A magas zsírtartalmú étrendre való korai expozíció elősegíti a táplálkozási preferenciák hosszú távú változását és a központi jutalomjelzést (a Deltafosb csökkenti a dopamin jelátvitelét) (2009)

Neuroscience. Szerzői kézirat; elérhető a PMC Sep 15, 2010.
Végleges szerkesztett formában megjelent:
PMCID: PMC2723193
NIHMSID: NIHMS119686
A kiadó ennek a cikknek a végleges szerkesztett változata elérhető a következő weboldalon: Neuroscience
Lásd a PMC egyéb cikkeit idéz a közzétett cikket.

Absztrakt

A túlsúly és az elhízás az Egyesült Államokban továbbra is növekszik a járványok arányában, nagyrészt a kalória-sűrű, ízletes ételek túlzott fogyasztása miatt. A hosszú távú makrotápanyag-preferenciákat befolyásoló tényezők azonosítása megvilágíthatja a megelőzés és a viselkedésmódosítás pontjait. Jelen tanulmányunkban a harmadik posztnatális hét alatt nagy zsírtartalmú étrendben akut egerek felnőtt macronutriens preferenciáit vizsgáltuk. Feltételeztük, hogy a magas zsírtartalmú étrend fogyasztása a korai életben megváltoztatja a felnőtt táplálkozási preferenciák szempontjából fontos központi útvonalak programozását. Felnőttként a korai kitett egerek jelentősen előnyben részesítették a magas zsírtartalmú étrendet a kontrollokhoz képest. Ez a hatás nem az étrend ismeretének köszönhető, mivel az új, magas szénhidráttartalmú étrendnek kitett egerek ugyanazon korai időszakban nem mutattak különbséget a macronutriens preferenciákban, mint felnőtteknél. A magas zsírtartalmú étrend megnövekedett bevitele a korai expozíciós egerekben az étrendi preferenciákra volt jellemző, mivel a teljes kalóriabevitel vagy a kalória-hatékonyság nem változott. Mechanikusan a korai életkorban magas zsírtartalmú étrendnek kitett egerek jelentős változásokat mutattak a dopamin jelátvitel biokémiai markereiben, beleértve a foszfo-DARPP-32 Thr-75, ΔFosB és Cdk5 szintek változását is. Ezek az eredmények alátámasztják azt a hipotézisünket, miszerint a kalorikusan sűrű, ízletes étrendek rövid életkori expozíciója megváltoztatja a táplálkozási preferenciák és a jutalom szempontjából fontos központi mechanizmusok hosszú távú programozását. Ezek a változások alátámaszthatják a magas zsírtartalmú élelmiszerek passzív túlfogyasztását, amelyek hozzájárulnak a nyugati világ testtömegének növekedéséhez.

Kulcsszavak: dopamin, striatum, makro-tápanyag, fejlődés

Az Egyesült Államokban az elhízás járványa tovább növekszik, a közelmúlt statisztikái azt mutatják, hogy az amerikai felnőttek több mint 60% -a jelenleg túlsúlyos vagy elhízott (Ogden és mtsai. 2006). Egy másik, ugyanolyan fontos trend a gyermekkori elhízás növekvő aránya (Ogden és mtsai. 2002). A nyugati társadalmakban élő gyermekek, a megnövekedett ülő életmód mellett, sokféle zsírt és kalóriát tartalmaznak, amelyek hozzájárulnak az elhízás kialakulásához. Az elhízott gyermekek nagyobb valószínűséggel elhízott felnőttekké válnak, talán részben a gyermekkorban kialakult táplálkozási preferenciák szokásai és programozása miatt.Serdula és mtsai. 1993).

Tanulmányok kimutatták, hogy a csecsemő és a korai gyermekkor bizonyos ízérzékelőknek való kitettség megváltoztathatja a gyermekek étrend-preferenciáit évekkel később (Johnson és mtsai. 1991; Kern és mtsai. 1993; Liem és Mennella 2002; Mennella és Beauchamp 2002). Azonban ezek a hosszú távú hatások kialakulásának mechanizmusai nem tisztázódtak. Ezért tanulmányoztuk a magas zsírtartalmú étrendre gyakorolt ​​korai életre gyakorolt ​​hatásokat az egerek felnőtt macronutriens preferenciáiban. Az egereket egy hétig nagy zsírtartalmú étrendnek vetettük alá a postnatalis 21-28 (P21-28) napoktól, amely idő alatt szilárd ételeket fogyasztanak, és már nem függenek a táplálék gátjától. Elválasztáskor az egereket visszavittük a standard házatételre, és megvizsgáltuk, hogy a felnőtteknél krónikus, magas zsírtartalmú étrendben a makro-tápanyag-választás és a kalóriabevitel. A korábbi tanulmányok alapján az ízletes étrendek hatása az agy jutalmazási központjaira és a dopamin jelátvitel változásaira (Teegarden és Bale 2007; Teegarden et al. 2008), ezeknek az egereknek a ventrális striatumában is vizsgáltuk a biokémiai markert. Feltételeztük, hogy a magas zsírtartalmú étrendnek való kitettség és az elhagyás korai életkorban a felnőttkorban magas zsírtartalmú étrend előnyben részesül a jutalom-áramkör változásai révén, amelyek elősegítik az energia sűrű, ízletes ételek bevitelét.

Kísérleti eljárások

Állatok és korai étrend-expozíció

Az egereket egy vegyes C57Bl / 6: 129 háttérrel állítottuk elő a házon belüli tenyésztő kolónia részeként. Ezek az egerek több mint tíz éve vegyes háttérpopulációban voltak (Bale és mtsai. 2000), kétévente egy új génkészlet bevezetésével, F1 C57Bl / 6: 129 kereszt segítségével. Az 3 korban az alomok egy hétig voltak kitéve a nagy zsírtartalmú étrendnek (Research Diets, New Brunswick, NJ). A nagy zsírtartalmú étrend 4.73 kcal / g-ot tartalmazott, és 44.9% zsírt, 35.1% szénhidrátot és 20% fehérjét tartalmazott. A vezérlő alomok a standard háziaságban maradtak (Purina Lab Diet, St. Louis, MO). A házakban az 4.00 kcal / g volt, és 12% zsírt, 60% szénhidrátot és 28% fehérjét tartalmazott. A diétás expozíció idejét az 3 korosztálya választotta, az utódok szilárd táplálékot fogyasztanak, és nem függenek az anyától a táplálkozáshoz. Az elválasztás után az összes egeret (n = 16 kontroll, 14 korai magas zsírtartalmú expozíció) az 3 hónapos korig tartották. Minden tanulmányt a Pennsylvania Egyetemi Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottság által jóváhagyott protokollok szerint végeztünk, és minden eljárást az intézményi iránymutatásokkal összhangban végeztünk.

