PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Absztrakt
A kokain által kiváltott gén expresszió változásai a neuronok morfológiájában és viselkedésében olyan változásokat okoznak, amelyek a kokainfüggőség alapját képezik. Megállapítottuk, hogy a hiszton 3 lizin 9 (H3K9) dimetiláció és a G9a lizin-dimetil-transzferáz fontos szerepet játszik a kokain által kiváltott szerkezeti és viselkedési plaszticitásban. A kokain ismételt adagolása csökkentette a H3K9 dimetiláció globális szintjét a nucleus activumban. Thiszton-metilezésének csökkentését a G9a elnyomásával közvetítették ezen agyi régióban, amelyet a kokain-indukált ΔFosB transzkripciós faktor szabályozott. Feltételes mutagenezist és vírusközvetített génátvitelt alkalmazva megállapítottuk, hogy a G9a lefelé történő szabályozása növeli a nucleus akumulsens neuronok dendritikus gerincének plaszticitását és fokozza a kokain preferenciáját, ezáltal meghatározva a hiszton metilezésének kulcsszerepet a kokain hosszú távú hatásában.
Bevezetés
Az ismétlődő kokain expozíciót a gén expresszió folyamatos változásai és a neuronális morfológia megváltozott hatása jellemzi a nucleus accumbens-ben (NAc), amely az agy jutalomáramlásának kulcseleme (1-2). A kromatin-átalakítás fontos az agy régió azon aberráns transzkripciós változásainak szempontjából, amelyek a kokainfüggőség szempontjai alapját képezhetik (3-9). A kromatin szerkezetének kokainszabályozása a NAc-ban részben a kromatin enzimatikus mechanizmusok közvetlen kokain által kiváltott módosításaiból származik, amelyek változásokhoz vezetnek a hiszton acetilezésében és a foszforilációban (4, 7-9); a hiszton metilezését szabályozó enzimek szerepét azonban még nem vizsgálták.
Egy nemrégiben végzett genomszintű promóter-elemzés, kromatin immunprecipitációval, mikrotáblákkal (ChIP-Chip) felhasználva, a represszív hiszton H3 lizin 9 (H3K9) és 27 (H3K27) megváltozott mintáit azonosította a specifikus génpromoterökben a NAc kezelés után megismételt specifikus génpromoteröknél (NAc)6). Ezért számos lizin-metil-transzferáz (KMT) és demetiláz (KDM) profilját profiloztuk, amelyekről ismert, hogy a H3K9 vagy a H3K27 metilációt szabályozzák (1A). Csak két enzim, a G9a és a GLP mutatott fenn tartós transzkripciós szabályozást 24 órával az ismételt kokain adagolás után, amikor mindkét gén expressziója szignifikánsan alul volt szabályozva. Mivel a G9a és a GLP kifejezetten katalizálja a H3K9 (H3K9me2) dimetilezését, kokain általi alsószabályozása összhangban áll az euchromatikus H3K9me2 globális szintjének ezen a pillanatban megfigyelt csökkenésével (1B). Ezzel szemben a heterokromatikus H3K27 metilezés globális szintje nem változott az ismételt kokain expozíció (S1 ábra az online támogató anyagban). Magas katalitikus aktivitása miatt egyaránt in vitro és a in vivo (10) a G9a elnyomás funkcionális jelentőségének további vizsgálata a NAc-ban történő ismételt kokain expozíciót követően. A G9a fehérje szintje, hasonlóan az mRNS szintjéhez, szignifikánsan csökkent az 24 órával az ismételt kokain beadás után (S2). Noha a NAX-ben a G9a mRNS expressziója 35% -kal csökkent, az immunhisztokémiai elemzés a G15a fehérje szintjének szerényebb 9% -os csökkenését mutatta, összhangban a H21K3me9 megfigyelt 2% -os csökkenésével a kokain ismételt beadása után (1B). A G9a mRNS expresszióját ezen agyi régióban szintén az 20% szabályozta a kokain ismételt önbeadása után (S3).
Annak azonosítására, hogy az euchromatikus H3K9me2 összefüggésben van-e a NAc gén expressziójának genomszintű változásaival, mikrotípus analízist alkalmaztunk a gén expressziós profilok vizsgálatához, amelyeket a kokain kiindulási adagja váltott ki állatokban, korábbi kokain expozícióval vagy anélkül (lásd a kiegészítő génjegyzékek Táblázatok S1 – S3). Azok az állatok, amelyek ismételt kokaint kaptak, drámai módon megnövekedett génexpresszióval mutatkoztak 1 órával a kokain provokálása után az akut módon kezelt állatokkal összehasonlítva (1C). Ez a megnövekedett gén expresszió továbbra is a kokain kihívására adott válaszként történt, amelyet az ismételt kokainból való 1 héten át tartó abbahagyása után adott. A korábbi jelentésekkel összhangban a gének kis százaléka (~ 10%) desenzitizált transzkripciós választ mutatott az ismételt kokain beadást követően (1C; lát S1 táblázat) (5). Az ismételt kokain után megfigyelt fokozott gén expresszióban játszott G9a csökkenő szerepének közvetlen vizsgálatához az egerek Herpes simplex vírus (HSV) vektorokat intravénásán injektálták GFP-t vagy G9a-t kifejezve, és fiziológiás sóoldattal vagy ismételt kokainnal kezelték, hogy meghatározzák, vajon a G9a túlzottan expresszál-e. elegendő volt a gén expressziójának a kokain által kiváltott ismételt fokozódásának gátlására. Az 12 véletlenszerűen kiválasztott génekből, amelyek megismételt expressziós szintet mutatnak az ismételt kokain után, megfigyeltük, hogy a G9a jelentősen csökkentette ezen gének 50% -ának fokozott expresszióját (S4 táblázat).
