A DeltaFosB közvetetten szabályozza a Cck promoter tevékenységét (2010)

Brain Res. 2010 május 6; 1329: 10 – 20.

Megjelent online 2010 március 11. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elizabeth Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edwards,2 Sade Spencer,2 Eric J. Nestler,3 és a Colleen A. McClung2 *

Szerzői információk ► Szerzői jogi és licencinformációk ►

A kiadó ennek a cikknek a végleges szerkesztett változata elérhető a következő weboldalon: Brain Res

Lásd a PMC egyéb cikkeit idéz a közzétett cikket.

Ugrás:

Absztrakt

A krónikus kábítószer-expozíció által kiváltott fontos biokémiai, szerkezeti és viselkedési változások egyike a rendkívül stabil ΔFosB transzkripciós faktor által közvetített. A korábbi munka kimutatta, hogy az 2-hetekben az AFosB túlzott expresszió egerekben számos gén expressziójának növekedését eredményezi a striatumban, amelyek többségét később az AFosB-expresszió 8-hetei után szabályozzák. Érdekes, hogy ezeknek a géneknek a nagy száma szintén a CREB transzkripciós faktort túltermelő egerekben szabályozott. Ebből a tanulmányból nem volt világos, hogy a rövid távú ΔFosB szabályozza-e ezeket a géneket CREB-en keresztül. Itt találjuk meg, hogy az 2 hetek ΔFosB túlexpressziója növeli a CREB expressziót a striatumban, ami az 8 hetekben eloszlik.. A korai indukció a fokozott CREB-kötődéshez kapcsolódik bizonyos célgén promoterekhez ebben az agyi régióban. Meglepő módon egy gén, amely a korábbi jelentések alapján feltételezett CREB célpont volt, kolecisztokinin (Cck), a CREB nem irányította striatumban. A. \ T CCK A ΔFosB túlexpressziója után megerősítettük, hogy a rövid távú ΔFosB túlexpresszió mindkét CCK promoter aktivitás és génexpresszió. Emellett növeli a kötődési aktivitást egy feltételezett CREB kötőhelyen (CRE) a CCK promoter. Míg a CRE-hely szükséges a normál bazális expresszióhoz CCK, nem szükséges a ΔFosB indukcióhoz CCK. Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy míg a rövid távú ΔFosB indukció növeli a CREB expressziót és aktivitást bizonyos gén promotereknél, ez nem az egyetlen olyan mechanizmus, amellyel a géneket ezekben a körülmények között felfelé szabályozzák.

Kulcsszavak: nucleus accumbens, transzkripció, függőség

Ugrás:

BEVEZETÉS

A kábítószerrel való visszaélés krónikus expozíciója biokémiai és szerkezeti változásokat okoz több agyi régióban. Ezekről a változásokról feltételezzük, hogy a mesolimbikus rendszerben a génexpressziós profilok megváltoznak. Ez a rendszer olyan dopaminerg neuronokból áll, amelyek a középső agyban a ventrális tegmentális területről (VTA) a középmagban lévő közepes tüskés neuronokig terjednek (NAc) (ventrális striatum), valamint számos más agyi régió. A két transzkripciós faktor, a cAMP válaszelem kötő fehérje (CREB) és az ΔFosB (a Fos család fehérje) aktivitásának megváltoztatását számos olyan biokémiai, szerkezeti és viselkedési változás közvetítésére javasolták, amelyeket a krónikus kábítószer-expozíció hatására megfigyelnek ( felülvizsgálta Nestler, 2005).

A CREB egy mindenütt kifejezett transzkripciós faktor, amely a CREB / ATF család tagja. A CREB homodimerek kötődnek egy CRE szekvencia variációjához (konszenzus: TGACGTCA), amely számos gén promotereiben található. A CREB foszforilációját (elsősorban a szerin 133-on, bár más helyeket azonosítottak) számos jelző kaszkád stimulálhat, beleértve azokat is, amelyek a dopaminreceptorok után vannak.Cole és munkatársai, 1995). A szerin 133-on végzett foszforiláció után a CREB felveszik a CREB-kötő fehérjét (CBP) vagy a kapcsolódó fehérjéket, ami fokozott génexpressziót eredményez. Johannessen és munkatársai, 2004). Az ópiát vagy pszichostimuláns gyógyszerek krónikus expozíciója a CREB aktivitásának átmeneti növekedését idézi elő a nukleáris sejtekben. (Barrot és munkatársai, 2002; Shaw-Lutchman és munkatársai, 2002, 2003), olyan adaptáció, amely csökkenti a gyógyszerek jutalmazó tulajdonságait, és hozzájárul a kábítószer-visszavonás negatív érzelmi állapotához (Nestler, 2005).

La visszaélések drogjainak tartós alkalmazkodását úgy gondolják, hogy részben a FosB, a FosB rendkívül stabil splice variánsának közvetíti. (Nestler és munkatársai, 1999; McClung és munkatársai, 2004; Nestler, 2008). A Fos család tagjai dimerizálódnak a Jun család tagjaival, hogy aktiváló fehérje 1 (AP-1) komplexet képezzenek. Az AP-1 transzkripciós komplexek kötődnek az AP-1 válaszelem variációihoz (konszenzus: TGACTCA), hogy szabályozzák a transzkripciót. Chinenov és Kerppola, 2001). Míg a kábítószerrel való akut expozíció a Fos családtagok rövid életű indukciójához (órákig) vezet (és a megnövekedett CREB aktivitás), az ismételt hatóanyag-expozíció a nagyon stabil ΔFosB felhalmozódásához vezet (Hope és munkatársai, 1994; Perrotti és munkatársai, 2008), amelynek kifejezése hetekig fennmarad.

A felnőtt striatumban az AFosB-t vagy CREB-t indukálhatóan túltermelő bi-transzgenikus egerek sok olyan biokémiai és viselkedési fenotípust mutatnak, amelyeket a pszichostimulánsok vagy más visszaélésszerű gyógyszerek ismételten kitett állatoknál tapasztaltak. AA génexpressziós változások nalízise ezekben a transzgénikus állatokban számos olyan gént azonosított, amelyek a rövid távú (2 hetek) ΔFosB túlzott expressziója által szabályozottak voltak, a gyógyszer-jutalom egyidejű csökkenésével összefüggő változások. A génexpresszió és a rövid távú ΔFosB viselkedési válaszváltozásai rendkívül hasonlóak voltak az 2 vagy 8 hetek CREB-t expresszáló állatoknál tapasztaltakhoz.McClung és Nestler, 2003). Feltűnő kontrasztban az ΔFosB hosszú távú túlexpressziója (8 hét) csökkentette ugyanezen gének sokaságát, és a drog jutalom növekedéséhez vezetett.Kelz és munkatársai, 1999; McClung és Nestler, 2003).

Egy ilyen gén azonosított ezekben a vizsgálatokban kolecisztokinin (CCK), több agyrégióban termelt neuropeptid, beleértve a striatumot is.Hokfelt és munkatársai, 1980). A CCK modulálhatja a dopaminerg transzmissziót (Vaccarino, 1992), részt vesz a drogok jutalmazásában és megerősítésében (Josselyn et al., 1996; Josselyn és munkatársai, 1997; Hamilton és munkatársai, 2000; Beinfeld és munkatársai, 2002; Rotzinger és munkatársai, 2002), és krónikus kokain okozta a striatumban (Ding és Mocchetti, 1992). Emellett a CCK kimutatták, hogy a promoter reagál mind a CREB, mind az AP-1 komplexekre (Haun és Dixon, 1990; Deavall és munkatársai, 2000; Hansen, 2001). Mivel számos gén (ideértve a géneket is) CCK), amelyek mind a CREB, mind a rövid távú ΔFosB expresszió után fokozott expressziót mutattak, ismert vagy feltételezett CREB célgéneket (McClung és Nestler, 2003), azt akartuk meghatározni, hogy a rövid távú ΔFosB-kifejezés ezeknek a géneknek a szabályozásához vezet (fókuszban CCK) a CREB szabályozásával vagy a génszabályozás bonyolultabb mechanizmusain keresztül.

