Cdk5 foszforilátok Dopamin D2 receptor és gyengíti a lefelé irányuló jelzést (2013)

Idézet: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Foszforilátok Dopamin D2 receptor és gyengíti a lefelé irányuló jelzést. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Szerkesztő: James Porter, Észak-Dakota Egyetem, Amerikai Egyesült Államok

kapott: Május 20, 2013; Elfogadott: November 14, 2013; Megjelent: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Attribution licenc, amely lehetővé teszi a korlátlan felhasználást, terjesztést és reprodukciót bármilyen médiumban, feltéve, hogy az eredeti szerzőt és forrást jóváírják.

finanszírozás: Ezt a munkát támogatta a koreai kormány (NRF-2012R1A2A2A01012923A2012 és NRF-1R4A1028200A2012) támogatása, valamint a koreai NRF (2K1A2033117A2031) és a Koreai Brain Research Institute (KBRI) által irányított nemzetközi együttműködési program keretében is. Az MSIP alapkutatási programja (415-2004). Az SKP az 2006 és az XNUMX Országos Szkizofrénia és Depresszió Kutatási Szövetségének (NARSAD) fiatal kutatói díjazása volt. A finanszírozóknak nem volt szerepe a tanulmánytervezésben, az adatgyűjtésben és -elemzésben, a közzétételre és a kézirat elkészítésére.

Versenyképes érdekek: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A dopamin-jelzés a különböző agyi funkciókban részt vesz, beleértve a motoros koordinációt, a hangulatvezérlő és a jutalmazási mechanizmusokat [1]. A gerincesek dopamin jelzésének egyik fő összetevőjét a striatális közepes tüskés neuronok (MSN) fejtik ki, amelyek szelektíven expresszálnak egy dopamin receptorok egy részhalmazát, és dopaminerg bevitelt kapnak főként a ventrális tegmentális területen (VTA) és a materia nigra (SN) [2]. A dopamin receptorok G-protein-kapcsolt receptorok (GPCR), hét transzmembrán doménnel, és két altípusból állnak, D1-szerű és D2-szerű receptorok, amelyek kölcsönös hatásokat közvetítenek a dopamin jelátvitelben [1]. Például a dopamin D1-szerű receptorok (D1, D5) aktiválják a G_aS és növeli a cAMP intracelluláris szintjét, de a dopamin D2-szerű receptorok (D2, D3, D4) gátolják az adenilil-ciklázot G-en keresztül_αi és csökkenti a cAMP intracelluláris szintjét [1], [3].

A dopamin receptorok közül a D2 receptor (DRD2) szerepet játszik a többszörös jelentős pszichiátriai rendellenességek patofiziológiájában, beleértve a skizofrénia és a kábítószer-függőséget. [4]úgy, hogy sok antipszichotikus gyógyszer legalább részlegesen célozza a DRD2-et. Ismeretes továbbá, hogy a DRD2 aktivitás jól korrelál az állatmodellekben a visszaélésszerű gyógyszerek viselkedési következményeivel [5]. Az antidepresszánsok és a hangulatstabilizátor hatékonysága szintén összefüggésben áll a DRD2 vagy a PKA, ERK és GSK3 által közvetített intracelluláris jelátvitel sejtfelszíni expressziójának megváltozásával. [1], [4], [6]. A DRD2 az agyban játszott kritikus szerepe ellenére a DRD2 tulajdonságainak heterogenitását és komplexitását biztosító részletes szabályozási mechanizmusok nem teljesen ismertek.

A bizonyítékok egymásba sorolása azt jelzi, hogy a DRD2 aktivitás finomhangolásában több utólagos transzlációs módosítás van. A DRD2 kiterjedt glikozilezését a korai fotó-affinitás címkézési tanulmányokban tártuk fel [7]és a DRD2-ben a diszulfidkötés kialakulását a ligandumkötés fontos módosításaként is azonosították [8]. Továbbá a DRD2 foszforilációs helyeit kezdetben azonosították in vitro radioaktív izotópokkal végzett vizsgálatot, amely különböző kinázok által közvetített különböző szabályozási útvonalakat biztosít [9]. Valóban, a protein kináz C (PKC) szabályozza az intracelluláris kalcium DRD2 által közvetített mozgósítását és modulálja a DRD2 kölcsönhatását a citoszkeletális fehérjékkel [10]. A GPCR kináz 2 (GRK2) foszforilációja szabályozza a DRD2 agonista által kiváltott rezenzitációs mintáit [11].