A G9a expressziójának ismételt kokain-indukált elnyomását közvetítő upstream transzkripciós események azonosítása céljából megvizsgáltuk az ΔFosB, a közvetlen korai gén rendkívül stabil splicing termékének lehetséges szerepét fosB. Az ΔFosB felhalmozódik a NAc-ban a kokain ismételt kitettsége után, ahol a fokozott kokain-jutalomhoz kapcsolódik (11). Az ΔFosB transzkripciós aktivátorként vagy represszorként is működhet, az érintett célgéntől függően (3, 5, 6, 12). Bitrangenikus NSE- használatatTA × tetOP-ΔfosB egerek, ahol az ΔFosB expresszió szelektíven indukálható felnőtt állatok NAc-jében és a hátsó striatumában (13) megvizsgáltuk az ΔFosB expresszió hatását a NAc H3K9me2 és KMT-k kokainszabályozására. Az ΔFosB túlzott expressziója elegendő volt mind a H3K9me2 szint csökkentéséhez (1D) és a G9a expresszió (1E), utánozva ezzel az ismételt kokain hatásait. Ezzel szemben az ΔFosB nem csökkentette a GLP expresszióját ezen agyi régióban, és nem volt hatással a SUV39H1-ra és az EZH2-re, a H3K9 és a H3K27 fő trimetilező enzimeire (S4). Ezen adatok független ΔFosB túlzott expressziós rendszer alkalmazásával történő megerősítésére a vadtípusú felnőtt egerek kétoldali intra-NAc injekciókat kaptak az Adeno-asszociált vírus (AAV) vektorokból, amelyek GFP-t vagy ΔFosB-et expresszálnak. Az ΔFosB vírus által közvetített túlzott expressziója csökkentette a G9a expresszió szintjét ebben az agyi régióban (1E).
A G9a ilyen kifejezett és specifikus szabályozása arra késztette bennünket, hogy vizsgáljuk meg, hogy a G9a expressziójának megváltoztatása a NAc idegsejtekben szabályozza-e a kokain viselkedési válaszát. A vadtípusú egerek GFP-t vagy G9a-t expresszáló HSV-vektorok intra-NAc injekcióit kaptak, majd egy elfogulatlan kokain-kondicionált helypreferencia-paradigma alkalmazásával elemezték őket, amely közvetett módon méri a gyógyszer jutalmát. A NAX idegsejtekben a G9a vírus-túlzott expresszióját viselkedési tesztek (2A). A G9a túlzott expressziója jelentősen csökkentette a kokain preferenciáját, összehasonlítva a GFP-t túl expresszáló állatokkal (2B), és megnövekedett H3K9me2 szint a NAc-ban (2C). A G9a (G9aH1093K) katalitikusan elpusztult mutánsának (GXNUMXaHXNUMXK) túlexpressziója (14) nem befolyásolta a kokain preferenciát (2B), és nem volt hatással a H3K9me2 szintjére ezen agyi régióban (2C).
A G9a szerepének további vizsgálata a kokain viselkedésbeli hatásaiban, és konkrétabban a G9a expressziójának ismételt kokain által kiváltott elnyomásának utánozása a NAc, felnőtt G9a-banfl / fl egerek (14) kapott AAV-vektorok intra-NAc injekcióit, amelyek kontrollként expresszálják a Cre rekombinázt vagy GFP-t. A G9a AAV-Cre elpusztulása a NAc-ban, amelyet immunhisztokémiailag igazoltak (S5), jelentősen megnöveli a kokain hatásait a kondicionáló kísérletekben és csökkentette a H3K9me2 szintet a NAc-ban (2D ábra, E). A G9a és a GLP, a BIX01294 kereskedelemben kapható farmakológiai inhibitora (15-16) annak megállapítására szolgáltak, hogy az enzimgátlás hasonlóan befolyásolja-e a kokain viselkedési reakcióit. Valójában, a G9a és a GLP farmakológiai gátlása jelentősen megnövelte a kokain preferenciáját és csökkentette a H3K9me2-et a NAc-ban (2F ábra, G).
A kokain ismételt alkalmazása növeli a dendritikus gerinc sűrűségét NAc közepes tüskés idegsejteken (17), amely a gerjesztő glutamáterg szinapszis funkcionális változásaihoz kapcsolódik ezen neuronokon (18-19) és a gyógyszerre érzékeny viselkedési reakciók (17, 20). Ezért feltételeztük, hogy a G9a aktivitásának az NAc-ban történő ismételt kokainnal történő szabályozása közvetítheti a kokain azon képességét, hogy szabályozza a NAc neuronok dendritikus gerinc-sűrűségét. A kromatin immunprecipitációt (ChIP) használva egy anti-G9a antitesttel számos feltételezett G9a géncélpontot azonosítottunk a NAc-ban, amelyek mindegyike korábban szerepet játszott a kokain által indukált dendritikus plaszticitásban (3A) (20-26). Megállapítottuk, hogy a kokain ismételt beadása jelentősen csökkentette a G9a kötődését, valamint a H3K9me2 szintjét ezen génpromótereknél (3B). Ezzel szemben az akut kokain beadása gyorsan toborozta a G9a-t ugyanazon génpromóterekhez, összhangban a NAX 9 órában megfigyelt fokozott G1a expresszióval az akut kokain adag után (S6). Noha a G9a kötődése a specifikus génpromótereknél korrelál az expressziójában bekövetkezett változásokkal, továbbra sem világos, hogy ezeket az eseményeket a NAX megváltozott globális G9a szintje és / vagy az akut utáni G9a felvétel különbségei közvetítik-e vs ismételt kokain adagolás.