Ugrás:

EREDMÉNYEK

A ΔFosB túlexpresszió átmenetileg növeli a CREB szinteket

Western blotot használtunk arra, hogy megvizsgáljuk, hogy az AFosB túlzott expressziója növeli-e a CREB fehérje szintjét az egerek striatumában. Ehhez a vizsgálathoz bi-transzgenikus egereket (11A vonal) használtunk, amelyek mind NSE-tTA transzgént, mind TetOp-AFosB transzgént hordoznak. A doxiciklin hiányában ezek az egerek a striatumban a dinamorfin pozitív neuronokban ΔFosB expressziójának erős növekedését mutatják.Kelz és munkatársai, 1999). Az ΔFosB túlzott mértékű expressziójának módszerét széles körben dokumentálták, és lehetővé teszi a régióspecifikus túlexpresszálást, amely párhuzamos a krónikus kokainnak kitett állatokban megfigyelt ΔFosB indukcióval (Hope és munkatársai, 1994; Kelz és munkatársai, 1999). Megállapítottuk, hogy az 11A egerekben, amelyek túlzott mértékben expresszálták az AFosB-t, a CREB fehérje szintje szignifikánsan felerősödött az 2 expressziós hetek után, és ezek a szintek visszaálltak a kiindulási értékre az 8 expressziós hetek után (1A ábra, n = 8). Annak eldöntésére, hogy a rövid távú ΔFosB túlexpresszióval járó CREB-szintek változásai megismétlődhetnek-e egy másik rendszerben, átmenetileg túlexpresszáltuk a ΔFosB-t PC12 sejtekben, és megállapítottuk, hogy a CREB szintek szignifikánsan (p <0.05) nőttek a kontrollokhoz képest1B ábra, n = 4). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a rövid távú AFosB expresszió növeli a CREB fehérje szintjét.

ábra 1

ábra 1

A CREB szintek ΔFosB túlexpresszióval nőnek. A lizátumok Western blot analízise (A) az 11A egerekből származó egérstriata az 2 vagy 8 hetek dox-jánál (B) ΔFosB-t túlzottan expresszáló PC12 sejtek. Adatok A az off dox százalékos változásait mutatjuk be ...

A ΔFosB és a CREB egyaránt kötődik a specifikus célgének promóteréhez a striatumban rövid távú ΔFosB túlexpresszió után

Chiat (kromatin immunprecipitáció) vizsgálatokat végeztünk a striatális szövetben, hogy meghatározzuk, hogy az AFosB vagy CREB kötődés bizonyos célgén promotereknél történt-e, és ha ez a kötés a rövid távú ΔFosB túlexpresszió után nőtt. Megvizsgáltuk a kötést a BDNF és a CCK promóterek, mivel mindkét gén magasan szabályozott a rövid távú ΔFosB túlexpresszió, a CREB túlexpresszió vagy a krónikus kokain-kezelés után (McClung és Nestler, 2003). Megvizsgáltuk a kötődést a CDK5 promóter, mivel az ΔFosB ismert közvetlen célpontja (Chen és munkatársai, 2000; Bibb és munkatársai, 2001; Kumar és munkatársai, 2005). Végül a kötést a prodinorfin promóter, mivel a korábbi tanulmányok azt találták, hogy mind a ΔFosB, mind a CREB különböző feltételek mellett \ tAndersson és munkatársai, 2001; Zachariou és munkatársai, 2006).

Az 11A egerekből 2-hetekre túlzott mértékben expresszáló XNUMXA egerekből származó Chia-analízist a CREB-t vagy a ΔFosB-t felismerő antitestek alkalmazásával végeztünk. Normál körülmények között azt találtuk, hogy az ΔFosB kötődik a CDK5 és a prodinorfin promóterek, míg a BDNF or CCK promóterek (Táblázat 1). Továbbá az AFosB túlexpresszió növelte a ΔFosB kötődését a CDK5 promóter, de nem a prodinorfin promoter. Ezután a CREB-t ezekben a promóterekben mértük, és megállapítottuk, hogy a CREB kötődik a CDK5, BDNF és a prodinorfin promóterek, de nem a CCK promóter, normál striatumban, és hogy ΔFosB túlexpresszió az 2-hetekre növeli a CREB \ t BDNF és a prodinorfin promóterek, de nem a CDK5 promoter. Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy az AFosB és a CREB egyaránt kötődhet bizonyos gén promoterekhez, mint pl prodinorfin és a CDK5azonban a CREB-kötés más promóterekre, mint például a specifikus BDNF. Továbbá az AFosB túlexpresszió az AFosB-kötés bizonyos promóterekben való növekedéséhez vezet, ahogy azt elvárjuk, hanem a CREB-nek a specifikus promoterekhez való kötődéséhez is, összhangban az αFosB által közvetített CREB indukcióval, amelyet ebben az időpontban figyeltünk meg.

Táblázat 1

Táblázat 1

A feltételezett szabályozó fehérjék kötődése különböző promóterekhez az AFosB-t két hétig túltermelő egerekben.

Korábbi munkák azt mutatták, hogy a hosszú távú AFosB túlexpresszió által indukált génexpresszió változásai kromatin módosításokkal, különösen a hiszton H3 acetilezésével kapcsolatosak, specifikus gén promotereknél (Kumar és munkatársai, 2005). Annak megállapításához, hogy ez képes-e a génexpresszió változásaira rövidebb időtartamú AFosB túlexpresszióval, az acetilezett hiszton H3 (transzkripciósan aktív kromatinnal kapcsolatos hisztonmódosítás) vagy egy metilezett hiszton H3 (Lys9, a transzkripcióhoz kapcsolódó hisztonmódosítás) mérését mértük. inaktív kromatin). Azt tapasztaltuk, hogy az AFosB túlzott expressziója az 2 héten nem eredményezett változást az acetilezett H3 kötődésében a vizsgált gén promoterek egyikében sem.Táblázat 1). A metilált hiszton H3 kötődésének szignifikáns csökkenését találtuk prodinorfin promóter, de nem kötelező CCK promóter és nem változik a kötelező érvényű CDK5 és a BDNF promóterek, ami arra utal, hogy ez nem egy általános mechanizmus, amellyel a ΔFosB rövid távon szabályozza a génexpressziót. Meglepődtünk és érdeklődtünk abban, hogy nem találtunk különbséget a ChIP tesztjeinkben, amelyek a növekedést jelenthetik CCK mRNS expressziója az 11A egerekben az AFosB expresszió 2 hete után, és úgy döntött, hogy tovább vizsgálja ezt a mechanizmust.

