Absztrakt
A dendritikus tüskék pszichostimuláns indukálta megváltozása a dopaminoceptív neuronokon a nukleáris accumbensben (NAcc) hipotézisként adaptív neuronális válasz, amely a tartós addiktív viselkedéshez kapcsolódik. A NAcc-t nagyrészt két, a dopamin D1 vagy D2 receptor magas szintjét expresszáló közepes méretű tüskés neuronok alpopulációjából áll. A jelen tanulmányban a dendritikus gerincsűrűséget krónikus kokainkezelés után elemeztük különböző D1 vagy D2 receptor-tartalmú közepes méretű tüskés neuronokban a NAcc-ben. Ezek a vizsgálatok olyan transzgenikus egereket alkalmaztak, amelyek EGFP-t expresszáltak a D1 vagy D2 receptor promoter (Drd1-EGFP vagy Drd2-EGFP) kontrollja alatt. A kokain kezelés 28 napja és a 2 elvonási napok után a gerincsűrűség mind a Drd1-EGFP-, mind a Drd2-EGFP-pozitív neuronokban nőtt. A gerincsűrűség növekedését azonban csak a Drd1-EGFP-pozitív neuronokban tartottuk fenn 30 nappal a gyógyszer visszavonása után. Nevezetesen, a Drd1-EGFP- és Drd2-EGFP-pozitív neuronokban a megnövekedett AFosB-expresszió 2 napok után történt, de csak a Drd1-EGFP-pozitív neuronokban, a 30 napok után. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a krónikus kokainkezelés után megfigyelt megnövekedett gerincsűrűség csak a D1-receptor-tartalmú neuronokban stabil, és hogy az AFosB expressziója a dendritikus tüskék kialakulásához és / vagy fenntartásához kapcsolódik, valamint a D1 receptor-tartalmú neuronokhoz. a NAcc-ben.
A mezolimbikus dopaminerg útvonal a ventrális tegmentális területen lévő neuronokból áll, amelyek megfertőzik a nukleáris accumbenset (NAcc), a szagló tubercle, a prefrontális kéreg és az amygdala (1), míg a nigrostriatális dopaminerg neuronok a materia nigra-ban (pars compacta) növekvő vetületet biztosítanak a dorsalis striatumra (2). A pszichostimulánsok növelik a dopamin szinaptikus koncentrációit a NAcc-ben: a kokain, a dopamin felvételének gátlásával a szinaptikus hasadékból és az amfetaminból az idegvégződésekből származó dopamin felszabadulás előmozdításával (3-5). A pszichostimulánsok ismételt, szakaszos beadása a viselkedési válaszok (szenzibilizáció) megnövekedett hatását idézi elő ezeknek a gyógyszereknek az akut stimuláló hatásaihoz6-8). A legtöbb bizonyítéksor arra utal, hogy a ventrális tegmentális terület – NAcc dopaminerg rendszer adaptív változásai központi szerepet játszanak a tapasztalatfüggő plaszticitás megváltozásában, amely a gyógyszer által okozott viselkedés alapját képezi.
A dopamin mellett a pszichostimulánsokra adott válaszként a glutamát a viselkedési érzékenység kialakításához szükséges (9, 10). A közepes méretű tüskés neuronok (MSN) a ventrális striatumban izgatott glutamatergikus vetületeket kapnak a prefrontális kéregből, amelyek szinapszanak a dendritikus tüskék fejére. Az MSN-k szintén a dopaminerg axonok fő célpontjai, amelyek szinapszanak a gerinc nyakára (1, 11, 12). Ezért az MSN-ekben a dendrites tüskék képviselik a sejtkamrát, ahol a dopaminerg és glutamáterg transzmisszió kezdetben integrált.
