Cdk5 ફોસ્ફોરીલેટ્સ ડોપામાઇન D2 રિસેપ્ટર અને એટન્યુએટ્સ ડાઉનસ્ટ્રીમ સિગ્નલિંગ (2013)

પ્રશસ્તિ: જીયોંગ જે, પાર્ક યુયુ, કિમ ડીકે, લી એસ, કવાક વાય, એટ અલ. (2013) Cdk5 ફોસ્ફોરીલેટ્સ ડોપામાઇન D2 રિસેપ્ટર અને એટન્યુએટ્સ ડાઉનસ્ટ્રીમ સિગ્નલિંગ. PLOS એક 8 (12): E84482. ડોઇ: 10.1371 / journal.pone.0084482

સંપાદક: જેમ્સ પોર્ટર, યુનિવર્સિટી ઓફ નોર્થ ડાકોટા, યુનાઈટેડ સ્ટેટ્સ ઑફ અમેરિકા

પ્રાપ્ત: 20, 2013; સ્વીકાર્યું: નવેમ્બર 14, 2013; પ્રકાશિત: ડિસેમ્બર 31, 2013

કૉપિરાઇટ: © 2013 જીયોંગ એટ અલ. આ એક ઓપન-એક્સેસ લેખ છે જેની શરતો હેઠળ વહેંચવામાં આવે છે ક્રિએટીવ કોમન્સ એટ્રિબ્યુશન લાયસન્સ, જે મૂળ લેખક અને સ્રોતને આપવામાં આવે છે, તે કોઈપણ માધ્યમમાં પ્રતિબંધિત ઉપયોગ, વિતરણ અને પ્રજનનની પરવાનગી આપે છે.

ભંડોળ: આ કાર્ય કોરિયન સરકાર (એમએસઆઇપી) તરફથી ગ્રાન્ટ (એનઆરએફ-એક્સNUMએક્સઆરએક્સએક્સઆરએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સ અને એનઆરએફ-એક્સNUMએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સ) દ્વારા સમર્થિત હતું અને કોરિયાના એનઆરએફ (2012K1A2A2) અને કોરિયા બ્રેઇન રિસર્ચ ઇન્સ્ટિટ્યુટ (કેબીઆરઆઇ) દ્વારા સંચાલિત આંતરરાષ્ટ્રીય સહકાર કાર્યક્રમના માળખા હેઠળ પણ ટેકો આપ્યો હતો. MSIP (01012923-2012) નો મૂળભૂત સંશોધન કાર્યક્રમ. એસકેપી એ 1 અને 4 નેશનલ એલાયન્સ ફોર રીસર્ચ ઓન સ્કિઝોફ્રેનિઆ એન્ડ ડિપ્રેસન (NARSAD) યંગ ઇન્વેસ્ટિગેટર ઍવોર્ડ્સ પ્રાપ્ત કરનાર છે. અભ્યાસ ડિઝાઇન, ડેટા સંગ્રહ અને વિશ્લેષણ, પ્રકાશિત કરવાના નિર્ણય અથવા હસ્તપ્રતની તૈયારીમાં ફંડર્સની કોઈ ભૂમિકા નથી.

સ્પર્ધાત્મક હિતો: લેખકોએ જાહેર કર્યું છે કે કોઈ સ્પર્ધાત્મક હિતો અસ્તિત્વમાં નથી.

પરિચય

મોટર સંકલન, મૂડ નિયંત્રણ અને પુરસ્કાર પદ્ધતિઓ સહિત વિવિધ મગજ કાર્યોમાં ડોપામાઇન સિગ્નલિંગ સામેલ છે [1]. કરોડરજ્જુમાં ડોપામાઇન સિગ્નલિંગનું મુખ્ય ઘટક સ્ટ્રાઇટલ માધ્યમ સ્પાઇની ન્યુરોન્સ (એમએસએન) દ્વારા પસંદ કરવામાં આવે છે જે પસંદગીયુક્ત રીતે ડોપામાઇન રીસેપ્ટર્સનો સબસેટ વ્યક્ત કરે છે અને ડોપામિનેર્જિક ઇનપુટ મુખ્યત્વે વેન્ટ્રલ ટેગમેન્ટલ એરિયા (વીટીએ) અને સર્ટિઆ નિગ્રા (એસએન) થી મેળવે છે.) [2]. ડોપામાઇન રીસેપ્ટર્સ જી પ્રોટીન-કમ્પલેટેડ રીસેપ્ટર્સ (જીપીસીઆર) છે જેમાં સાત ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન ડોમેન્સ છે અને તેમાં બે પેટા પ્રકારો છે, D1- જેવા અને D2- જેવા રીસેપ્ટર્સ, જે ડોપામાઇન સિગ્નલિંગમાં પારસ્પરિક ક્રિયાઓ મધ્યસ્થી કરે છે [1]. ઉદાહરણ તરીકે, ડોપામાઇન D1- જેવા રીસેપ્ટર્સ (D1, D5) જી દ્વારા એડેનીલાઇ સાયક્લેઝને સક્રિય કરે છે._.s અને CAMP ના ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર સ્તરને વધારો, પરંતુ ડોપામાઇન D2- જેવા રીસેપ્ટર્સ (D2, D3, D4) જી દ્વારા એડેનીલાઇ સાયક્લેઝને અટકાવે છે._.i અને CAMP ના ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર સ્તર ઘટાડે છે [1], [3].

ડોપામાઇન રીસેપ્ટર્સમાં, ડીએક્સટીએક્સએક્સ રીસેપ્ટર (ડીઆરડીએક્સટીએક્સ) એ સ્કિઝોફ્રેનિઆ અને ડ્રગ વ્યસન સહિત અનેક મુખ્ય માનસિક વિકૃતિઓના પેથોફિઝિઓલોજીમાં સંકળાયેલા છે. [4], જેમ કે ઘણા એન્ટિસાઇકોટિક દવાઓ ઓછામાં ઓછા અંશતઃ DRD2 ને લક્ષ્ય બનાવે છે. તે પણ જાણીતું છે કે ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સ પ્રવૃત્તિ પ્રાણીના મોડલોમાં દુરૂપયોગની દવાઓનાં વર્તણૂકના પરિણામો સાથે સારી રીતે સંકળાયેલી છે [5]. એન્ટીડિપ્રેસન્ટ્સ અને મૂડ સ્ટેબિલાઇઝર અસરકારકતાને પી.ડી.એ., ઇઆરકે અને જીએસકેક્સ્યુએક્સ દ્વારા મધ્યસ્થી દ્વારા ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ અથવા ડાઉનસ્ટ્રીમ ઇનટ્રાસેલ્યુલર સિગ્નલિંગની સેલ સપાટી અભિવ્યક્તિમાં ફેરફાર સાથે જોડવામાં આવી છે. [1], [4], [6]. મગજમાં ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ માટે આ નિર્ણાયક ભૂમિકાઓ હોવા છતાં, વિગતવાર નિયમનકારી મિકેનિઝમ્સ જે ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સ ગુણધર્મોમાં વિષમતા અને જટિલતાને પ્રદાન કરે છે તે સંપૂર્ણપણે સમજી શકાતા નથી.

પુરાવાઓની કન્વર્જિંગ રેખાઓ સૂચવે છે કે ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સએક્સ પ્રવૃત્તિની ફાઈન-ટ્યુનિંગમાં બહુવિધ પોસ્ટ ટ્રાન્સ્લેશનલ ફેરફારો સામેલ છે. ફોટો-એફેનીટી લેબલિંગ અભ્યાસમાં ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સનું વ્યાપક ગ્લાયકોસિલેશન જાહેર કરવામાં આવ્યું હતું [7], અને ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સની અંદર ડાસફાઇડ બૉન્ડ રચનાને લીગન્ડ બંધન માટે મહત્વપૂર્ણ ફેરફાર તરીકે ઓળખવામાં આવી હતી [8]. વધુમાં, ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સની ફોસ્ફોરેલેશન સાઇટ્સની શરૂઆતમાં ઓળખ કરવામાં આવી હતી ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ રેડિયોઆઇસોટોપ્સ સાથેના આક્ષેપો, વિવિધ કેનાઇઝ દ્વારા મધ્યસ્થી કરતા વિવિધ નિયમનકારી માર્ગો માટે માર્ગો પ્રદાન કરે છે [9]. ખરેખર, પ્રોટીન કેનાસે સી (પીકેસી) ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર કેલ્શિયમના ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ-મધ્યસ્થ ગતિશીલતાને નિયંત્રિત કરે છે અને ડીટીડીએક્સ્યુએનએક્સની સાયટોસ્કેલેટેલ પ્રોટીન સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં ફેરફાર કરે છે. [10]. જી.પી.સી.આર. કેનાઝ 2 (GRK2) દ્વારા ફોસ્ફોરિલેશન એ ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સના એગોનિસ્ટ-પ્રેરિત રેસીન્સિટાઇઝેશન પેટર્નને નિયંત્રિત કરે છે. [11].