A rövid távú AFosB növekszik CCK kifejezés több rendszerben

A striatumban ΔFosB-t túlzott mértékben expresszáló bi-transzgenikus 11A egerek mikroarray jellemzése azt tapasztalta, hogy CCK az expressziós szintek emelkednek az 2 hetek túltermelésének hetei után, majd fokozatosan csökkennek a hosszabb ΔFosB expresszióval (2A ábra, n = 3). Ezt a hatást validáltuk CCK az 2 és 8 hetekben valós idejű PCR-t alkalmaztunk egy különálló állatcsoporton, és a két időpontban talált eredményeket hasonlónak találtuk a microarray analízishez (az adatokat nem mutatjuk be).

ábra 2

ábra 2

Az ΔFosB rövid távú túlexpressziója nő CCK gén expressziója. (A) CCK mRNS expressziója striatumban az 11A 1, 2, 4 vagy 8 hetekben az XNUMXA egerekben az αFosB túlzott expressziója után. A mikroarray analízist striatális mintákon végeztük CCK szintek ...

Az AFosB szabályozási képességének további vizsgálata CCK kifejezést használtunk, a PC12 sejteket átmenetileg transzfektáltuk a CCK-luciferáz riporter plazmid és egy FosB expressziós plazmid vagy egyenlő mennyiségű pCDNS. Mindkét (n = 5-9) és három (n = 11-13) nap AFosB túlexpressziója jelentős növekedést eredményezett CCK-luciferáz expresszió. Emellett három napos ΔFosB túlexpresszió jelentősen többet eredményezett CCKluciferáz indukció két napos túlzott expresszióval összehasonlítva (2B ábra). Az AFosB túlzott expressziója nem indukálta a promoter nélküli luciferáz konstrukció expresszióját (az adatokat nem mutatjuk be). Egyetlen kezelési körülmény között sem volt csökkenés CCKluciferáz aktivitás nyilvánvaló. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a rövid távú ΔFosB expresszió növeli a CCK promóter, és megválaszolatlanul hagyja a mechanizmust, amellyel a hosszú távú ΔFosB túlexpresszió elnyom CCK kifejezés.

Az AFosB túlexpresszió növeli a kötést egy feltételezett CREB kötőhelyen a CCK elősegítő

Elemzéseink azt találták CCK az expresszió a rövid távú ΔFosB expresszió után növekszik, azonban a ChIP tesztjeink azt mutatták, hogy sem a CREB, sem az ΔFosB nem kötődik a CCK promoter. Annak megállapítására, hogy vannak-e változások a fehérje kötődésében CCK Az AFosB túlexpresszióját követő promóter elektroforetikus mobilitási eltolódási vizsgálatokat (EMSA) használtunk egy próbával, amely a feltételezett CRE-szerű helyet tartalmazza CCK promoter. Az 11A egerek 2-hetekre túlzott mértékű kifejeződéséből származó striata nukleáris kivonatait felhasználva XNUMX hetekben növekvő kötődést találtunk a feltételezett CRE helyhez. CCK promóter (3 A, C, n = 4). Érdekes, hogy 11A egerek, amelyek 8 hetekben ΔFosB-t túlzottan expresszálnak, ami csökkent CCK a kifejezés kifejezetten megnövekedett kötést mutatott ezen a webhelyen (3B, C, n = 4). Összehasonlításként megvizsgáltuk a konszenzusos CRE-helyhez való kötődést az AFosB-t 2-hetekre túlzottan expresszáló egerekben, és robosztus CRE-kötést találtunk striatum kivonatokban, de nem növekedett a kötés az ΔFosB indukció után (3F, n = 4). Így az ezen időpontban megfigyelt összes CREB szint növekedése ellenére, ezek az eredmények összhangban vannak a ChIP vizsgálatainkkal, amelyek szerint az ΔFosB túlzott expresszióját követő promóterekben a megnövekedett CREB kötés csak bizonyos génekre jellemző, és nem globális jelenség . Annak megállapításához, hogy a CREB-nek van-e kötve a CCK EMSA elemzésünkben a promótert CREB-specifikus antitesttel végeztünk. A ChIP tesztjeinkkel egyetértésben nem találtunk semmilyen kötődést a CREB-hez a CCK az EMSA-tesztekben a feltételezett CRE-helyet tartalmazó próba, míg a CREB szignifikánsan kötődött és szinkronizált egy konszenzusos CRE-helyet (3D, E, n = 4). A DNS kötő aktivitása a CCK A promótert az AFosB antitestje sem befolyásolta (az adatokat nem ábrázoltuk) olyan körülmények között, amelyeket számos korábbi vizsgálatban mutatott be, hogy blokkolja az AFosB kötődését a jóhiszemű AP-1 helyekhez (Hope és munkatársai, 1994a, 1994b; Chen és munkatársai, 1995, Hiroi és munkatársai, 1998). Az 11A állatok 8-hetei után az XNUMXA-állatok striata-ját ChIP-vizsgálatokat is elvégeztük, és még mindig nem találtunk kötődést a CREB-hez vagy a ΔFosB-hez. CCK promoter (az adatokat nem mutatjuk be). Így az AFosB expresszió a fehérje kötődésének növekedéséhez vezet CCK mind az 2, mind az 8 expressziós hét után; ezeknek a tényezőknek az azonosítása azonban nem ismert.

ábra 3

ábra 3

A fehérje kötődik a CCK promoter. (A, B) Elektroforetikus mobilitási eltolódási vizsgálat a CCK CRE-szerű hely, ahol az AFosB-t túlzott mértékben expresszáló állatokból származó striatális szövet 2 héten (A) vagy 8 héten (B). Az (A) pontban a verseny a felesleges jelöletlen versenytárssal ...

A feltételezett CRE oldal a CCK a promóter nem felelős a fokozott promóciós tevékenységért

Mivel a fehérje kötődésének növekedését találtuk a CCK a promóter, amely tartalmazza a feltételezett CRE-oldalt a ΔFosB túlexpressziója után, azt akartuk meghatározni, hogy szükséges-e ez az oldal a megnövekedett CCK ΔFosB túlexpresszió után. A lehetőség teszteléséhez a PC12 sejteket transzfektáltuk a CCK- a luciferáz plazmid, amely érintetlen CRE-szerű helyét tartalmazza, vagy egy olyan mutációt tartalmaz a helyszínen, amely eltörölné a CREB-vel való kölcsönhatást. Érdekes módon a CRE-szerű hely mutációja csökkent a bazális értékkel CCK 32% promóter tevékenysége (4A ábra, n = 9), de nem befolyásolta a CCK promóter indukciója ΔFosB túlexpresszióval (4B ábra, n = 11-13). Ez arra utal, hogy bár a CCK A promoter megköveteli egy intenzív CRE-szerű helyet a teljes bazális aktivitáshoz, az AFosB túlexpresszió által indukált megnövekedett promoter aktivitás nem igényli a CRE-szerű szekvenciát.

ábra 4

ábra 4

A CCK- mint a CRE oldal nem szükséges CCK ΔFosB indukciója. (A) CCKA luciferáz aktivitást a transzfekció után 2 nappal mértük bármelyik normál esetben CCK-luciferáz vagy olyan, amelyben a CRE-szerű hely mutálódott. * p <0.05 (B) CCK-luciferase ...

cFos kötődik a CCK elősegítő

Korábbi tanulmányok azt találták cFos Az mRNS rövid távú ΔFosB expresszióval növekszik, azonban a hosszabb ΔFosB expresszió után csökken a kokain kezelésének képessége a cFos indukálására a striatumban.McClung és Nestler, 2003; Renthal és munkatársai, 2008). Ezért lehetséges, hogy a cFos hozzájárul a növekedéshez CCK rövid távú ΔFosB expresszió után. ChIP-vizsgálatokat végeztünk a cFos-ra specifikus antitesttel és a CFos-nál mért cFos-értékekkel CCK promoter rövid távú ΔFosB expresszióval és anélkül. Míg azt találtuk, hogy a cFos nem kötődik a CCK promóter, ez a kötés nem növelte szignifikánsan a ΔFosB túlexpresszióját (ábra 5, n = 5). Ez arra utal, hogy mivel a cFos kötődik a CCK promóter, hozzájárulhat a CCK kifejezést, de valószínűleg nem vesz részt a CCK ΔFosB promóter.