A dopamin két fő receptor alcsaládra, a D1 alcsaládra (D1 és D5 altípusokra) és a D2 alcsaládra (D2, D3 és D4 altípusokra) hat.13). A dorsalis striatumban az anatómiai vizsgálatok kimutatták, hogy a striatonigrális MSN-ek nagy mennyiségű D1-receptorot tartalmaznak (a P és a dinorfinnal együtt), míg a striatopallidális MSN-ek túlnyomórészt D2-receptorokat expresszálnak (együtt enkefalin).14-17). A NAcc vetületei bonyolultabbak, mint a dorzális striatumban, a NAcc héja és magrészei a ventrális pallidum különböző alrégióira és a ventrális tegmentális területre és a materia nigra-ra (18). Míg a D2 receptorok és az enkefalin nagy mértékben expresszálódnak a ventrális pallidumhoz képest, a D1 receptorok és a P anyag egyenlő eloszlásúak a ventrális pallidum és ventrális tegmentális területeken (19). A D1 vagy D2 receptorokra szelektív agonisták és antagonisták vizsgálatai azt mutatták, hogy mind a D1, mind a D2 receptorok szükségesek a pszichostimuláns függő viselkedési változásokhoz (20-25). Ezeknek a receptoroknak a szerepe azonban másnak tűnik. Például a D1 receptorok stimulálása gyengíti a kokainkérést, amelyet a kokainalapozó injekciók és a kokainhoz kapcsolódó környezeti jelek indukálnak, míg a D2 receptorok stimulálása megkönnyíti a kokain által indukált visszaállítást (26-28).
A pszichostimuláns függőséggel kapcsolatos viselkedési rendellenességek rendkívül hosszú életűek. Ezért a dopamin és a glutamát által szabályozott neuronális áramkörökben jelentős érdeklődés mutatkozik a hosszú távú gyógyszerindukált molekuláris és szerkezeti változások azonosításában.29-32). Különösen a kokain vagy az amfetamin hosszú távú expozíciója kimutatta, hogy növeli a dendritikus ágak és az MSN-ek tüskék számát a NAcc-ben (33-35). Ezek a szerkezeti változások az utolsó kábítószer-expozíció után ≈1 – 3.5 hónapig fennmaradtak (30, 35) és azt javasolják, hogy a pszichostimuláns expozícióval összefüggő szinaptikus plaszticitás hosszú távú változásait alapozzák meg.
Jelen tanulmány célja a dendritikus gerincek kokain által kiváltott szerkezeti átalakulásának vizsgálata a D1 vagy a D2 receptorokat expresszáló accumbális MSN-ek alpopulációiban. Ezekben a vizsgálatokban olyan bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC) transzgenikus egereket alkalmaztunk, amelyek EGFP-t expresszálnak a D1 (Drd1-EGFP) vagy D2 (Drd2-EGFP) dopamin receptor promoter (36). Az eredmények azt mutatják, hogy bár a fokozott gerincsűrűség kezdetben D1 receptor-tartalmú MSN-ekben és D2 receptor-tartalmú MSN-ekben fordul elő, a megváltozott gerincsűrűség csak a D1 receptor-tartalmú neuronokban stabil. Ezenkívül hasonló változásokat tapasztalunk az ΔFosB transzkripciós faktor expressziójában, ami arra utal, hogy az AFosB részt vehet a dendritikus gerincek kialakulásában és / vagy fenntartásában a D1-ben, valamint a D2 receptor-tartalmú neuronokban a NAcc-ben.
Eredmények
MSN-ek elemzése Drd1-EGFP és Drd2-EGFP BAC transzgenikus egerekben.
A Drd1-EGFP vagy Drd2-EGFP BAC transzgenikus egerekben a dorzális és ventrális striatumból származó MSN-ek vetületi mintázatát a GFP-expresszió elemzésével jellemeztük (36). A GFP differenciális expressziója a dorsalis striatum MSN-jében általában megfelel az endogén D1 vagy D2 receptorok expressziójának (36). Továbbá elemeztük a GFP differenciális expresszióját NAcc-ben Drd1-EGFP vagy Drd2-EGFP egerekben (Ábra 1a és a b). Bár a NAcc neuronok ≈58% -a expresszált GFP-t Drd1-EGFP egerekben (Ábra 1a), A NAcc neuronjainak ≈48% -a expresszált GFP-t Drd-2-EGFP egerekben (Ábra 1b). Az MSN-ek az NAcc összes neuronjának 90 – 95% -át képviselik (12, 37). A D1 receptorokat csak MSN-ekben expresszálják, és a D2 receptorokat MSN-ekben és kolinerg interneuronokban fejezik ki, amelyek a striatális neuronok 1 – 3% -át képviselik (37). Ezeket a tényezőket figyelembe véve az eredmények arra utalnak, hogy a NAcc-ben lévő MSN-ek minimális ≈10 – 15% -a valószínűleg mind a D1, mind a D2 receptorokat expresszálja.
