(HUMAN) Viselkedési és szerkezeti válaszok a krónikus kokainra A táplálás előtti hurkot igényelnek, amely magában foglalja az AFosB-t és a kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II-t a Nucleus Accumbens Shellben (2013)

Az AFosB transzkripciós faktort és az agyban dúsított kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II-t (CaMKIIa) a nukleinsavban (NAc) indukáljuk krónikus kokain vagy más pszichostimuláns gyógyszerekkel való visszaélés révén, amelyben a két fehérje közvetíti a szenzitizált gyógyszerválaszokat . Bár az AFosB és a CaMKIIα mind az AMPA glutamát receptor expresszióját és működését szabályozza NAc-ben, a dendritikus gerincképződést NAc közepes tüskés neuronokon (MSN), és a lokomotoros érzékenységet a kokainra nézve, a molekulák között nem volt közvetlen kapcsolat. Itt bemutatjuk, hogy az AFosB CaMKIIα-val foszforilálódik a fehérje-stabilizáló Ser27-ben, és hogy a CaMKII szükséges a kokain által közvetített AFosB felhalmozódásához patkány NAc-ben.

Ezzel szemben megmutatjuk, hogy a ΔFosB szükséges és elegendő a CaMKIIα gén expressziójának in vivo kokainindukciójához, ami a D szelektív hatása.₁-típusú MSN-ek az NAc shell alrégióban.

Továbbá a dendritikus gerincek indukciója NAc MSN-eken és fokozott viselkedési reakció a kokain után az AFosB NAc túlexpressziója után mindkettő CaMKII-függő.

Fontos, hogy bemutatjuk az AFosB és CaMKII első indukcióját a emberi kokainfüggők, ami a jövőbeni terápiás beavatkozásra vonatkozó lehetséges célokat sugall Ezek az adatok azt mutatják, hogy az AFosB és a CaMKII egy sejt-típusú és agy-régió-specifikus pozitív feedforwardhurkot vesznek részt, mint kulcsfontosságú mechanizmust az agy jutalmazási áramkörének szabályozására a krónikus kokain hatására.

Bevezetés

A növekvő bizonyítékok alátámasztják azt a nézetet, hogy a génexpresszió változásai hozzájárulnak a kábítószerfüggőség mechanizmusához (Robison és Nestler, 2011). Ezen változások egyik fontos közvetítője a FosB, a Fos család transzkripciós faktorja (Nestler, 2008). Gyakorlatilag bármilyen bántalmazó gyógyszer krónikus beadása indukálja az AFosB hosszú távú felhalmozódását a nukleáris accumbensben (NAc), amely a jutalom viselkedéséhez szükséges limbikus régió. Such az indukció specifikus a NAc közepes tüskés neuron (MSN) osztályára, amely D1 dopamin receptorokat expresszál. Az ΔFosB indukálható túlzott expressziója ezekben a D1 típusú NAc-ben Az MSN-ek növelik a mozgásszervi és a kokainra és a morfinra adott válaszokat. (Kelz és munkatársai, 1999; Zachariou és munkatársai, 2006), beleértve a fokozott kokain-önadagolást (Colby és munkatársai, 2003). Továbbá az ΔFosB transzkripciós aktivitás genetikai vagy vírusos blokkolása csökkenti e gyógyszerek előnyös hatásait (Zachariou és munkatársai, 2006), ami azt jelzi, hogy ez a tartós AFosB indukció kritikus közvetítője a krónikus gyógyszeradagolás során a NAc-ben indukált tartós változásoknak..

Az AFosB szokatlan stabilitása (az összes többi Fos-fehérjéhez viszonyítva) a molekula belső tulajdonsága, mivel a teljes hosszúságú FosB-ben lévő degron-domének csonkítása miatt (Carle és munkatársai, 2007) és egy szabályozott folyamat. A FosB foszforilált in vitro és a in vivo Ser27-en, és ez a reakció tovább stabilizálja az AFosB-t, ~ 10-szerű sejteket a sejttenyészetben és a NAc-ben in vivo (Ulery-Reynolds és munkatársai, 2009). Bár a Ser27-AFosB bizonyult szubsztrátnak a kazein-kináz-2 számára in vitro (Ulery és munkatársai, 2006), annak mechanizmusa in vivo a foszforiláció még nem ismert.

A kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II (CaMKII) egy erősen expresszált szerin / treonin kináz, amelynek α és β izoformái dodecamerikus homo- és hetero-holoenzimeket képeznek in vivo, és elengedhetetlenek a neuroplasztika többféle formájához (Lisman és munkatársai, 2002; Colbran és Brown, 2004). A CaMKIIα-t szelektíven indukálják NAc héjban krónikus amfetamin (Loweth és munkatársai, 2010), és a CaMKII-aktivitás NAc-héjban való farmakológiai blokádja csökkenti az amfetamin viselkedési érzékenységét (Loweth és munkatársai, 2008) és a kokain (Pierce és munkatársai, 1998), míg a CaMKIIα vírusos túlzott expressziója ebben a NAc szubregionban fokozza az amfetamin lokomotoros szenzitizálását és önadagolását (Loweth és munkatársai, 2010). A CaMKIIα befolyásolhatja a jutalom viselkedését az AMPA glutamát receptor alegységek modulálásával (Pierce és munkatársai, 1998), mivel a CaMKIIα aktivitás már régóta összefügg az AMPA receptor funkcióval és a szinaptikus célzással a neuroplasztika számos formájában (Malinow és Malenka, 2002).

Ez a szakirodalom számos párhuzamot mutat az ΔFosB és a CaMKII között: mindkettő szükséges és elegendő a visszaélésszerű gyógyszerek többféle viselkedési hatásához, mindkét dendritikus gerincet különböző neuronális sejttípusokban felfelé szabályozva in vivo (Jourdain és munkatársai, 2003; Maze és munkatársai, 2010), és mindkettő legalább néhány viselkedési hatást gyakorol az AMPA receptorok modulálásával (Kelz és munkatársai, 1999; Malinow és Malenka, 2002; Vialou és munkatársai, 2010). Ezen párhuzamok ellenére nem ismert funkcionális kapcsolat az AFosB és a CaMKII között. Itt kölcsönös szabályozást hozunk létre az AFosB és a CaMKII között, és azt mutatjuk be, hogy a két fehérje egy D1 típusú MSN-specifikus előremenő hurkot alkot a NAc-héjban, amelyet a kokain indukál, és szabályozza a kokain válaszreakciókat in vivo.

Ugrás:

Anyagok és módszerek

Kísérlet 1: iTRAQ NAc Shell és Core proteinek analízise a kokainkezelés után (1A)

Felnőtt (8 hetek) hím patkányokat naponta egyszer 20 mg / kg kokain vagy sóoldatú IP-t adtunk be hét napig. 24 óra az utolsó injekció után a NAc héj és a mag mikrodisszektálták (1A) és fagyasztva villog. Az iTRAQ elemzéseket a korábban leírtak szerint végeztük (Ross és munkatársai, 2004; Davalos és munkatársai, 2010).

ábra 1

A CaMKII-nak a kokcinnal végzett CaMKII-specifikus indukciója

2 kísérlet: A fehérje változások mennyiségi meghatározása a patkány NAc Core-ban és a Shell-ben a kokainkezelés után (1B – D ábra)

Felnőtt (8 hét) hím patkányokat naponta egyszer 10 mg / kg kokain vagy sóoldat-hordozó IP-hez adtunk a mozgáskorlátozó kamrákban. A kokain egyetlen injekciójához (5 mg / kg IP) adott lokomotoros válaszokat a korábban kokainnal („krónikus”) kezelt állatoknál és a fiziológiás sóoldattal kezelteknél („akut”) kezelt állatoknál, valamint a fiziológiás sóoldatra adott lokomotoros válaszoknál regisztrálták. csak a fennmaradó krónikus sóoldattal kezelt állatokban (a „sóoldatban”) regisztrálták. A lokomotor aktivitási vizsgálatokat a leírtak szerint végeztük (Hiroi és munkatársai, 1997). Röviden, a felnőtt hím patkányokat 18 "x 24" PAS nyílt terepi felvétel dobozokba helyeztük (San Diego Instruments) 30 min-hez a szokás megszerzéséhez, egyetlen fiziológiás sóoldat injekciót adtunk be, és további 30 percig figyeltük, 5 mg / kg kokain egyetlen egyszeri injektálása és 30 min.