Az 5 (Cdk5) ciklin-függő kináz egy prolin által irányított szerin / treonin kináz, amelynek előnyös aktivitása lényeges aktivátorainak agyspecifikus expressziója miatt van, p35 és p39 [12]. A Cdk5 részt vesz különböző neuronális folyamatokban, beleértve az idegsejt-migrációt és az axon-irányítást, és a Cdk5 és a p35 null egerek hibákat mutatnak a kérgi rétegben [13]. A közelmúltban kimutatták, hogy a WAVE1 és az ephexin foszforilációja a Cdk5 által szabályozza a dendritikus gerinc morphogenezist. [14]. Továbbá a Cdk5 szabályozza az NMDA receptor, az NR2B és az NR2A által közvetített NMDA áramok felületi expressziós szintjeit is. [15], [16]. Érdemes megjegyezni, hogy több bizonyíték arra utal, hogy a Cdk5 és a dopamin rendszer közötti intim kapcsolat van. A Cdk5 foszforilálja a tirozin-hidroxilázt (TH), szabályozva annak stabilitását, és így fenntartja a dopaminerg homeosztáziát [17]. A posztszinaptikus neuronokban, amikor a dopamin T75 maradékát és a ciklikus AMP szabályozott foszfoprotein-32kD-t (DARPP-32) a Cdk5 foszforilálja, ez gátolhatja a PKA aktivitást, és ezáltal antagonizálhatja a dopamin DRD1 által közvetített PKA jelátvitelt [18]. Érdekes módon, ha a kokain, a dopamin receptorok közvetett agonista, patkányokban krónikusan kerül beadásra, a Cdk5 mRNS és fehérje szintje közepes tüskés neuronokban nő. [19]. Összességében úgy tűnik, hogy a Cdk5 részt vesz a gyógyszer által indukált szinaptikus adaptációkban. Ebben a tanulmányban a DRD2 és a Cdk5 funkcionális kölcsönhatását mutatjuk be, amely tovább növeli a Cdk5 szerepét a dopamin jelátvitelben.

Anyagok és módszerek

Az antitestek

A DRD321 harmadik intracelluláris hurokjának (D321i2) foszfo-szerin 2-et (pS3) tartalmazó peptidek ellen anti-nyúl szérumokat állítottunk elő. A foszfo-peptidet, a CNPDpSPAKPEK-et (PEPTRON) használtuk egy peptid-konjugált oszlop előállítására affinitás-tisztításhoz (20401, PIERCE). Az anti-pS321 antitestet a gyártó utasításainak megfelelően affinitás-tisztító rendszerrel dúsítottuk. A tisztított foszfo-antitestet PBS-ben tároltuk 0.1% nátrium-aziddal és 0.1% zselatinnal. Anti-egér anti-Cdk5 antitestet (sc-249) és anti-nyúl anti-p35 antitestet (sc-820) alkalmaztunk a Cdk5 / p35 Western blot és immunocitokémiai vizsgálatához. A DRD9996-GFP immunprecipitációjához és Western-blotolásához anti-egér anti-GFP antitestet (sc-2) használtunk. Anti-nyúl anti-FLAG antitest (sc-807), anti-nyúl anti-HA antitest (sc-805), egér anti-GST antitest (sc-138) és anti-egér anti-GAPDH antitest (sc-32293). XNUMX) megvásárolták a Santa Cruz Biotechnológiából.

Állatok

A p35 knockout egér egy kedves ajándék volt Dr. Katsuhiko Mikoshibatól a japán RIKEN Brain Science Institute-ben, és az elsődleges neuronkultúrát használta. A genotípusok primer készletei 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC és 5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT voltak, amint azt korábban leírtuk. [20]. ICR egereket és Sprague Dawley patkányokat alkalmaztunk az agy lizátum előállítására. Minden állatkísérletet a Pohang Tudományos és Műszaki Egyetem Intézményi Állatgondozási és Használati Bizottsága hagyott jóvá.

Plasmid Constructs

A humán DRD2 hosszú izoformát EGFP-N1 plazmidvektorban és a harmadik intracelluláris DRD2 hurkot (212-373 aminosavmaradékok, beleértve a DRD29 hosszú aminosavaihoz tartozó 2 aminosavmaradékokat is) egy pFLAG-CMV-2 plazmid vektorban használtuk. A humán Cdk5-et pCMV-HA plazmidvektorba inszertáltuk, és a humán p35-t pcDNA 3.1 plazmid vektorba inszertáltuk. A humán Cdk5-et a humán p35-vel együtt egy citomegalovírus (CMV) promoter alá helyeztük egy pcDNA 3.1 vektorba, hogy egy kettős expressziós konstrukciót (Cdk5 / p35) állítsunk elő az immunocitokémia, a receptor internalizációs vizsgálatához, [³⁵S] GTP_γS kötési vizsgálat, radioligand kötési vizsgálat és cAMP enzim immunoassay.

In vitro Kináz teszt

IP-linked in vitro a kináz vizsgálatot az alábbiak szerint végeztük. Egy teljes egér agyat lizáltunk 3 ml eritrociták lízis pufferében (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) egy Dounce homogenizátor 20 stroke-jával homogenizált agy lizátumokhoz . A lizátumokat jégen inkubáltuk 30 percig, ultrahanggal kezeltük, és 16,000-en centrifugáltuk. g az 10 min. A felülúszókat anti-nyúl anti-p35 antitesttel immunizáltuk, hogy aktív Cdk5 / p35 komplexet kapjunk. A Cdk5 / p35 komplexet és a tisztított GST fúziós fehérjét adenozin 5'-triposzfáttal összekevertük, [y-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) és kináz pufferben inkubáltuk (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) 1 h-ra szobahőmérsékleten [18], [21]. A tisztított Cdk5 / p25 komplexet (14 – 516, Millipore) szintén használtuk in vitro a fentiekben leírt módon. A reakcióelegyhez 2 × minta-töltő puffert adtunk és 100 ° C-on forraltuk. A mintákat ezután SDS-PAGE-nak vetettük alá, és a szárított gélt autoradiográfiával vizsgáltuk.