Dendritikus tüskék elemzése Drd1-EGFP és Drd2-EGFP egerekben.
A GFP expressziója a Drd1-EGFP és a Drd2-EGFP egerekben hasznos volt a neuronális sejtek festésére. A dendritekben és a dendrites tüskékben a GFP-jel azonban túl gyenge volt ahhoz, hogy az anti-GFP antitestekkel végzett immunfestés után elemezhető legyen. A fluoreszcens festékek részecskék által közvetített ballisztikus adagolását a közelmúltban alkalmazták a neuronális populációk gyors és hatékony megjelölésére (38). A teljes idegsejteket ezzel a módszerrel jelölhetjük, és a módszer hasonlónak tűnik a Golgi – Cox festéssel. A NAcc-ben lévő neuronok dendritikus morfológiájának elemzéséhez fix rögzített szeleteket jelöltek 1,1'-diotadecil-3,3,3 'lipofil festékkel, 3-tetrametil-indokarbocianin perkloráttal (DiI) génpisztoly alkalmazásával. A DiI-festett MSN példája látható Ábra 1c. Az alkalmazott körülmények között általában jelölt neuronokat figyeltünk meg, anélkül, hogy átfedő dendriteket szereztünk más jelölt neuronokból. Nagyobb nagyítás esetén részletes dendritikus morfológiát, köztük dendritikus tüskéket is megfigyeltek (Ábra 1d).
Ezután a DiF-jelölés és az immunhisztokémia kombinációját használtuk a GFP-hez a Drd1-EGFP vagy a Drd2-EGFP transzgenikus egerekben, melyet alacsony koncentrációjú detergens alkalmazásával lehetett elérni a szövet permeabilizálására (lásd Mód). A DiI-foltok és a GFP-expresszió gondos összehasonlításával az MSN sejtek sejtjeiben azonosítottuk a DiI- és GFP-pozitív vagy DiI-pozitív és GFP-negatív neuronokat a Drd1-EGFP-ben (Ábra 2a) vagy Drd2-EGFP (Ábra 2b) egerek. A következő vizsgálatokban a dendritikus morfológiát csak a Drd1-EGFP vagy Drd2-EGFP egerek DiI- és GFP-pozitív neuronjaiban vizsgáltuk.
Krónikus kokainkezelési eredmények a Drd1-EGFP-t vagy a Drd2-EGFP-t expresszáló Accumbal MSN-ek fokozott gerincsűrűségében.
A Drd1-EGFP vagy a Drd2-EGFP egereket négy egymást követő héten ismételten kokainnal (30 mg / kg) vagy sóoldattal injektáltuk (lásd Mód). Két nap (2WD) vagy 30 nap (30WD) az utolsó gyógyszeres kezelés után, az agyokat DiI jelölés és immunhisztokémia céljából dolgoztuk fel a fent leírtak szerint. Egy korábbi tanulmány szerint az amfetamin krónikus kezelése fokozta a gerincsűrűséget az MSN-ek távoli, de nem proximális dendritjeiben a NAcc-ben (35). Az elemzésünket tehát a disztális dendritekre (azaz a második vagy harmadik rendű ágakkal rendelkező), beleértve a terminális régiókat is, korlátozzuk. 2WD-vel elemezve a gerincsűrűséget a Drd1-EGFP-pozitív MSN-ekben (128% sóoldatcsoport) növelték (Ábra 3a és a c) és kisebb mértékben a Drd2-EGFP-pozitív neuronokban (115% sóoldatcsoport) (Ábra 3 b és a d). 30WD után a Drd1-EGFP-pozitív neuronokban megnövekedett gerincsűrűséget (118% a sóoldat-kontroll) tartottuk fenn.Ábra 3 a és a c), de nem a Drd2-EGFP-pozitív neuronokban (Ábra 3 b és a d).