Makrotápanyag-választási preferencia

Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk, hogy a makro-tápanyaggal dúsított étrend korai expozíciója befolyásolja-e a felnőtt táplálkozási preferenciákat, az 3 hónapos egereket makro-tápanyagválasztási preferenciák alapján vizsgáltuk 10 napokon. Az egereknek a választási preferencia előtt megengedték, hogy az 1 wk egyéni házához szoktak szokni. A ketrec padlójára a magas zsírtartalmú, magas szénhidrát- és magas fehérjetartalmú étrendű (Research Diets) pelleteket helyeztük el. Az egereket és az élelmiszer-pelleteket naponta lemértük. A magas szénhidrát diéta 3.85 kcal / g-ot tartalmazott, amely 10% zsírt, 70% szénhidrátot és 20% fehérjét tartalmazott. A magas fehérjetartalmú étrend 4.29 kcal / g-ot tartalmazott, és 29.5% zsírt, 30.5% szénhidrátot és 40% fehérjét tartalmazott. A magas zsírtartalmú étrend azonos volt a korai expozícióhoz használt étrenddel.

Annak érdekében, hogy ellenőrizzék a táplálkozási étrend makrogazdasági preferenciákra gyakorolt ​​hatásait, megvizsgáltuk a magas szénhidrát diétával (kutatási étrend, a fentiekben leírtak szerint) különálló almákat, ismételten az 3-4 korosztályból, és vizsgáltuk, hogy a felnőttek makro-tápanyagválasztékot választottak-e. (n = 6).

Felnőtt krónikus, magas zsírtartalmú étrend-expozíció

A makrotápanyag-választási preferenciát követően az egerek egy részhalmaza (n = 7 kontroll, 9 korai magas zsírtartalmú expozíció) a magas zsírtartalmú étrendnek csak az 15 wks-nek volt kitéve a krónikus, magas zsírtartalmú étrend fogyasztásának és hatásainak vizsgálata, valamint az elhízás az egerekben, amelyek a korai életkorban voltak kitéve ennek az étrendnek. Ebben az időszakban az egereket hetente mérjük, és az 24-órás táplálékfelvételt egy 6 wks krónikus expozíció utáni időszakban mértük. A krónikus, magas zsírtartalmú étrend végén az egereket az izoflurán rövid érzéstelenítése után feldaraboltuk, és a zsírszövetet, a plazmát és agyakat összegyűjtöttük elemzés céljából.

Adipositás és plazma leptin

Feláldozáskor az egereket megmérjük, és barna zsírszövetet és reproduktív és vese-fehér zsírszövet-depótokat távolítunk el és mérünk. A törzsvért 50 mM EDTA-t tartalmazó csövekbe gyűjtöttük és 10 percig 5000 rpm-en és 4 ° C-on centrifugáltuk a plazma elválasztásához. A plazmát -80 ° C-on tároltuk, amíg meg nem vizsgáltuk. A leptin szinteket radioimmun vizsgálattal (Linco Research, St. Charles, MO) határoztuk meg. Mintánként ötven mikroliter plazmát alkalmaztunk, és az összes mintát kétszer végeztük. A vizsgálat érzékenysége 0.2 ng / ml volt, az intra- és interassay variációs együtthatók pedig 7.2% és 7.9% volt.

Biokémiai elemzések

Feláldozáskor az agyat gyorsan eltávolították, a ventrális striatumot (kb. 0.5 - 1.75 mm-re a bregmától, 3.5 - 5.5 mm mélységben) feldarabolták (Teegarden és Bale 2007), és a szövet azonnal folyékony nitrogénben fagyasztva van. Western-blotokat (n = 4 kontroll, n = 5 korai magas zsírpozíció) végeztek a foszfatáz inhibitor koktél (P2850 Sigma, St. Louis, MO) alkalmazásával a foszforilációs állapot megőrzése érdekében.Bale és mtsai. 2003; Teegarden és Bale 2007). Antitestek: FosB (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia), Cdk5 (1: 500; Santa Cruz Biotechnology), foszfo-DARPP-32 Thr 75 (1: 200; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) , foszfo-DARPP-32 Thr 34 (1: 500; PhosphoSolutions, Aurora, CO), teljes DARPP-32 (1: 500; K + F rendszerek, Minneapolis, MN) és mu opioid receptor (1: 500; Abcam, Cambridge, MA). A ΔFosB-t súly alapján különböztették meg a teljes hosszúságú FosB-től (Nestler és mtsai. 2001). Az összes blotot megfosztottuk és replikáltuk a p-aktin normalizálásához (1: 1000; Sigma, St. Louis, MO). A blotokat IPLab szoftverrel elemeztük (Teegarden és Bale 2007). A célfehérjék optikai sűrűségértékeit az egyes mintákban lévő β-aktin értékével osztottuk meg a terhelési hiba korrigálására.

Statisztika

Az összes adatot egy hallgatói t-teszt alkalmazásával elemeztük, független változóként a korai étrendkezelést. Minden adatot átlag ± SEM-ként adunk meg.

Eredmények

Makrotápanyag-választási preferencia

Annak megállapítása érdekében, hogy a korai étrend-expozíció milyen hatást gyakorolt ​​a felnőtt étrend-preferenciákra, az 3-4 wks-ből magas zsírtartalmú étrendnek kitett egereket vizsgáltuk az 10-napoknál kezdődő 3-napok makro-tápanyagválasztási preferenciáira. Előnyben részesítik a magas zsírtartalmú étrendet (a magas zsírtartalmú étrendként fogyasztott összes kalória százalékában jelentik); 1A) szignifikánsan nagyobb volt azoknál az egereknél, akik korai életük során magas zsírtartalmú étrendnek voltak kitéve (P <0.05). A magas fehérjetartalmú étrend preferenciáját a korai étrendi expozíció nem változtatta meg szignifikánsan (P = 0.17). A korábban magas zsírtartalmú étrendnek kitett egerek lényegesen kevesebbet fogyasztottak a magas szénhidráttartalmú étrendből, mint a kontrollok (P <0.05). Az átlagos napi kalóriabevitel a kontroll és a magas zsírtartalmú korai egerek között nem különbözött (1B). Amikor a napi bevitelt grammban fogyasztottuk, ismét nem volt szignifikáns különbség a csoportok között (kontroll = 3.29 ± 0.13 g / nap, korai magas zsírtartalom = 3.15 ± 0.14 g / nap).