Folyadékkromatográfia (LC) -Mass spektrometria (MS) / MS analízis

A rekombináns GST-D2i3 fehérjét LC-MS / MS-vel elemeztük IP-kapcsolattal. in vitro kináz vizsgálat. Az LC-MS / MS adatok peptid azonosítását X !! Tandem (Dec-01-2008 verzió) segítségével végeztük. Minden RAW adatfájlt először átalakítottunk mzXML-re a transz-proteomikus csővezeték (TPP; 4.3 verzió) segítségével. Az átalakított mzXML-ekben az MS / MS vizsgálatokat ezután az UniProt egérfehérje szekvencia adatbázissal (2010_07 kiadás) végzett keresésnek vetettük alá, beleértve a GST-D2i3 szekvenciát X !! Tandem alkalmazásával. A toleranciát 3 Da értékre állítottuk be a prekurzor ionok és az 2 Da esetében a fragmensionok esetében. A tripszin enzim-specifitását használtuk. A cisztein (57.021 Da) karbamidometilezéséhez, a metionin (15.995 Da) oxidációjához, az aszparagin (0.987 Da) hidrolíziséhez és a szerin foszforilációjához (79.966 Da) változó módosítási lehetőségeket alkalmaztunk.

Immunoprecipitáció

Az immunprecipitációt az ELB lízis pufferben végzett sejtlizátumokon végeztük. Anti-GFP antitestet adtunk a lizátumokhoz, és 3 h-on 4 ° C-on inkubáltuk. Az immunkomplexeket fehérje-A agaróz alkalmazásával tisztítottuk. A csapadékot SDS minta töltő pufferrel inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on, és SDS-PAGE és Western blot-nak vetettük alá.

GST Pull-down Assay

10 µg tisztított GST-t és GST-D2i3-et patkány agy lizátummal inkubáltunk 1.5 h-on 4 ° C-on. A lízis pufferrel kiegyensúlyozott glutation (GSH) -konjugált Sepharose 30B gyöngyöket (4-17-0756, GE Healthcare) hozzáadtuk és további 01 h-ig inkubáltuk. A gyöngyöket centrifugálással összegyűjtöttük 1-ong és az 4 lízis pufferrel öblítjük [22], [23]. A csapadékot Western-blottal analizáltuk anti-Cdk5 és anti-p35 antitestek alkalmazásával.

immuncitokémiája

A transzfektált HEK 293 sejteket és a fedőlemezeken tenyésztett striatális neuronokat egyszer foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mossuk, és hideg 4% paraformaldehid / PBS-be merítéssel 30 min. Az elsődleges antitestet a blokkoló oldatban hígítottuk (2% lószérum és 1% Triton X-100 PBS-ben). Másodlagos antitestekként Alexafluor-647-konjugált anti-egér antitestet (A20990, Invitrogen) és Alexafluor-568-konjugált nyúl antitestet (A11011, Invitrogen) alkalmaztunk. Hoechst-et használtuk a magfestéshez. A képeket konfokális mikroszkóppal (Olympus, FluoView-1000) kaptuk.

Receptor internalizációs vizsgálat

24 h transzfekció után a sejteket 1 µM ​​quinpirollal (Q102, Sigma) kezeltük 30 percre és 90 percet 37 ° C-on. A sejteket 2 ml hideg PBS-ben újra szuszpendáltuk, és minden egyes reakcióhoz 200 µL alikvotokat használtunk. A gyógyszeres kezeléseket szobahőmérsékleten 3 h-ig végezzük a következő koncentrációkban; 3 nM [³H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​szulpirid (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofób [³H] -spiperont használtunk a teljes expresszált receptorok megjelölésére, és a hidrofil szulpiridet használtuk a membrán receptor kötődés helyettesítésére [³H] -spiperon jelek. A membránhoz kapcsolódó receptor jeleket úgy számítottuk ki, hogy az intracelluláris receptor értékeket levonjuk az összes expresszált receptor értékből. A sejteket GF / B (Millipore) szűrőn szűrtük, és 3-szereket mostuk mosó pufferrel (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). A szűrőket kiszárítottuk és a maradék radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval mértük [24].

A sejtmembrán előkészítése

A transzfekció után az 100 mm-es tenyészedényekben lévő konfluens sejteket jéghideg PBS-sel mostuk, és 1 ml HME pufferben (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl-ban gyűjtöttük.₂, 1 mM EDTA). A homogenizált lizátumokat 500 x g-vel centrifugáltuk 15 percben, majd a felülúszókat 36,000 x g-vel centrifugáltuk 30 min. A vizsgálathoz HME pufferben újra szuszpendált pelleteket használtunk.

[³⁵S] GTP_γS kötődési vizsgálat

A sejtmembrán-frakciókat előzetesen inkubáltuk 1 uM kinpirollal (Q102, Sigma) a vizsgálati pufferben (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂100 mM NaCl, 1 mM EDTA és 0.01 mM GDP) 10 min. [³⁵S] GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) adtunk az 3 nM végkoncentrációjához 30 µL-ben, és tovább inkubáltuk 90 min. 170 µl jéghideg puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂és 0.1 mM GTP-t adtunk a reakció leállításához. A membránokat GF / B szűrőn (Millipore) szűrtük, és 3-szereket mostuk mosó pufferrel (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). A szűrőket megszárítottuk és a radioaktivitást a szcintillációs számlálóval mértük [25], [26].