A dendritikus gerincek morfológiája hosszúsága és a gerincfej szélessége tekintetében változó. Ezért a dendritikus nyúlványokat négy spin osztályba soroltuk (makacs, gomba, vékony és filopodia) a kokainból származó 2WD-nél (az adatokat nem mutatjuk be). A gombatípus sűrűsége (119.7 ± 4.0%, P <0.01) és vékony tüskék (120.0 ± 3.4%, P <0.01) a kokainkezelés növelte Drd1-EGFP-pozitív MSN-ekben, míg a makacs sűrűsége (182.4 ± 21.6%, P <0.05) és a gombatüskék (122.5 ± 5.0%, P <0.01) növekedett a Drd2-EGFP-pozitív MSN-ekben. Nem volt szignifikáns növekedés a rögös gerincekben a Drd1-EGFP-pozitív idegsejtekben vagy a vékony tüskékben a Drd2-EGFP-pozitív neuronokban.
A krónikus kokain αFosB expressziót indukál Drd1-EGFP- vagy Drd2-EGFP-pozitív MSN-ekben a NAcc-ben.
Az AFosB a transzkripciós faktorok Fos családjának tagja. Míg a kokain akut adagolása számos Fos izoforma gyors és átmeneti indukálását indukálja NAcc-ben, a kokain ismételt expozíciója növeli az ΔFosB szintjét. Továbbá az ΔFosB expresszió növekedése a NAcc-ben a gyógyszer-expozíció abbahagyását követő hetek és hónapok között fennmarad, és azt feltételezték, hogy részt vesz a génexpresszió tartós szabályozásában is, még a gyógyszer szedése után is29, 39, 40).
A DcD1-EGFP vagy Drd2-EGFP egerekből származó ΔFosB indukciójának vizsgálatára a kokain kezelés után a FosB és a GFP expresszióját kettős címkézéssel elemeztük (Ábra 4 és a Táblázat 1) Az anti-FosB antitest felismeri a FosB minden formáját, de feltételezzük, hogy a megnövekedett immunszövet ΔFosB-t képvisel (lásd Mód további vitára). A sóoldattal kezelt egerekben a Drd16-EGFP-pozitív neuronok 1% -a és a Drd15-EGFP-pozitív neuronok 2% -a viszonylag gyenge intenzitású FosB immunreaktivitást fejezett ki.Ábra 4 a és a b és a Táblázat 1). Az ismételt kokainkezelés, amelyet az 2WD követ, a Drd1-EGFP-pozitív neuronok számának jelentős növekedését eredményezte, amelyek együtt expresszálták az AFosB-t (GFP-pozitív neuronok 55% -a) (Ábra 4c és a Táblázat 1). A Drd2-EGFP-pozitív neuronokban (a GFP-pozitív neuronok 25% -ában) kisebb volt, de még mindig jelentős növekedés az AFosB-expresszióban (Ábra 4d és a Táblázat 1). A gerincsűrűség változásaihoz hasonlóan az AFosB megnövekedett expressziója a Drd1-EGFP-pozitív neuronokban (GFP-pozitív neuronok 46% -ában), de nem a Drd2-EGFP-pozitív neuronokban (15% GFP-pozitív neuronok) volt fenntartva. 30WD (Ábra 4 e és a f és a Táblázat 1). Megjegyezzük, hogy a megnövekedett ΔFosB expresszió megfigyelésre került Ábra 4f jelen van a Drd2-EGFP-negatív neuronokban.
Megbeszélés
Úgy gondolják, hogy a dopaminerg neurotranszmisszió hosszantartó adaptációi alátámasztják a pszichostimuláns szerekkel kapcsolatos addiktív viselkedést. Különösen az MSN-ek dendritikus gerincsűrűségének növekedése a NAcc-ben feltételezhető, hogy a szinaptikus kapcsolat reorganizációjához kapcsolódik (30). A NAcc-t nagyrészt az MSN két különálló alcsoportja alkotja, amelyek a D1 vagy a D2 dopamin receptorok magas szintjét fejezik ki. A jelen tanulmányban a krónikus kokainkezelés után a NAcc-ben lévő gerincsűrűséget különböző D1 vagy D2 receptor tartalmú MSN-ekben elemeztük. A kapott eredmények azt mutatják, hogy bár a fokozott gerincsűrűség kezdetben D1 receptor-tartalmú MSN-ekben és D2 receptor-tartalmú MSN-ekben fordul elő, a megváltozott gerincsűrűség csak a D1-receptor-tartalmú neuronokban stabil. Ezen túlmenően, a D1 és a D2 receptorokat tartalmazó MSN-ekben a transzkripciós faktor ΔFosB expressziójában hasonló változások tapasztalhatók.