ábra 1 

A magas zsírtartalmú étrend rövid életkori expozíciója a felnőttkorban fokozottan előnyben részesíti a zsírt. (A) A nagy zsírtartalmú étrendnek közvetlenül az elválasztás előtt (Early HF) kitett egerek kalóriájuk szignifikánsan nagyobb hányadát fogyasztották a ...

Az átlagos testtömeg nem különbözött szignifikánsan a kezelési csoportok között a makrotápanyag-választási preferencia előtt vagy után (1C). A kalória-hatékonyságot a kísérlet során kiszámított tömeg (g) / fogyasztott kalória (kcal) alapján számítottuk ki. A makro-tápanyagválasztási preferencia mellett nem volt különbség a csoportok közötti kalóriahatékonyságban.1D). Ez arra utal, hogy bár a korai expozíció egy nagy zsírtartalmú étrendben növeli a felnőttek preferenciáját a magas zsírtartalmú étrendre, ez nem vezet a teljes kalóriabevitelhez vagy a hatékonysághoz.

Az étrend ismereteinek hosszú távú étrend-preferenciákra gyakorolt ​​hatásának ellenőrzése érdekében az egerek külön csoportja megkapta a magas szénhidrát diétát az 3-4 korban. Ezek az egerek nem mutattak változást a magas szénhidrát- vagy magas zsírtartalmú étrendek makro-tápanyag-preferenciáiban a kontrollokhoz viszonyítva (1E), amely támogatja a nagy zsírtartalmú étrendre kifejtett erős hatást az élelmiszer-preferenciákat szabályozó agyi rendszerekben.

Krónikus magas zsírtartalmú étrend

Az egereket krónikus, magas zsírtartalmú étrendnek és táplálékfelvételnek, testtömegnek, zsírszövetnek és a plazma leptin szintjének mértük. A magas zsírtartalmú étrend-expozíció során nem volt szignifikáns különbség az átlagos napi táplálékfelvételben, a végső testtömegben vagy a kalória-hatékonyságban.2A-C). A magas zsírtartalmú étrendben a 3 hónapok után nem volt különbség a testzsírok relatív mennyiségében a csoportok között.2D). Továbbá, a krónikus, magas zsírtartalmú étrend után a plazma leptin szintek között nem volt különbség.2E).

ábra 2 

Az 3-hónap krónikus, magas zsírtartalmú étrend-expozíció során nem figyeltek meg különbségeket az étkezés és a testtömeg csoportok között. (A) A napi kalóriabevitel nem különbözött a kontroll (Ctrl) és a korai magas zsírtartalmú (Early HF) egerek között, amikor az egereket ...

Biokémia a Ventral Striatumban

A krónikus, magas zsírtartalmú étrend-expozíciót követően ezekben az egerekben elemezték a jutalom jelzésének biokémiai markereit. A korai életkorban magas zsírtartalmú étrendnek kitett egereknél a ΔFosB transzkripciós faktor szignifikánsan magas szintet mutatott (P <0.05; 3A). Az AFosB-nek kimutatták, hogy a ciklinfüggő kináz 5 (Cdk5) expresszióját indukálja (Bibb és mtsai. 2001). Ennek a modellnek megfelelően a korai, magas zsírtartalmú étrendnek kitett egereknél a Cdk5 szintje is megemelkedett a striatumban (P <0.05; 3B). A Cdk5 foszforilálja a protein-dopamin és a cAMP-szabályozott foszfoproteint, 32 kDa molekulatömegét (DARPP-32) a Xonum Xonon (Bibb és mtsai. 1999). A korai életkorban magas zsírtartalmú étrendnek kitett egereknél szintén szignifikánsan magasabb foszfo-DARPP 32 Thr 75 volt (P <0.05; 3C). Ezek az egerek szintén nem szignifikáns tendenciát mutattak a DARPP-32 foszforilációjának megfelelő csökkenésében a Thr 34-nél (P <0.10; 3D). A striatumban lévő teljes DARPP-32 fehérje szintjét nem változtatta meg a korai étrend-kezelés (P = 0.78; 3E). Az opioid rendszer aktiválása a striatumban szintén az ízletes ételek fokozott fogyasztásával jár. Különösen a mu opioid receptor szorosan kapcsolódik az előnyben részesített étrendek megnövekedett fogyasztásához. Ezért vizsgáltuk a mu receptorok szintjét ezen a területen (Zhang és mtsai. 1998). A szintek nem különböztek a kontroll és a korai nagy zsírtartalmú étrendű egerek között (P = 0.90; 3F).

ábra 3 

A ventrális striatumban a dopamin-jelzés jelzőit megváltoztattuk a korai életkorban magas zsírtartalmú étrendnek kitett egerekben (Early HF). (A) A ΔFosB transzkripciós faktor szintje a felnőtt egerek ventrális striatumában szignifikánsan emelkedett ...

Megbeszélés

A csecsemők és gyermekek táplálkozási preferenciáinak vizsgálata azt mutatta, hogy a különböző ízek korai expozíciója a későbbi életben az ilyen ízek fokozottabb elfogadásához és preferenciáihoz vezethet (Liem és Mennella 2002; Mennella és Beauchamp 2002). Mivel a korai életkorban a gyermekek egyre nagyobb mértékben ki vannak téve a zsírtartalmú élelmiszereknek, fontos meghatározni, hogy az adott étrenddel való expozíció ez idő alatt befolyásolhatja a felnőttkori élelmezési preferenciákat, és lehet, hogy hozzájárulhat az energia-sűrű ízletes ételek fokozott beviteléhez. A jelenlegi vizsgálatban azt vizsgáltuk, hogy a magas zsírtartalmú étrendre való expozíció a periweaning periódusban (3-4 korszak), amikor az egerek szilárd táplálékot fogyasztanak, és már nem függenek a táplálkozás gátjától, befolyásolná a felnőtt macronutriens preferenciákat, táplálékfelvétel és a súlygyarapodás.