સાયકલિન-આશ્રિત કિનેઝ 5 (Cdk5) એ પ્રોલાઇન-નિર્દેશિત સીરીન / થ્રેઓનાઇન કિનેઝ છે જે તેના આવશ્યક સક્રિયકર્તાઓની મગજ-વિશિષ્ટ અભિવ્યક્તિને લીધે પસંદગીની પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે, P35 અને P39 [12]. સીડીકએક્સએનએક્સએક્સ ન્યુરોનલ સ્થળાંતર અને ચેતાક્ષ માર્ગદર્શિકા સહિત વિવિધ ન્યુરોનલ પ્રક્રિયાઓમાં સંકળાયેલ છે, અને સીડીકેક્સ્યુએનએક્સ અને પીક્સ્યુએક્સએક્સ નલ ઉંદર કોર્ટીકલ લેયરિંગમાં ખામી બતાવે છે. [13]. તાજેતરમાં, તે બતાવવામાં આવ્યું હતું કે ડબલ્યુએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સનું ફોસ્ફોરિલેશન અને સીડીકેક્સ્યુએક્સ દ્વારા ઇફેક્સિન ડેન્ડેટ્રિક સ્પાઇન મૉર્ફોજેનેસિસનું નિયમન કરે છે. [14]. વધુમાં, સીડીકેક્સટીએક્સ એનએમડીએ રીસેપ્ટર, એનઆરએક્સટીએક્સબીબી અને એનઆરએક્સએનએક્સએએ-મધ્યસ્થ એનએમડીએના પ્રવાહોના સપાટી અભિવ્યક્તિ સ્તરને પણ નિયંત્રિત કરે છે. [15], [16]. તે નોંધપાત્ર છે કે પુરાવાના અનેક ભાગો સીડીકેક્સ્યુએક્સએક્સ અને ડોપામાઇન સિસ્ટમ વચ્ચેનો ગાઢ સંબંધ સૂચવે છે. Cdk5 ફોસ્ફોરીલેટ્સ ટાયરોસિન હાઇડ્રોક્સાઇલેસ (TH), તેની સ્થિરતા નિયમન કરે છે, અને આમ ડોપામિનેર્જિક હોમિઓસ્ટેસિસ જાળવી રાખે છે [17]. પોસ્ટસિનેપ્ટિક ન્યુરોન્સમાં, જ્યારે ડોમેમાઇન અને સાયક્લિક-એએમપી નિયમન કરેલા ફોસ્ફોપ્રોટીન-એક્સNUMએક્સડીડી (DARPP-75) નું T32 અવશેષ Cdk32 દ્વારા ફોસ્ફોરિલેટેડ છે, તે પીકેએ પ્રવૃત્તિને અટકાવી શકે છે અને આમ ડોપામાઇન DRD5-mediated PKA સિગ્નલિંગનો વિરોધ કરી શકે છે. [18]. રસપ્રદ વાત એ છે કે જ્યારે કોકેઈન, ડોપામાઇન રીસેપ્ટર્સના પરોક્ષ એગોનિસ્ટ, ઉંદરોમાં કાલક્રમિક રીતે સંચાલિત થાય છે, એમઆરએનએ અને સીડીકેક્સ્યુએક્સના પ્રોટીન સ્તરો મધ્યમ સ્પાઇની ચેતાકોષમાં વધારો કરે છે. [19]. સામૂહિક રીતે, સીડીકેક્સ્યુએક્સ ડ્રગ-પ્રેરિત સિનેપ્ટિક અનુકૂલનમાં સામેલ હોવાનું જણાય છે. આ અભ્યાસમાં, અમે ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સ અને સીડીકએક્સએક્સએક્સએક્સની કાર્યશીલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દર્શાવે છે જે ડોપામાઇન સિગ્નલિંગમાં સીડીકેક્સ્યુએક્સની ભૂમિકાને વધુ વિસ્તૃત કરે છે.

સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ

એન્ટિબોડીઝ

DRD321 (D321i2) ના ત્રીજા ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર લૂપના ફોસ્ફો-સેરીન 2 (pS3) ધરાવતા પેપ્ટાઇડ્સ સામે વિરોધી સસલાના સીરમ ઉભા કરવામાં આવ્યા હતા. ફોસ્ફો-પેપ્ટાઇડ, સીએનપીડીસ્પીપીકેપીકે (PEPTRON) નો ઉપયોગ એફેનિટી શુદ્ધિકરણ (20401, PIERCE) માટે પેપ્ટાઇડ-કન્જેગ્યુટેડ કોલમ બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. એન્ટી-પીએસએક્સએનએક્સએક્સ એન્ટીબોડી ઉત્પાદકના સૂચન પછી એફેનિટી શુદ્ધિકરણ સિસ્ટમ દ્વારા સમૃદ્ધ થયો. શુદ્ધ ફોસ્ફો-એન્ટિબોડી PBS માં 321% સોડિયમ એઝાઇડ અને 0.1% જિલેટીન સાથે સંગ્રહિત કરવામાં આવી હતી. એન્ટી-માઉસ એન્ટી-સીડીકેક્સ્યુએક્સ એન્ટિબોડી (એસસી-એક્સ્યુએનએક્સએક્સ) અને એન્ટિ-રેબિટ એન્ટી-પીક્સ્યુએક્સએક્સ એન્ટિબોડી (સ્કે-એક્સયુએનએક્સ) નો ઉપયોગ સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીક્સ્યુએક્સએક્સની પશ્ચિમી બ્લૂટિંગ અને ઇમ્યુનોસાયટોકેમેસ્ટ્રી માટે થયો હતો. એન્ટી-માઉસ એન્ટી-જીએફપી એન્ટિબોડી (એસસી-એક્સ્યુએનએક્સ) નો ઉપયોગ ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ-જીએફપીની ઇમ્યુનોપેરેઇઅ અને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે થયો હતો. વિરોધી સસલા વિરોધી ફ્લેગ એન્ટિબોડી (એસસી-એક્સ્યુએનએક્સ), વિરોધી સસલા વિરોધી એચએ એન્ટિબોડી (એસસી-એક્સ્યુએનએક્સ), એન્ટી-માઉસ એન્ટિ-જીએસટી એન્ટિબોડી (એસસી-એક્સ્યુએનએક્સએક્સ), અને એન્ટી-માઉસ એન્ટિ-ગેપડીએચ એન્ટિબોડી (એસસી- 0.1) સાન્ટા ક્રૂઝ બાયોટેકનોલોજીથી ખરીદવામાં આવી હતી.

પ્રાણીઓ

પીક્સ્યુએનએક્સ નોકઆઉટ માઉસ જાપાનમાં રિકેન બ્રેઇન સાયંસ ઇન્સ્ટિટ્યુટમાં ડૉ. કાત્સુઇકો મિકોશીબા તરફથી એક પ્રકારની ભેટ હતી અને પ્રાથમિક ન્યુરોન સંસ્કૃતિ માટે ઉપયોગમાં લેવાતી હતી. જીનોટાઇપીંગ માટે પ્રાઇમર સેટ્સ 35'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC અને 5 '- TCCATCT GCACGAGACTAGT અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ [20]. આઈસીઆર ઉંદર અને સ્પ્રેગ ડૉવલી ઉંદરો મગજની લોસેટની તૈયારી માટે ઉપયોગમાં લેવાય છે. પોહાંગ યુનિવર્સિટી ઓફ સાયન્સ એન્ડ ટેક્નોલૉજી ઇન્સ્ટિટ્યુશનલ એનિમલ કેર એન્ડ યુઝ કમિટી દ્વારા તમામ પ્રાણીઓની કાર્યવાહી મંજૂર કરવામાં આવી હતી.

