુરોન ફિરિંગ્સના ઓપ્ટોજેનેટિક કંટ્રોલનો ઉપયોગ કર્યો હતો: ડાર્ક-રૂમ પ્રેફરન્સ ટેસ્ટ અને ત્રણ-ચેમ્બર સી.પી.એ. પરીક્ષણ. અમારા ઓપ્ટોજેનેટિક મેનીપ્યુલેશનમાં વીએટીએમાં ડી.એન. ન્યુરોન ગોળીબારની કાર્યક્ષમ દમન અને એનએસીમાં ડીએના સ્તરોનું ડાઉન-રેગ્યુલેશન દર્શાવે છે.. ડી.એન. ન્યુરોન ફિરિંગ્સની ચોક્કસ ઓપ્ટોજેનેટિક નિષ્ક્રિયતા માત્ર તે સમયગાળા દરમિયાન જ કે જે કન્ડિશન કરેલા ચેમ્બરમાં રહેતી હતી તે સ્પષ્ટપણે પ્રતિક્રિયાત્મક પ્રતિક્રિયા અને શીખવાની પ્રક્રિયાને ઉદ્ભવે છે, જે દર્શાવે છે કે ક્ષણિક ડીએ સીધી રીતે નિષ્ક્રિય પેસેવ અવ્યવહાર વર્તણૂંકને શાંત કરે છે. આ ઉપરાંત, આ તપાસે સમજાવ્યું છે કે D2R- મધ્યસ્થી સિગ્નલ પ્રોસેસિંગ આ પ્રતિકૂળ પ્રતિક્રિયા અને શીખવાની પ્રેરણા માટેનું મુખ્ય નિર્ણાયક છે.
તેમ છતાં, અમારા ડેટાએ દર્શાવ્યું હતું કે ડીએક્સટીએક્સએઆરએ CPA વિકસાવવા માટે વર્તણૂકલક્ષી પ્રયોગો પર કોઈ અસર કરી નથી, ઘણા અભ્યાસોએ દસ્તાવેજીકૃત કર્યું છે કે ડીએન ચેતાકોષોની ફાસિક ફાયરિંગ ડર પ્રતિસાદો અને વિવેકપૂર્ણ શિક્ષણ માટે જરૂરી છે (28, 29). આ તફાવત પ્રાયોગિક સેટિંગને કારણે છે; એટલે કે, અમારા ઓપ્ટોજેનિક અભિગમ સક્રિય ડીએન ન્યુરોન્સ દ્વારા સિગ્નલિંગની શક્યતાને વ્યસ્ત વર્તણૂક ઉઠાવવા માટે બાકાત રાખતા હતા, જે સૂચવે છે કે ડીએન ન્યુરોન્સ નિષ્ક્રિય વર્તન અને શીખવાની પ્રેરણા માટે પૂરતી હતી. વિવેચક ઉત્તેજના દ્વારા ઉદ્ભવેલા સક્રિય ડીએ ફાયરિંગના કાર્ય અને સિગ્નલ પ્રોસેસિંગને અહીં અભ્યાસ કરનારા લોકોના વિવેચક વર્તણૂકોમાં ભિન્ન યોગદાન હશે અને ભવિષ્યમાં સ્પષ્ટ કરવામાં આવશ્યક છે.