A végső injekció beadása után 24 hr. Patkányokat anesztézia nélkül dekapitáltuk, hogy elkerüljük az érzéstelenítők hatását a neuronális fehérje szintekre és a foszfo-állapotokra. Agyakat sorozatosan szeleteltük egy 1.2 mm-es mátrixban (Braintree Scientific), és a célszövetet eltávolítottuk foszfát-pufferelt sóoldatban, amely proteáz (Roche) és foszfatáz (Sigma Aldrich) inhibitorokat tartalmazott, 14 mérőpofát használva NAc maghoz és 12 mérőpálcát a fennmaradó szövetek NAc héjhoz (lásd 1A) és azonnal száraz jégen fagyasztjuk. A mintákat módosított RIPA pufferben végzett ultrahanggal homogenizáljuk: 10 mM Tris bázis, 150 mM nátrium-klorid, 1 mM EDTA, 0.1% nátrium-dodecil-szulfát, 1% Triton X-100, 1% nátrium-dezoxikolát, pH 7.4, proteáz és foszfatáz inhibitorok mint fent. A Laemmli puffer hozzáadása után a fehérjéket 4 – 15% poliakrilamid gradiens géleken (Criterion System, BioRad) választottuk el, és a Western-blotot az Odyssey rendszer (Li-Cor) alkalmazásával végeztük a gyártó protokollja szerint.

3 kísérlet: A fehérje változások mennyiségi meghatározása patkány NAc magban és a Shellben a kokain visszavonása után (1E)

Felnőtt (8 hetek) hím patkányokat naponta egyszer 10 mg / kg kokain vagy sóoldatú IP-t adtunk be hét napig. A végső injekciót követő 14 nappal a fiziológiás sóoldattal kezelt állatok egy másik sóoldat injekciót kaptak (sóoldatnak), és a kokainnal kezelt állatok egy másik sóoldat injekciót kaptak (14 napos kivonás vagy „14d WD”), vagy egyszeri kokain injekciót ( „14d WD Chal” -nak nevezték ki. Egy órával az utolsó injekció után az állatokat dekapitáltuk és Western-blotot végeztünk a fentiek szerint kísérlet 2.

4 kísérlet: A fehérje változások mennyiségi meghatározása Rat NAc Core és Shell után a kokain önigazgatás után (2A – C)

A patkányokat arra tanították, hogy önállóan adják be 0.5 mg / kg / infúzióját a kokain egy órás ülésein egy fix arányú 1 menetrend szerint kilenc napig. Kilenc alapfolyamat után a patkányokat két csoportra osztották, amelyeket az utolsó két ülésen a kokain-bevitel követett. A patkányok egy csoportját hagyjuk önmagában beadni a kokainot (0.5 mg / kg / infúzió) egy órás szekciókban (rövid hozzáférés, ShA), míg a másik patkánycsoport önmagában beadta a kokain hat órás üléseken (hosszú hozzáférés, LgA ) tíz további napra (eszkalációs ülések).

Az agyszakaszokat immunhisztokémiai eljárással dolgoztuk fel a leírtak szerint (Perrotti és munkatársai, 2004). Az agyakat az utolsó hatóanyag-expozíció után 18 – 24 óra után perfundáltuk, ami a maradék teljes hosszúságú FosB-fehérje lebomlását eredményezte, így az összes maradék immunreaktivitás ΔFosB-t tükröz. Ezt a lebomlást Western blottal igazoltuk, amely nem mutatott szignifikáns festést egy olyan ellenanyaggal, amely a teljes hosszúságú FosB C-terminálisa ellen irányult, amely nem ismeri fel az AFosB-t (az adatokat nem mutatjuk be). Az 35 µm metszetekre történő szeletelés után az AFosB immunopozitív sejtek számát az egyes patkányok NAc-jén keresztül két részen vakon megfigyelt megfigyelõvel határoztuk meg, majd az egyes állatokra vonatkozóan az 40 × mezõ átlagértékeit számítottuk. Mindegyik állatot statisztikai elemzés céljából egyéni megfigyelésnek tekintettük. Az érdeklődő régiókat Paxinos és Watson segítségével azonosították (Paxinos és Watson, 2007).