પ્લાઝમીડ રચનાઓ

EFFP-N2 પ્લાઝમીડ વેક્ટરમાં હ્યુમન ડીઆરડીએક્સ્યુએક્સએક્સ લાંબા આઇસોફોર્મ અને પીએફએલએજી-સીએમવી-એક્સએનટીએક્સ પ્લાઝમિડ વેક્ટરમાં ડીએઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ (1-2 એમિનો એસિડ અવશેષો 212 અતિરિક્ત એમિનો એસિડ અવશેષો સહિત ડીઆરડીએક્સ્યુએક્સએક્સ લાંબા આઇસોફોર્મ) નો ત્રીજો ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર લૂપનો ઉપયોગ થયો હતો. પીએમએમવી-એચએ પ્લાઝિમિડ વેક્ટરમાં માનવ સીડીકેક્સ્યુએક્સ દાખલ કરવામાં આવ્યું હતું અને માનવ પીક્સ્યુએક્સ પીસીડીએન એક્સ્યુએનએક્સ પ્લાઝમીડ વેક્ટરમાં દાખલ કરવામાં આવ્યું હતું. માનવ સીડીએક્સએક્સએનએક્સ એ સાયટોમેગાલોવાયરસ (સીએમવી) પ્રમોટર હેઠળ પીસીડીએન એક્સ્યુએનએક્સ વેક્ટરમાં માનવ પીક્સ્યુએક્સએક્સ સાથે, ઇમ્યુનોસાયટોકેમિસ્ટ્રી માટે ડ્યુઅલ એક્સપ્રેશન કન્સ્ટ્રકશન (સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સ) બનાવવા માટે, રિસેપ્ટર ઇન્ટરરાઇઝેશન એસે, [³⁵એસ] -જીટીપી_γએસ બાઇન્ડિંગ એસે, રેડિઓલિગંડ બાએન્ડીંગ એસે અને સીએએમપી એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસાસે.

વિટ્રોમાં કિનસેસ એસે

આઇપી-જોડાયેલ ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ કાઇનેઝ એસેને નીચે પ્રમાણે કરવામાં આવ્યું હતું. એક સંપૂર્ણ માઉસ મગજને 3 એમએલ એલિથ્રોસાઇટ્સ લિસિસ બફર (ઇએલબી) (50 એમએમ ટ્રાઇસ (પીએચ 8.0), 250 એમએમ NaCl, 5 એમએમ ઇડીટીએ, 0.1% એનપી-એક્સ્યુએનએક્સ) માં ડૂન્સ હોમોજેનાઇઝરના 40 સ્ટ્રોક્સ દ્વારા હોમજિનેઝ્ડ મગજ lysates મેળવવા માટે lysed હતી . લ્યુએટ્સને બરફ પર 20 મિનિટ, સોનિટિક, અને 30 × પર સેન્ટ્રિફ્યુગ કરવામાં આવતું હતું. g 10 મિનિટ માટે. સક્રિય સીએડીએક્સએક્સએક્સએક્સ / પીક્સ્યુએક્સએક્સ કૉમ્પ્લેક્સ મેળવવા માટે સુપરરેટન્ટ્સને એન્ટિ-રેબિટ એન્ટિ-પીક્સ્યુએક્સએક્સ એન્ટિબોડીથી ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેડ કરવામાં આવ્યું હતું. Cdk35 / p5 જટિલ અને શુદ્ધ જીએસટી ફ્યુઝન પ્રોટીન એડિનોસિન 35 '-ટ્રાઇફોસ્ફેટ સાથે મિશ્ર કરવામાં આવ્યું હતું, [γ-³²પી] (Neg-502H, PerkinElmer) અને કિનેઝ બફર (30 mM HEPES (પીએચ 7.2), 10 mM MgCl માં સેવવામાંઆવે₂, 0.2 એમએમ ડીટીટી) રૂમ તાપમાન પર 1 એચ માટે [18], [21]. શુદ્ધ Cdk5 / p25 જટિલ (14-516, મિલિપોર) નો પણ ઉપયોગ કરવામાં આવતો હતો ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ ઉપર વર્ણવ્યા અનુસાર કાઇનેઝ એસે. 2 × નમૂના લોડિંગ બફર પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને 100 ° C પર ઉકાળી ગયું હતું. ત્યારબાદ નમૂનાઓને એસડીએસ-PAGE ને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા અને સુકા જલનું મૂલ્યાંકન ઑટોરાડિઓગ્રાફી દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું.

લિક્વિડ ક્રોમેટ્રોગ્રાફી (એલસી) - માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (એમએસ) / એમએસ એનાલિસિસ

રિકોમ્બિનન્ટ જીએસટી-ડીએક્સNUMએક્સએક્સટીએક્સ પ્રોટીનનું વિશ્લેષણ એલસી-એમએસ / એમએસ દ્વારા આઇપી-લિંક્ડ દ્વારા કરવામાં આવ્યું છે. ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ કાઇનેઝ પરેડ. અમે એક્સ !! ટેન્ડેમ (આવૃત્તિ ડિસ-એક્સNUMએક્સ-એક્સ્યુએનએક્સ) નો ઉપયોગ કરીને એલસી-એમએસ / એમએસ ડેટાની પેપ્ટાઇડ ઓળખ રજૂઆત કરી. પ્રત્યેક આરએડબલ્યુ ડેટા ફાઇલને ટ્રાંસ-પ્રોટોમેમિક પાઇપલાઇન (ટીપીપી; આવૃત્તિ 01) નો ઉપયોગ કરીને પ્રથમ mzXML માં રૂપાંતરિત કરવામાં આવી હતી. રૂપાંતરિત mzXMLs એમએસ / એમએસ સ્કેન પછી UniProt માઉસ પ્રોટીન ક્રમ ડેટાબેઝ (પ્રકાશન 2008_4.3) જીએસટી-D2010i07 ક્રમ મદદથી એક્સ !! ટેન્ડમ સહિત સામે શોધવા આધિન કરવામાં આવી હતી. સહનશીલતા આયનો અને 2 ડા માટે ફ્રેગમેન્ટ આયન માટે 3 દા પર સેટ કરવામાં આવી હતી. ટ્રીપ્સિન માટે એન્ઝાઇમ વિશિષ્ટતાનો ઉપયોગ થયો હતો. વેરિયેબલ ફેરફાર વિકલ્પોનો ઉપયોગ સાયસ્ટાઇન (3 દા) ના કાર્બેમિડોમેથીલેશન, મેથોનિન (2 દા) નું ઓક્સિડેશન, એસ્પેરેજિન (57.021 દા) નું હાઇડ્રોલિસિસ અને સેરીન (15.995 Da) નું ફોસ્ફોરેલેશન માટે કરવામાં આવ્યું હતું.

ઇમ્યુનોપ્રેઇર

ઈમ્યુનોપ્ર્રેઇર ઇએલબી લિસિસ બફરમાં સેલ લેસેટ્સ પર કરવામાં આવતો હતો. એન્ટિ-જીએફપી એન્ટિબોડી લોસેટ્સમાં ઉમેરાઈ હતી અને 3 ° સે માટે 4 ° C માં ઉકાળી હતી. ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સ પ્રોટીન-એ ઍગોરોઝનો ઉપયોગ કરીને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યાં હતાં. 30 ° C પર 37 મિનિટ માટે SDS નમૂના લોડિંગ બફર સાથે ઉપજાવી કાઢવામાં આવ્યા હતા, અને એસડીએસ-PAGE અને પશ્ચિમી બ્લેટ્સને આધિન હતા.

જીએસટી પુલ-ડાઉન એસે

10 μg શુદ્ધ જીએસટી અને જીએસટી-ડીએક્સયુએનએક્સએક્સયુએનએક્સ XTXH X માટે 2 ° C પર ઉંદર મગજની લૅસેટ સાથે ઉકળતા હતા. ગ્લુટાથિઓન (જીએસએચ) ના 3 μL - કન્જેજ્ડ સેફરોઝ 1.5B મણકા (4-30-4, જીઇ હેલ્થકેર), લિસિસ બફર સાથે સંતુલિત કરવામાં આવ્યું હતું અને વધારાના 17 એચ માટે ઉકાળી લીધું હતું. માળા XNTX × પર સેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા એકત્ર કરવામાં આવી હતીg અને lysis બફર 4 વખત સાથે rinsed [22], [23]. એન્ટિ-સીડીક્સએક્સએક્સએક્સ અને એન્ટિ-પીક્સ્યુએનએક્સ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા પ્રિસ્ક્રિપ્ટ્સનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.