A NAX számos plaszticitással kapcsolatos génjének G9a általi szabályozása alapján közvetlenül megvizsgáltuk, hogy a G9a expresszió fenntartása ezen agyi régióban az ismételt kokainkezelés után elegendő-e a kokain által indukált dendritikus gerincképződés megakadályozásához. A korábban kimutatott kokainkezelési protokoll alkalmazásával elősegítik a dendritikus gerinc indukcióját a NAc-ban (20), megvizsgáltuk a gerinc-sűrűséget állatokban, amelyeket HSV-GFP-vel vagy HSV-G9a-val injektáltunk. A korábbi eredményekkel egyetértve, a kokain kezelés után a NAc gerincének dendritikus sűrűségének jelentős növekedését figyeltük meg, ezt a hatást teljesen gátolta a G9a túlexpresszió (3C). A G9a túlexpresszió önmagában nem volt elegendő az NAc dendritikus gerinc sűrűségének csökkentéséhez kokain hiányában. Ezen adatok kiegészítéseként a G9afl / fl Az egerek HSV-Cre intra-NAc injekcióval részesültek és a gerinc sűrűségét mennyiségileg meghatároztuk, és összehasonlítottuk azokat az állatokkal, amelyekben kokain hiányában HSV-GFP-t kaptak. A G9a expresszió elnyomása szignifikánsan növeli a gerinc sűrűségét NAc közepes tüskés idegsejteken (3C).
Tekintettel arra a bizonyítékra, hogy a G9a csökkent szabályozása a NAc-ban az ismételt kokain után az ΔFosB közvetíti, ezt követően megvizsgáltuk, hogy ez a transzkripciós faktor szintén szerepet játszik-e a NAc dendritikus tüskék szabályozásában. Noha az ΔFosB korábban nem volt okozati összefüggésben az ilyen dendritikus plaszticitással, számos célpontját, beleértve a Cdk5 és az NFκB alegységeket, annyira befolyásolták (20-23), és ΔFosB tartós expressziója NAc neuronokban korrelál a megnövekedett dendritikus gerinc sűrűséggel az ismételt kokainkezelés után (27). Először azt találtuk, hogy az ΔFosB indukciója bitransgén egerekben kokain hiányában, amely csökkentette a G9a és a H3K9me2 expresszióját (1D ábra, E), csökkentette a G9a kötődését számos plaszticitással kapcsolatos génhez, amelyek közül soknak bizonyult maga az AFosB közvetlen célpontja is (3D) (3, 6). Ezt követően megmutattuk, hogy az ΔFosB vírusos túlzott expressziója a NAc-ban szignifikánsan növeli a dendritikus gerinc sűrűségét alapfeltételek között, hasonló a kokain ismételt beadását követően megfigyelthez (3E). Ezzel szemben az ΔJunD, egy domináns negatív mutáns protein, amely antagonizálja az ΔFosB transzkripciós aktivitást, NAc túltermelése blokkolta az ismételt kokain azon képességét, hogy fokozza a dendritikus gerincképződést a NAc-ban (3C).
Azt a megfigyelésünket, hogy ΔFosB szabályozza a G9a expressziót a NAc-ben, és hogy ΔFosB és G9a ugyanazon célgének egy részét szabályozza, arra késztettünk minket, hogy megvizsgáljuk az ΔFosB és a G9a közötti egyéb interakciókat. Az akut kokain után, amikor a G9a szintje megemelkedett, a G9a kötődik a fosB a gén növekedett, míg az ismételt kokain után, amikor a G9a expressziója elnyomódott, a G9a kötődik a fosB a gén csökkent (3A). A G9a ilyen csökkent csökkenését az ismételt kokain után nem figyelték meg c-fos, ahol a G9a kötődését fokozza az ismételt kokain (S7). Ez összhangban áll azzal a ténnyel, hogy ellentétben a fosB, c-fos elnyomják, nem indukálják krónikus pszichostimuláns expozícióval (5). A ΔFosB túlzott mértékű expressziója bitransgén egerekben elegendő volt a G9a kötődésének szignifikáns csökkentéséhez. fosB gén (3D). Ezenkívül a G9a túlzott expressziója elegendő volt a fokozott ΔFosB expresszió csökkentéséhez az ismételt kokain beadást követően (S4 táblázat). Ezek az adatok azt sugallják, hogy az autoregulációs hurok a G9a kezdetben korlátozza az ΔFosB indukcióját akut kokain beadással. Mivel azonban az ΔFosB felhalmozódik az ismételt gyógyszer expozícióval, elnyomja a G9a-t, és ezáltal fokozza a saját további indukcióját.
Összegzésként bebizonyítottuk, hogy a NAc-ban lévő hiszton-lizin-metilezés kritikus szerepet játszik a kokainra adott válasz neuronális génexpressziójának szabályozásában. A G9a és a H3K9me2 elnyomása a kokain ismételt beadása után elősegíti a kokain preferenciáját, részben számos olyan gén transzkripciós aktiválásával, amelyről ismert, hogy a dendritikus plaszticitás rendellenes formáit szabályozza. Az ilyen mechanizmusok révén szabályozott gének jobb megértése javítja ismereteinket a kábítószer-függőség komplex biológiai alapjairól, és elősegítheti az addiktív rendellenességek hatékonyabb kezelésének kidolgozását.
Anyagok és módszerek
Állatok és kezelések
Eltérő rendelkezés hiányában az egereket ketretenként négytől ötig helyeztük el telepen 12 órás fény / sötét ciklus mellett (7: 00 AM-től 7: 00 PM-ig világít) állandó hőmérsékleten (23 ° C) ad libitum vízhez és ételhez való hozzáférés. Az állati protokollokat az IACUC mind az UT Délnyugati Orvosi Központjában, mind a Mount Sinai Orvostudományi Iskolában jóváhagyta.