Egy 10-napi makro-tápanyagválasztási preferencia tesztben a magas zsírtartalmú étrend korai expozíciós egerek jelentősen nagyobb preferenciát mutattak a nagy zsírtartalmú étrendhez, mint felnőttek, a teljes napi kalóriabevitel arányában mérve. Az étrend ismeretének ellenőrzése során a korai életkorban a magas szénhidráttartalmú étrendnek kitett egerek nem mutattak különbséget a felnőtt macronutriens preferenciákban, ami arra utal, hogy a felnőtt preferenciák változásai nem csupán az étrend korábbi tapasztalatai. Az anyai étrendben bekövetkezett változások a makrotápanyagok megváltozott preferenciáival társultak, mind az alacsony fehérje-, mind a magas zsírtartalmú étrendben a korai korban egyre inkább a magas zsírtartalmú étrendet részesítik előnyben, bár ezek a különbségek csökkentik az életkorban (Bellinger és mtsai. 2004; Kozak et al. 2005). Azonban ezek a manipulációk a terhesség és a szoptatás alatt jelentkeznek, amikor az agy még fejlődik, és így nem valószínű, hogy felelősek az itt megfigyelt hatásokért. Érdekes, hogy a P22-27-tól származó új édes kezelés (Froot Loops gabonafélék) expozíciója kimutatta, hogy növeli a termék fogyasztását felnőttkorban (Silveira és mtsai. 2008). E munka következtetései azonban azt is sugallják, hogy a fogyasztás változásai inkább a korlátozott hozzáférésnek és az élelmiszer újszerű környezetének voltak köszönhetők, mint a patkányok eredendő preferenciájának bármilyen változásának. Táplálkozási szempontból teljes, makroelemekben gazdag étrend alkalmazásával, amelyet ad libitum mutatott be az otthoni ketrecben, képesek voltunk felmérni a globális étrendi preferenciák változását. Mivel az étrend bemutatásának időzítése későn alakult ki, kevésbé valószínű, hogy az etetési és jutalmazási áramkörök idegi vezetékeinek változásai felelősek a megfigyelt viselkedésbeli változásokért, és más mechanizmusok, például epigenetikai változások is jelen lehetnek.

Annak ellenére, hogy a korai expozíciós egerekben megfigyelt magas zsírtartalmú étrend arányosan nőtt, a makro-tápanyagválasztási preferencia időszakban nem volt különbség a teljes napi kalóriabevitelben vagy a súlygyarapodásban. Azok a egerek, amelyek többet fogyasztanak a nagy zsírtartalmú étrendből, kompenzálták a felesleges kalóriákat, csökkentve a többi makroelegyekkel dúsított étrend, különösen a magas szénhidrát diéta bevitelét. Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a korai expozíció hatása egyedül a preferenciákra, és nem az általános táplálékfelvételre vagy az anyagcserére vonatkozik. Elképzelhető, hogy a makrotápanyag-választási preferencia teszt hosszának növekedésével a testtömeg és a kalória-hatékonyság különbségei a táplálkozási zsír bevitelének hosszabb ideig tartó növekedése miatt alakultak ki. Azonban a krónikus, magas zsírtartalmú étrend-expozíció során nem figyeltünk meg különbségeket a bevitel, a tömeggyarapodás vagy a zsírosság csoportjai között, ami tovább erősítette a táplálkozási preferenciákra jellemző korai életkori expozíció hatását.

Mechanikailag megvizsgáltuk a megnövekedett étrend-zsír preferencia lehetséges tényezőit. A jelenlegi vizsgálatban a diéta expozíció időzítése nem valószínű, hogy a hypothalamusra gyakorolt ​​közvetlen hatások a fenotípusért felelősek. Az íves mag, az élelmiszer-bevitel elsődleges központja, áramköre nagyrészt az élet második hetében alakul ki, a P18-nel a felnőtt állatéhoz hasonló kapcsolatok állnak rendelkezésre.Bouret és mtsai. 2004). A fő orexigén és anorexigén peptidek, az Y neuropeptid (NPY) és a pro-opiomelanokortin (POMC) expressziója szintén megváltozik a korai posztnatális fejlődés során, elérve a felnőttek szintjét az élet harmadik hetében (Ahima és Hileman 2000; Grove és mtsai. 2003; Leibowitz és mtsai. 2005). Az ívelt neuronok a születés után két és négy héttel a leptinre és a ghrelinre reagálnak.Mistry és mtsai. 1999; Proulx és mtsai. 2002). A korai táplálkozás rágcsálókra gyakorolt ​​hatásaira vonatkozó vizsgálatok többnyire a terhesség és / vagy a szoptatás során történő táplálkozási manipulációkat foglalják magukban, annak érdekében, hogy a rágcsálók hipotalamuszában ezt a plaszticitási időszakot hasznosítsák. A negyedik élethétig, amikor megkezdtük a magas zsírtartalmú étrend-expozíciót, a hipotalamikus fejlődés nagyrészt teljes. Van azonban néhány bizonyíték a felnőtt hipotalamusz korlátozott plaszticitására (Horvath 2005; Kokoeva és mtsai. 2005). Nem zárhatjuk ki az ilyen változások lehetséges hozzájárulását a fenotípusunkba.