ઇમ્યુનોસાયટોકેમિસ્ટ્રી

આવરણવાળા HEK 293 કોશિકાઓ અને આવરણવાળા પર ચેતાપ્રેષિત ચેતાકોષો ફોસ્ફેટ બફર્ડ સૅલાઇન (પીબીએસ) સાથે એકવાર ધોવાઇ હતી અને 4 મિનિટ માટે ઠંડા 30% પેરાફોર્મેલ્ડેહાઇડ / પીબીએસમાં નિમજ્જન દ્વારા નિશ્ચિત કરવામાં આવી હતી. પ્રાથમિક એન્ટિબોડી બ્લોકીંગ સોલ્યુશન (1 પ 0 સીએક્સ X% ઘોડો સીરમ અને પીબીએસમાં 2% ટ્રાઇટોન એક્સ-એક્સ્યુએનએક્સ) માં મંદ થયો હતો. એલેક્સાફ્લોર-એક્સ્યુએનએક્સએક્સ-એન્જેટેડ એન્ટી-માઉસ એન્ટિબોડી (એક્સ્યુએનએક્સ, ઇન્વિટ્રોજન) અને એલેક્સફ્લોર-એક્સ્યુએનએક્સ-કન્જેગટેડ એન્ટી સસબ એન્ટિબોડી (એક્સએક્સટીએક્સ, ઇન્વિટ્રોજન) નો ઉપયોગ સેકન્ડરી એન્ટિબોડીઝ તરીકે કરવામાં આવતો હતો. હોચીસ્ટનો ન્યુક્લિયસ સ્ટેનિંગ માટે ઉપયોગ થતો હતો. છબીઓ confocal માઇક્રોસ્કોપી (ઓલિમ્પસ, FluoView-1) દ્વારા મેળવવામાં આવી હતી.

રિસેપ્ટર આંતરિકકરણ એસે

24 એચ ટ્રાન્સએક્શન પછી, કોષો 1 μM ક્વિનીપ્રોલ (X102, સિગ્મા) સાથે 30 મિનિટ અને 90 ° C પર 37 મિનિટ માટે સારવાર કરવામાં આવી હતી. દરેક પ્રતિક્રિયા માટે 2 એમએલ કોલ્ડ પીબીએસ અને 200 μL આલ્કોહોલ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવતો હતો. નીચેની સાંદ્રતા પર 3 એચ માટે ઓરડાના તાપમાને ડ્રગ સારવાર કરવામાં આવી હતી; 3 એનએમ [³એચ] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, સિગ્મા). હાઈડ્રોફોબિક [³એચ] -સ્પાઇપરનનો ઉપયોગ કુલ વ્યક્ત થયેલા રીસેપ્ટર્સને લેબલ કરવા માટે કરવામાં આવતો હતો અને હાયડ્રોફિલિક સલ્પીરાઇડનો ઉપયોગ મેમબ્રાન્સસ રીસેપ્ટર-બાઉન્ડને બદલવા માટે કરવામાં આવતો હતો [³એચ] - સ્પાયરોન સિગ્નલો. મેમ્બ્રેન-સંબંધિત રીસેપ્ટર સંકેતોની ગણતરી કુલ વ્યક્ત થયેલ રીસેપ્ટર મૂલ્યોમાંથી ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર રીસેપ્ટર મૂલ્યોને બાદ કરીને કરી હતી. કોષ એક જીએફ / B (Millipore) ફિલ્ટર પર ફિલ્ટર્ડ અને વોશિંગ બફર (3 mM Tris-HCl (પીએચ 50), 7.4 mM NaCl) સાથે 100 વખત ધોવાઇ ગયા હતા. ફિલ્ટર સુકાઈ ગયા હતા અને અવશેષ રેડિયોએક્ટિવિટી પ્રવાહી સ્કીન્ટિલેશન કાઉન્ટરનો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવી હતી [24].

સેલ મેમ્બરન તૈયારી

એક્સએનએનએક્સ એમએમ કલ્ચર-ડીશમાં કન્ફ્લુઅન્ટ કોશિકાઓ બરફના કોલ્ડ પીબીએસથી ધોવાઇ ગઈ હતી અને 100 એમએલ એચએમઇ બફર (1 એમએમ HEPES (પીએચ 25), 7.5 એમએમ એમજીસીસીમાં લણણી હતી.₂, 1 એમએમ ઇડીટીએ). હોમોજેનાઇઝ્ડ lysates 500 × જી સાથે 15 મિનિટ માટે સેન્ટ્રિફ્યુગ કરવામાં આવ્યા હતા અને સુપરરેટન્ટ્સને ત્યારબાદ 36,000 × જી માટે 30 મિનિટ સાથે કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. એચએમઇ બફરમાં ફરીથી ગોઠવાયેલી ગોળીઓનો ઉપયોગ assays માટે કરવામાં આવતો હતો.

[³⁵એસ] -જીટીપી_γએસ બાઇન્ડિંગ એસે

ખીલ બફર (1 એમએમ HEPES (પીએચ 102), 25 એમએમ એમજીસીએલ માં 7.5 μM ક્વિનપ્રિલોલ (Q1.5, સિગ્મા) સાથે સેલ મેમ્બરન અપૂર્ણાંક પ્રી-ઇન્યુબ્યુટેડ હતા.₂, 100 એમએમ NaCl, 1 એમએમ ઇડીટીએ અને 0.01 એમએમ જીડીપી) 10 મિનિટ માટે. [³⁵એસ] -જીટીપી_γએસ (NET-030H, પેર્કિનઅલ્મર) 3 μL માં 30 એનએમની અંતિમ સાંદ્રતામાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને વધુ 90 મિનિટ માટે ઉકાળી ગયું હતું. આઇસ-કોલ્ડ બફરનું 170 μL (10 એમએમ ટ્રાઇસ-એચસીએલ (પીએચ 8.0), 100 એમએમ NaCl, 10 એમએમ એમજીસીએલ₂, અને 0.1 એમએમ જીટીપી) પ્રતિક્રિયા રોકવા માટે ઉમેરવામાં આવી હતી. પટલમાં એક જીએફ / B ફિલ્ટર (Millipore) પર ફિલ્ટર્ડ અને વોશિંગ બફર (3 mM Tris-HCl (પીએચ 50), 7.4 mM NaCl) સાથે 100 વખત ધોવાઇ ગયા હતા. ફિલ્ટર સુકાઈ ગયા હતા અને કિરણોત્સર્ગ કાઉન્ટરનો ઉપયોગ કરીને રેડિયોએક્ટિવિટી માપવામાં આવી હતી [25], [26].

રેડિઓલિગંડ અને બાઇન્ડિંગ એસે

0.01 એનએમ સાથે સજ્જ સેલ કોશિકાઓ ઉકાળીને [³એચ] - સ્પાઇરોન (એનઇટી-એક્સ્યુએનએક્સ, પેર્કિનઅલમર) અને ખનિજ બફરમાં 565 મિનિટ માટે ક્વિનપ્રિલોલ (Q102, સિગ્મા) ની વધતી સાંદ્રતા (30 એમએમ HEPES (પીએચ 25), 7.5 એમએમ એમજીસીએલ₂, 100 એમએમ NaCl, 1 એમએમ EDTA). મેમ્બરને જીએફ / બી ફિલ્ટર (મિલિપોર) પર ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું અને વોશિંગ બફર (3 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ (પીએચ 50), 7.4 એમએમ NaCl સાથે 100 વખત ધોવાઇ હતી. પ્રતિક્રિયા જીએફ / સી ગાળકો દ્વારા ઝડપી ગાળણક્રિયા દ્વારા સમાપ્ત કરવામાં આવી હતી. અવશેષો રેડિયોએક્ટિવિટી પ્રવાહી સ્નિટેલેશન કાઉન્ટરનો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવી હતી [27]-[29].

કેમ્પ એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસોસે

ચેપગ્રસ્ત HEK 293 કોશિકાઓ 10 μM રોલીગ્રામ (R6520, સિગ્મા) સાથે 1 એચ માટે પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવી હતી, અને ત્યારબાદ 0.1 μM ફોર્સ્કોલીન (F6886, સિગ્મા) અને 102 મિનિટ માટે ક્વિનપ્રિલોલ (Q30, સિગ્મા) ની સાંદ્રતા વધારી હતી. પ્રાથમિક સંસ્કારી સ્ટ્રાઇટલ ચેતાકોષો 10 μM રોલિરામ સાથે 1 એચ માટે અને પછી 1 એચ માટે 1 μM ડોપામાઇન સાથે સારવાર કરવામાં આવી હતી. [22]. ઉત્પાદકની સૂચનાને પગલે સીએએમપી એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસાસે કીટ (સૅફાયર બાયોસાયન્સ) દ્વારા 0.1 એમ એચસીએલ અને સીએએમપી સ્તરો સાથે સેલ લેસેટ તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા.