ábra 5

ábra 5

cFos kötődik a CCK promoter. A kromatin immunprecipitációs vizsgálatokat specifikus ellenanyaggal végeztük cFos-ra, striatális szövetet használva az AFosB túlexpresszáló egerekből doxon vagy 2 hetekben a dox eltávolítás után. Valós idejű PCR-analízis volt ...

Ugrás:

VITA

Ez a tanulmány megerősíti és kiterjeszti a korábbi megállapításokat, amelyek azt mutatják, hogy az ΔFosB szabályozza a gén expresszióját a striatumban, és azt látjuk, hogy ezt a rövid távú expresszió után több mechanizmuson keresztül végezzük. Megmutatjuk, hogy az 2 hetek túltermelés után az ΔFosB közvetlenül kötődik a promóterekhez bizonyos génekben, ami az expresszió változásához vezet (azaz CDK5). Továbbá növeli a CREB fehérje szintjét, a tenyésztett sejtekben és a striatumban megfigyelt hatást, ami a CREB kötődésének növekedéséhez vezet más gén promotereknél (pl. dinorfint és a BDNF). Egy korábbi vizsgálatban azt találtuk, hogy a ΔFosB rövidtávú túlzott expressziója a striatumban ugyanazokat a génexpressziós változásokat eredményezi, amelyek a CREB túlzott expressziója során jelentkeznek, és hasonló viselkedési válaszokat eredményez a kokain-preferenciák méréseiben (McClung és Nestler, 2003). Tehát a jelen megállapítás, amely szerint az AFosB a CREB indukciójához vezet, valamint a CREB bizonyos gén promoterekhez való kötődése, segít megmagyarázni, hogy a gén expressziójának sok ilyen változását megosztották ezek a két transzkripciós faktor.

A CREB ΔFosB által történő indukciója érdekes, mivel kimutatták, hogy a visszaélés gyógyszerei megváltoztatják a szerin 133-foszforilált CREB szintjét (Mattson és munkatársai, 2005) és növeli a CRE-közvetített transzkripciót (Barrot és munkatársai, 2002; Shaw-Lutchman és munkatársai, 2002, 2003), a CREB általános szintjének megváltoztatása nélkül. Lehetséges, hogy a CREB-szintek változásai átmenetiek lehetnek, és ezért más vizsgálatokban könnyen kihagyhatók. A mi kezünkben a kokain által kiváltott CREB mRNS növekedés bizonyos kísérletekben tapasztalható, azonban ez a hatás nagyon változó (nem publikált megfigyelés). Mivel mind az 11A transzgenikus egerek, mind a PC-12 sejtek rövidtávú AFosB túlexpresszió után CREB indukciót mutatnak, ez azt sugallja, hogy a CREB valóban ΔFosB (vagy az ΔFosB célpontja) által indukálódik, és ezáltal újabb mechanizmusot szolgáltat a gén által indukált változások magyarázatára kifejezés.

Meglepő módon azt találtuk, hogy sem a CREB, sem az ΔFosB nem kötődik a CCK promóter CCK Az expresszió egyértelműen felerősödött a rövid távú ΔFosB expresszió után. A Cck bőséges neuropeptid, mind a VTA, mind a NAc-ben kifejezve (Hokfelt és munkatársai, 1980) és valószínűleg a visszaélések gyógyszereire adott viselkedési válaszokban vesz részt (Josselyn et al., 1996; Josselyn és munkatársai, 1997; Hamilton és munkatársai, 2000; Beinfeld és munkatársai, 2002; Rotzinger és munkatársai, 2002). A sejttenyésztési vizsgálatokban a CCK a promótert széles körben jellemezték, és bebizonyosodott, hogy a CREB és az AP-1 családtagokra reagál Hansen, 2001). Haun és Dixon (1990) kimutatta, hogy az AP-1 komplexek kötődhetnek a CCK CRE-szerű oldal in vitroés később azt mutatjuk be, hogy SK-N-MC neuroblasztóma sejtek alkalmazásával a CRE-szerű hely mutációja csökkentette a promoter válaszát a túlzottan expresszált cFos / cJun-ra (Rourke és munkatársai, 1999). Valóban, megnövekedett is CCK promóter tevékenység (ábra 2) és kötelező a CRE-szerű elemen vagy azok körül (ábra 3) egy másik AP-1 családtag AFosB túltermelésénél, de nem találtunk közvetlen ΔFosB kötődést a CCK elősegítő in vivo or in vitro, még a túlexpresszió után is.

Sok munka bizonyította a CREB szerepét a CCK promóter tevékenység. A CCK A CRE-szerű hely a gerincesek között konzervált (Hansen, 2001), és egyes sejttenyésztési vizsgálatokban mind a CREB, mind az AP-1 komplexek kötődnek ehhez a helyhez, és szükségesek a CCK promóter tevékenység (Haun és Dixon, 1990; Deavall és munkatársai, 2000; Hansen, 2001). Emellett számos ismert aktivátor is létezik CCK kimutatták, hogy a expresszió (beleértve a bFGF-et, a PACAP-ot, a peptonokat és a depolarizációt) CREB \ tHansen és munkatársai, 1999; Deavall et al., 2000; Bernard és munkatársai, 2001; Gevrey és munkatársai, 2002; Hansen és munkatársai, 2004). a CCKA luciferáz riporter gén adatai a CRE-szerű hely lényeges szerepét támasztják alá a CCK a promóter aktivitása, mivel ezen a helyen a mutáció csökkenti a bázist CCK promóter tevékenység és CCKA VP16-CREB által indukált luciferáz expresszió, amely a CREB konstitutívan aktív formája, elvész, ha ez a hely mutált (közzététel nélküli megfigyelés). Így meglepődtünk, hogy a CREB nem kötődik a CCK promoter sztriatális kivonatokban, akár alapvonalban, akár rövid távú ΔFosB túlexpresszió esetén, amikor a CREB szintek emelkednek. Ez azt állítja, hogy a CREB szintje önmagában nem az egyetlen tényező, amely meghatározza a kötelező érvényű mennyiséget ezen az oldalon, és ezt mások munkája is támogatja (Cha-Molstad és munkatársai, 2004). Mivel más, korábban azonosított CREB célgének, mint például a BDNF és a prodinorfin, nem köti a CREB-t, bízunk benne, hogy megállapítottuk, hogy a CREB nem kötelező a CCK promoter a striatális nukleáris kivonatokban. Továbbá, a CCKA osFosB által a luciferáz aktivitás nem függött az ép CRE-szerű helytől, ami arra utal, hogy az ΔFosB nem szabályozza CCK a CREB közvetlen kötődésének szabályozásával CCK promoter.