ડીએન ચેતાકોષ એમપીએફસી, એમિગડાલા અને હિપ્પોકેમ્પસ સહિતના અન્ય વિવિધ પ્રદેશો માટે પણ પ્રોજેક્ટ કરે છે. એક તાજેતરના અભ્યાસ સૂચવે છે કે વીએટીએમાં ડીએન ન્યુરોન્સને પ્રોજેક્ટેડ લેટેબલ હાબેન્યુલા ચેતાકોષના ઓપ્ટોજેનેટિક સક્રિયકરણ, વ્યુત્પન્ન વર્તણૂંકને પ્રેરિત કરવામાં સક્ષમ છે અને આ ડીએન ન્યુરોન્સ મુખ્યત્વે અને ખાસ કરીને એમપીએફસીને લક્ષ્યાંક બનાવે છે. (30), તેમ છતાં તેમના ઓપ્ટોજેનેટિક કન્ડીશનીંગ તેના વર્તમાન અભ્યાસમાં તે કરતા જુદું હતું, કારણ કે તેમની ઓપ્ટોજેનેટિક ઉત્તેજના સંપૂર્ણ કન્ડીશનીંગ સત્ર માટે લાંબી હતી. કારણ કે એમ.પી.એફ.સી. માટે ડોપામિનેર્જિક ઇનપુટ માત્ર વિપુલ ઉત્તેજના દ્વારા જ નહીં પણ ક્રોનિક સ્ટ્રેસ દ્વારા પણ સક્રિય કરવામાં આવે છે.31, 32), એમ શક્ય છે કે એમપીએફસી-પ્રોજેક્ટીંગ ડીએન ચેતાકોષના સતત સક્રિયકરણને અત્યંત તાણવાળા વાતાવરણમાંથી સંકેતો તરીકે જોવામાં આવશે; અને, તાણપૂર્ણ કન્ડીશનીંગના સંચયના પરિણામ રૂપે, પ્રાણીઓ કન્ડિશન કરેલ ચેમ્બરમાં વ્યગ્ર વર્તન બતાવશે. તેનાથી વિપરીત, અમે ફક્ત ડીએન ચેતાકોષોના ફાયરિંગને અટકાવી દીધા હતા જ્યારે પ્રાણીઓ કન્ડીશનીંગ ચેમ્બરમાં હતા. સમય-મેળ ખાતા કન્ડીશનીંગનો ઉપયોગ કરીને અમારા વર્તણૂકલક્ષી પ્રયોગોના પરિણામો સૂચવે છે કે ડીએ સંકેતને અચાનક દમન એ અચાનક અપ્રિય ઇનપુટ તરીકે જોવામાં આવશે, જેના પરિણામે તેમના ઝડપી પ્રતિકૂળ પ્રતિસાદમાં પરિણમ્યું.
ડી.એન. ચેતાકોષો એમીગડાલાને પણ પ્રદાન કરે છે, તે પ્રદેશ જે મોટાભાગે ભયની પ્રતિક્રિયામાં ફાળો આપે છે. ખરેખર, અમિગડાલાને સંકેત આપતા ડીએ ડરની પ્રતિક્રિયા અને ડર મેમરીમાં હસ્તગત કરવામાં આવ્યું છે (33, 34). અમારા અભ્યાસમાં, વીટીએમાં ડી.એન. ચેતાકોષોને લેબલ કરવાથી બીએએલ તરફ નજર રાખતા ડી.એન. ચેતાકોષોનો સમૂહ ઓળખાયો હતો, પરંતુ આ અંદાજોની મર્યાદા એનએસી તરફ પ્રસ્તાવ કરતાં ઓછી હતી. જો કે અમે અમારા અવ્યવસ્થિત વર્તણૂંક વર્તન પર એમિગ્ડાલા-પ્રકલ્પિત ડીએ સંકેતલિપીની સૂક્ષ્મ અસરને બાકાત કરી શકીએ નહીં, પણ ડીએન ન્યુરોન્સના અમારા ઑપ્ટોજેનેટિક નિષ્ક્રિયકરણની મુખ્ય અસર એનએસી પર હોવી જોઈએ, કારણ કે એનએસીમાં ડીએક્સટીએક્સએક્સઆરના વિશિષ્ટ નોકડાઉન સાથેના અમારા પ્રયોગો નાટકીય રીતે ઘટાડો થયો છે. આક્રમક વર્તન. લક્ષ્ય-વિશિષ્ટ ડીએ સિગ્નલિંગને સંબોધિત ભવિષ્યની તપાસમાં ડીએન ન્યુરોન્સના સર્કિટ-વાઇડ ફેરફારની અસરને ઉત્તેજક ઉત્તેજના અને ડર કન્ડીશનીંગ પર અસર કરવાની જરૂર છે.
સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ
વિષયો.