A kokainkísérletekhez [immunhisztokémiai, Western blot, kvantitatív PCR (qPCR), a mikroarray analízis és a kromatin immunprecipitáció (ChIP)], 8 - 10-hetes hímivarú C57BL / 6J egereket használtunk. Az állatok naponta injektálták „fiziológiás sóoldatot” (7 kezelések sóoldat, ip), „akut” kokaint (6 kezelések sóoldat + egy kezelés 20 mg / kg kokain-HCl, ip) vagy „ismételt” kokaint (7 kezelések 20 mg / kg). kokain-HCl, ip). Az egereket akár a végső kezelést követő 1 órában, akár 24 órában feláldozták. A mikroarray vizsgálatok során az állatokat naponta kezelik „sóoldattal” (15 kezelések sóoldat, ip), „akut” kokainnal (14 kezelések sóoldattal + 1 kezelés 20 mg / kg kokain-HCl, ip), „ismételt + akut” kokainnal ( 7 kezelések sóoldat + 8 kezelések 20 mg / kg kokain-HCl, ip) vagy „ismételt kivonás + akut” kokain (7 kezelések 20 mg / kg kokain-HCl + 7 kezelések sóoldat + 1 kiindulási kezelés 20 mg / kg kokain-HCl, ip) és 1 órával feláldozták a végső kezelés után. A viselkedési kísérletekben az egereket külön-külön helyezték el műtét után és 10 mg / kg kokain-sósavval kezelték, ip, az alábbiak szerint. A dendritikus gerinc elemzéséhez és a mikrotípusos validációhoz a HSV-GFP és a HSV-G9a-GFP fertőzés után az egereket „sóoldattal” (5 kezelések sóoldat, ip) vagy „ismételt kokainnal” (5 kezelések 20 mg / kg kokain-HCl, ip) kezeltük. ) az 3 napok során, mivel ezt az injekciós protokollt korábban kimutatták, hogy a Herpes simplex vírus (HSV) transzgén expressziójának időkereten belül növeli a gerinc sűrűségét a nucleus akumbens (NAc) idegsejteken (Kiegészítő referencia S1). A dendritikus gerinc analízishez használt egereket az utolsó kezelés után 4 órával feláldozták.
A NAX idegsejtekre korlátozott G9a transzkriptum lokális deléciójának indukálásához homozigóta mutánsokat alkalmaztunk egy floxált G9a allélhez, amelyeket másutt részletesen ismertettek (S2). A Cre által indukált rekombináció az 22 és 25 exonokat eredményez kereten kívüli splicingként, ami a mutált transzkriptum értelmetlen közvetítéséhez vezet. G9a egereket használtunk, amelyeket teljesen kereszteztek C57BL / 6J egerekre. Az egereket szterotaxikusan injektáltuk a NAc-be Adeno-associate virus (AAV) vektorokkal (2 szerotípus), amelyek expresszálják GFP-t vagy Cre-GFP-t 7 és 10 hetes korok között. Immunhisztokémiai analízist alkalmaztunk a Cre által mediált rekombináció hatékonyságának igazolására (lásd Kiegészítő S5 ábra). Az AAV injekcióval beadott állatokat 21 nappal a műtét után alkalmaztuk, mivel a rekombináció a G9a lebegő egerekben stabil és maximális volt ebben az időpontban, összhangban a közzétett jelentésekkel (S3-S4). A G9a és ΔJunD túlexpressziós kísérleteket hasonló módon végeztük HSV vírusvektorokkal, amelyek GFP-t, vad típusú G9a-GFP-t, katalitikusan elpusztult G9aH1093K-GFP-t vagy ΔJunD-GFP-t expresszálnak (lásd: S2 a G9a konstrukciók fejlesztésének részleteiről). A HSV túlexpresszáló egereit 3 nappal a műtét után alkalmazták, mivel az overexpresszió ebben az időpontban volt a maximális, amint azt immunhisztokémiával megfigyeltük. A HSV-expresszió átmeneti jellege és az AAV-expresszió lényegesen stabilabb jellege miatt a HSV-vektorokat gyors, rövid távú transzgén expressziót igénylő kísérletekben használták, míg az AAV-vektorokat olyan kísérletekben használták, amelyekben hosszabb ideig tartott a transzgén expresszió. Mindkét vektorról kiterjedt korábbi vizsgálatok során kimutatták, hogy csak az idegsejttesteket fertőzik meg az injektált agy területén, az afferens vagy efferens idegsejtek fertőzése nélkül.
A farmakológiai G9a / GLP inhibitor, BIX01294 (25 ng / μl) alkalmazásával végzett viselkedési kísérletekhez az egereket szterotaxikusan implantáltuk két szubkután mini szivattyúval, valamint kétoldalú vezető kanülökkel a NAc-be. A mini-szivattyúkat 12 órákkal aktiválták a beültetés előtt, és megkezdték a hordozó (0.25 hidroxi-propil-β-ciklodextrin) vagy gyógyszer folyamatos leadását (5 μl / óra) vagy gyógyszert 14 napokra, ezen idő alatt viselkedésbeli értékeléseket végeztünk.