Nem tudjuk felismerni a CREB-t, amely kölcsönhatásban áll a CCK a promótert támogatja Renthal és mtsai. (2009), aki ChIP-chip-megközelítést alkalmazott a foszforilált CREB (pCREB) és a striatum ΔFosB kötődésének globális változásainak vizsgálatára krónikus kokain-expozíció után. Ezekben a kísérletekben a DNS-fehérje komplexeket AFosB vagy pCREB antitestekkel immunprecipitáltuk, és a kicsapott DNS-t jelölés után hibridizáltuk egy promoter microarray-hez. Bár számos korábban jellemzett CREB célgént azonosítottak ezzel a megközelítéssel (pl. BDNF, prodinorfin), CCK nem azonosították. Ezenkívül kimutatták, hogy a CREB konszenzusos CRE-helyhez való kötődése nagymértékben változik a tenyésztett sejtvonalak között (Cha-Molstad és munkatársai, 2004). Az összes korábbi tanulmány, amely a CREB-vel kölcsönhatásba lépett CCK a promótert sejttenyészetben hajtottuk végre (nem az agyat, amelyből az EMSA és a ChIP mintáinkat származtattuk), és géleltolódási vizsgálatokat alkalmaztunk a fehérje-DNS kölcsönhatások kivizsgálására. Míg az EMSA képes felmérni egy faktor DNS-szekvenciához való kötődésének lehetőségét, a ChIP-vizsgálatok újszerűen vizsgálják ezeket a kölcsönhatásokat in vivo. Továbbá, az adatok nagy része bizonyítja, hogy a CCK vagy a CREB-hez kötődő CREB CCK promótereket kaptunk olyan sejtekből, amelyeket olyan faktorok stimuláltak, mint a peptonok (Bernard és munkatársai, 2001), depolarizáció (Hansen és munkatársai, 2004), vagy az intracelluláris jelátviteli kaszkádok sokféle aktivátora, beleértve a cAMP-t és az ERK-t (Hansen és munkatársai, 1999). Kísérleteinkben az egyetlen „stimulus” az ΔFosB túlzott expressziója volt, ami elegendő ahhoz, hogy \ t CCK kifejezés. Összességében ez azt sugallja, hogy a CREB képes megkötni a (és esetleg szabályozni) a CCK A promóter nagymértékben függ a sejt típusától és az egyes jelátviteli útvonalak aktiválásától. Továbbá a CCK A CRE-szerű promoter elem (legalábbis nem indukált PC12 sejtekben és egér striatumban) nem CREB vagy ΔFosB közvetlen célpontja. Érdekes, hogy a fosB A CREB expressziója is specifikus a sejttípusra és a stimuláció típusára. Andersson tanulmánya et al. megállapította, hogy a CREB antiszensz oligonukleotidok injektálása egér striatumba részben gátolta a fosB kokain-kezelés után (Andersson és munkatársai, 2001). Ugyanakkor azt is megállapították, hogy az L-Dopa képes arra, hogy indukálja fosB az expresszió 6-OHDA-károsodott striatumban nem befolyásolta a CREB antiszensz oligonukleotidok jelenlétét.

Mivel a CREB és a ΔFosB úgy tűnik, hogy közvetetten szabályozzák a CCK promótert, és a kromatin szerkezet változásait számos documentFosB-t kiváltó ingerre adott válaszként dokumentálták.Tsankova és munkatársai, 2004; Kumar és munkatársai, 2005; Renthal és munkatársai, 2008) indokoltuk, hogy az AFosB közvetett módon módosíthatja a promoter aktivitását a kromatin szerkezet megváltoztatásával. Az 2-hetekben ΔFosB-t túlzottan expresszáló egerekben azonban a hiszton H3 acetilezésben nem történt változás. CCK promóter (Táblázat 1). Ezt támogatja a ChIP-chip adatok is Renthal és mtsai. (2009), aki nem jelentett változást az acetilezett H3 kötésben a CCK promoter a krónikus kokainnak kitett egerekben. Mivel a CCK A promoter aktív a striatumban, nem volt várható vagy megfigyelhető represszív metilált H3 kötés. Érdekes módon nem tapasztaltunk változást az acetilezett H3 kötés ΔFosB túlexpressziója miatt. BDNF promóter (amely megnövekedett CREB kötést mutatott) vagy a CDK5 és a prodinorfin promóterek (amelyek megnövekedett ΔFosB kötést mutattak). Mivel a promóteraktivitás változásaiban számos hisztonmódosítás van, amelyet a Rando és Chang, 2009) valószínűleg más kromatin módosítások is kapcsolódnak ezeknek a géneknek az indukciójához. Bármely egyetlen kromatin módosítás, bár gyakran előrejelzi a promoter aktivitásának szintjét, nem változhat egy adott gén aktiválása során. A jövőbeni munkában érdekes lenne megvizsgálni a kromatin szerkezetének más lehetséges változásait a CCK ΔFosB túlexpresszió után. Érdekes, hogy krónikus kokain (valószínű keresztül Az AFosB indukció) kimutatták, hogy az 1 és 2, III. Osztályú hiszton-dezacetilázok expresszióját váltja ki, amelyek úgy tűnik, hogy megváltoztatják a neuronális fiziológiát, az ERK jelátvitelt és a kokain viselkedési reakcióit.Renthal és munkatársai, 2009). A hiszton-dezacetiláz indukciója képes egyidejűleg nagyszámú gén expresszióját szabályozni keresztül globális változások a kromatin szerkezetben.

Egy lehetséges jelölt részt vett CCK Az AFosB túlexpresszióját követő szabályozás az AP-1 családtag cFos volt. A cFos kifejezését a CREB szabályozza (Sheng és munkatársai, 1990; Impey és munkatársai, 2004), és a cFos túlexpressziója (a kötőpartner cJun túlexpressziójával összhangban) nő CCK promóter tevékenység (Rourke és munkatársai, 1999). Ezért a rövid távú ΔFosB túlexpresszió következtében megnövekedett CREB-szintek növelhetik a cFos-szinteket, és a megnövekedett kötődést eredményezhetik a CCK CRE-szerű oldal. cfos mRNS-t indukálnak egerekben, két héttel ΔFosB túlexpresszióval (McClung és Nestler, 2003) és csökkent a krónikus kokainnal vagy hosszú távú ΔFosB túlexpresszióval kezelt egerekben (Renthal és munkatársai, 2008). Itt találjuk, hogy a cFos közvetlenül kötődik a CCK a striatális szövetben a promóter azonban nem befolyásolja szignifikánsan a kötést. Ez arra enged következtetni, hogy míg a cFosok szabályozhatók CCK általában a cFos kötődésének megváltozása önmagában nem valószínű, hogy az ΔFosB szabályozza a mechanizmust CCK kifejezés. Lehetséges azonban, hogy az AFosB indukálhatja a cFos-okban a poszt-transzlációs változásokat (pl. Megváltozott foszforiláció), vagy indukálhatja a kötőpartner (például cJun) vagy ko-aktivátor fehérje expresszióját. Mivel azonban az ép CRE-szerű hely (amely korábban kimutatták, hogy az AP-1 komplexek kötőhelye, lásd: Haun és Dixon, 1990) nem szükséges a megnövekedett CCK A promóteraktivitás, amit az AFosB túlexpresszióval figyeltek meg (a riportergén kísérleteinkben értékelt), az az oka, hogy más transz-ható faktorokat is szabályoz a ΔFosB.