Radioligand kötési vizsgálat

Az előállított sejtmembránokat 0.01 nM-gyel inkubáltuk [³H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer) és a kinpirol (Q102, Sigma) növekvő koncentrációja 30 percben a vizsgálati pufferben (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂100 mM NaCl, 1 mM EDTA). A membránokat GF / B szűrőn (Millipore) szűrtük, és 3-szereket mostuk mosó pufferrel (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). A reakciót gyors szűréssel végeztük GF / C szűrőkön keresztül. A maradék radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval mértük [27]-[29].

cAMP Enzim Immunoassay

A transzfektált HEK 293-sejteket 10-hez 6520 uM roliprammal (R1, Sigma) előkezeltük, majd 0.1 µM ​​forskolinnal (F6886, Sigma) kezeltük és növekvő koncentrációjú quinpirolt (Q102, Sigma) 30 min. A primer tenyésztett striatális idegsejteket 10 µM ​​roliprammal kezeltük 1 h-re, majd 1 µM ​​dopamint 1 h-ra. [22]. A sejtlizátumokat 0.1 M HCI-vel állítottuk elő, és cAMP-szinteket detektáltunk cAMP enzim immunoassay kit (Sapphire Bioscience) segítségével a gyártó utasításait követve.

Elsődleges kultivált striatusi neuron

Striatális területet izoláltunk az egér embrionális agyából (E15). A leválasztott szövetet minimális esszenciális táptalajban (MEM) (11095, Invitrogen) disszociáltuk, amely 0.25% tripszint (T4549-100, Sigma) és 0.1% DNáz I-t tartalmaz 6 percig 37 ° C-on. A sejteket újraszuszpendáljuk a bevonó közegben (MEM 0.01 M HEPES (pH 7.4) és 10% (térfogat / térfogat) lószérummal (16050-122, GIBCO)). A neuronokat 7 napokon tenyésztettük in vitro (DIV 7) a MEM-ben a B27-kiegészítéssel (17504-044, Invitrogen), mielőtt a cAMP enzim immunvizsgálatokra alkalmazzuk.

Eredmények

Cdk5 Foszforilátok Serin 321 a DRD2 harmadik intracelluláris hurokjában in vitro

Az új Cdk5 szubsztrátumok azonosításához szisztematikus keresést végeztünk (S / T) PX (K / H / R) használatával Cdk5 felismerési konszenzus szekvenciákként [30] és azonosította a DRD2-et jelölt szubsztrátként. A konszenzusszekvencia, beleértve a szerin 321-et is, a DRD2 (D2i3) harmadik intracelluláris hurokjában található, ahol különböző szabályozási mechanizmusokat alkalmaztak [3], [10], [11]. A szekvenciát gerinces állatokban a DRD2-ben evolúciósan konzerváltuk, ami a maradék funkcionális jelentőségét jelenti.1A).

Letöltés:      

• PPT

  PowerPoint dia

• PNG

  nagyobb kép (2.08MB)

• TIFF

  eredeti kép (4.36MB)

1. A Cdk5 foszforilálja a szerin 321-et a DRD2 harmadik intracelluláris hurokjában in vitro.

(A) Aminosav-szekvencia illesztés, amely a DRD2 konzervált területeit mutatja be különböző fajokból (árnyékolt). A potenciális Cdk5 foszforilációs helyet csillag jelöli. (B) IP-kapcsolt in vitro rekombináns GST-D2i3 és GST-D2i3 mutáns fehérjékkel végzett kinázvizsgálat. A kináz reakciókhoz egér agyi extraktummal dúsított Cdk5 / p35 komplexet alkalmaztunk anti-p35 immunprecipitációval. A foszforilált fehérjék autoradiográfiája látható ugyanazon gél Coomassie briliáns kék festéssel együtt. A nyílhegy jelzi a GST-D2i3-eknek megfelelő radioaktív jelet, és a nyílhegy a p35 rádiójeleket jelzi. (C) A D2i3 foszforilezett peptidfragmense MS / MS spektruma. Az elméleti fragmentációs mintákat a spektrum alatt mutatjuk be. A fragmensionok közül az észlelt y- és b-ionokat a spektrumban jelöljük. Ők₆ és y₇ Az ionok erősen jelzik a szerin 321 foszforilációját. (D) In vitro kináz assay tisztított Cdk5 / GST-p25 komplex alkalmazásával GST-D2i3 és GST-D2i3 mutáns fehérjékkel. A foszforilált fehérjéket egy autoradiográfián mutatjuk be, a Coomassie briliáns kék festéssel együtt. A nyílhegy jelzi, hogy a GST-D2i3 megfelelő radioaktív jel és a nyílhegy a GST-p25 radioaktív jelét jelzi.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