A ΔFosB túlexpressziós kísérletekhez [Western blot, qPCR és ChIP], férfi bitransgén NSE-tTA × tetOP-ΔfosB egereket használtunk (hetente 10), ahol a tetraciklinszármazék doxyciklin hiányában (8 héten kívül a doxiciklin) az állatok robusztus striatálisan korlátozott konstitutív expressziót mutattak ΔFosB (S5). Ezekben az egerekben az ΔFosB túlexpresszióját qPCR-en igazoltuk. Megállapítások megerősítése az NSE-tTA × tetOP-ΔfosB egereket, vadtípusú 8-hetes C57BL / 6J hím egereket sztereotaxikusan injektáltunk NAc-vel AAV vektorokkal, amelyek GFP-t vagy ΔFosB-GFP-t expresszáltak. Ebben az esetben AAV-vektorokat használtunk a maximális ΔFosB expresszió biztosítására a műtét utáni 8 héten, lehetővé téve a vírusokkal fertőzött és a bit transzgenikus ΔFosB túlexpresszáló egerek közvetlen összehasonlítását. A vírus túlexpresszióját qPCR alkalmazásával igazoltuk a műtét utáni 8 héten (az 15 méretű NAc lyukakat boncoltuk az injekció helyén). A QPCR-hez nem használt AAV-GFP és AAV-ΔFosB-GFP egereket sóoldattal (14 kezelések fiziológiás sóoldat, ip) vagy ismételt kokainnal (14 kezelések 30 mg / kg kokain-HCl, ip) kezeltük az 6 héten belül, sebészet. Az utolsó kezelést követő 4 nappal az agyokat 4% paraformaldehiddel fixáltuk, vibratomeren szétválasztottuk és dendritikus gerinc elemzéshez használtuk.
Western blot analízis
14-méretű NAc lyukakat vettünk rozsdamentes acél egér agymátrix alkalmazásával nyert 1 mm-es koronális metszetekből, majd proteinnet és foszfatázgátlókat tartalmazó 1 M HEPES lízispufferben (1% SDS) ultrahanggal ultrahanggal ultrahanggal ultrahanggal kezeltük. 10-Az összes protein 30 μg mintáit elektroforézissel vizsgáltuk 18% SDS gélen. A fehérjéket átvisszük a PVDF membránokba, és inkubáljuk anti-H3K9me2 (egér monoklonális, 1: 500), anti-β-tubulinnal (egér monoklonális, 1: 60,000), anti-teljes hiszton H3 (nyúl poliklonális, 1), anti-GFP (az azonos vírus expresszió ellenőrzésére lyukasztott szövetben) (nyúl poliklonális, 5,000: 1), anti-H1000K3me27 (nyúl poliklonális, 3: 1) vagy anti-aktin antitestek (egér monoklonális, 500: 1: 60,000) 4 ° C (az összes membránt blokkoltuk 5% tejben vagy 5% szarvasmarha szérum albuminban). A membránokat ezután peroxidázzal jelölt szekunder antitestekkel inkubáltuk (1: 15,000-1: 60,000 az alkalmazott elsődleges antitesttől függően) és a sávokat a SuperSignal West Dura szubsztrát alkalmazásával vizualizáltuk. A sávokat NIH Image J szoftverrel számszerűsítettük, és a H3K9me2 sávokat aktinná vagy β-tubulinná és a H3 teljes hisztonnal normalizáltuk az egyenlő terhelés ellenőrzése céljából. Az ismételt kokainnak nem volt hatása az aktinszintre (S8) vagy a teljes hiszton 3 (S1) a NAc-ban. Ezenkívül a HSV-G9a-GFP és a HSV-G9aH1093K-GFP fertőzés nem befolyásolta a NAc teljes β-tubulinszintjét (S8).
Immunohisztokémia
Az egereket szatáltuk halálos dózisú klorális hidráttal és perfuzáltuk 4% paraformaldehiddel, mielőtt egy vagy kettős immunhisztokémiai elemzéssel végeztük a korábban ismertetett módon (S6). Röviden: az utólag rögzített agyakat szobahőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk 30% szacharózban, mielőtt szétválasztottuk az 35 μm-nél (a dendritikus gerinc analízishez használt agyokat 100 μm metszeteken vibratomereken szétválasztottuk 30% szacharóz hiányában). A szabadon lebegő NAc metszeteket 1X PBS-sel mostuk, blokkoltuk (3% normál szamér szérum, 0.1% tritonX, 1X PBS), majd később anti-GFP-vel (csirke poliklonális, 1: 8000) és / vagy anti-G9a-val (nyúl poliklonális) inkubáltuk. , 1: 500) antitestek blokkoló oldatban. A dendritikus tüskék szempontjából vizsgált metszeteket nyúl poliklonális anti-GFP antitesttel inkubáltuk az 1: 200 helyen. Egy éjszakán át tartó inkubálás után a NAc metszeteket 3-percekben 10-percekben öblítettük 1X PBS-sel, majd Cy2 és / vagy Cy3 fluoreszcens kapcsolt szekunder antitestekkel inkubáltuk 1X PBS blokkoló oldatban 2 óráig. A morfológiai vizsgálatokhoz használt metszeteket egy másodlagos antitestben inkubáltuk egy éjszakán át szobahőmérsékleten. A nukleáris együttfestést úgy végeztük, hogy a metszeteket inkubáltuk DAPI-t tartalmazó 1X PBS-ben (1: 50,000) 10 percig. A szekciókat ismét mossuk, majd etanollal dehidráljuk és DPX-fel szereljük. Az összes metszetet konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk.
RNS izolálás és qPCR
A kétoldalas 14-es méretű NAc lyukasztókat Trizol-ban homogenizáltuk és a gyártó utasításainak megfelelően dolgoztuk fel. Az RNS-t RNAesy Micro oszlopokkal tisztítottuk, és a spektroszkópia megerősítette, hogy az RNS 260/280 és 260/230 adagja> 1.8. Ezután az RNS-t Bio-Rad iScript Kit segítségével fordítottuk át. A cDNS-t qPCR-rel számszerűsítettük SYBR Green alkalmazásával. Mindegyik reakciót duplikátumban vagy triplikátumban futtattuk, és a korábban leírt ΔΔCt módszerrel elemeztük, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázt (GAPDH) használva normalizációs kontrollként (S7). Lát kiegészítő S5 táblázat mRNS primer szekvenciákhoz.