Az ízletes diéták preferenciái szorosan kapcsolódnak a jutalmazási rendszerekhez, előnyben részesített élelmiszerek bevitelével, amelyek mély hatást gyakorolnak a dopamin (DA) felszabadulására a magban, és a DA funkció megváltozása a táplálkozási viselkedés megváltozásához vezet.Blum és mtsai. 2000; Colantuoni és mtsai. 2001; Colantuoni és mtsai. 2002; Cagniard és mtsai. 2006). Emellett kimutatták, hogy a korai táplálkozási manipulációk vagy a rágcsálókra jutó ösztönző hatások befolyásolják a DA rendszer hosszú távú működését (Sato és mtsai. 1991; Zippel és mtsai. 2003; Kelley és Rowan 2004). Korábban arról számoltunk be, hogy a magas zsírtartalmú étrendből való kivonás mély és tartós hatással lehet a DA rendszerre (Teegarden és Bale 2007; Teegarden et al. 2008). Tehát a jelenlegi vizsgálatban feltételeztük, hogy a korai életkorban magas zsírtartalmú étrendnek kitett egerekben a jutalomjelzés megváltozhat. A hipotézis teszteléséhez az egereket feláldoztuk a krónikus, magas zsírtartalmú étrend-expozíció után, és megvizsgáltuk a ventrális striatumban a jutalomjelzés markereit. Azt tapasztaltuk, hogy a korai életkorban magas zsírtartalmú étrendnek kitett egerekben a krónikus, magas zsírtartalmú étrend-expozíciót követően a ventrális striatumban a ΔFosB transzkripciós faktor jelentősen magasabb volt. ΔFosB-t indukálnak a sejtmagban, a krónikus visszaélések és a természetes jutalmak miatt.Nestler és mtsai. 2001; Teegarden és Bale 2007; Wallace és mtsai. 2008). Azok a egerek, amelyek ΔFosB-t túlzottan expresszálnak a dinamorfin-pozitív accumbal közepes tüskés idegsejtekben, fokozott motivációt mutatnak arra, hogy a DA jelzés alapszintű szabályozása miatt élelmiszer-jutalmat kapjanak (Olausson és mtsai. 2006; Teegarden et al. 2008). Saját munkánk kimutatta, hogy ezek az egerek érzékenyebbek a nagy zsírtartalmú étrend-visszavonásra, és drámai változásokat mutatnak a DA-jelzés markereiben a nagy zsírtartalmú táplálkozás után (Teegarden et al. 2008). A Xonum 5-on foszforilált 5 (CDk32) és a dopamin és a cAMP szabályozott foszfoprotein, a 32 kDa molekulatömeg (DARPP-75) szignifikáns növekedését, valamint a pDARPP-32 megfelelő csökkenésének tendenciáját figyeltük meg. Thr 34. A jutalmazási tapasztalat és a ΔFosB felemelkedése után a jelátvitel progressziójában a Cdk5 szintje emelkedni kezd (Bibb és mtsai. 2001). A DA neurotranszmisszió és neuronális ingerlékenység negatív szabályozójakéntChergui és mtsai. 2004; Benavides és mtsai. 2007), A Cdk5 foszforilálja a DARPP-32-ot treonin 75-on (Bibb és mtsai. 1999). Érdekes módon a DARPP-32 foszforilációja ezen a helyen gyengíti a D1 DA receptor aktivitását a protein kináz A közvetlen gátlásával, és gátolja a Thr 34 foszforilációját (Benavides és Bibb 2004). Összességében ezek a biokémiai intézkedések erősen utalnak a DA jelátvitel csökkenésére a striatumban magas zsírtartalmú étrend-expozíció során a korai életkorban magas zsírtartalmú étrendnek kitett egerekben. Feltételezzük, hogy a nagy zsírtartalmú étrend-expozíció során megfigyelt csökkentett DA jelzés valószínűleg hozzájárul a magas zsírtartalmú étrend fokozott preferenciájához a makrotápanyag-választás preferenciája során. A krónikus, magas zsírtartalmú étrend-expozíció során valószínű, hogy a fogyasztást korlátozza a teljes kalória-fogyasztás, és így nem figyeltek meg viselkedési különbségeket. Adataink összhangban vannak a klinikai jelentésekkel, amelyek az elhízott betegek DA-jelzésének csökkentését sugallják (Wang és mtsai. 2001). A magas zsírtartalmú étrend előnyben részesítése felnőttkorban kompenzáló válasz lehet a szervezet számára a dopaminerg tónus normalizálására (Blum és mtsai. 2000; Wang és mtsai. 2004; Teegarden et al. 2008).

A dopamin jelátvitel ezen változásainak mechanizmusa még nem tisztázott. Fontos megjegyezni, hogy az opioid jelátvitel változásai a ventrális striatumban szintén szorosan kapcsolódnak az ízletes táplálkozás és a dopaminerg jelátvitel változásához. Különösen a mu opioid receptor stimulálása a zsírtartalmú étrend bevitelének erős növekedéséhez vezet.Zhang és mtsai. 1998), és a magas zsírtartalmú étrendnek való kitettség megváltoztathatja az \ tBlendy és mtsai. 2005; Jain és mtsai. 2004). Ugyanakkor nem tapasztaltunk különbséget a mu opioid receptor szintjeiben a kontrollban és a korai, nagy zsírtartalmú étrendben lévő egerek között. Bár ez nem zárja ki a mu receptor jelzésének vagy más opiodergikus tényezőknek a szerepét, adataink arra utalnak, hogy az étrend-preferencia változása a dopamin jelátvitel változásainak köszönhető, amelyek nem kapcsolódnak a mu opioid receptor szintek változásához.