A Cdk5 D2i3 foszforilációjának kapacitásának értékeléséhez IP-kapcsolt in vitro kináz vizsgálatokat alkalmazva, aktív Cdk5 / p35 komplexet használva, amely szubsztrátként p35 immunprecipitációval tisztított rekombináns GST-D2i3 (aminosavmaradékok 212 – 373) fehérjékkel gazdagodott. Foszforilációs jeleket figyeltünk meg a tisztított GST-D2i3 és GST-D2i3 S297A fehérjékben, de a jel jelentősen csökkent a GST-D2i3 S321A alkalmazásával (1B). A szerin 321 foszforilációjának további ellenőrzésére a GST-D2i3-ben az IP-kapcsolt minták LC-MS / MS elemzését végeztük el in vitro kináz vizsgálatok LTQ XL tömegspektrometriával. Következésképpen a foszfo-peptidek, amelyek megfelelnek a foszfo-szerin 321 peptidek tömegének, kinyerhetők (1C). Figyelembe véve, hogy az adatfüggő megszerzés az LC-MS / MS elemzés során hajlamos kimutatni a bőséges fehérjéket a mintában [31]ez az adat arra utal, hogy a szerin 321 maradék a Cdk5 domináns foszforilációs helye a D2i3 régióban. A Cdk321 által a GST-D2i3-ben lévő szerin 5 közvetlen foszforilációjának igazolása, in vitro a tisztított rekombináns GST-D5i25 fehérjékkel tisztított Cdk2 / GST-p3 komplexet alkalmazó kináz vizsgálatot végeztünk. A GST-D2i3 S2A-ban hiányzó jelentős foszforilációs jelet azonosítottunk a GST-D3i321-ben.1D). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a D2i3 S321 maradék a Cdk5 által közvetített foszforiláció előnyös célpontja.

Cdk5 Foszforilátok Serin 321 a harmadik intracelluláris hurokban a DRD2 sejtekben

A szerin 321 foszforilációjának azonosításához a foszfo-szerin 321-re specifikus antitestet (pS321) emeltünk. Az IP-kapcsolt minták in vitro a kináz vizsgálatot Western-blottal analizáltuk anti-pS321 ellenanyag alkalmazásával. A blotok a GST-D2i3-től függő kinázreakcióban külön sávot mutattak (2A). A Cdk321-ben lévő DRD2-ben lévő szerin 5 potenciális foszforilációjának igazolására a DRD293-GFP-t és a DRD2 S2A-GFP-t expresszáló HEK 321 sejtekből származó anti-GFP immunprecipitátumokat HA-Cdk5-rel és p35-rel vagy anélkül analizáltuk anti-GFP és anti-pS321 antitestek. A DRD2 túlzott glikozilációjának köszönhetően az anti-GFP antitest által jellemzett, elkenődött sáv jeleket csak DRD2-GFP jelenlétében figyeltük meg, és az anti-pS321 antitest csak a Cdk2 / p5 ko-expresszióval azonos DRD35 jeleket észlelt (2B) [7]. A Cdk321, a D5i2 (FLAG-D3i2) és a D3i2 mutáns formájának (FLAG-D3i2 S3A) foszforilezésének további ellenőrzésére a D321i2 (FLAG-D3i2). Az FLAG-D3i321 és az FLAG-D5i35 S293A-t, melyet a HEK 5 sejtekben HA-Cdk2 és p3-ekkel expresszáltunk, vagy SDS-gél mobilitási eltolódási vizsgálattal elemeztünk. Jelentős Cdk2-függő mobilitási eltolódást figyeltek meg a FLAG-D3i321 esetében, de nem az FLAG-DXNUMXiXNUMX SXNUMXA esetében (2C). Az agonista stimulálás során a Ser2-on végzett DRD321 foszforilációs szintjét is értékeltük. A DRD293-GFP és a Cdk2 / p5 komplexet expresszáló HEK 35 sejteket quinpirol stimulálta, és a sejt lizátumokból származó anti-GFP immunprecipitátumokat Western-blottal analizáltuk anti-GFP és anti-pS321 antitestek alkalmazásával. Azt találtuk, hogy a DRD5 CXK2 által közvetített foszforilációja a Ser321-on nem befolyásolta az agonista stimulációt, amely eltér a GRK- és PKC-közvetített foszforilációtól (2D) [32], [33]. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a Cdk5 képes foszforilálni a DRD321 szerin 2 maradékát a sejtkörnyezetben.

Letöltés:      

• PPT

  PowerPoint dia

• PNG

  nagyobb kép (1.92MB)

• TIFF

  eredeti kép (3.5MB)

2. A Cdk5 foszforilálja a szerin 321-et a DRD2 harmadik intracelluláris hurokjában a sejtekben.

A szerin 5 Cdk321 által közvetített foszforilációját anti-pS321 antitest segítségével analizáltuk. (A) IP-kapcsolt minták in vitro A GST-D2i3 fehérjéket alkalmazó kináz assay-t Western-blotolással (WB) analizáltuk jelzett antitestekkel. A nyilak a GST-D2i3-eket jelzik. (B) DRD2-GFP és DRD2 S321A-GFP expresszióját a HEK 5 sejtekben HA-Cdk35 és p293-ekkel vagy anélkül fejeztük ki. Az anti-GFP immunprecipitátumokat Western-blottal analizáltuk anti-GFP és anti-pS321 antitestek alkalmazásával. A konzol a DRD2 jeleket jelzi, és a nyílt nyílhegy nem specifikus jeleket jelez az anti-GFP immunprecipitátumokból. A „% input” az IP-reakcióhoz tartozó teljes lizátum térfogat%. A gyenge endogén Cdk5 jeleket csillaggal jelöltük. (C) Gél mobilitási eltolódási vizsgálat. A jelzett módon transzfektált HEK 293 sejteket Western blottal analizáltuk. (D) A transzfektált HEK 293 sejteket kinpirollal kezeltük, és az anti-GFP immunprecipitátumokat Western-blottal analizáltuk anti-GFP és anti-pS321 antitestekkel. A nyílhegy az anti-GFP immunprecipitátumokból származó nem specifikus jeleket jelzi.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