પ્રાથમિક સંસ્કારી સ્ટ્રાઇટલ ન્યુરોન

સ્ટ્રાઇટલ એરિયા માઉસ એમ્બ્રોનિક મગજ (E15) થી અલગ પાડવામાં આવ્યો હતો. વિખેરાયેલા ટીશ્યુને ન્યૂનતમ આવશ્યક મીડિયા (એમઇએમ) (11095, Invitrogen) માં 0.25% ટ્રાઇપ્સિન (T4549-100, સિગ્મા) અને 0.1% DNase I 6 ° C પર 37 મિનિટ માટે સમાવિષ્ટ છે. કોષ પ્લેટિંગ મીડિયા (0.01 એમ HEPES (પીએચ 7.4) અને 10% (વોલ્યુમ / વોલ્યુમ) ઘોડો સીરમ (16050-122, GIBCO) સાથે MEM) ફરી suspened કરવામાં આવી હતી. ન્યુરોન્સને 7 દિવસો માટે સંસ્કારી કરવામાં આવી હતી ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ (DIV 7) એમએએમમાં ​​B27 સપ્લિમેન્ટ (17504-044, ઇન્વિટ્રોજન) સાથે CAMP એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોએસેસ પર લાગુ થતાં પહેલાં.

પરિણામો

ડીડીડીએક્સયુએનએક્સના ત્રીજા ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર લૂપમાં સીડીકેક્સ્યુએક્સ ફોસ્ફોરીલેટ્સ સેરીન 5 ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ

નવલકથા સીડીકેક્સ્યુએક્સ સબસ્ટ્રેટ્સને ઓળખવા માટે, અમે (S / T) PX (કે / એચ / આર) નો ઉપયોગ કરીને વ્યવસ્થિત શોધ સીડીકેક્સ્યુએક્સએક્સ માન્યતા સર્વસંમતિ સિક્વન્સ તરીકે કરી હતી [30] અને ઉમેદવાર સબસ્ટ્રેટ તરીકે ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સ ઓળખી કાઢ્યું. સેરેન 2 સહિત સર્વસંમતિ ક્રમ, DRD321 (D2i2) ના ત્રીજા ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર લૂપમાં સ્થિત છે જ્યાં વિવિધ નિયમનકારી મિકેનિઝમ્સ શામેલ કરવામાં આવ્યા છે. [3], [10], [11]. આ ક્રમ ઉત્ક્રાંતિથી કરોડરજ્જુમાં ડીઆરડીએક્સ્યુએક્સએક્સમાં સાચવવામાં આવે છે, જે અવશેષનું કાર્યકારી મહત્વ દર્શાવે છે (ફિગ. 1A).

Cdk5 ની ફોસ્ફોરીલેટ D2i3 ની ક્ષમતાને આકારણી કરવા માટે, અમે આઇપી-લિંક કરેલું ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ પેઇનમેક્સ ઇમ્યુનોપ્રિઇયા દ્વારા સજીસ્ટ્રેટ તરીકે શુદ્ધ રેકોમ્બિનેટન્ટ જીએસટી-ડીએક્સNUMએક્સિએક્સએક્સએક્સ (એમિનો એસિડ અવશેષો 5-35) પ્રોટીન સાથે માઉસ મગજ લીસેટ દ્વારા સમૃદ્ધ સક્રિય Cdk35 / p2 જટિલનો ઉપયોગ કરીને કિનેઝ assays. અમે શુદ્ધ જીએસટી-ડીએક્સNUMએક્સએક્સયુએનએક્સ અને જીએસટી-ડીએક્સNUMએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સ પ્રોટીન્સમાં ફોસ્ફોરેલેશન સિગ્નલ્સનું અવલોકન કર્યું છે, પરંતુ જીએસટી-ડીએક્સNUMએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએ (XST-D3i212 S373A) નો ઉપયોગ કરીને સિગ્નલ નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો (ફિગ. 1B). GST-D321i2 માં સેરીન 3 ના ફોસ્ફોરિલેશનને વધુ ચકાસવા માટે, અમે આઇપી-લિંક્સમાંથી નમૂનાઓના એલસી-એમએસ / એમએસ વિશ્લેષણને રજૂ કર્યું. ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ એલટીક્યુ એક્સએલ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરીને કિનેઝ એસેઝ. સતત, ફોસ્ફો-પેપ્ટાઇડ્સ ફોસ્ફ્રો-સેરીન 321 પેપ્ટાઇડ્સના જથ્થાને અનુરૂપ છે.ફિગ. 1C). એલસી-એમએસ / એમએસ વિશ્લેષણ દરમિયાન ડેટા-આશ્રિત સંપાદન નમૂનામાં પુષ્કળ પ્રોટીન શોધવાનું વલણ ધરાવે છે [31], આ ડેટા સૂચવે છે કે સેરેન 321 અવશેષ એ D5i2 ક્ષેત્રમાં Cdk3 નું મુખ્ય ફોસ્ફોરિલેશન સાઇટ છે. સીડીકેક્સ્યુએક્સએક્સ દ્વારા જીએસટી-ડીએક્સNUMએક્સએક્સએનએક્સએક્સમાં સેરેન 321 નું પ્રત્યક્ષ ફોસ્ફોરેલેશન સાબિત કરવા માટે, ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ શુદ્ધિકરણ રેકોમ્બિનન્ટ GST-D5i25 પ્રોટીન સાથે શુદ્ધ Cdk2 / GST-p3 સંકુલનો ઉપયોગ કરીને કિનેઝ એસે. અમે GST-D2i3 માં નોંધપાત્ર ફોસ્ફ્રોરેલેશન સંકેત ઓળખી કાઢ્યું છે જે GST-D2i3 S321A માં ગેરહાજર હતું (ફિગ. 1D). એક સાથે લેવામાં, આ પરિણામો સૂચવે છે કે D2i3 S321 અવશેષ Cdk5-mediated ફોસ્ફોરિલેશન માટે પસંદગીનું લક્ષ્ય છે.

સીડીડીએક્સ્યુએનએક્સ સેલ્સમાં ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સના ત્રીજા ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર લૂપમાં સેરીન 5 ફોસ્ફોરીલેટ્સ કરે છે.