ટાયરોસિન હાઈડ્રોક્સાઇલેસ :: આઇઆરએસએસ-ક્રાઇ (TH-Cre) નોક-ઇન ઉંદર (ઇએમ: 00254) (18) યુરોપિયન માઉસ મ્યુટન્ટ આર્કાઇવમાંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા. બધા પ્રાયોગિક પ્રાણીઓને 57 પેઢીઓ કરતા વધુ સમય માટે C6BL / 10J સ્ટ્રેઇનમાં પાછું ખેંચવામાં આવ્યું હતું. ઉંદરને C57BL / 6J WT ઉંદર સાથે જોડવામાં આવ્યું હતું અને પ્રમાણભૂત 12-H પ્રકાશ / 12-h શ્યામ ચક્ર સાથે રાખવામાં આવ્યું હતું અને ખોરાક અને પાણીની જાહેરાત લિબિટમ આપવામાં આવી હતી. ક્રે+ અને ક્રે- પ્રયોગો માટે એક જ લીટર (3-6 મો ઉંમર) ની ઉંદરનો ઉપયોગ કરવામાં આવતો હતો. પ્રાણી પ્રયોગોના માર્ગદર્શિકા હેઠળ ઓસાકા બાયોસાયન્સ ઇન્સ્ટિટ્યુટની પ્રાણી સમિતિ દ્વારા તમામ પ્રાણી પ્રયોગોને મંજૂરી આપવામાં આવી હતી.
વર્તણૂકલક્ષી ટેસ્ટ.
તમામ વર્તણૂકલક્ષી પરીક્ષણો દરમિયાન, ઉંદર ઓપ્ટિકલ ફાઇબર સાથે જોડાયેલા હતા અને સમગ્ર ઉપકરણની ફરતે ખસેડવાની મંજૂરી આપી હતી. ઉંદરના ચળવળની દેખરેખ રાખવામાં આવી હતી જેથી તેઓ તેમના માથા પર ઓપ્ટિકલ ફાઈબર સાથે જોડાયેલા હોય ત્યાં સુધી તેઓ કોઈપણ અવરોધો વિના ફરતે ખસેડી શકે. વર્તણૂકલક્ષી ઉપકરણ પર નિલંબિત વિડિઓ કૅમેરા દ્વારા માઉસની સ્થિતિ શોધી કાઢવામાં આવી હતી અને લેબવ્યૂ સૉફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને કસ્ટમ-બનાવેલ પ્રોગ્રામ દ્વારા તેનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
ડાર્ક રૂમ પસંદગી પરીક્ષણ.
પરીક્ષણમાં ઉપયોગમાં લેવાયેલી કસ્ટમ રીતભાત વર્તણૂંક સાધન કાળી રૂમ (15 × 9.5 સે.મી.) અને તેજસ્વી ખુલ્લી જગ્યા (15 × 11 સે.મી.) થી બનેલી હતી. શ્યામ ઓરડામાં દિવાલો, એક માળ અને છત હતી, જે બધા કાળા રંગમાં હતા અને ખુલ્લી તેજસ્વી જગ્યામાં પ્રવેશ (4.5 સે.મી. લાંબું) હતું. ખુલ્લી તેજસ્વી જગ્યા એલિપ્સ જેવી આકારની હતી અને તેની છત વિના મેટલ ગ્રિડ ફ્લોર અને સ્પષ્ટ દિવાલો હતી. પરીક્ષણ પહેલાં, બધા ઉંદરો ઉપકરણમાં 10 મિનિટ માટે વસવાટ કરતા હતા. આ પરીક્ષણમાં ત્રણ સત્રોનો સમાવેશ થતો હતો: દિવસના પ્રારંભિક અર્ધ ભાગમાં 1 (સૌથી વધુ: 5 મિનિટ), ઉંદરને સમગ્ર ઉપકરણની શોધ કરવાની મંજૂરી આપવામાં આવી હતી. દિવસના અંતના અર્ધા ભાગથી 1 થી 4 (કન્ડીશનીંગ: કુલ 35 મિનિટ), ઉંદરને અંધારાના રૂમમાં રોકાયા ત્યારે ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના પ્રાપ્ત થઈ. દિવસે 5 પર, ડાર્ક રૂમની પસંદગીઓને ઑપ્ટિકલ ઉત્તેજના વિના ચકાસવામાં આવી હતી (પોસ્ટટેસ્ટ: 5 min; ફિગર એસએક્સએનટીએક્સE).
થ્રી-ચેમ્બર સી.પી.એ. પરીક્ષણ.