A Cdk5 / p35 komplex és a DRD2 fizikailag társult

Megvizsgáltuk a Cdk5 / p35 komplex és a DRD2 közötti potenciális fizikai kölcsönhatást, mivel sok Cdk5 szubsztrát fizikailag társult a Cdk5 / p35 komplexhez [23], [34], [35]. Először a GST legördülő kísérletet hajtottuk végre. A tisztított rekombináns GST-D2i3 fehérjét patkány agy lizátummal inkubáltuk, és a GST lehúzható csapadékokat Western-blot vizsgálatnak vetettük alá. Ahogy látható 3AAz endogén Cdk5-et és a p35-et a legördülő csapadékokban azonosítottuk, jelezve a DRD2 és a Cdk5 / p35 komplex közötti fizikai kölcsönhatást (3A). Továbbá, a H-5-sejt lizátumokból származó, DRD35-GFP-t és Cdk293-et / p2-et expresszáló anti-GFP immunprecipitátumokban HA-Cdk5 és p35 detektáltak.3B). Emellett immunocitokémiai elemzéseket végeztünk, és megfigyeltük, hogy a DRD2-GFP, a HA-Cdk5 és a p35 szignifikáns ko-lokalizációs jeleket mutat a HEK 293 sejtek membrános területén (3C, felső panelek). A DRD2 és a Cdk5 / p35 együttes lokalizációját is vizsgáltuk a neuronális kontextusban. Következésképpen a DRD2-GFP szignifikáns együttes lokalizációt mutatott az endogén Cdk5 és p35-ekkel a tenyésztett striatális neuronokban (DIV7), tovább támogatva a DRD2 és a Cdk5 / p35 közötti funkcionális kapcsolatokat (3C, alsó panelek). Az eredmények azt mutatják, hogy a DRD2 és a Cdk5 / p35 komplexet képezhet, és így támogathatja azt az elképzelést, hogy a DRD2 a Cdk5 fiziológiai szubsztrátja.

Letöltés:      

• PPT

  PowerPoint dia

• PNG

  nagyobb kép (3.91MB)

• TIFF

  eredeti kép (5.35MB)

3. A Cdk5 / p35 komplexet képezhet DRD2-el.

(A) GST lehúzható vizsgálat, tisztított rekombináns GST-D2i3 fehérjével, patkány agykivonattal. A GST lehúzható csapadékokat Western blot analízisnek vetettük alá. A "gyöngy" a GST fehérjék nélküli lehulló csapadékot jelzi. (B) DRD2 és Cdk5 / p35 komplex immunprecipitációja. A transzfektált sejtek lizátumaiból származó anti-GFP IP-t Western-blot analízisnek vetettük alá. A konzol a DRD2 jeleket jelzi, és a nyílt nyílhegy nem specifikus jeleket jelez az anti-GFP immunprecipitátumokból. A jobb oldalon látható a bemenetek túlzott expozíciója is. (C) DRD2 és Cdk5 / p35 immunocitokémiai elemzése. A DRD293-GFP-t és a Cdk2 / p5-et expresszáló HEK 35 sejteket anti-Cdk5 és anti-p35 antitestekkel (felső panelek) festettük. A DRD2-GFP-t egyedül expresszáltuk a tenyésztett striatális neuronokban, és anti-Cdk5 és anti-p35 antitestekkel (alsó panelek) festettük. Hoechst-et használtuk a magfestéshez. A méretarány 5 µm. Minden képet konfokális mikroszkóppal (Olympus, FluoView-1000) készítettünk.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

A DRD5 Cdk2 által közvetített foszforilációja Lelassítja a receptor aktivitását

Azt jelentették, hogy a foszforiláció modulálja a GPCR-ek kritikus tulajdonságait, mint például a G-fehérje kapcsolást, a receptor-internalizációt, az intracelluláris lokalizációt és a modulátor fehérjékhez való kapcsolódást [9], [11], [24]. AA gonista által indukált receptor internalizáció a jelátvitel kritikus szabályozási folyamata. A DRD5 internalizáció Cdk2 által közvetített modulációját vizsgáltuk. A DRD293-GFP-t és a DRD2 S2A-GFP-t expresszáló HEK 321 sejteket Cdk5 / p35-el vagy anélkül inkubáltuk 1 µM ​​kinpirollal agonista által stimulált DRD2 internalizáció indukálására (4A). [³A DRD2-GFP-t expresszáló sejtek H] -spiperon-jeleit szignifikánsan csökkentették 30 min quinpirol kezelésben, és 90 min. Érdekes, [³A DRD2-GFP és a Cdk5 / p35 expresszáló sejtek H] -spiperon-jeleit szintén csökkentettük 30 min quinpirol-kezeléssel, de 90 min.4A, második szakasz). Másrészről, [³A DRD2 S321A-GFP-t expresszáló sejtek H] -spiperon-jeleit 30 percben redukáltuk és 90 percen belül kinyertük, függetlenül a Cdk5 / p35-vel való együttes expressziótól. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az internalizált DRD2 visszanyeri a plazmamembránba hosszabb agonista stimuláció után. [11]. TÚgy tűnik, hogy a DRD5 Cdk2 által közvetített foszforilációja részt vesz az agonista által indukált DRD2 internalizáció után fellépő reszenzitizációs folyamatokban.