સેરીન 321 ના ફોસ્ફોરિલેશનને ઓળખવા માટે, અમે ફોસ્ફ્રો-સેરીન 321 (pS321) માટે વિશિષ્ટ એન્ટિબોડી ઉભા કર્યા. આઇપી-લિંક્સમાંથી નમૂનાઓ ઈન વિટ્રો સ્થિતિએ એન્ટી-પીએસએક્સએનએક્સએક્સ એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરીને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા કિનેઝ એસેનાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. બ્લોટ્સએ કીનેઝ પ્રતિક્રિયામાં એક વિશિષ્ટ બેન્ડ બતાવ્યો જે જીએસટી-ડીએક્સNUMએક્સએક્સટીએક્સ (XST-D321i2) પર આધારિત હતો (ફિગ. 2A). સંભવિત કોશિકાઓ Cdk321 દ્વારા DRD2 માં સેરિનનું 5 ના ફોસ્ફોરાયલેશનની ચકાસવા માટે, HEK 293 કોશિકાઓ સાથે અથવા Ha-Cdk2 અને p2 વગર DRD321-GFP અને DRD5 S35A-GFP વ્યક્ત તરફથી એંટી-GFP immunoprecipitates વિરોધી GFP અને મદદથી પશ્ચિમી શાહીચૂસ દ્વારા પૃથક્કરણ કરવામાં આવી હતી એન્ટી-પીએસએક્સએનએક્સએક્સ એન્ટિબોડીઝ. એન્ટિ-જીએફપી એન્ટિબોડી દ્વારા વિશિષ્ટ સ્મિત બેન્ડ સિગ્નલો જે DRD321 ના અતિશય ગ્લાયકોસિલેશનને કારણે જાણીતા છે, તે માત્ર DRD2-GFP ની હાજરીમાં જ જોવાય છે અને એન્ટિ-પીએસએક્સએનએક્સએક્સ એન્ટિબોડીઝે સમાન ડીડીડીએક્સયુએનએક્સ સિગ્નલોને સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીક્સ્યુએક્સએક્સ એક્સ અભિવ્યક્તિ સાથે જ શોધી કાઢ્યું છે (ફિગ. 2B) [7]. Cdk321, D5i2 (FLAG-D3i2) અને D3i2 (FLAG-D3i2 S3A) નું મ્યુટન્ટ ફોર્મ દ્વારા સેરેન 321 ના ફોસ્ફોરિલેશનને વધુ ચકાસવા માટે. ફ્લેગ-ડીએક્સએનએક્સઇએક્સટીએક્સએક્સ અને ફ્લેગ-ડીએક્સએનએક્સએક્સએનએક્સએક્સ સીએક્સએનએક્સએએએકે એક્સએનટીએક્સ સેલ્સમાં HA-Cdk2 અને P3 સાથે અથવા તેના વગર વ્યક્ત કરવામાં આવ્યું છે તેનું વિશ્લેષણ એસડીએસ-જેલ ગતિશીલતા શિફ્ટ અસે દ્વારા કરવામાં આવ્યું છે. FLAG-D2i3 માટે નોંધપાત્ર Cdx321- આધારિત ગતિશીલતા શિફ્ટ દેખાઈ હતી, પરંતુ ફ્લેગ-ડીએક્સNUMએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સ (XXG-D5i35 S293A) માટે નહીંફિગ. 2C). અમે એગોનિસ્ટ ઉત્તેજના પર Ser2 પર DRD321 ના ફોસ્ફોરિલેશન સ્તરનું પણ મૂલ્યાંકન કર્યું. DRD293-GFP અને Cdk2 / p5 સંકુલને વ્યક્ત કરતા HEK 35 કોષો ક્વિનીપ્રોલ દ્વારા ઉત્તેજિત કરવામાં આવ્યા હતા, અને સેલ લેસેટ્સથી એન્ટિ-જીએફપી ઇમ્યુનોપ્રિસિપેટીટ્સનું વિશ્લેષણ એન્ટી-જીએફપી અને એન્ટી-પીએસએક્સએનએક્સએક્સ એન્ટિબોડીઝ દ્વારા પશ્ચિમી બ્લેટિંગ દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું. અમે શોધ્યું કે Ser321 પર DRD5 નું Cdk2-mediated ફોસ્ફોરિલેશન ઍગોનિસ્ટ ઉત્તેજના દ્વારા અસર કરતું નહોતું, જે GRK- અને PKC-mediated ફોસ્ફોરિલેશનથી અલગ દેખાય છે (ફિગ. 2D) [32], [33]. એકસાથે, આ પરિણામો સૂચવે છે કે Cdk5 સેલ્યુલર વાતાવરણમાં DRD321 ના સેરેન 2 અવશેષને ફોસ્ફોરીલેટ કરી શકે છે.

Cdk5 / p35 કૉમ્પ્લેક્સ અને DRD2 શારીરિક રીતે સંકળાયેલા છે

અમે Cdk5 / p35 જટિલ અને DRD2 ની સંભવિત ભૌતિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની તપાસ કરી હતી કારણ કે ઘણા Cdk5 સબસ્ટ્રેટ્સને શારીરિક રૂપે Cdk5 / p35 કૉમ્પ્લેક્સ સાથે સંકળાયેલ હોવાનું માનવામાં આવે છે. [23], [34], [35]. પ્રથમ, જીએસટી પુલ-ડાઉન પ્રયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. શુદ્ધ રીકોમ્બિનન્ટ GST-D2i3 પ્રોટીન ઉંદર મગજની લસેટ સાથે ઉભરાઈ ગયું હતું અને જીએસટી પુલ-ડાઉન ઉપસંહારનું વિશ્લેષણ પશ્ચિમ બ્લોટિંગ માટે કરવામાં આવ્યું હતું. બતાવ્યા મુજબ ફિગ. 3A, એન્ડોજેનસ સીડીકેક્સયુએનએક્સ અને પીએક્સયુએનએક્સ પુલ ડાઉન પ્રિસિપેટીસમાં ઓળખાયા હતા, જે ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સ અને સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીક્સયુએનએક્સ કૉમ્પ્લેક્સ વચ્ચેની શારીરિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સૂચવે છે (ફિગ. 3A). તદુપરાંત, ડીએચડીએક્સટીએક્સ-જીએફપી અને સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સ (XD5-GFP) અને સીડીકેક્સએક્સએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સ (XD35-GFP) ને વ્યક્ત કરતી HEK 293 કોષ લાયસેટ્સમાંથી એન્ટિ-જીએફપી ઇમ્યુનોપ્રિસીસેટ્સમાં એચએ-સીડીએક્સએક્સએક્સએક્સ અને પીક્સ્યુએક્સએક્સ મળી આવ્યા હતાફિગ. 3B). આ ઉપરાંત, અમે ઇમ્યુનોસાયટોકેમિકલ વિશ્લેષણ કર્યું હતું અને કહ્યું હતું કે ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ-જીએફપી, એચએ-સીડીકેક્સ્યુએક્સ અને પીએક્સયુએનએક્સ HEK 2 કોશિકાઓના ઝેરી વિસ્તારમાં નોંધપાત્ર સહ-સ્થાનિકીકરણ સંકેતો દર્શાવે છે (ફિગ. 3C, ઉપલા પેનલ્સ). અમે ન્યુરોનલ સંદર્ભમાં ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સ અને સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સના સહ-સ્થાનિકીકરણની પણ તપાસ કરી. સાતત્યપૂર્ણ રીતે, ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સ-જીએફપીએ સંસ્કારી સ્ટ્રાઇટલ ચેતાકોષ (ડીવીએક્સએક્સએક્સએક્સ) માં એન્ડોજેનસ સીડીકેક્સ્યુએનએક્સ અને પીએક્સએનએક્સએક્સ સાથે નોંધપાત્ર સહ-સ્થાનિકીકરણ બતાવ્યું હતું, ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ અને સીડીકએક્સએક્સએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સ (XD2) અને સીડીકએક્સએક્સએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સ (XXXXX) વચ્ચે વધુ સપોર્ટિંગ લિંક્સ (ફિગ. 3C, નીચે પેનલ્સ). પરિણામો સૂચવે છે કે DRD2 અને Cdk5 / p35 એક જટિલ રચના કરી શકે છે અને આ રીતે, ડ્રાડેનને સમર્થન આપે છે કે DRD2 એ Cdk5 નું શારીરિક સબસ્ટ્રેટ છે.

ડીડીડીએક્સએનએક્સએક્સએક્સએક્સિએક્સ રીસેપ્ટર પ્રવૃત્તિની ડીડીડીએક્સયુએક્સએક્સ-મધ્યસ્થ ફોસ્ફોરિલેશન