DNS mikrotábla-elemzés
Négy csoportot (csoportonként 3 független biológiai replikátumok) alkalmaztunk a mikrotáblás vizsgálathoz, összesen 12 mikrotáblákat. Az utolsó kokain injekció beadása után 1 órában az állatokat gyorsan lebontották, az agyakat eltávolítottuk és jégre helyeztük. A NAc szétválasztásait 15-méretű tűlyukasztással végeztük, majd gyorsan száraz jégen fagyasztottuk, amíg az RNS-t extraháltuk. A kétoldalú ütéseket négy állatból összegyűjtöttük replikátumonként, összesen 12 egereket csoportonként. Az RNS izolálását, a mikrotáblák feldolgozását és az adatok elemzését a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (S8). Röviden: az RNS-t a fent leírtak szerint izoláltuk és tisztítottuk, és minőségüket az Agilent Bioanalyzer segítségével ellenőriztük. Az Illumina MouseWG-6 v2.0 tömbökhöz fordított transzkripciót, amplifikációt, jelölést és hibridizációt az UT Southwestern microarray magjának szokásos eljárásaival hajtottunk végre. A nyers adatokat a háttérből kivontuk és a kvantilt normalizáltuk a Beadstudio szoftver segítségével. A normalizált adatokat a GeneSpring szoftverrel elemeztük, és genelistákat állítottunk elő az 1.3-szoros változási határérték szignifikancia kritériumai alapján, amelyhez p <0.05 nem szigorú p-érték cutoff társult.
Számos okból fenntartjuk az adatok magas fokú bizalmát. Először az összes állatot kezelték, kezelték és leölték ugyanabban az időben, azonos feltételek mellett. Ugyancsak az összes RNS és tömb feldolgozást egyszerre végeztük. Másodszor, három párhuzamos tömböt és több állat összegyűjtését tömb mintánként végeztük, ezáltal minimalizálva az egyéni variabilitás miatti különbségeket és növelve a statisztikai teljesítményt (S9). Harmadszor, a vizsgálatunkhoz felhasznált adatelemzési kritériumokat a MicroArray Quality Control projekt ajánlja, mivel ezeket a kritériumokat érvényesítették, hogy magas szintű helyszíni reprodukálhatóságot, valamint a lemezek közötti és belső formátumú reprodukálhatóságot biztosítsanak (S10-S11).
A vírusvektorok felépítése
A vírusvektor-beillesztés méretének korlátozása miatt a G9a vadtípusra (G9a) vagy a katalitikusan elpusztult G9a-ra (G9aH1093K) kódoló szekvenciákat szubklónoztuk a bicistronic p1005 + HSV plazmidba, amely GFP-t expresszál (a humán azonnali kovin citogén irányítása alatt). beillesztési méret ~ 9 kb volt, amely meghaladja az AAV-3.96 vektorok maximális beillesztési méretét). Az IE2 / 4 promóter vezérli a G5a expressziót. A fragmenseket szubklónoztuk a biszisztronos p9 + HSV plazmidba tompa végű ligálással Klenow-val kezelt PmeI-vel és EcoRI-vel emésztett G1005a-val (pcDNA9-ből) és CIP-vel kezelt p3.1 + -val EcoRI emésztést követően. A HSV-AJunD-GFP előállításához az EcoRI restrikciós helyekkel szegélyezett AJunD kódoló szekvenciáját PCR-rel állítottuk elő, az EcoRI helyet tartalmazó primer oligonukleotidok felhasználásával. A PCR-terméket ezután ligáltuk a p1005 + vektor EcoRI helyére. A Cre rekombináz helyi expresszióját NAc idegsejtekben vírusközvetített génbejuttatással érjük el AAV vektor alkalmazásával, a leírtak szerint (S12). A GFP-t vagy a GFP N-terminális fúzióját Cre-val szubklónoztuk egy rekombináns AAV-2 vektorba, amely CMV-promótert tartalmaz, összekapcsolt donor-akceptor szekvenciával és poliadenilációs szignállal. Az összes vektor-inszerciót didezoxi-szekvenálással igazoltuk. A vírusvektoreket hármas transzfekcióval, segítő nélküli módszerrel állítottuk elő, az előzőekben leírtak szerint (S13). A tisztított vírust -80 ° C-on tároltuk. A vírusminőséget fertőző titerrel határoztuk meg, amelyet a HEK293 sejtekben értékeltünk. Hasonlóképpen készítettük az AAV-ΔFosB-GFP vírusokat. A HSV-Cre esetében a Cre expressziót egy IRES promóter hajtotta végre, szemben az IE4 / 5 promóterrel, a Cre expresszió minimalizálása és az idegrendszeri toxicitás megelőzése érdekében (lásd: S14 vírusszerkezethez). A vírusok túlzott expresszióját mindkét esetben validálták in vitro és a in vivo, qPCR-en keresztül, és a vírusokat immunhisztokémiailag igazoltuk, hogy műtét után NAc-korlátozott expressziót mutatnak.
Sztereotaxikus műtét
Ketamin (100 mg / kg) / xilazin (10 mg / kg) érzéstelenítés alatt az egereket kisállatok sztereotaxikus eszközébe helyeztük, és a koponya felületét kitettük. Harminchárom fecskendőtűt használtunk az 0.5 μl vírus kétoldalú infúziójához a NAc-ba 10 ° szögben (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) 0.1 μl / perc sebességgel. A HSV-injekciót kapó állatoknak 2 napokon keresztül lehetővé tették a gyógyulást a műtét után, míg az AAV-vektorokat kapó viselkedési tesztekhez használt egereknek 20 napokon át lehetővé tette a gyógyulást, mielőtt azokat kondicionáltuk. Ezek az időszavak összhangban vannak a két vektor maximális vírus-közvetített transzgén expressziójának periódusaival. A BIX01294 infúziókhoz mindkét miniszivattyút szubkután helyeztük el az egér hátára. A kanül elhelyezését két kisebb koponya lyuk fúrásával, a NAc fölött, és a kanül bregmából történő leadásával érhetjük el (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Az egereknek hagyták, hogy az 4-tól 5-ig terjedő műtétekből gyógyuljanak, mielőtt megkezdenék a kokainra történő kondicionálási eljárást, az alábbiak szerint.