Letöltés:      

• PPT

  PowerPoint dia

• PNG

  nagyobb kép (387KB)

• TIFF

  eredeti kép (1.31MB)

4. A Cdk5 által közvetített foszforiláció csillapítja a DRD2 felszíni expressziót és a lefelé irányuló jelátvitelt.

(A) DRD2 felületi expressziója [³H] -spiperon-kötési vizsgálat. A transzfektált HEK293 sejteket 1 µM ​​kvinpirollal stimuláltuk a jelzett időre és betakarítottuk, majd 3 nM [³H] -spiperon-kezelés 3 órán át. Megmértük a radioaktivitást és kiszámítottuk a felszíni jeleket. A hibasávok az átlag ± SE értékét jelentik (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Egyirányú ANOVA Dunnett post hoc teszttel: hasonlítsuk össze az összes oszlopot a kontroll oszloppal). (B) [³⁵S] GTP_γS kötési vizsgálat. A sejtmembránokat a jelzett sejtekből transzfektáltuk. A membránkészítményeket 1 µM ​​quinpirollal inkubáltuk, majd 3 nM [³⁵S] GTP_γS 90 percig. A hibasávok az átlag ± SE értékét képviselik (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Egyirányú ANOVA Bonferroni post hoc teszttel: hasonlítsuk össze az összes oszloppárt). (C) Quinpirol-versengő [³H] -spiperon-kötési vizsgálat. A transzfektált sejtek membránkészítményeit 0.01 nM-gyel inkubáltuk [³H] -spiperon és növekvő koncentrációjú quinpirol 30 percig. A nemlineáris regressziót a GraphPad segítségével kaptuk meg. A hibasávok az átlag ± SE (n = 3) értéket mutatják. (D) cAMP enzim immunvizsgálatok transzfektált HEK 293 sejtekben. A transzfektált sejteket előkezeltük 10 µM roliprammal 1 órán át, majd ezt követően együtt kezeltük 0.1 µM forskolinnal és növekvő koncentrációjú quinpirollal 30 percig. A nemlineáris regressziót a GraphPad segítségével kaptuk meg. A hibasávok az átlag ± SE értékét jelentik (n = 4; ** p <0.01; kétfarkú t-tests). (E) A vad típusú és p35 knockout embriók (DIV 7) tenyésztett striatális neuronjait 10 µM ​​roliprammal kezeltük 1 h-hez, majd 1 µM ​​dopamint 1 h-ra. A hibarészek átlag ± SE (n = 4; **p<0.01; kétfarkú t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Továbbá értékeltük a Cdk2 által közvetített foszforilációval összefüggő DRD5-hez való agonista-stimulált G-fehérje-kapcsolás lehetséges változását [³⁵S] GTP_γS kötési vizsgálat [25], [26]. A DRD2-GFP-t és a DRD2 S321A-GFP-t Cdk5 / p35-sel vagy anélkül fejeztük ki HEK 293 sejtekben. A membránokat előállítottuk és 1 µM ​​quinpirollal stimuláltuk, és tovább engedélyeztük [³⁵S] GTP_γS beépítés. A DRD2-GFP és a Cdk5 / p35 expresszáló sejtmembrán szignifikánsan romlott [³⁵S] GTP_γS kötődés az összes többi sejtmembránhoz képest (4B). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Cdk5 által közvetített foszforiláció szabályozza az agonista által stimulált G fehérje kötődését a DRD2-on.

Továbbá, quinpirole-versengő [³H] -spiperon-kötődési vizsgálatokat végeztünk annak vizsgálatára, hogy a DRD2-en az agonista-affinitás bármely lehetséges változása Cdk5-közvetített foszforilációval történt. [[³H] -spiperont a transzfektált membránkészítményre növekvő kinpirolkoncentrációk kezelésére mértünk. A quinpirole és [³H] -spiperon a DRD2-GFP és a DRD2 S321A-GFP esetében hasonló logK_i értékek (-9.789 a DRD2-GFP esetében; -9.691 a DRD2 S321A-GFP esetében), ami azt jelzi, hogy a ligandum DRD2-hez való affinitását nem befolyásolja szignifikánsan a Cdk5 által közvetített foszforiláció a DRD2-on (4C).

Cdk5-közvetített foszforiláció A DRD2-cAMP jelzőút szabályozása

Ezután azt vizsgáltuk, hogy a Cdk2 által a DRD5 módosítása befolyásolja-e a lefelé irányuló jelátviteli útvonalakat. A forskolin által stimulált cAMP-termelés DRD2-közvetítésében a DRD2-GFP-t és a DRD2 S321A-GFP-t expresszáló sejtekben a cAMP enzim immunoassay segítségével expresszáltuk a DRD2 által közvetített gátlását. A DRD5-t expresszáló sejtek a cinpirolra adott dózis-függő módon csökkent cAMP-szintet mutattak. Figyelemre méltó, hogy a Cdk35 / pXNUMX ko-expressziója jelentősen csökkentette a cAMP képződés maximális gátlását (4D ábra, bal panel). Másrészről a DRD2 S321A-GFP-t expresszáló sejtekben a cAMP-képződmények hatékonyan gátolódtak a quinpirole kezelés hatására, függetlenül a Cdk5 / p35 expressziójától.4D ábra, jobb oldali panel). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a DRD5 Cdk2 által közvetített foszforilációja gyengíti a DRD2 gátló aktivitását a cAMP jelátviteli pályán. Annak érdekében, hogy a jelenségeket egy fiziológiailag relevánsabb környezetben is megerősítsük, a p35-ben hiányos primer tenyésztett neuronokat alkalmaztuk, ami egy lényeges Cdk5 aktivátor. Az elsődlegesen tenyésztett striatális neuronokat 1 µM ​​dopaminnal kezeltük és cAMP enzim immunoassay-val analizáltuk. A p35 knockout egerekből származó neuronok csökkent cAMP-szinteket mutatnak a vad típusú neuronokhoz képest, amikor dopaminnal stimuláltuk.4E). TÖsszefoglalva azt a következtetést vontuk le, hogy a DRD5 Cdk2 által közvetített foszforilációja a DRD2 által kifejtett cAMP útvonalon a gátló tónus csökkenését eredményezi.