એવું કહેવામાં આવ્યું છે કે ફોસ્ફોરીલેશન જી.પી.સી.આર. ના નિર્ણાયક ગુણધર્મો જેમ કે જી પ્રોટીન કમ્પલિંગ, રીસેપ્ટર આંતરિકકરણ, ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર સ્થાનિકીકરણ, અને મોડ્યુલેટર પ્રોટીન સાથે જોડાણની રચના કરે છે. [9], [11], [24]. એકગોનોસ્ટ પ્રેરિત રીસેપ્ટર આંતરિકકરણ સિગ્નલ ટ્રાન્સડક્શનની નિર્ણાયક નિયમનકારી પ્રક્રિયા છે. અમે ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સ આંતરિકકરણના સીડીકેક્સ્યુએક્સ-મધ્યસ્થ મોડ્યુલેશનની તપાસ કરી. ડીડીડીએક્સયુએનએક્સ-જીએફપી અને ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સએક્સએક્સએક્સ-જીએફપીને સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સ વગર અથવા વગર દર્શાવતા HEK 5 કોષો એગોનિસ્ટ-ઉત્તેજિત DRD2 આંતરિકકરણને પ્રેરિત કરવા માટે 293 μM ક્વિનપ્રિલોલ સાથે ઉકળતા હતા (ફિગ. 4A). [³એચ] - ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સ-જીએફપી વ્યક્ત કરતી કોશિકાઓના સ્પાઇરોન સિગ્નલ્સ 2 મિનિટ ક્વિનપ્રિલોલ સારવારમાં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો અને 30 મિનિટ પર પુનઃપ્રાપ્ત થયો હતો. રસપ્રદ રીતે, [³એચ] - ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સ-જીએફપી અને સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સ એક્સપ્રેસ સેલ્સના સ્પાયરોન સિગ્નલ્સ 2 મિનિટ ક્વિનપ્રિલોલ ટ્રીટમેન્ટમાં પણ ઘટાડો થયો હતો પરંતુ 5 મિનિટે પુનઃપ્રાપ્ત થયો નથી (ફિગ. 4A, બીજો વિભાગ). બીજી બાજુ, [³એચ] - ડીડીડીએક્સએનએક્સએક્સ સએક્સએનએક્સએક્સએ-જીએફપી એક્સપ્રેસ સેલ્સના સ્પાઇરોન સિગ્નલ્સ 2 મિનિટમાં ઘટાડવામાં આવ્યા હતા અને સીએડીકએક્સએક્સએક્સ / પીક્સ્યુએક્સએક્સ સાથેના સહ-અભિવ્યક્તિને ધ્યાનમાં લીધા વિના 321 મિનિટ પર પુનઃપ્રાપ્ત થયા હતા. પાછલા અભ્યાસો દર્શાવે છે કે આંતરિક ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ લાંબા સમય સુધી ઍગોનિસ્ટ ઉત્તેજના પર પ્લાઝ્મા પટલ પર પાછા ફરી છે. [11]. ટીhus તે દેખાય છે કે ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સએક્સનું સીડીકેક્સ્યુએક્સ-મધ્યસ્થ ફોસ્ફોરિલેશન ઍગોનિસ્ટ-પ્રેરિત ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સ ઇન્ટરનેશનલાઇઝેશન પછી રીસેન્સિટાઇઝેશન પ્રક્રિયાઓમાં સામેલ છે.

અમે ડીડીડીએક્સએનએક્સએક્સ-મધ્યસ્થ ફોસ્ફોરિલેશન સાથે સંકળાયેલા DRD2 ને એગોનિસ્ટ-ઉત્તેજિત જી પ્રોટીન કમ્પલિંગના સંભવિત પરિવર્તનનું વધુ મૂલ્યાંકન કર્યું [³⁵એસ] -જીટીપી_γએસ બાઇન્ડિંગ પરોક્ષ [25], [26]. ડીડીડીએક્સ્યુએક્સએક્સ-જીએફપી અને ડીડીડીએક્સએનએક્સ સીએક્સએનએક્સએક્સ-જીએફપી કેડીકેક્સ્યુએક્સ / પીક્સ્યુએક્સ વિના અથવા તેના વિનાના HEK 2 કોશિકાઓમાં વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા હતા. મેમ્બ્રેન તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા અને 2 μM ક્વિનીપ્રોલ સાથે ઉત્તેજિત થયા હતા અને વધુ મંજૂરી આપી હતી [³⁵એસ] -જીટીપી_γએસ નિવેશ. ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ-જીએફપી અને સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીક્સ્યુએક્સએ સેલ કલાને દર્શાવતા નોંધપાત્ર રીતે અવ્યવસ્થિત [³⁵એસ] -જીટીપી_γઅન્ય તમામ કોષ પટલની તુલનામાં એસ બાઇન્ડિંગ (ફિગ. 4B). આ પરિણામો સૂચવે છે કે Cdk5-mediated ફોસ્ફોરિલેશન DRD2 પર ઍગોનિસ્ટ-ઉત્તેજિત જી પ્રોટીનને બંધનકર્તા બનાવે છે.

વધુમાં, ક્વિનપીરોલ-સ્પર્ધા [³એચ] - સ્પીડરોન-બાઇપેન્ડીંગ assays સીડીડીએક્સ્યુએક્સએક્સ-મધ્યસ્થ ફોસ્ફોરિલેશન દ્વારા DRD2 પર એગોનિસ્ટ-એફેનિટીમાં કોઈપણ સંભવિત ફેરફારની તપાસ કરવા માટે કરવામાં આવ્યા હતા. સ્પર્ધાત્મક બંધન [³એચ] - સ્પિન્ફેક્ટેડ માંથી ઝાડવા તૈયાર કરવા માટે ક્વિનપોલોલના વધતા સાંદ્રતાના ઉપચાર પર સ્પાઇરોનનું માપન કરવામાં આવ્યું હતું. ક્વિનપીરોલ અને [³એચ] - ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સ-જીએફપી અને ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સ સીએક્સએનએક્સએક્સ-જીએફપીમાં સ્પાઇરોન સમાન લોગો બનાવ્યાં_i મૂલ્યો (DRD9.789-GFP માટે -2; DRD9.691 S2A-GFP માટે -321), સૂચવે છે કે ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ માટે લિગૅન્ડની સંલગ્નતા સીડીડીએક્સ્યુએક્સએક્સ (CDD2) પર સીડીકેક્સ્યુએક્સ-મધ્યસ્થ ફોસ્ફોરિલેશન દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે પ્રભાવિત નથી.ફિગ. 4C).

સીડીકેક્સ્યુએક્સએક્સ-મધ્યસ્થ ફોસ્ફોરિલેશન એ DRD5-CAMP સિગ્નલિંગ પાથવેને ડાઉન-રેગ્યુલેટ કરે છે

આગળ, અમે તપાસ કરી હતી કે ડીડીડીએક્સએનએક્સએક્સ દ્વારા ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સમાં ફેરફાર ડાઉનસ્ટ્રીમ સિગ્નલિંગ પાથવેઝને અસર કરે છે. અમે ડીએમડીએક્સએનએક્સ-જીએફપી અને ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સ સીએક્સએનએક્સએક્સ-જીએફપીને સીએએમપી એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસાસીનો ઉપયોગ કરીને કોષોમાં એડેનીલાઇ સાયક્લેઝ દ્વારા ફોર્સ્કોલીન-ઉત્તેજિત કેએએમપી ઉત્પાદનના DRD2-મધ્યસ્થ અવરોધનું નિરીક્ષણ કર્યું. ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ એક્સપ્રેસ સેલ્સે ડોઝ-આશ્રિત રીતે ક્વિનપીરોલની પ્રતિક્રિયામાં સીએએમપી સ્તરમાં ઘટાડો કર્યો છે. નોંધનીય રીતે, સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીએક્સયુએનએક્સના સહ અભિવ્યક્તિએ સીએએમપી રચનાના મહત્તમ નિયંત્રણોને નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડ્યું છે (ફિગ. 4D, ડાબું પેનલ). બીજી બાજુ, ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ સીએક્સએનએક્સએક્સ-જીએફપી વ્યક્ત કરતી કોશિકાઓમાં, સીડીપી રચનાઓ અસરકારક રીતે ક્વિનપીરોલ સારવારની પ્રતિક્રિયામાં અસર પામી હતી, પછી પણ સીડીકેક્સ્યુએક્સ / પીક્સ્યુએક્સક્સ (XXXXX /ફિગ. 4D, જમણી પેનલ). આ પરિણામો સૂચવે છે કે DRD5 નું Cdk2-mediated ફોસ્ફોરિલેશન ડાઉનસ્ટ્રીમ કેએએમપી સિગ્નલિંગ પાથવે પર DRD2 ની અવરોધક પ્રવૃત્તિને વટાવે છે. વધુ શારીરિક રીતે સુસંગત સેટિંગમાં ઘટનાની પુષ્ટિ કરવા માટે, અમે જરૂરી સીએડીક્સએક્સએનએક્સએક્સ એક્ટિએટર, પીક્સયુએનએક્સમાં અપૂરતા નોકઆઉટ એમ્બ્રોયોમાંથી પ્રાથમિક સંસ્કારી ચેતાકોષનો ઉપયોગ કર્યો. પ્રાથમિક સંસ્કારી સ્ટ્રાઇટલ ચેતાકોષોને 35 μM ડોપામાઇન સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી અને તેનું વિશ્લેષણ CAMP એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસાસે કર્યું હતું. જ્યારે ડોપામાઇન સાથે ઉત્તેજિત થતાં વાઇલ્ડ-ટાઇપ ન્યુરોન્સની તુલનામાં પીક્સયુએનએક્સ નાકઆઉટ મીસના ન્યૂરન્સે સીએએમપી સ્તરમાં ઘટાડો કર્યો હતો (ફિગ. 4E). ટીએકસાથે મળીને, અમે તારણ કાઢ્યું કે DRD5 ના CDK2-mediated ફોસ્ફોરિલેશન એ DRD2 દ્વારા પ્રસ્તુત કરેલા CAMP પાથવે પરના અવરોધક ટોનમાં ઘટે છે.