A patkányokban a dopamin neuronok az 12 (E12) embriónap körül születnek, és megkezdik az E13 folyamatainak kiterjesztését. A striatum megőrzése az első postnatális hétig terjed, és az átszervezés legalább a harmadik posztnatális hétig tart (Van den Heuvel és a Pasterkamp 2008). Így a jelenlegi vizsgálatban az étrend-manipulációs paradigma nem befolyásolja a mesolimbikus dopamin rendszer kezdeti kialakulását. A fejlődés során és a későbbi életkorban bekövetkező zsírsavszintek változása szintén befolyásolhatja a DA és DA receptorok szintjét a felnőtt patkányok frontális kéregében.Delion és mtsai. 1994; Delion és mtsai. 1996; Zimmer és mtsai. 1998), és a magas zsírtartalmú étrend anyai fogyasztása megváltoztathatja a DA rendszer működését felnőtt utódokban, ami valószínűleg a dopamin receptorok deszenzitizációjához vezethet (Naef és mtsai. 2008). Bár a jelen tanulmányunkban használt étrend a zsírsavak kiegyensúlyozott sokféleségét tartalmazza, fennmarad az a lehetőség, hogy az étrendi zsírtartalom finom változása megváltoztathatja a hosszú távú DA jelzést. Emellett az anyai étrend-manipuláció modelljeiben megfigyelhető közvetlen fejlődési hatások valószínűleg nem felelősek az aktuális eredményekért az étrend expozíció késői időzítése miatt, ami arra utal, hogy az epigenetikus mechanizmusok szerepet játszhatnak. A nukleáris accumbensben a plaszticitás a kábítószerrel való kezelés után is megfigyelhető. A kokain, a nikotin és az amfetamin növeli a gerincsűrűséget ezen a területen (Robinson és Kolb 2004). Ezek a változások az utolsó kábítószer-expozíciót követő hónapokig tartanak, és csak egyetlen tapasztalat indukálhatók (Kolb és mtsai. 2003). Korábban kimutattuk, hogy a felnőtteknél a magas zsírtartalmú étrendből való kivonás az egerek stressz- és jutalmazási útvonalait megváltoztatja (Teegarden és Bale 2007). Ezért lehetséges, hogy a rövid élettartam és az étrend visszavonása a korai élet során hasonló hatásokat eredményez, amelyek ezeket az áramköröket átprogramozzák. Végül, egy másik jelölt a génexpresszió hosszú távú változásainak közvetítésére az epigenetikai szabályozás. Az étrend-manipuláció a génexpresszió hosszú távú programozásához is vezethet a DNS-metiláció vagy a hiszton-acetiláció változásai révén. A DA-rendszerben a gének metilálódásának változásait pszichiátriai és hangulati zavarokhoz, valamint függőséghez kapcsolták.Abdolmaleky és mtsai. 2008; Hillemacher et al. 2008). Bár ezek a tanulmányok nem foglalkoznak közvetlenül a nagy zsírtartalmú étrend DA-rendszer plaszticitására gyakorolt ​​hatásával, emellett felkeltik az érdekes lehetőséget, hogy ennek a rendszernek a működése hosszú távon megváltozhat egy természetes jutalommal a korai élet során. Ezek a mechanizmusok tovább vizsgálhatók a jövőbeni vizsgálatokban.

Összefoglalva, a jelen tanulmány azt mutatja, hogy a korai életkori programok során egy ízletes, nagy zsírtartalmú étrendnek való rövid expozíció a felnőttkorban fokozottan előnyben részesíti ezt a diétát, amely nem az étrend ismeretén alapul. A mechanikusan csökkentett DA-jelátvitel a ventrális striatumban ezekben az egerekben fokozottan előnyben részesítheti a magas zsírtartalmú étrendet a DA-szintek normalizálása érdekében. Az adatok azt sugallják, hogy a korai élet során egy ízletes, nagy zsírtartalmú étrendnek való kitettség a jutalmazási rendszer hosszú távú újraprogramozásához vezethet, így a szervezet nemcsak a maladaptív táplálkozási szokásokra, hanem a jutalmazási rendszer egyéb rendellenességeire is veszélybe kerül.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük K. Carlinnak az állattenyésztésben és a tenyésztésben nyújtott segítséget. Ezt a munkát támogatta a Pennsylvania Egyetem Diabétesz, Elhízás és Metabolizmus Intézete, DK019525.

rövidítések listája

  • P
  • postnatalis nap
  • Cdk5
  • ciklinfüggő kináz 5
  • DARPP-32
  • dopamin és ciklikus adenozin-monofoszfát-szabályozott foszfoprotein, molekulatömeg 32 kDa
  • Thr
  • treonin
  • NPY
  • Y neuropeptid
  • POMC
  • pro-opiomelanokortin
  • DA
  • dopamin
  • E
  • embriónap

Lábjegyzetek

Kiadói nyilatkozat: Ez egy PDF-fájl egy nem szerkesztett kéziratból, amelyet közzétételre fogadtak el. Ügyfeleink szolgálataként a kézirat korai változatát nyújtjuk. A kéziratot másolják, megírják és felülvizsgálják a kapott bizonyítékot, mielőtt a végleges idézhető formában közzéteszik. Kérjük, vegye figyelembe, hogy a gyártási folyamat során hibák észlelhetők, amelyek hatással lehetnek a tartalomra, és minden, a naplóra vonatkozó jogi nyilatkozat vonatkozik.