પરીક્ષણમાં ઉપયોગમાં લેવાયેલી કસ્ટમ-કમ્ડ થ્રી-ચેમ્બર કન્ડીશનીંગ પ્લેસ પ્રેફરન્સ / સીપીએ ઉપકરણ બે ચેમ્બર (10 × 17 સેમી) અને કનેક્ટિંગ કોરિડોરથી બનેલું હતું. ટેસ્ટમાં ત્રણ સત્રોનો સમાવેશ થતો હતો. દિવસ 1 (સૌથી વધુ: 15 મિનિટ): ઉંદરને સંપૂર્ણ ઉપકરણને મુક્તપણે અન્વેષણ કરવાની મંજૂરી આપવામાં આવી હતી. ઉંદર જે એક ચેમ્બરમાં 1.5 વખત લાંબા સમય સુધી રહેતો હતો તેના કરતાં પરીક્ષણમાંથી બાકાત રાખવામાં આવતો હતો. દિવસ 2 અને 3 (કન્ડીશનીંગ: 15 મિનિટ દરેક): પ્રકાશને જોડાયેલા ચેમ્બરમાં રહેતાં ઉંદરને ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના પ્રાપ્ત થઈ. લાઇટ-જોડીવાળા ચેમ્બરની પસંદગી અસંતુલિત હતી. દિવસ 4 (પોસ્ટટેસ્ટ: 15 મિનિટ): આ પરીક્ષાની તપાસ એ જ સ્થિતિમાં કરવામાં આવી હતી,ફિગર એસએક્સએનટીએક્સA).
કન્ડીશનીંગ સત્રમાં, 30s માટે ઓપ્ટીકલ ઉત્તેજના બંધ કરવામાં આવી હતી જ્યારે ઉંદર સતત XHXX થી વધારે ડાર્ક રૂમમાં અથવા લાઇટ-જોડીવાળા ચેમ્બરમાં ઓવરહિટિંગ ટાળવા રોક્યો હતો. લેઝર પાવરને તમામ વર્તણૂક પરીક્ષણોમાં ઓપ્ટિકલ ફાઈબરની ટોચ પર આશરે 30 એમડબલ્યુ સુધી નિયંત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.
વિવો ફાસ્ટ-સ્કેન સાયક્લિક વોલ્ટેમેમેટ્રીમાં.
અગાઉના અભ્યાસમાં વર્ણવેલ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને એફએસસીવી પ્રયોગો હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા (35-37). વર્ણવ્યા પ્રમાણે ઉંદરને કેટામાઇન / ઝાયલેઝિન મિશ્રણથી એનેસ્થેસાઇઝ કરવામાં આવ્યું હતું એસઆઈ સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ અને સ્ટીરિઓટેક્સિક ફ્રેમમાં મૂકવામાં આવે છે. આર્ક-એક્સપ્રેસિંગ ડીએ ચેતાકોષ ઉત્તેજીત કરવા માટે વપરાતા ઓપ્ટિકલ ફાઇબર ઉત્તેજક ઇલેક્ટ્રોડની નજીક સ્થિત હતા. ઉત્તેજક ઓપ્ટ્રોઇડ પછી વીટીએ (બ્રીગામા: અગ્રવર્તી-પશ્ચાદવર્તી, -3.2 મીમી; બાજુની, 0.5 મીમી; અને ડોર્સલ-વેન્ટ્રલ, 3.5 એમએમ) માં મૂકવામાં આવી હતી અને 0.25-mm અંતરાલોમાં ઘટાડો થયો હતો. વોલ્ટમૅમેટ્રિક રેકોર્ડિંગ માટે કાર્બન ફાઇબર માઇક્રોઇલેક્ટ્રોડ (લંબાઈમાં 300 μm) નેએએસીમાં ઘટાડવામાં આવ્યું હતું (બ્રેગમાથી: અગ્રવર્તી-પશ્ચાદવર્તી, 1.0 મીમી; બાજુની, 1.0 મીમી અને ડોર્સલ વેન્ટ્રલ, 3.5 એમએમ). ત્રિકોણ વેવફોર્મ (XXXV થી + 100 V થી + 0.4 V થી -1.3 V થી -0.4 V, એજી / એજીસીએલ, 400 V / S પર) કાર્બન ફાઇબર માઇક્રોઇલેક્ટ્રોડને લાગુ કરીને પ્રત્યેક 24 એમએસ બનાવવામાં આવ્યા હતા. વેવફોર્મ એકાંત અને વર્તમાન એમ્પ્લીફિકેશન માટે કસ્ટમ-બનાવટ પોટેન્ટીઓસ્ટેટનો ઉપયોગ કરવામાં આવતો હતો. એક્સએનએક્સ-પલ્સ ઉત્તેજના (100 μA, 5 એમએસ સમયગાળો, 30 Hz) નો ઉપયોગ કરીને ડી.