Ezek a vizsgálatok olyan BAC transzgenikus egereket alkalmaztak, amelyek a GFP-t expresszálják az MSN-ek specifikus alpopulációiban a D1 vagy D2 receptor promoter irányítása alatt. Továbbá egy kettős címkézési módszert dolgoztunk ki, amely kombinálja az immunhisztokémiát a GFP-vel a neuronok ballisztikus jelölésével DiI segítségével. A korábbi vizsgálatok a Golgi – Cox módszerrel elemezték a pszichostimulánsok gerincsűrűségre gyakorolt hatását (34), és az itt alkalmazott DiI módszer kvantitatívan összehasonlítható eredményeket adott. Kifejlesztettük a kettős címkézési módszert, mert a Golgi festés nem kompatibilis az immunhisztokémiai módszerrel. Az immunfestés általában szöveti permeabilizálást igényel detergensekkel, olyan eljárással, amely tipikusan a lipofil színezékek szolubilizálásához vezet a membránból (38). Jelenlegi vizsgálatainkban azonban a GFP immunfestés nem igényel nagy mennyiségű mosószert a szöveti permeabilizáláshoz, és így a lipofil festék címkézéssel együtt használható. A kettős címkézési módszerünknek általánosságban hasznosnak kell lennie a dendrites gerincek szerkezeti változásainak vizsgálatára, például amikor a BAC transzgenikus egerek vonalak elemzésére használják, ahol a GFP kifejeződik az idegsejtek specifikus populációiban a kéregben (36).
Bár továbbra is ellentmondásos, úgy gondoljuk, hogy a D1 és a D2 receptorok nagyrészt anatómiailag elkülönülnek a direkt (striatonigrális) és közvetett (striatopallidális) striatális vetületi neuronokhoz (17, 41). A GFP lokalizációjának kezdeti jellemzése a Drd1-EGFP és a Drd2-EGFP egerekben összhangban volt ezzel a következtetéssel (36). Ezenkívül a Drd1-EGFP és a Drd2-EGFP egerekben a NAcc-ben lévő GFP-pozitív neuronok számának elemzése összhangban van azzal a következtetéssel, hogy az MSN-ek N50% -a csak D1-receptorokat fejez ki, hogy ≈35 – 40% csak D2-receptorokat fejez ki, és hogy a ≈10 – 15% együttesen expresszál mind a D1, mind a D2 receptorokat. Ez a koexpresszió értéke hasonló a dorsalis striatum tanulmányaihoz, amelyek egyetlen striatális neuronok patch-clamp elemzését kombinálták RT-PCR technikákkal az mRNS-ek izolálására és amplifikálására (k17% enkefalin és P anyag együtt expresszálása).42). Meg kell jegyezni, hogy a jelenlegi vizsgálatok nem foglalkoznak a D3, D4 és D5 receptorok expressziójával, és nem foglalkoznak a D1 receptorok alacsony szintű expressziójának kérdésével a D2 receptorok magas szintjét expresszáló MSN-ekben, és fordítva.
Számos korábbi vizsgálat vizsgálta a pszichostimuláns által kiváltott Fos expresszió neuronális lokalizációját és a D1 és D2 receptorok szerepét (43-45). Ezek a tanulmányok alátámasztották azt a következtetést, hogy a Fos és ΔFosB indukciót a D1 receptorok aktiválása közvetíti. A Fos expressziójának lokális lokalizációját azonban befolyásolja a környezeti összefüggések, amelyekben a pszichostimuláns gyógyszereket adagolják (46, 47). Például az otthoni ketrecben adott amfetamin vagy kokain azonnali korai géneket (köztük Fos-t) indukál a PX-pozitív sejtekben, amelyek együtt expresszálják a D1-receptorokat. Ezzel szemben ezek a gyógyszerek Fos expressziót indukálhatnak mind D1, mind D2 receptor tartalmú MSN-ekben, amikor új környezetben adjuk be. A jelenlegi vizsgálatainkban használt protokoll nem tartalmazta a kábítószer-injekció párosítását egy új környezetnek való kitettséggel. Ugyanakkor nem zárhatjuk ki a kontextusfüggő stresszt, amely a D2 receptor-tartalmú MSN-ekben felelős az AFosB expresszióért.