A CaMKIIα immunreaktivitás mennyiségi meghatározását a leírásban ismertetett Licor rendszer segítségével végeztük.Covington és munkatársai, 2009). A CaMKII és a GAPDH integrált intenzitását Odyssey szoftverrel határoztuk meg. Az eredményeket integrált intenzitás értékekként adjuk meg mm-enként² és átlagban ± sem (n = 4 – 10 csoportonként). A GAPDH értékeit referenciaként alkalmaztuk a szeletvastagság és a körülmények közötti CaMKII intenzitás normalizálására.

ábra 2

CaMKII indukálása önmagát beadó patkányok és humán kokainfüggők NAc héjában

5 kísérlet: A fehérje szintek mennyiségi meghatározása kokain-függő emberekben (2D)

Eljárás

A post -ortemális emberi agyszöveteket a Quebec Suicide Brain Bankból szereztük be (Douglas Mental Health University Institute, Montreal, Quebec, Kanada). A szövetek megőrzése lényegében a leírtak szerint történt (Quirion és munkatársai, 1987). Röviden, az extrahálás után az agy nedves jégre kerül Styrofoam dobozba, és a Quebec Suicide Brain Bank létesítményeire rohant. A félgömböket az agy, az agyszár és a kisagy közepén egy szagittális vágással szétválasztják. A bal oldali féltekén a véredények, a fogpótlást, a koroid plexust, a félagyi és a fele agyi törzset tipikusan kivágják, majd a fagyasztás előtt koronálisan vágjuk 1 cm vastag szeletekre. Az utóbbi félagy az 1cm vastag szeletekre fagyasztva vágja. A szöveteket 2-metil-butánban fagyasztva fagyasztjuk -40 ° C-on ~ 60 sec. Az összes fagyasztott szövetet külön tartjuk műanyag tasakokban -80 ° C-on, hosszú távú tároláshoz. A specifikus agyterületeket a fagyasztott koronaszeletekről egy rozsdamentes acéllemezen szétvágják száraz jéggel, hogy szabályozzák a környezet hőmérsékletét. A Western-blotot az alábbiakban ismertetett módon végeztük kísérlet 2.

kohort

A kohorsz 37 férfi és 3 nőstényekből állt, az 15 – 66 évek korában. Minden személy hirtelen meghalt, hosszantartó agonális állapot vagy elhúzódó orvosi betegség nélkül. Mindegyik esetben a halál okát a Quebec Coroner irodája állapította meg, és a toxikológiai képernyőt szövetmintákkal végeztük, hogy információt szerezzenek a gyógyszeres kezelésről és az illegális szerhasználatról a halál idején. A vizsgált csoport 20 egyénekből állt, akik teljesítették a kokainfüggőségre vonatkozó SCID-I kritériumokat. A kontroll csoport 20-alanyokból állt, akiknek előzménye nem volt kokainfüggőség és nincsenek jelentős pszichiátriai diagnózisok. Minden személy hirtelen halt meg olyan okokból, amelyeknek nincs közvetlen hatása az agyszövetre. A csoportokat az átlag alatti életkor, a hűtési késleltetés és a pH értékhez igazítottuk. Az összes alany esetében a pszichológiai boncolásokat a korábban leírtak szerint végeztük.Dumais és munkatársai, 2005), amely lehetővé teszi számunkra, hogy hozzáférjenek a pszichiátriai és orvosi előzményekre vonatkozó részletes esettanulmányokhoz, valamint más releváns klinikai és szociodemográfiai adatokhoz. Röviden, egy kiképzett interjúkészítő végzett Strukturált klinikai interjú a DSM-IV számára Pszichiátriai zavarok (SCID-I) az elhunyt egy vagy több informátorával. A klinikusok egy csoportja felülvizsgálta a SCID-I értékeléseket, esettanulmányokat, koroner jegyzeteket és orvosi feljegyzéseket, hogy konszenzusos pszichiátriai diagnózisokat szerezzenek.