ચર્ચા

અમે ડીડીડીએક્સએનએક્સએક્સના નવલકથા સબસ્ટ્રેટ તરીકે ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ ઓળખી કાઢ્યા. ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સએક્સ જી ઘટાડવાથી રિસેપ્ટર આંતરિકકરણ પછી DRD2 ના ભાવિને અસર કરીને ફોસ્ફોરેલેશન DRD2 સપાટી અભિવ્યક્તિને ઓછી-નિયંત્રિત કરે છે._i- કૂપલિંગ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ સીએએમપી પાથવે. ફોસ્ફોરીલેશન અવશેષ S321 બંને DRD2 લાંબા અને ટૂંકા આઇસોર્મ્સમાં અસ્તિત્વ ધરાવે છે, આ અભ્યાસમાં પ્રસ્તાવિત પદ્ધતિ DRD2-mediated સિગ્નલિંગમાં નિયમનનો સામાન્ય મોડ હોઈ શકે છે..

મધ્યમ સ્પાઇની ચેતાકોષમાં ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ માત્ર મુખ્ય ડોપામાઇન રીસેપ્ટર પેટા પ્રકાર તરીકે માનવામાં આવતું નથી પણ પર્યાવરણીય ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં ઉપલબ્ધતામાં ફેરફારની તેની સંવેદનશીલતા માટે પણ માન્ય કરવામાં આવ્યું છે. ડીજીડીએક્સ્યુએનએક્સના આગેવાન પ્રેરિત ડિસેન્સિટાઇઝેશન અને રીસેન્સિટાઇઝેશનનો વ્યાપક અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો છે [11], [24]. ખાસ કરીને, સંખ્યાબંધ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે ક્રોનિક મનોવિશ્લેષક સંપર્ક, જેમ કે કોકેન અને એમ્ફેટામાઇન, જે સ્ટ્રાઇટલ સિનપ્સમાં ડોપામાઇનના બાહ્યકોષીય સ્તરને વધારે છે તેની અસરો દર્શાવે છે, સાથે સાથે ડીઆરડીએક્સયુએનએક્સની ગતિશીલ ફેરફારોની સાથે સાથે [36]. ખરેખર, ક્રોનિક કોકેઈન યુઝર્સ સ્ટ્રાઇટલ એરિયામાં ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સ સ્તર ઘટાડવા માટે જાણીતા છે, અને ન્યુક્લિયસ ઍક્યુમ્બન્સ (એનએસીસી) માં ડીઆરડીએક્સટીએક્સ પ્રાપ્યતા ઉંદર અને આદિજાતિમાં માદક દ્રવ્યો મેળવવા અને મજબૂતીકરણના વર્તન સાથે નકારાત્મક સંબંધ દર્શાવે છે. [37]-[39]. આ તારણો સૂચવે છે કે ડીઆરડીએક્સ્યુએનએક્સની કાર્યક્ષમતા ક્રોનિક ડ્રગ એક્સપોઝર સહિત વિવિધ ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં અનુકૂલનશીલ અથવા વળતરકારી નિયમન માટે ખૂબ સંવેદનશીલ છે. અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સના ત્રીજા ઇન્ટ્રાસેસ્યુલર લૂપમાં S2 અવશેષ Cdk321 દ્વારા ફોસ્ફોરીલેટેડ હોઈ શકે છે, જે સીએએમપી પાથવે પર DRD2 ના અવરોધક પ્રભાવમાં ઘટાડો દર્શાવે છે. આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ડોપામિનોસેપ્ટિવ ચેતાકોષમાં સીડીકેક્સ્યુએનએક્સ સાથે સંકળાયેલ નવલકથા નિયમનકારી પ્રણાલીની દરખાસ્ત કરે છે જે DRD5 સપાટીની પ્રાપ્યતાની ગતિશીલ પ્રકૃતિ સાથે જોડી શકાય છે.

તે નોંધવું જોઇએ કે સીડીકેક્સ્યુએનએક્સ ન્યુરોનલ વાતાવરણના અનુકૂલનશીલ ફેરફારોમાં મધ્યસ્થી કરવા માટે એક મુખ્ય ઘટક તરીકે જાણીતું છે. ઉદાહરણ તરીકે, લિંબિક સર્કિટના ચેતાકોષમાં ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન્સના માળખાકીય અને વિધેયાત્મક ફેરફારો એ પુનરાવર્તિત મનોવૈજ્ઞાનિક સંપર્કના પરિણામોમાંનું એક છે. [40]. આ ફેરફારોમાં વિવિધ પરમાણુ પરિવર્તન આવે છે જેમાં સીએએમપી રિસ્પોન્સ એલિમેન્ટ-બાઈન્ડીંગ પ્રોટીન (સીઆરબી) અને ΔFOSB, ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં ક્રોનિક કોકેઈન વહીવટીતંત્રના જવાબમાં એક સ્થિર અપ-નિયમન દર્શાવે છે. [41], [42]. મહત્વનું છે, સીડીકેક્સ્યુએક્સ એ ΔFOSB નો લક્ષ્યાંક છે [19], અને ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન ડાયનેમિક્સમાં સંકળાયેલા ઘણા જટિલ ઘટકો, જેમ કે PSD-95, P21-activated kinase (PAK), β-catenin અને spinophilin, Cdk5 સબસ્ટ્રેટ્સ તરીકે જાણ કરવામાં આવ્યા હતા [43]-[46]. સતત, સીડીકેક્સ્યુએક્સએક્સ પ્રવૃત્તિના આનુવંશિક અથવા ફાર્માકોલોજિકલ મેનિપ્યુલેશન્સ ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન મૉર્ફોલોજી અને કોકેઈનના વર્તણૂકલક્ષી પ્રતિસાદમાં ફેરફાર કરે છે, જે મેસોલિમ્બિક ડોપામાઇન સર્કિટ્સના પરમાણુ અને મોર્ફોલોજિકલ ફેરફારોમાં સીડીકેક્સટીએક્સ માટે નિર્ણાયક ભૂમિકા સૂચવે છે. [47], [48]. અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે ડીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સ એ સીડીકેક્સ્યુએક્સનું નવલકથા લક્ષ્ય છે જે ક્રોનિક ડ્રગ એક્સ્પોઝરની પ્રતિક્રિયામાં ડોપામાઇન સિસ્ટમના અનુકૂલનશીલ ફેરફારોમાં વધારાના આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરે છે, ત્યારબાદ સીડીડીએક્સએનએક્સએક્સના ΔFOSB-mediated અપ-રેગ્યુલેશનને કારણે ડીઆરડીએક્સટીએક્સના ફોસ્ફોરેલેશનમાં ટૉનિક વધારો થાય છે. . તદુપરાંત, ડીઆરડીએક્સટીએક્સ અસંખ્ય સેલ્યુલર પ્રક્રિયાને અસર કરવા માટે જાણીતું છે, જેમાં સીએએમપી અને એમએપી કિનેઝ પાથવેઝ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ ટ્રાન્સક્રિપ્શન ઇવેન્ટ્સનો સમાવેશ થાય છે. [42], [49]. આમ, આ અભ્યાસમાં થયેલા નિષ્કર્ષો સીડીડીએક્સએનએક્સએક્સ દ્વારા સીઆરડીએક્સએનએક્સએક્સના સીધા નિયમનનું વર્ણન કરી શકશે નહીં પરંતુ ડ્રગ એક્સપોઝરને ડોપામાઇન સિસ્ટમના અનુકૂલનશીલ પ્રતિસાદમાં નવલકથા અંતર્જ્ઞાન પણ આપશે.

લેખક ફાળો

કલ્પના અને પ્રયોગો ડિઝાઇન કરી: જેજે યુપ્યુ ડીએચ એસકેપી. પ્રયોગો કર્યા: જે.જે. યુપ ડકેકે વાયકે. ડેટાનું વિશ્લેષણ: જેજે યુપ ડકકે એસએલ વાય કે સાલ એચએલ વાયએસજી ડીએચ એસકેપી. યોગદાન આપેલ ઘટકો / સામગ્રી / વિશ્લેષણ સાધનો: YHS. કાગળ લખ્યું: જેજે એસકેપી.