A jelen eredmények jelentős jellemzője a megnövekedett gerincsűrűség és az AFosB expresszió párhuzamos mintája. A Drd1-EGFP-t és a Drd2-EGFP-t expresszáló MSN-ekben a gerincsűrűség és az AFosB expresszió kezdetben megnövekedett. Ezek a változások azonban csak D1 receptor-tartalmú neuronokban stabilak. Az egyik lehetséges magyarázat arra a megfigyelésre, hogy a fokozott gerincsűrűség és az AFosB expresszió átmenetileg megtalálható a D2 receptor-tartalmú neuronokban, az, hogy ez az MSN-ek kis frakciójában fordult elő, amelyek mind a D1, mind a D2 dopamin receptorokat együtt expresszálják. Így ezeknek a növekedéseknek a tranziens jellege a D2 receptor aktiválás D1-függő jelátviteli útvonalakra gyakorolt antagonista hatásával társítható (48). Érdekes, hogy a gerincsűrűség és az AFosB expresszió változása reverzibilis, ami tükrözi a D2 receptorfüggő jelátviteli útvonalak azon képességét, hogy befolyásolják az AFosB stabilitását.
Az a megfigyelés, hogy az AFosB és a gerincsűrűség expressziója párhuzamosan változik, összhangban van azzal az elképzeléssel, hogy az AFosB részt vesz a dendritikus gerincek D1 receptor-tartalmú neuronokban történő kezdeti kialakításában és ezt követő fenntartásában. Az ΔFosB expresszióját a D1 / DARPP-32 / PP1-függő jelátviteli útvonal vezérli az MSN-ekben (49). Számos tanulmány kimutatta, hogy az ΔFosB fontos szerepet játszik a pszichostimulánsok jutalmazó és mozgó-aktiváló tevékenységében (39), valószínűleg befolyásolja a több gén expresszióját, amely magában foglalja a neurotranszmitter receptorokat, a jelző fehérjéket és a neuronális morfológia szabályozásában részt vevő fehérjéket (50). A krónikus kokain által kiváltott gerincképzésben szerepet játszó specifikus molekuláris mechanizmusok azonban jelenleg nem ismertek. Korábbi tanulmányaink azt mutatták, hogy a Cdk5 inhibitor roscovitine intracumbális infúziója gyengítette a kokain által kiváltott gerincsűrűség-növekedést (51). Ezenkívül a Cdk5 a ΔFosB célirányos génje, és a krónikus kokainkezeléssel kapcsolatos kompenzációs adaptív változásokhoz kapcsolódik (52). Ezért a Cdk5-függő foszforiláció változása a kokain által kiváltott gerincképződés és / vagy a gerinc stabilitásának alapja. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55) és spinofilin (56) a Cdk5 szubsztrátjai, és mindannyian részt vesznek a gerinc morphogenezis szabályozásában (57-60). Ezeknek és más Cdk5 szubsztrátoknak a tüskékben történő további jellemzése remélhetőleg megvilágítja a pszichostimulánsok gerincképzésének szabályozásában szerepet játszó mechanizmusokat.
Mód
Animals.
Azok a egerek, amelyek EGFP transzgént hordoztak a D1 vagy D2 dopamin receptorok kontrollja alatt, a Gensat BAC transzgénikus projektben jöttek létre (36). Az ebben a vizsgálatban használt transzgenikus egerek 4 – 5 hetesek voltak és svájci-Webster háttérrel rendelkeztek. Az egereket 12-ben tartottuk: 12-h fény / sötét ciklusban, és 2 – 5 csoportokban tartottuk az ad libitum rendelkezésre álló élelmiszerrel és vízzel. Minden állatprotokoll összhangban volt a laboratóriumi állatok gondozásával és használatával foglalkozó Nemzeti Egészségügyi Intézetekkel, és azokat a Rockefeller Egyetem Intézményi Állatgondozási és Használati Bizottsága hagyta jóvá.