Referenciák

  1. Abdolmaleky HM, Smith CL, Zhou JR, Thiagalingam S. A dopaminerg rendszer epigenetikus változása a súlyos pszichiátriai rendellenességekben. Methods Mol Biol. 2008; 448: 187-212. [PubMed]
  2. Ahima RS, Hileman SM. A hipothalamikus neuropeptid expresszió posztnatális szabályozása leptinnel: az energiaegyensúlyra és a testsúlyszabályozásra gyakorolt ​​hatás. Regul Pept. 2000; 92 (13): 1-7. [PubMed]
  3. Bale TL, Contarino A, Smith GW, Chan R, Gold LH, Sawchenko PE, Koob GF, Vale WW, Lee KF. A kortikotropin felszabadító hormon receptor-2 hiányos egerek szorongásos viselkedést mutatnak, és túlérzékenyek a stresszre. Nat Genet. 2000; 24 (4): 410-4. [PubMed]
  4. Bale TL, Anderson KR, Roberts AJ, Lee KF, Nagy TR, Vale WW. A kortikotropin-felszabadító faktor-2-hiányos egereknél a fokozott táplálkozási zsír és a hideg okozta kihívások rendellenes homeosztatikus válaszai vannak. Endokrinológia. 2003; 144 (6): 2580-7. [PubMed]
  5. Bellinger L, Lilley C, Langley-Evans SC. Az anyatej alacsony fehérjetartalmú étrend-étkezéseknél a prenatális expozíció előnyben részesíti a magas zsírtartalmú ételeket a fiatal felnőtt patkányokban. Br J Nutr. 2004; 92 (3): 513-20. [PubMed]
  6. Benavides DR, Bibb JA. A Cdk5 szerepe a kábítószer-használatban és a plaszticitásban. Ann NY Acad Sci. 2004; 1025: 335-44. [PubMed]
  7. Blendy JA, Strasser A, Walters CL, Perkins KA, Patterson F, Berkowitz R, Lerman C. Csökkent nikotin jutalom az elhízásban: az emberi és az egér kereszt összehasonlítása. Psychopharmacology. 2005; 180 (2): 306-15. [PubMed]
  8. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, Dileone RJ, Kansy JW, Olausson P, Yan Z, Taylor JR, Bibb JA. A Cdk5 modulálja a kokain-jutalmat, a motivációt és a striatális neuron-ingerlékenységet. J Neurosci. 2007; 27 (47): 12967-12976. [PubMed]
  9. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. A kokain krónikus expozíciójának hatását a Cdk5 neuronális fehérje szabályozza. Természet. 2001; 410 (6826): 376-80. [PubMed]
  10. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, Fienberg AA, Tsai LH, Kwon YT, Girault JA, Czernik AJ, Huganir RL, Hemmings HC, Jr., Nairn AC, Greengard P. DARPP-32 foszforilációja a Cdk5 modulálja a dopamin jelátvitelt neuronokban. Természet. 1999; 402 (6762): 669-71. [PubMed]
  11. Blum K, Braverman ER, Holder JM, Lubar JF, Monastra VJ, Miller D, Lubar JO, Chen TJ, Comings DE. Jutalomhiány szindróma: biogenetikai modell az impulzív, addiktív és kényszeres viselkedések diagnosztizálására és kezelésére. J Pszichoaktív gyógyszerek. 2000, 32 (Suppl iiv): 1 – 112. [PubMed]
  12. Bouret SG, Draper SJ, Simerly RB. A hipotalamusz ívelt magjából kiindulási útvonalak kialakulása az egerek táplálkozási viselkedésének neurális szabályozásában szerepet játszó hipotalamikus régiókra. J Neurosci. 2004; 24 (11): 2797-805. [PubMed]
  13. Cagniard B, Balsam PD, Brunner D, Zhuang X. A krónikusan megnövelt dopamin egereknek fokozott motivációjuk van, de nem tanulnak az élelmiszer-jutalomért. Neuropsychop. 2006; 31 (7): 1362-70. [PubMed]
  14. Chergui K, Svenningsson P, Greengard P. Cyclin-függő kináz 5 szabályozza a dopaminerg és glutamaterg transzmissziót a striatumban. Proc Natl Acad Sci US A. 2004, 101 (7): 2191 – 6. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  15. Colantuoni C, Rada P, McCarthy J, Patten C, Avena NM, Chadeayne A, Hoebel BG. Bizonyíték arra, hogy az időszakos, túlzott cukorbevitel endogén opioidfüggőséget okoz. Obes Res. 2002; 10 (6): 478-88. [PubMed]
  16. Colantuoni C, Schwenker J, McCarthy J, Rada P, Ladenheim B, Cadet JL, Schwartz GJ, Moran TH, Hoebel BG. A túlzott cukorbevitel megváltoztatja a dopamin és a mu-opioid receptorok kötődését az agyban. Neuroreport. 2001; 12 (16): 3549-52. [PubMed]
  17. Delion S, Chalon S, Guilloteau D, Besnard JC, Durand G. alfa-Linolénsav étrendhiány megváltoztatja a dopaminerg és szerotoninerg neurotranszmisszió életkorral kapcsolatos változásait a patkány frontális kéregében. J Neurochem. 1996; 66 (4): 1582-91. [PubMed]
  18. Delion S, Chalon S, Herault J, Guilloteau D, Besnard JC, Durand G. Krónikus étrend-alfa-linolénsav hiánya megváltoztatja a dopaminerg és szerotoninerg neurotranszmissziót patkányokban. J Nutr. 1994; 124 (12): 2466-76. [PubMed]
  19. Grove KL, Allen S, Grayson BE, Smith MS. A hipotalamusz neuropeptid Y rendszer posztnatális fejlődése. Neuroscience. 2003; 116 (2): 393-406. [PubMed]
  20. Hillemacher T, Frieling H, Hartl T, Wilhelm J, Kornhuber J, Bleich S. A dopamin transzporter gén promóterspecifikus metilációja megváltozott az alkoholfüggőségben és a vágyhoz kapcsolódik. J Psychiatr Res. 2008 [PubMed]
  21. Horvath TL. Az elhízás nehézségei: lágy vezetékes hypothalamus. Nat Neurosci. 2005; 8 (5): 561-5. [PubMed]
  22. Jain R, Mukherjee K, Singh R. Az édes ízű megoldások hatása az opioid visszavonásra. Brain Res Bull. 2004; 64 (4): 319-22. [PubMed]
  23. Johnson SL, McPhee L, Birch LL. Kondicionált preferenciák: a kisgyermekek inkább a magas étrendi zsírtartalmú ízeket kedvelik. Physiol Behav. 1991; 50 (6): 1245-51. [PubMed]
  24. Kelley BM, Rowan JD. Hosszú távú, alacsony szintű serdülők nikotin expozíciója dózisfüggő változásokat okoz a kokainérzékenységben és a jutalomban felnőtt felnőtt egerekben. Int. J. Dev Neurosci. 2004; 22 (56): 339-48. [PubMed]
  25. Kern DL, McPhee L, Fisher J, Johnson S, Birch LL. A zsírállapot preferenciák utólagos következményei a magas étrendi zsírtartalmú ízek ízében. Physiol Behav. 1993; 54 (1): 71-6. [PubMed]
  26. Kokoeva MV, Yin H, Flier JS. Neurogenezis a felnőtt egerek hipotalamuszában: potenciális szerep az energiaegyensúlyban. Tudomány. 2005; 310 (5748): 679-83. [PubMed]