6 kísérlet: kromatin immunprecipitáció Rat NAc-hez (3A – C)

Felnőtt (8 hetek) hím patkányokat naponta egyszer 10 mg / kg kokain vagy sóoldatú IP-t adtunk be hét napig. Az utolsó injekció után az 24 órát a NAc héj és a mag mikrodissziáltuk. A kromatin immunprecipitációját (ChIP) a héj vagy a mag kétoldali NAc lyukasztásának csoportosítása során végeztük el 14 összes csoportban (98 állatok összesen, 7 kokainmedencék, 7 sóoldatok). A szöveteket térhálósítottuk, mostuk és -80 ° C-on tároltuk, amíg a kromatin szonikálással nem nyíródott. A nyírott kromatint egy éjszakán át inkubáltuk antitestekkel, amelyeket korábban mágneses gyöngyökhöz kötöttünk (Dynabeads M-280, Invitrogen). Ellenőrzésként nem-immunizált IgG-t alkalmaztunk. A reverz térhálósítást és a DNS-tisztítást követően a qPCR-t használtuk a CaMKIIα promoter DNS szintjének mérésére. A primereket úgy terveztük meg, hogy az AP-1 konszenzus szekvenciát tartalmazó X-NUMX bp-et tartalmazó régiót amplifikáljuk a transzkripciós starthely előtt (tovább: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

ábra 3

CaMKIIα sejtfaj- és régióspecifikus ΔFosB indukciója in vivo

7 kísérlet: CaMKII transzkriptum és fehérje expresszió mérése cellatípus-specifikus ΔFosB túlexpresszióval (3D)

Férfi NSE-tTA (A vonal) × TetOp-ΔfosB (11 vonal) és NSE-tTA (B vonal) × TetOp-FLAG-ΔfosB (11 vonal) egerek (Chen és munkatársai, 1998; Kelz és munkatársai, 1999; Werme és munkatársai, 2002; Zachariou és munkatársai, 2006) az 100 µg / ml doxiciklinen fogták fel és emelték az AFosB expressziójának elnyomását a fejlődés során. Az almattársak elválasztáskor megoszlottak: a félig maradt a doxiciklin, a feleket pedig vízbe kapcsoltuk, és az állatokat 8-hez használtuk 11 héttel később, amikor az ΔFosB transzkripciós hatásai maximálisak voltak (Kelz és munkatársai, 1999; McClung és Nestler, 2003). A transzkripciós analízishez az egereket gyorsan eltávolítottuk, és az agyakat eltávolítottuk és jégre helyeztük. A NAc disszekcióit egy 14-mérő tűcsúcs segítségével vettük fel, és gyorsan száraz jégen fagyasztottuk, amíg az RNS-t kivontuk. Az RNS-izolálást, a qPCR-t és az adatelemzést a korábban leírtak szerint végeztük (LaPlant és munkatársai, 2009). Röviden összefoglalva, az RNS-t TriZol reagenssel (Invitrogen) izoláltuk, tovább tisztítottuk a Qiagen RNAeasy mikro készletével, és az Agilent Bioanalyzer alkalmazásával ellenőrizni kívántuk a minőséget. A fordított transzkripciót iScript (BioRad) segítségével végeztük. qPCR-t egy Applied Biosystems 7900HT RT PCR rendszerrel hajtottunk végre a következő ciklusparaméterekkel: 10 min 95 ° C-on; 40 ° C 95 ciklusok 1 min, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec; a fűtést 95 ° C-ra osztályozzuk, hogy disszociációs görbéket állítsunk elő egyetlen PCR-termék megerősítéséhez. Az AFosB és CaMKIIα fehérje expressziójának immunhisztokémiai analízisét az alábbiakban ismertetett módon végeztük kísérlet 4.