A CCK A luciferáz riporter gén kísérleteinkben használt promoter fragmens konzervált Sp1 kötőhelyet és egy E-boxot tartalmaz (Hansen, 2002 áttekintette). Különösen kimutatták, hogy az E-box szekvenciák számos transzkripciós faktort kötnek össze Forrest és McNamara, 2004). PC12 sejtek segítségével láttuk, hogy az E-box mutációja csökken CCK promóteraktivitás, de nem változtatja meg a promoter ΔFosB-re adott válaszát (az adatokat nem mutatjuk be). Érdekes, a CCKA luciferáz riporter, amely mind a CRE helyén, mind az E-boxban mutációkat tartalmaz, nincs kimutatható bazális aktivitása, és nem reagál az AFosB túlzott expressziójára (nem publikált megfigyelés). A CCK a promóter ATF-ek, amelyek bizonyos formáit a krónikus pszichostimuláns expozíció által ismert striatumban indukálják (Green és munkatársai, 2008). Ugyanakkor nem találtunk bizonyítékot ezen ATF-ok ΔFosB-indukciójára (az adatokat nem ábrázoltuk), és az ATF-ek nem várhatóan a mutált CRE-szerű helyhez kapcsolódnak a CCK promoter.

Ennek a tanulmánynak az egyik meggyőződése, hogy egy bi-transzgenikus rendszert használunk az AFosB túltermelésére, és így konzervatívnak kell lennünk ahhoz, hogy párhuzamot hozzunk e paradigma és a krónikus kokain beadása között. Azonban az 11A transzgenikus egerek egyedülálló lehetőséget biztosítanak arra, hogy megvizsgálják a ΔFosB specifikus hatásait a striatumban, mivel a túlzott expresszió ezen agyi régióra korlátozódik.Chen és munkatársai, 1998), míg a kokain adagolása számos más agyi régióban változásokat okoz, amelyek ezután közvetve befolyásolhatják a striatumot. Ezenkívül számos tanulmány hasonlóan viselkedett és molekuláris fenotípusokat dokumentált az 11A egerekben, összehasonlítva a nem transzgenikus állatokkal, amelyeket krónikus kokainnal kezeltek (Kelz és munkatársai, 1999; McClung és Nestler, 2003; Renthal és munkatársai, 2009). Továbbá, Bibb és mtsai. (2001) hasonló striatumszinteket jelentettek Cdk5 mRNS és fehérje indukció ebben a 11A törzsben a kokainnal kezelt, nem transzgenikus alomtársakhoz képest, valamint a CDK5 célpontokban, a p35 és a DARPP-32 hasonló változásaiban.

Összefoglalva, azt találtuk, hogy a rövid távú ΔFosB expresszió a striatumban a gének indukciójához vezet több mechanizmuson keresztül. Ezek közé tartoznak a közvetlen promóterkötés, a CREB fehérje indukciója és az aktivitás, a kromatin módosítása, a még meghatározandó útvonalakon kívül.

Ugrás:

KÍSÉRLETI ELJÁRÁSOK

Állatok

Ebben a vizsgálatban hím bi-transzgénikus 11A-állatokat (NSE-tTA x TetOP-AFosB) alkalmaztunk, és ezek jellemzői Kelz és munkatársai, 1999. Az AFosB túltermeléséhez az egereket eltávolítottuk a doxiciklinből az 3 és az 6 hetes kor között, míg a kontroll egereket doxiciklinen tartottuk. Minden egeret 12: 12 fény / sötét cikluson, 7 am-on világítanak és 7-on világítanak, és XNUMX-en tartották. ad lib élelmiszerhez és vízhez való hozzáférés. Az egér minden kísérlete megfelel a Dallas-i Egyetem Délnyugati Orvostudományi Központjának állatápolási és használati bizottsága által jóváhagyott protokolloknak.

Riporter és expressziós plazmidok

A vad típusú (WT) CCK a promoter-luciferáz riportert úgy állítottuk elő, hogy egy körülbelül 200 bp PCR fragmentumot inszertáltunk a pGL3-luc vektorba (Promega). Ezt a fragmenst egér genomiális DNS-ből nyertük (primerek: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' felfelé, és 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' lefelé), és kezdetben a pGEM-T Easy vektorba (Promega, #A1360) helyeztük be. A promoter fragmenst ezután klónoztuk a pGL1-luc Kpn1 / Xho3 restrikciós enzim helyére.

A CRE pontmutáció létrehozásához a CCK promótert, egy mutagenikus primert egy korábban bejelentett CRE-szerű hely ellen irányítottak (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGAAACA 3 ', antiszensz-primert: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACis kombinációval a Change mutációs segédanyagát használtuk . Ez átalakítja a bejelentett CRE-szerű webhelyet (ACTGCGTCAGC) ACTGAGCTCC-re. Valamennyi riporter plazmidot DNS-szekvenálással igazoltuk. A ΔFosB expressziós plazmid egy teljes hosszúságú ΔFosB szekvenciát tartalmaz, amelyet a pCDNA 3 többszörös klónozási helyébe inszertáltunk, és amelyet korábban leírtak (Ulery és Nestler, 2007).

Sejttenyészet és DNS transzfekciók

A patkány feokromocitoma (PC12) sejteket Dulbecco által módosított E-Eagle F-12 táptalajban tartottuk fenn, 10% lószérummal, 5% szarvasmarha magzati szérummal és 1% penicillin / sztreptomicinnel kiegészítve 37 ° C-on és 5% CO2. A sejteket elektroporációval transzfektáltuk BTX 360 elektroporátorral (350 V, 0 ohm és 850 μF) 800 μl Dulbecco foszfáttal pufferolt sóoldatban, 4 mm résű küvettában 10 μg riporterrel és 5 μg expressziós konstrukcióval. Üres vektor plazmidot (pCDNS) használtunk a DNS teljes mennyiségének normalizálására. A transzfekció után a sejteket 35 mm-es kollagénnel bevont edényeken tenyésztettük a megadott ideig.

Luciferáz vizsgálatok

Két vagy három nappal a transzfekció után a sejteket háromszor mossuk Dulbecco foszfáttal pufferolt sóoldatában, amelyet lizáltunk (3 mM glicil-glicin, 25 mM MgSO felhasználásával).44 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), összegyűjtjük és centrifugálással tisztítjuk. 30 μL lizátumot kombináltunk 140 μL luciferáz vizsgálati pufferrel (25 mM glicil-glicin, 15 mM MgSO44 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kálium-foszfát, 1 mM koenzim A, pH 7.8). A lumineszcencia aktivitást egy FLx-800 mikroplate fluoreszcencia leolvasó alkalmazásával mértük, miután az 40 μL 1 mM luciferin üregenként automatizált injekciója történt. A luciferáz aktivitást a teljes fehérjetartalomra normalizáltuk, amit BioRad fehérje meghatározással határoztunk meg.