  27. Kolb B, Gorny G, Li Y, Samaha AN, Robinson TE. Az amfetamin vagy a kokain korlátozza a későbbi tapasztalatok azon képességét, hogy elősegítse a neocortex és a nucleus accumbens szerkezeti plaszticitását. Proc Natl Acad Sci US A. 2003, 100 (18): 10523 – 8. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  28. Kozak R, Richy S, Beck B. Folyamatos változások a neuropeptid Y felszabadulásában a patkányok paraventricularis magjában az étrend-manipulációnak a korai élet során. Eur J Neurosci. 2005; 21 (10): 2887-92. [PubMed]
  29. Leibowitz SF, Sepiashili K, Akabayashi A, Karatayev O, Davydova Z, Alexander JT, Wang J, Chang GQ. A neuropeptid Y és az agouti-fehérje funkciója elválasztáskor: a kortikoszteronhoz, az étrendi szénhidráthoz és a testtömeghez viszonyítva. Brain Res. 2005; 1036 (12): 180-91. [PubMed]
  30. Liem DG, Mennella JA. Édes és savanyú preferenciák gyermekkorban: a korai tapasztalatok szerepe. Dev Psychobiol. 2002; 41 (4): 388-95. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  31. Mennella JA, Beauchamp GK. Az ízesítési élmények a táplálás során a gyermekkori preferenciákhoz kapcsolódnak. Korai Hum Dev. 2002; 68 (2): 71-82. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  32. Mistry AM, Swick A, Romsos DR. A leptin az anyagcsere sebességét megváltoztatja, mielőtt megérzi az anorektikus hatását az újszülött egerek kialakulásában. Am J Physiol. 1999, 277 (3 Pt 2): R742 – 7. [PubMed]
  33. Naef L, Srivastava L, Gratton A, Hendrickson H, Owens SM, Walker CD. Az anyai magas zsírtartalmú étrend a perinatális időszak alatt megváltoztatja a mezokortikolimbikus dopamint a felnőtt patkány utódokban: az ismétlődő amfetamin adagolásra adott viselkedési válasz csökkenése. Pszichofarmakológia (Berl) 2008, 197 (1): 83 – 94. [PubMed]
  34. Nestler EJ, Barrot M, Self DW. DeltaFosB: tartós molekuláris kapcsoló a függőséghez. Proc Natl Acad Sci US A. 2001, 98 (20): 11042 – 6. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  35. Ogden CL, Carroll MD, Curtin LR, McDowell MA, Tabak CJ, Flegal KM. A túlsúly és az elhízás elterjedtsége az Egyesült Államokban, 1999-2004. Jama. 2006; 295 (13): 1549-55. [PubMed]
  36. Ogden CL, Flegal KM, Carroll MD, Johnson CL. Az amerikai gyermekek és serdülők túlsúlyának elterjedtsége és tendenciái, 1999-2000. Jama. 2002; 288 (14): 1728-32. [PubMed]
  37. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Nestler EJ, Taylor JR. A dFosB a Nucleus Accumbensben szabályozza az élelmiszer-megerősített instrumentális viselkedést és a motivációt. A Neuroscience folyóirat. 2006; 26 (36): 9196-9204. [PubMed]
  38. Proulx K, Richard D, Walker CD. A leptin szabályozza az étvágyhoz kapcsolódó neuropeptideket a fejlődő patkányok hypothalamusában, anélkül, hogy befolyásolná a táplálékfelvételt. Endokrinológia. 2002; 143 (12): 4683-92. [PubMed]
  39. Robinson TE, Kolb B. A kábítószerekkel való visszaéléshez kapcsolódó szerkezeti plaszticitás. Neuropharmacology. 2004, 47 (Suppl 1): 33 – 46. [PubMed]
  40. Sato N, Shimizu H, Shimomura Y, Uehara Y, Takahashi M, Negishi M. Sachrose táplálkozás elválasztáskor megváltoztatja a szacharóz preferenciáját serdülőkorban. Exp Clin Endocrinol. 1991; 98 (3): 201-6. [PubMed]
  41. Serdula MK, Ivery D, Coates RJ, Freedman DS, Williamson DF, Byers T. Az elhízott gyerekek elhízott felnőttekké válnak? A szakirodalom áttekintése. Prev Med. 1993; 22 (2): 167-77. [PubMed]
  42. Silveira PP, Portella AK, Crema L, Correa M, Nieto FB, Diehl L, Lucion AB, Dalmaz C. Mind a csecsemőstimuláció, mind az édes ételek expozíciója fokozott édes táplálékfelvételt eredményez felnőttkorban. Physiol Behav. 2008; 93 (45): 877-82. [PubMed]
  43. Teegarden SL, Bale TL. A táplálkozási preferenciák csökkenése fokozott érzékenységet és étrend-visszaesés kockázatát eredményezi. Biol Psychiatry. 2007; 61 (9): 1021-9. [PubMed]
  44. Teegarden SL, Nestler EJ, Bale TL. A delta FosB által közvetített dopamin-jelátviteli változások ízletes, magas zsírtartalmú diétával normalizálódnak. Biol Psychiatry. 2008; 64 (11): 941-50. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  45. Van den Heuvel DM, Pasterkamp RJ. Csatlakozás a dopamin rendszerhez. Prog Neurobiol. 2008; 85 (1): 75-93. [PubMed]
  46. Wallace DL, Vialou V, Rios L, Carle-Florence TL, Chakravarty S, Kumar A, Graham DL, Green TA, Kirk A, Iniguez SD, Perrotti LI, Barrot M, DiLeone RJ, Nestler EJ, Bolanos-Guzman CA. A DeltaFosB hatása a magban a természetes jutalomhoz kapcsolódó magatartásra. J Neurosci. 2008; 28 (41): 10272-7. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  47. Wang GJ, Volkow ND, Logan J, Pappas NR, Wong CT, Zhu W, Netusil N, Fowler JS. Agyi dopamin és elhízás. Lancet. 2001; 357 (9253): 354-7. [PubMed]
  48. Wang GJ, Volkow ND, Thanos PK, Fowler JS. Az elhízás és a kábítószer-függőség hasonlósága neurofunkciós képalkotás alapján: fogalmi áttekintés. J Addict Dis. 2004; 23 (3): 39-53. [PubMed]
  49. Zhang M, Gosnell BA, Kelley AE. A magas zsírtartalmú ételek bevitelét szelektíven fokozzák a mu opioid receptor stimuláció a magmagban. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 285 (2): 908-14. [PubMed]
  50. Zimmer L, Hembert S, Durand G, Breton P, Guilloteau D, Besnard JC, Chalon S. Chronic n-3 többszörösen telítetlen zsírsav-étrend-hiány lép fel a dopamin metabolizmusára a patkány frontális kéregében: mikrodialízis vizsgálat. Neurosci Lett. 1998; 240 (3): 177-81. [PubMed]
  51. Zippel U, Plagemann A, Davidowa H. A dopamin és a kolecystokinin módosított hatása a különböző táplálkozási körülmények között emelt patkányokban a laterális hipotalamusz neuronokra. Behav Brain Res. 2003; 147 (12): 89-94. [PubMed]