Kábítószer-kezelés.
A krónikus kokain-kezelés (30 mg / kg, naponta) arról számoltak be, hogy a patkányok mind a magban, mind a héjában erősen megnövelik az MSN-ek gerincsűrűségét, de alacsonyabb dózis (15 mg / kg) csak a a héj (61). Ezért az NAcc mindkét részében a nagyobb kokain-mennyiséget strukturális módosítások indukálására használtuk. Az egereknek naponta egyszer 30 mg / kg kokain-HCl (vagy sóoldat) injekciót kaptunk 5 mg / kg, majd 2 injekciómentes napok után, és ezt az eljárást megismételtük az 4 egymást követő hetekben. Az injekciókat az otthoni ketrecben végeztük. 2WD vagy 30WD, egér agyakat dolgoztunk fel DiI jelölés és / vagy immunhisztokémia céljából.
Ballisztikus címkézés a fluoreszcens festékkel.
Az egereket 80 mg / kg nátrium-pentobarbitallal érzéstelenítettük és transzkardiálisan perfundáltuk 5 ml PBS-sel, majd gyors perfúzióval 40 ml 4% paraformaldehidet PBS-ben (20 ml / perc). Az agyakat gyorsan eltávolítottuk a koponyáról, majd 4% paraformaldehidben 10 min. Az agyszeleteket (100 μm) a DiI (Molecular Probes) fluoreszcens festék ballisztikus adagolásával jelöltük, amint azt a ref. 38. A kombinált DiI-jelölés – immunhisztokémiai módszer kifejlesztése alacsony mosószer koncentrációval történt. A DiI-jelzett részeket 0.01% Triton X-100-vel PBS-ben permeabilizáltuk 15 percig, majd 0.01% Triton X-100 és 10% normál kecske szérumban inkubáltuk PBS-ben 1 h-hez a nemspecifikus címkézés minimalizálása céljából. A szövetszakaszokat ezután 1% normál kecske szérummal / 0.01% Triton X-100-gyel és anti-GFP antitesttel (Abcam, Cambridge, MA) inkubáltuk szobahőmérsékleten 2 h-on, mostuk, és 1: 1,000 hígításban FITC- konjugált szekunder antitest (Molecular Probes). A metszeteket mikroszkóp tárgylemezekre helyeztük és szerelő közeggel lefedtük. A ballisztikus címkézési módszer lehetővé tette a dendritikus gerincszerkezet részletes elemzését, és a kapott eredmények kvalitatívan és mennyiségi szempontból összehasonlíthatóak voltak a korábbi vizsgálatokkal, a Golgi – Cox impregnáló módszerrel patkány agyszeleteken.34). A korábbi vizsgálatokkal ellentétben azonban ritkán figyeltünk meg kétfejű tüskéket DiI-festett neuronokban. Ezt a különbséget a festési módszerek érzékenysége vagy az egér variabilitása okozhatja (ez a vizsgálat) a patkányszövetekkel szemben.34).
Immunhisztokémia.