Elektroforetikus mobilitási eltolódási vizsgálat

A bi-transzgénikus 11A egerekből származó kétoldali striatum szeletekből származó nukleáris kivonatok (ahol a doxiciklinen vagy 2-hez vagy 8-hetekre fennmaradt)McClung és Nestler, 2003) a Huang és Walters (1996). 32A P-jelölt kettős szálú oligonukleotid próbákat a Promega Gel Shift Assay rendszerprotokollal (#E3300) állítottuk elő, és a próbákat Roche Quick Spin oszlopokkal tisztítottuk. A konszenzusos CRE és AP-1 szonda szekvenciák a Promega-tól (#E328A és E320B), valamint a CCK A CRE szekvenciák voltak (Cck-CRE értelem: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

A kötődési reakciókat és az elektroforézist a Promega Gel Shift Assay rendszer eljárásának (#E3300) módosításával végeztük. A jelzett szonda 50,000 CPM-jét 10 μg striatális nukleáris extraktummal kombináltuk. Hideg versenytárs DNS-t vagy antitesteket adtunk a radioaktívan jelzett próbák bevezetése előtt. Supershift kísérletekhez 2 μg CREB antitestet (Upstate Biotechnology # 06-083) használtunk. A reakciókat elektroforézissel határoztuk meg 4% poliakrilamid géleken, szárítottuk és filmbevitelnek vetettük alá (az 1 órát 2 napokra erősítő képernyőkkel).

immunoblot

PC12 sejtek esetében a transzfektált sejtek 35 mm-es lemezeit jéghideg Dulbecco foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk, és a lizátumokat jéghideg RIPA lízispufferben (50 mM Tris (pH 7.4), 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% dezoxikolát, 1%) készítettük. % Triton X-100, 0.1% nátrium-dodecil-szulfát), amely proteáz inhibitorokat tartalmaz. Szonikálás, tisztítás és Bradford fehérje vizsgálat után a lizátumokat teljesen denaturáltuk, és mindegyik minta 50 μg-ját elektroforézist végeztük 10% SDS poliakrilamid géleken. A fehérjéket PVDF membránra vittük, 1 órán át blokkoltuk 3% zsírmentes száraz tejben, Tris-pufferolt sóoldatban, amely 0.1% Tween-20-ot (TBS-T tej) tartalmazott, és egy éjszakán át 4 ° C-on próbáztuk primer antitestekkel (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, 1: 1,000 8795-nél alkalmazott; GAPDH-Sigma # G1, 80,000: 1 5,000-nél használtuk) TBS-T tejjel hígítva. A TBS-T-ben végzett többszöri mosás után a blotokat egy órán át szobahőmérsékleten vizsgáltuk lúgos foszfatázzal konjugált szekunder antitestek (Sigma) alkalmazásával, 170: 6432 arányban hígítva TBS-T tejben. Többszörös mosás után Tris-pufferolt sóoldatban a színreakciót a BioRad (# XNUMX-XNUMX) utasításai szerint hajtottuk végre. A membránokat egy éjszakán át szárítottuk, síkágyas szkenneren szkenneltük, és denzitometriát végeztünk ImageJ alkalmazásával (lásd alább).

Striatális kivonatok esetében a Western blot vizsgálatokat a korábban közzétett módon végeztük.Hope és munkatársai, 1994). A szövetet eltávolítottuk a dekapitált egerekből, jégre helyeztük, és az agy mátrixra osztottuk 1 mm vastagságban. A szövetszúrókat ezután a felhasználásig -80 ° C-on lefagyasztjuk. A szövetet jégen ultrahanggal kezeltük egy módosított detergens alapú pufferben, amely mind a foszfatázt, mind a proteáz inhibitorokat (Roche, Sigma) tartalmazza. Szonikálás után a mintákat forró vízben denaturáltuk, és 15,000xg-n 15 percig centrifugáltuk; ezt követően a felülúszót összegyűjtjük és feldolgoztuk; a fehérje-koncentráció mennyiségét ezután Bradford-vizsgálattal (Bio-Rad) számszerűsítettük. A mintákat 10% akrilamid / biszakrilamid gélen futtattuk, átvisszük egy PVDF membránra, blokkoltuk 5% tejben és inkubáltuk primer antitestekkel (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). A blotokat ezután kemilumineszcens rendszer (Pierce) alkalmazásával vizualizáltuk. Az összes mintát GAPDH-ra (Fitzgerald, Concord, MA) normalizáltuk. Standard görbéket futtattunk annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálat lineáris tartományában legyünk.

Denzitometriás elemzés

PC12 immunoblotok esetén a denzitometriás analízist ImageJ alkalmazásával hajtottuk végre a rodbard kalibrálással. Az egyes mérésekből levonjuk az átlagos háttérjelet, és az egyes mintákra kiszámoltuk a CREB és a GAPDH jel arányát. Striatális immunoblotok és EMSA-analízis esetén Scion Image 1.62c-t használtunk a háttér kivonással.

Kromatin immunprecipitáció (ChIP)

A ChIP vizsgálatokat a Tsankova és mtsai. (2004) és a Kumar és mtsai. (2005). Röviden, a doxiciklinen vagy azon kívül tartott 11A egerek kétoldali sztriatális mintáit 1% formaldehiddel térhálósítottuk, és a térhálósítást glicinnel leállítottuk (a végső koncentráció 0.125 M). Ezek a minták a teljes agyszeletekből származnak, a mag kéregének szintjén, a kéreg eltávolításával. A kromatint kb. 0.2–1 kb méretű fragmensekre nyírtuk ultrahangos kezeléssel, Protein G gyöngyökkel (Thermo Scientific # 22852) tisztítottuk, és a bemeneti mintákat -80 ° C-on fagyasztottuk. Minden csapadékhoz 60 és 100 μg közötti kromatint használtunk. Minden egyes primer antitestből 5-10 μg-ot használtunk fel (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetilezett H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metilezett H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Az antitest-kromatin komplexeket immunprecipitáljuk Protein G plusz gyöngyökkel a gyártás utasításai szerint (Thermo Scientific # 22852). A bemenő és kicsapott minták reverz összekapcsolását követően mindegyik mintát kvantitatív PCR-nek (qPCR) vetettük alá. Ezeknek az antitesteknek a ChIP-nek való felhasználását alaposan validálták (Tsankova és munkatársai, 2004; Kumar és munkatársai, 2005; Renthal és munkatársai, 2009).

A fehérje-kötődés szintjét minden érdekes gén promoter esetében meghatároztuk a társított DNS mennyiségének qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA) mérésével. A bevitelt vagy a teljes DNS-t (nem-immunprecipitált) és immunprecipitált DNS-t háromszorosra amplifikáltuk SYBR Green jelenlétében (Applied Biosystems, CA). Az egyes mintákból származó Ct értékeket a Sequence Detector 1.1 szoftver segítségével kaptuk meg. A templát DNS relatív kvantifikációját a ΔΔCt módszerrel végeztük (Tsankova és munkatársai, 2004). Alkalmazott primerek: BDNF promoter 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 promoter: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promoter: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodinorfin promoter: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statisztikai analízis

Minden adatot átlagként ± az átlag standard hibájaként adunk meg. A statisztikai különbséget Student kétfarkú t-próbájával határoztuk meg (p <0.05). Több összehasonlítás esetén a p-értékeket Bonferroni-korrekcióval állítottuk be.

Ugrás:

Köszönetnyilvánítás

Szeretnénk köszönetet mondani Will Renthalnak és Arvind Kumarnak a hasznos megbeszélésekért. Szeretnénk megköszönni a NIDA-nak a kísérletek finanszírozását.

Ugrás:

Lábjegyzetek

Kiadói nyilatkozat: Ez egy PDF-fájl egy nem szerkesztett kéziratból, amelyet közzétételre fogadtak el. Ügyfeleink szolgálataként a kézirat korai változatát nyújtjuk. A kéziratot másolják, megírják és felülvizsgálják a kapott bizonyítékot, mielőtt a végleges idézhető formában közzéteszik. Kérjük, vegye figyelembe, hogy a gyártási folyamat során hibák észlelhetők, amelyek hatással lehetnek a tartalomra, és minden, a naplóra vonatkozó jogi nyilatkozat vonatkozik.