Kondicionált helybeállítás
A helykondicionáló eljárást az előzőekben leírtak szerint hajtottuk végre, a következő módosításokkal (S7). Röviden, 3 nappal azután, hogy a HSV-G9a-GFP, a HSV-G9aH1093K-GFP vagy a HSV-GFP NA-n belüli infúzióit tettük, az egereket a kondicionáló kamrákba helyeztük, amelyek három különböző környezetből állnak. Azokat az egereket, amelyek szignifikánsan preferálták a két kondicionáló kamra bármelyikét, kizártuk a vizsgálatból (az összes állat <10% -a). A kondicionáló csoportokat ezután kiegyensúlyozták, hogy igazodjanak a kamra esetleges torzulásához. A következő napokban az állatokat fiziológiás sóoldattal injektálták, és délután 30 percig az egyik kamrába zárták, majd kokaint (10 mg / kg, ip) injektáltak, majd 30 percig esténként a másik kamrába 2 napig (két sóoldat és két kokain párosítás). A teszt napján az egereket 20 percig kezelés nélkül visszahelyeztük a készülékbe, és teszteltük, hogy értékeljük, melyik oldalt preferálják. A kokainra adott mozgásreakciókat a kokainnal párosított kamrákban végzett gerenda-törésekkel értékelték, hogy biztosítsák a kábítószer-kezelés hatékonyságát. Az AAV és BIX01294 CPP kísérletekhez kissé módosított protokollt alkalmaztunk. Az állatokat ismét sóoldattal vagy kokainnal (10 mg / kg, ip) injektáltuk, és 30 percen át meghatározott kamrákba zártuk, de ehelyett csak naponta egyszer kondicionáltuk 4 napig, majd az 5. napon elvégeztük a vizsgálatot (az állatokat kondicionáltuk). este és a kondicionáló kezeléseket váltogatták). Valamennyi csoport esetében értékeltük a kiindulási mozgást a fiziológiás sóoldat hatására annak biztosítására, hogy a mozgást ne befolyásolja a vírusos vagy inhibitoros kezelés.
Intravénás kokain önbeadás
Hím serdülőkorú Long-Evans patkányokat nyertünk, amelyek súlya 230 – 250 g volt a kísérlet elején. Ezeket nedvesség- és hőmérséklet-szabályozott környezetben helyezték el egy fordított 12 órás fény / sötét cikluson (világítás kikapcsolva 9: 00 am) ad libitum élelemhez és vízhez való hozzáférés. A patkányokat hagytuk akklimatizálni az új környezetükben, és a kísérlet megkezdése előtt minden héten 1 kezeltük. Az összes eljárást a Nemzeti Egészségügyi Intézet laboratóriumi állatok gondozásáról és felhasználásáról szóló útmutatójának megfelelően hajtották végre, és a Mount Sinai Állatgondozási és Használási Bizottság jóváhagyta. Az önszabályozó berendezést infravörös sugarakkal láttuk el, hogy meghatározzuk a mozgásszervi viselkedést. Az önbeadást a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (S15-S16) izoflurán (2.4–2.7%) altatásban a jobb nyaki vénába beültetett katéterekkel. A katétereket 0.1 ml sóoldattal öblítettük, amely 10 U heparint és ampicillint (50 mg / kg) tartalmazott. A műtét utáni egy hetes gyógyulást követően a világos / sötét ciklus sötét szakaszában megkezdődött az önadminisztráció. Az állatok napi 3 órás hozzáférést kaptak kokainhoz (0.75 mg / kg / infúzió) fix arányú 1 (FR1) megerősítési ütemterv alatt, ahol 1 aktív karnyomás egyetlen gyógyszerinfúziót eredményezett. A patkányok 6 nap után stabilizálták kokainbevitelüket (15 egymást követő napon a válaszarány <3% -os változása, legalább 75% -kal reagálva a megerősített karon). 24 órával az utolsó önadagolás után a patkányokat gyorsan lefejezték, az agyakat gyorsan eltávolították és feldolgozták RNS izoláláshoz és qPCR-hez.