8 kísérlet: A NAc D1 és D2 dopamin receptor antagonisták hatásai a kokain által közvetített fehérje változásokra (3H)

Felnőtt (8 hét) hím patkányokat naponta egyszer 10 mg / kg kokain vagy sóoldat („jármű” csoport) IP-nek adtunk be hét napig. 30 min. Minden egyes kokain injekció beadása előtt, a patkányokat IP-nek adtuk, vagy a D1 receptor antagonistát, az X XUMUMX-t (23390 mg / kg, „D0.5 Ant” csoport), vagy a D1 receptor antagonista etiklopridet (2 mg / kg, „D0.5 Ant” csoport) vagy egy sóoldat-kontroll injekció („kokain” csoport). 2 óra az utolsó injekció után, az állatokat dekapitáljuk és fehérjéket kvantifikáljuk Western-blottal kísérlet 2.

9 kísérlet: Az AAV-közvetített ΔFosB túlexpresszió hatása a fehérje expresszióra (4 A – C ábra)

Sztereotaxikus műtétet végeztünk felnőtt hím patkányokon (8 hét) az AAV-GFP (zöld fluoreszcens fehérje) vagy AAV-GFP-ΔFosB injekció beadására (Maze és munkatársai, 2010). Minden műtéthez 33 gauge tűket (Hamilton) alkalmaztunk, amelyek során 0.5 µl tisztított nagy titer vírust kétoldalúan infundáltunk 5 perc alatt, majd egy további 5 min infúzió utáni pihenőidőt. Minden távolságot Bregma-hoz viszonyítva mérünk: 10 ° szög, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 műtét után az állatoknak egyetlen IP-injekciót adtunk 10 mg / kg kokainnak a mozgásszervi megfigyelőkamrákban, hogy értékeljük az ΔFosB túlexpresszió viselkedési hatásait. A végső injekció után 24 óra után patkányokat dekapitáltunk kísérlet 2és a szöveti mikrodiszekciót fluoreszcens mikroszkópos irányítás alatt végeztük a GFP-pozitív NAc szövet előállításához. Ezután Western-blotot hajtottunk végre Kísérlet 2.

ábra 4

Az AFosB egyaránt szükséges és elegendő a kokain által közvetített D1 receptorfüggő CaMKIIα indukcióhoz NAc héjban

10 kísérlet: Az AAV-közvetített ΔJunD túlexpresszió hatása a kokain-függő fehérje expresszióra (4 D – F ábra)

Az AAV-GFP vagy az AAV-GFP-ΔJunD sztereotaxikus injekcióját Kísérlet 8. 14 műtét után az állatoknak naponta egyszer 10 mg / kg kokain vagy sóoldatú IP-t adtunk a mozgáskorlátozó kamrákban. A kokain egyetlen injekciójára (5 mg / kg IP) vagy sóoldatra adott lokomotoros válaszokat regisztráltuk. A végső injekció után 24 óra után a patkányokat dekapitáltuk, a szövetet összegyűjtjük, és a Western-blotokat úgy hajtottuk végre, ahogyan azt a Kísérlet 9.

Kísérlet 11: In vitro Fehérje-kináz-vizsgálatok (5A – D ábra)

A rekombináns CaMKIIα-t és AFosB-t rovarsejtekből tisztítottuk (Brickey és munkatársai, 1990; Jorissen és munkatársai, 2007), és a protein kináz vizsgálatokat végeztük (Colbran, 1993), amint azt korábban leírtuk. Röviden, a CaMKII-t jégen előinkubáltuk 2.5 uM (vagy jelzett koncentrációval) ΔFosB, 1 mM Ca²⁺40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​kalmodulin és 200 mM HEPES pH 7.5. A foszforilációt 200 µM ​​ATP hozzáadásával indítottuk el [γ-³²P] ATP-t és hagyjuk 10 percig szobahőmérsékleten folytatni (5A és B ábra) vagy 2 min jégen (5C és D ábra). A termékeket Western blottal (5A és B ábra) vagy autoradiogram és szcintillációs számlálással (B – D ábra).