Az állatokat érzéstelenítettük és perfundáltuk a fent leírt módon. Az agyakat eltávolítottuk és egy éjszakán át 4% paraformaldehidben tároltuk 4 ° C-on. Az agyakat átvisszük 30% -os szacharózba PBS oldatban, kriogén védelem céljából. A koronális metszeteket (12 μm) fagyasztó mikrotomra (Leica) vágtuk, majd immunhisztokémiai feldolgozás céljából feldolgoztuk. Az agyszakaszokat ezután 0.3% Triton X-100-ben permeabilizáltuk PBS-ben 15 percig, és kétszer PBS-ben öblítettük. A szekciókat 10 normál kecske szérumban előinkubáltuk PBS-ben 1 h-ra 37 ° C-on, primer ellenanyagokkal (hígítottuk 1% normál kecske szérumban PBS-ben) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd PBS-ben öblítettük és másodlagosan inkubáltuk. 1 h-re vonatkozó antitestek 37 ° C-on. A következő antitesteket használtuk: nyúl anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz biotechnológia), egér anti-NeuN (Chemicon), nyúl anti-GFP, FITC-konjugált nyúl-IgG és rodamin- konjugált anti-egér IgG (Molecular Probes). Hármas jelöléshez (AFosB, NeuN és GFP) az agyszakaszokat először anti-pan FosB ellenanyaggal és anti-NeuN antitesttel immunizáltuk, majd másodlagos antitestekkel inkubáltuk (rodamin-konjugált anti-nyúl IgG és ciánkonjugált anti-egér IgG). ). A kettős festésű agyszakaszokat tovább feldolgoztuk a GFP immunfestéshez Zenon jelölési technológiával (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Az anti-pan-FosB antitestet a FosB N-terminálisához emeltük, és felismeri a FosB-t és a teljes hosszúságú FosB-t (62). A korábbi vizsgálatok alapján, amelyek azt mutatták, hogy az AFosB, de nem FosB vagy más Fos-hoz kapcsolódó antigének stabilan expresszálódnak a krónikus kokainkezelés után, feltételezzük, hogy az immunreaktivitás tartós növekedése a ΔFosB stabil expresszióját jelenti. A sóoldattal kezelt egerekben megfigyelt immunreaktív FosB jel azonossága azonban nem ismert. Statisztikai elemzés Táblázat 1 használta a hallgatót t teszt.
Dendritikus gerincelemzés.
A NAcc-ben az egyes MSN-eket több szempont alapján választottuk ki gerinc elemzésre. (i) A címkézett sejtekkel való átfedés minimális volt, vagy nem volt biztos, hogy a különböző sejtekből származó folyamatok ne legyenek összetévesztve. (ii) Legalább három primer dendritre volt szükség az elemzéshez használt sejtek számára. (III) Distalis dendriteket (terminális dendriteket vagy a terminális dendrithez közeli) vizsgáltunk. A NAcc magjában és héjában lévő MSN-ekből származó dendriteket elemeztük. Bár ritkán tüskés MSN-eket figyeltünk meg (tüskés II típusú), csak sűrűn tüskés MSN-eket (I tüskés típusú) elemeztünk. A gerincsűrűség kiszámításához konfokális mikroszkóppal (Zeiss LSM 20) olajmerülő lencsével (× 510) követtük a dendrit hosszát (> 40 μm hosszú). A dendritek összes képét különbözőképpen készítették z szintek (0.5 – 1 μm mélységintervallumok) a dendritikus tüskék morfológiájának vizsgálatára. Minden mérést metamorf képelemző szoftverrel (Universal Imaging, Downingtown, PA) végeztünk. A statisztikai elemzés a Kolmogorov – Smirnov tesztet használt.
A dendritekből származó nyúlványokat négy típusba soroltuk a hosszuk szerint, a ref. 63 és a 64. Az 1. osztályú kiemelkedések, más néven rögös kiemelkedések, <0.5 μm hosszúak voltak, nem voltak nagy gerincfejük, és úgy tűnt, hogy nincs nyakuk; a 2. osztályú, vagy gomba alakú tüskék 0.5 és 1.25 μm közöttiek voltak, rövid nyak és nagy gerincfej jellemezte őket; a 3. osztály vagy a vékony tüskék 1.25 és 3.0 μm között mozogtak, és hosszúkás gerincnyakuk volt, kis fejekkel; a 4. osztály vagy a filopodiális kiterjesztések hosszú fonalas nyúlványok voltak, amelyekből hiányzott az észrevehető gerincfej.
Köszönetnyilvánítás
Ezt a munkát az Egyesült Államok Közegészségügyi Szolgálatának DA10044 (PG és ACN) és a Simons Alapítvány, a Peter J. Sharp Alapítvány, a Picower Alapítvány és az FM Kirby Alapítvány támogatta.
Rövidítések
- NAcc
- nucleus accumbens
- MSN
- közepes méretű tüskés neuron
- BAC
- bakteriális mesterséges kromoszóma
- Drd1
- dopamin receptor D1 promoter által vezérelt
- Drd2
- dopamin receptor D2 promoter által vezérelt
- Dil
- 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametil-indokarbocianin-perklorát
- 2WD
- 2 nap az utolsó gyógyszeres kezelés után
- 30WD
- 30 nap az utolsó gyógyszeres kezelés után.
Referenciák
;