એન. ન્યુરોન્સના ઇલેક્ટ્રિકલ ઉત્તેજના દ્વારા ડીએ રીલીઝ કરવામાં આવ્યું હતું. ડીએન ન્યુરોન્સની ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના (532 એનએમ, ફાઇબર ટીપ પર ~ 5 એમડબ્લ્યુ પાવર) XNTX માટે ઇલેક્ટ્રિકલ ઉત્તેજનાની શરૂઆત પહેલા 10 ની શરૂઆત માટે લાગુ કરવામાં આવી હતી. કાર્બન-ફાઈબર માઇક્રોઇલેક્ટ્રોડ્સને ડીએ (5 μM, 0.2 μM, અને 0.5 μM) ના જાણીતા સાંદ્રતાવાળા સોલ્યુશનમાં માપાંકિત કરવામાં આવ્યા હતા. લેબવ્યુ અને મૅલેબ સૉફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને કસ્ટમ-લૉડેડ પ્રોગ્રામ્સ દ્વારા બધા વોલ્ટેમૅમેટ્રી ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ઓપ્ટિકલ ઉત્તેજના દ્વારા ડીએ (CA) સ્તરોમાં ઘટાડો, મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ સાથે, ડીજે વેવફોર્મ્સ ઇલેક્ટ્રિકલ વીટીએ ઉત્તેજનાથી અલગ ડોપામાઇન સિગ્નલોમાં મેળવીને તેનો ઉપયોગ કરીને ઉકેલવામાં આવ્યો હતો (35, 36).
આંકડાકીય વિશ્લેષણ.
ગ્રાફિકપેડ PRISM 5.0 (ગ્રાફપેડ સૉફ્ટવેર) નો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય વિશ્લેષણ હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. ANOVA પુનરાવર્તિત પગલાંઓ દ્વારા ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યુંફીગ્સ 1B, , 4D,4D, અને ફિગર એસએક્સએનટીએક્સ D અને E) અથવા વન-વે એનોવા (ફીગ્સ 1C, , 3D,3D, 4 C અને E, અને ફીગ્સ S4 K-M, S6F, અને S7A), અને બાદમાં આ બોનફોરોની પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. બધા ગુણ / કૉલમ અને બાર અનુક્રમે સરેરાશ અને ± SEM રજૂ કરે છે.
વાયરસની તૈયારી અને ઇન્જેક્શન, ઇલેક્ટ્રોફિઝિઓલોજિકલ રેકોર્ડિંગ અને ઇમ્યુનોહિયોસાયકેમિકલ અને એમઆરએનએ વિશ્લેષણ સહિતની અન્ય પ્રાયોગિક પ્રક્રિયાઓમાં વિગતવાર વર્ણન કરવામાં આવ્યું છે. એસઆઈ સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ.
સમર્થન
અમે એલ. બોયડેનને આર્ક કન્સ્ટ્રક્શન, આર. મત્સુઇને લેન્ટિવાયરસ ઉત્પાદન અને શુદ્ધિકરણમાં તકનીકી સલાહ માટે અને વાય. હેઆશીને ડેટા વિશ્લેષણના પ્રોગ્રામિંગમાં તકનીકી સલાહ માટે આભાર માન્યો. આ કાર્યને સંશોધન મંત્રાલય, સંસ્કૃતિ, રમતો, વિજ્ઞાન અને સંશોધન મંત્રાલય દ્વારા સંશોધન ગ્રાંટ-ઇન-એઇડ 22220005 (એસએન માટે), 23120011 (SY અને SN માટે), 24700339 (TD પર), અને 25871080 (SY થી) દ્વારા સમર્થન આપવામાં આવ્યું હતું. જાપાનની તકનીકી અને ટેકેડા સાયન્સ ફાઉન્ડેશન (એસ.એન.) તરફથી અનુદાન.
ફૂટનોટ્સ
લેખકો વ્યાજના કોઈ સંઘર્ષની જાહેરાત કરે છે.
આ લેખમાં ઑનલાઇન સમર્થન માહિતી શામેલ છે www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSUPplemental.
સંદર્ભ