Megbeszélés

A DRD2-et a Cdk5 új szubsztrátumaként azonosítottuk. Úgy tűnik, hogy a foszforiláció a DRD2 sorsát befolyásoló DRD2 felszíni expresszióját lefelé szabályozza, és ezáltal csökkenti a DRD2 G-t._iösszekapcsolás és a cAMP lefelé irányuló útvonal. Mivel a S321 foszforilációs maradék mind a DRD2 hosszú, mind a rövid izoformákban egyaránt létezik, a vizsgálatban javasolt mechanizmus a DRD2 által közvetített jelátvitel általános szabályozási módja lehet..

A közepes tüskés neuronokban a DRD2-et nem csak a dopamin receptorok altípusának tekintették, hanem a környezeti ingerekre adott válaszadási változások iránti érzékenységét is felismerték. A DRD2 agonista által kiváltott deszenzitizálását és reszenzitizálását széles körben tanulmányozták [11], [24]. Különösen számos tanulmány kimutatta, hogy a krónikus pszichostimuláns expozíció, például a kokain és az amfetamin hatásai, amelyek a striatális szinapszisban fokozzák a dopamin extracelluláris szintjét, a DRD2 dinamikus változásai kísérik a posztszinaptikusan. [36]. Valójában ismert, hogy a krónikus kokainhasználók csökkentették a DRD2 szinteket a striatális területen, és a DRD2 rendelkezésre állása a nukleáris accumbensben (NAcc) negatív korrelációt mutat az egerekben és főemlősökben a kábítószer-kereső és megerősítő viselkedéssel. [37]-[39]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a DRD2 funkcionalitása rendkívül érzékeny az adaptív vagy kompenzáló szabályozásra a különböző ingerekre, beleértve a krónikus hatóanyag-expozíciót. Eredményeink azt mutatják, hogy a DRD321 harmadik intracelluláris hurokjában lévő S2 maradékot a Cdk5 képes foszforilálni, ami a DRD2 gátló hatásának csökkenését eredményezi a cAMP útvonalon. Ez a kölcsönhatás olyan új szabályozási mechanizmust javasol, amely a Cdk5-hez kapcsolódik a dopaminoceptív neuronokhoz, ami a DRD2 felszíni rendelkezésre állásának dinamikus jellegéhez kapcsolódik.

Meg kell jegyezni, hogy a Cdk5 ismert, hogy kulcsfontosságú eleme a neuronális környezet adaptív változásainak közvetítésében. Például a dendritikus gerincek szerkezeti és funkcionális változásai a limbikus áramkör neuronjaiban az ismételt pszichostimuláns expozíció egyik következménye. [40]. Ezeket a változásokat különböző molekuláris változások kísérik, beleértve a cAMP válaszelem-kötő fehérje (CREB) és az AFosB transzkripciós faktorok indukcióját, amelyek a krónikus kokain-kezelésre adott válaszként tartósan szabályozódnak [41], [42]. Fontos, hogy a Cdk5 az ΔFosB célpontja [19], és számos dendritikus gerincdinamikában szerepet játszó kritikus komponens, mint például a PSD-95, a p21-aktivált kináz (PAK), a β-catenin és a spinofilin, Cdk5 szubsztrátként jelentettek [43]-[46]. A Cdk5 aktivitásának következetesen, genetikai vagy farmakológiai manipulációi megváltoztatják a dendritikus gerinc morfológiáját és a kokainra adott viselkedési válaszokat, ami a Cdk5 kritikus szerepét jelenti a mesolimbikus dopamin áramkörök molekuláris és morfológiai változásaiban [47], [48]. Az eredmények azt mutatják, hogy a DRD2 a Cdk5 új célpontja további betekintést nyújt a dopamin rendszer adaptív változásaiba a krónikus hatóanyag-expozícióra adott válasz miatt, mivel a Cdk5 későbbi αFosB által közvetített fel-szabályozása tonikus növekedést okozhat a DRD2 foszforilációjában . Emellett ismert, hogy a DRD2 számos sejtes folyamatot befolyásol, beleértve a cAMP és MAP kináz útvonalak szabályozását és a lefelé irányuló transzkripciós eseményeket. [42], [49]. Ezért a vizsgálat eredményei nemcsak a DRD2 közvetlen szabályozását mutatják be a Cdk5 által, hanem újszerű betekintést nyújtanak a dopamin rendszer adaptív válaszaiba a krónikus hatóanyag-expozícióra.

Szerzői hozzájárulások

Megtervezték és tervezték a kísérleteket: JJ YUP DH SKP. A kísérleteket elvégezte: JJ YUP DKK YK. Az adatok elemzése: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Hozzájárult reagensek / anyagok / elemző eszközök: YHS. Írta a papírt: JJ SKP.