Kromatin immunprecipitáció (ChIP)
A friss NAc lyukakat formaldehiddel térhálósítottuk és előkészítettük a ChIP-hez a korábban leírtak szerint (S17-S18) kisebb módosításokkal. Röviden: állatokonként 4 14 méretű NAc ütéseket gyűjtöttünk össze (mintánként összegyűjtött 5 állatokat), keresztkötöttük 1% formaldehiddel és 2 M glicinnel leállítottuk, mielőtt –80 ° C-on fagyasztottuk. 1 nappal a minta szonikálása előtt juh-nyúl / egér (a csapadék-ellenanyagotól függően) IgG mágneses gyöngyöket készítettünk megfelelő mágneses gyöngyök inkubálásával akár anti-G9a-val (nyúl poliklonális ChIP fokozat), akár anti-H3K9me2-vel (egér monoklonális ChIP fokozat). antitestek egy éjszakán át 4 ° C-on, állandó forgatással, blokkoldatban. A szöveti szonikálást és a kromatin nyírást a korábban leírtak szerint végeztük (S17). A szonikációt követően a kromatin azonos koncentrációját vittük át új csövekbe, és a végtermékek ~ 5% -át megmentettük, hogy „bemeneti” kontrollként szolgáljanak. A konjugált gyöngy / antitest keverékek alapos mosása és újraszuszpendálása után egyenlő mennyiségű antitest / gyöngy keveréket (~ 7.5 μg antitest / minta) adtunk minden egyes kromatin mintához, és ~ 16 órán át inkubáltuk állandó forgatással, 4 ° C hőmérsékleten. A mintákat tovább mostuk és fordított térhálósítással 65 ° C-on egy éjszakán át, mielőtt a DNS-t tisztítottuk egy PCR tisztítókészlettel. A DNS tisztítását követően a mintákat qPCR-nek vetjük alá, és normalizáljuk a megfelelő „bemeneti” kontrollokkal, a korábban leírtak szerint (S17). Az egér poliklonális anti-IgG antitesttel végzett normál egér IgG immunprecipitációit szintén elvégeztük a szignál amplifikáció megfelelő gazdagodásának ellenőrzése céljából. Az adenin-foszforiboszil-transzferázt (APRT) negatív kontrollként használták a kokain és az ΔFosB túlzott expressziós kísérletekben. Lát Kiegészítő táblázat S5 a promoter primer szekvenciákhoz.
Dendritikus gerinc analízis
A G9a szerepének tanulmányozására a neuronális morfológia szabályozásában in vivo a korábbiakban ismertetett módszereket alkalmaztuk a következő módosításokkal (S1). Három nappal a HSV-GFP, a HSV-G9a-GFP, a HSV-AJunD-GFP (az összes vírust a vad típusú C57Bl / 6J egerekben használták), vagy a HSV-Cre-GFP (a G9a-ban használták) injekciózása utánfl / fl egerek), amikor a vírus expressziója maximális volt, az egereket perfundáltuk, az agyakat hidegen védettük, majd később 100 μm-rel elválasztottuk egy vibratomeren. A szekciókat ezután immunfestékkel kezeltük a GFP elleni antitest felhasználásával, a fentiek szerint (lásd az immunhisztokémia). A G9a túlzott expressziójának és a knockoutnak a gerincszámra gyakorolt hatásainak, valamint az ΔJunD túlzott expressziójának értékeléséhez megmérjük a tüskék számát neurononként körülbelül 1 – 2 neuritekön, egyenlő legalább 299 μm másodlagos dendritekkel a GFP-t expresszáló NAc táptalajból. tüskés idegsejtek (MSN-k). Tekintettel arra, hogy az MSN-ek morfológiai szempontból különböznek a NAc más idegpopulációitól, valamint a korábbi jelentések szerint a HSV elsősorban a DARPP-32-t expresszáló idegsejteket fertőzi ezen agyi régióban (S19), biztosak vagyunk abban, hogy az MSN-ket kizárólag ezekben a vizsgálatokban értékelték. Minden állatnál ~ 6 – 8 idegsejteket vizsgáltunk 3 – 4 állatokban csoportonként (7 csoportok), majd minden állatra statisztikai elemzés céljából átlagértéket kaptunk. Az ΔFosB túlzott expressziójának a NAc gerinc sűrűségére gyakorolt hatásainak vizsgálatára hasonlóan a fentiekben leírtakkal is foglalkozunk, azzal a különbséggel, hogy az AAV vektorokat hosszabb ideig (8 hétek) fejezték ki a GFP vagy az ΔFosB-GFP expressziójára. Az összes HSV-képet konfokális mikroszkóppal rögzítettük egy 100X olajimmerziós objektívvel (az AAV-képeket egy 63X olajimmerziós objektívvel készítettük). A képeket az 1 tetszőleges egységnél beállított csaplyukkal és 1024 × 1024 keretmérettel állítottuk elő. A dendritikus hosszúságot az NIH Image J szoftver segítségével mértük, és a gerincszámokat vakként számoltuk meg az elsőkísérlet során, mivel a diákat a kísérleti szkennelés előtt kódoltuk. Kiszámoltuk a tüskék átlagos számát 10 μm dendritben.
Statisztikai analízis
Egy- és kétirányú ANOVA-kat végeztünk a kondicionált helypreferencia és a dendritikus gerinc analízis szempontjából a szignifikancia meghatározására kétnél nagyobb csoportnál. A Student t teszteit más összehasonlításokhoz használták, beleértve a qPCR-t, a Western blotot, a dendritikus gerinc elemzést, összehasonlítva a HSV-GFP-t a HSV-Cre-val a G9a-banfl / fl egerek, mikroarray elemzések (lásd fent) és kromatin immunprecipitációs kísérletek. A tervezett hallgatói t-teszteket a dendritikus gerincsűrűség kétirányú ANOVA elemzését követően alkalmaztuk ΔFosB túlzott expresszió után, megerősítve a gyógyszeres kezelés és a vírus jelentős fő hatásait. Az ábrákban szereplő összes érték az átlag ± SEM értéket képviseli (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Részletes statisztikai elemzések a Ábrákon. 1-3 a fő szövegben a következő: Részletes ábra legendák statisztikával együtt.
Lábjegyzetek
Igazolom, hogy a kéziratban szereplő anyagok egyike sem jogosult A hiszton metil-transzferáz G9a alapvető szerepe a kokain által indukált plaszticitásban korábban már közzétették vagy fontolgatják máshol, beleértve az internetet is.
Az állatok felhasználásával kapcsolatos minden munkát az intézményi és az IACUC iránymutatásokkal összhangban végeztek mind a Texasi Egyetem Délnyugati Orvosi Központjában, mind a Mount Sinai Orvostudományi Iskolában.
Hivatkozások és megjegyzések
;