Besorolási feltételek:

Szekció: #1 sejtes és molekuláris biológia az idegrendszerekben

Ugrás:

Referenciák

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP válaszelem-kötő fehérje szükséges a dopamin-függő génexpresszióhoz az intakt, de nem a dopamin-denervált striatumban. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. A CREB aktivitás a magban az accumbens héjában szabályozza az érzelmi ingerekre adott viselkedési válaszok átjárását. Proc Natl Acad Sci US A. 2002, 99: 11435 – 40. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. A kokain-kezelés növeli az extracelluláris cholecystokinint (CCK) az ébren, szabadon mozgó patkányok magjába, amely fokozza a kokainra érzékenyen érzékeny patkányokat. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptonok stimulálják a bél-kolecisztokinin-gén transzkripcióját ciklikus adenozin-monofoszfát válaszelem-kötő faktorokon keresztül. Endokrinológia. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. A kokain krónikus expozíciójának hatását a Cdk5 neuronális fehérje szabályozza. Természet. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. A CREB transzkripciós faktor sejt-specifikus kötődése a cAMP-válasz elemhez. Proc Natl Acad Sci US A. 2004, 101: 13572 – 7. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. A delta FosB és FosB-szerű fehérjék szabályozása elektrokonvulzív roham és kokainkezeléssel. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Az agyban indukálható, célzott génexpresszióval rendelkező transzgenikus állatok. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. A ciklinfüggő kináz 5 indukálása a hippocampusban krónikus elektrokonvulzív rohamokkal: ΔFosB szerepe. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Zárja be a sokféle találkozást: Fos-Jun kölcsönhatások, amelyek közvetítik a transzkripció szabályozási specifitását. Onkogén. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronális adaptáció az amfetaminhoz és a dopaminhoz: a prodinorfin gén szabályozásának molekuláris mechanizmusai patkány striatumban. Idegsejt. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. A CCK gén transzkripciójának ellenőrzése PACAP segítségével STC-1 sejtekben. Am J Physiol Gastrointest máj Physiol. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. A kolecisztokinin mRNS-tartalmának dopaminerg szabályozása patkány striatumban. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id transzkripciós faktorok és érrendszeri sérülések kialakulása. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Ciklusos AMP- és kalciumfüggő protein kinázok együttes követelménye a kolecisztokinin gén transzkripciós aktiválásához fehérje hidrolizátumokkal. J. Biol. Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
  16. Zöld TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Az ATF2, az ATF3 és az ATF4 aktiváló transzkripciós faktorok (ATF-ek) indukálása az atommagban és az érzelmi viselkedés szabályozásában. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
  17. Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. A dopamin és a kolecisztokinin túlcsordulása patkánymagokban, akut hatóanyag-adagolásra adott válaszként. Szinapszis. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. A mitogén-aktivált protein-kináz és a protein-kináz A jelátviteli útvonalai a ciklikus adenozin-3 ', 5'-monofoszfát-válaszelem-kötő fehérje aktiválásán keresztül serkentik a kolecisztokinin transzkripcióját. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen FC. A neuronális kolecisztokinin gén transzkripciójának szabályozása. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
  20. Hansen TV. Cholecystokinin gén transzkripció: promoter elemek, transzkripciós faktorok és jelátviteli útvonalak. Peptidek. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. A KCl és a forskolin szinergikusan szabályozza a kolecisztokinin génexpresszióját a CREB és a CBP ko-aktivátor koordináta aktiválásával. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. A patkány kolecisztokinin gén expressziójához nélkülözhetetlen transzkripciós fokozó tartalmaz egy, a humán c-fos gén -296 elemével azonos szekvenciát. J. Biol. Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. A foszb gén lényeges szerepe a krónikus elektrokonvulzív rohamok molekuláris, sejtes és viselkedési hatásaiban. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Bizonyíték a dopamin és a CCK együttélésére meso-limbikus neuronokban. Természet. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
  25. Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. A krónikus elektrokonvulzív rohamok (ECS) kezelése egy hosszan tartó AP-1 komplex kifejeződését eredményezi a megváltozott összetételű és jellemző tulajdonságú agyban. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
  26. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Egy hosszú ideig tartó AP-1-komplex kialakulása, amely az agyban megváltozott Fos-szerű fehérjékből áll, krónikus kokain és más krónikus kezelések révén. Idegsejt. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. Az AP-1 transzkripciós faktor DNS-kötő aktivitásának dopaminerg szabályozása patkány striatumban. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. A CREB regulon meghatározása: a transzkripciós faktor szabályozó régiók genom-kiterjedt elemzése. Sejt. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
  29. Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Mi vált a CREB-re? Cell Signal. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. A CCK (A) és a CCK (B) antagonisták ellenálló hatásai a kondicionált aktivitás kialakulására patkányokban. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Bizonyíték a CCK (A) receptor részvételéről a kokain által termelt kondicionált aktivitás megszerzésében patkányokban. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Piccotto MR , Nestler EJ. A deltaFosB transzkripciós faktor expressziója az agyban szabályozza a kokain érzékenységét. Természet. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
  33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. A kromatin-átalakítás a kokain által kiváltott plaszticitás egyik legfontosabb mechanizmusa a striatumban. Idegsejt. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. A kokain által kiváltott CREB-foszforiláció a kokainszenzitált patkányok magjában az extracelluláris szignálhoz kapcsolódó kináz fokozott aktiválásával lehetséges, de nem a protein kináz A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. A génexpresszió és a kokain jutalom szabályozása a CREB és a DeltaFosB által. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekuláris kapcsoló az agy hosszú távú alkalmazkodásához. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: A hosszú távú neurális és viselkedési plaszticitás molekuláris közvetítője. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Van-e közös molekuláris út a függőséghez? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. A függőség transzkripciós mechanizmusai: a DeltaFosB szerepe. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. A DeltaFosB indukciójának megkülönböztető mintái az agyban a visszaélésszerű gyógyszerek által. Szinapszis. 2008; 62: 358-69. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. A kromatin szerkezetének genomra kiterjedő nézetei. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. A Delta FosB a c-fos gén epigenetikus deszenzitizációját közvetíti krónikus amfetamin expozíció után. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  43. Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. A kokain által végzett kromatin szabályozás genom-kiterjedt elemzése rávilágít a sirtuinok szerepére. Idegsejt. 2009; 62: 335-48. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. A mezolimbikus dopamin funkció kolecisztokinin modulációja: a motivált viselkedés szabályozása. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negatív kooperativitás az egymás melletti E-box és cAMP / TPA reakcióelemek között a kolecisztokinin gén promoterben. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Dorm D, Nestler EJ. A CRE-közvetített transzkripció regionális és celluláris feltérképezése naltrexon-kicsapott morfin visszavonás során. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Dorm D, Nestler EJ. A CRE által közvetített transzkripció szabályozása egér agyban amfetamin segítségével. Szinapszis. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. A membrán depolarizáció és a kalcium c-fos transzkripciót indukál a CREB transzkripciós faktor foszforilezésével. Idegsejt. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. A patkány hippocampus gén promoter régióiban a hiszton módosítása akut és krónikus elektrokonvulzív rohamok után. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. A DeltaFosB transzkripciós aktivitás szabályozása Ser27 foszforilációval. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamin-CCK kölcsönhatások pszichostimuláns jutalomban és a kapcsolódó viselkedésben. Neurosci Biobehav Rev. 1992: 18: 207 – 14. [PubMed]
  52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Az ΔFosB alapvető szerepe a morfin hatású magban. Nature Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]