ábra 5

Az AFosB a CaMKIIα hatásos szubsztrátja

12 kísérlet: Ser27 ΔFosB foszforiláció azonosítása (5E)

In vitro kináz vizsgálatokat végeztünk kísérlet 11a fehérjéket SDS-PAGE-val szétválasztottuk, és az AFosB-nek megfelelő sávokat kivágtuk és tandem tömegspektrometriának vetettük alá. A megfelelő ionfragmensek m / z hozzárendelése az összes panelben az ioncsúcsok tetején van jelölve. Nem minden fragmension van jelölve a térbeli korlátozások miatt. Általában a fragmentumionos címkék szövege fekete színű, kivéve, ha közvetlenül megerősítik vagy bizonyítják a foszforilációs helyek jelenlétét, amely esetben piros színnel vannak jelölve. A gerinc fragmentációs termékeire vonatkozó bizonyítékokat a foszfo-peptid szekvencia-leolvasásában mutatjuk be, a foszforilációs maradék helyét piros jelzéssel, egyetlen aminosav-betűvel jelezve. A megfigyelt fragmensionok numerikus leírása a peptidszekvencián is b és yionként van jelölve. Az alacsonyabb intenzitású fragmensionokat az m / z tengely szakaszainak nagyítási tényezői jelennek meg minden egyes fragmens tömegspektrumának tetején. A H panelen bemutatott fragmensionok megerősítik a Ser27 foszforilált izoformájának jelenlétét, azonban más foszforilált izoformák keverékében a Ser28, Ser31, Ser34 és Thr37 helyeken. A pa5, a pa5-P, a pb5 és a pb5-P ionok jelenléte egyértelműen megerősíti a Ser27 maradék foszforilációját.

13 kísérlet: A Ser27 foszforiláció mennyiségi meghatározása (5F)

A standard peptideket úgy terveztük meg, hogy utánozzák a Ser27 ΔFosB foszfo- és nem-foszfo-formáit. A szintézis és tisztítás után mindegyik „nehéz” idiotípusos peptidet feloldottuk 50 / 50 acetonitril / víz pufferben, és aminosav-elemzés céljából elküldtük a szintetikus peptid törzsoldat abszolút koncentrációjának meghatározására. Az egyes „nehéz” peptideket ezután közvetlenül az 4000 QTRAP tömegspektrométerbe (MS) infundáltuk, hogy meghatározzuk a legjobb ütközési energiát az MS / MS fragmentáció és a két-négy MRM átmenet között. Ezután a tiszta "nehéz" peptideket LCMS-nek vetettük alá az 4000 QTRAP-en, hogy biztosítsuk a peptid szétválasztását. A műszert hármas quadrupole módban futtattuk, a Q1 beállítva a specifikus prekurzor m / z értékre (Q1 nem szkennel), és a Q3 a specifikus m / z értékre van állítva, amely megfelel a peptid egy adott fragmensének. MRM módban egymás után mértük az egyes reakciók sorozatát (prekurzor / fragmention átmenetek, ahol az ütközési energia be van állítva, hogy optimalizálja az érdeklődésre számot tartó fragmensionok intenzitását), és a ciklust (jellemzően 1 – 2 sec) hurokolták a HPLC-elválasztás teljes ideje alatt. Az MRM átmeneteket a meglévő peptidek MS / MS spektrumaiból határoztuk meg. A peptidenként két átmenetet választottunk, amelyek megfelelnek a nagy intenzitású fragmensionoknak, és az ütközési energiát optimalizáltuk az MRM átmenetek jelerősségének maximalizálására automatizálási szoftver segítségével. Ezután összehasonlítottuk a standard peptidekből és a CaMKII-nak vagy kontrollnak kitett AFosB-mintákból származó csúcsokat, hogy meghatározzuk az egyes peptidformák abszolút mennyiségét a reakcióban. Az LC-MRM adatok adatelemzését az AB Multiquant 1.1 szoftver segítségével végzik.

14 kísérlet: ΔFosB indukálása CaMKII túltermelő egerekben (5G & H ábra)

A T286D CaMKII-t túltermelő transzgenikus egerek (Mayford és munkatársai, 1996; Kourrich és munkatársai, 2012) és a vad típusú alomtársakat doxiciklin hiányában emeltük a transzgén expressziójának lehetővé tétele érdekében. A felnőtt egereket 20 mg / kg kokaint vagy sóoldatot adtunk be naponta egyszer 14-napra. 24 óra az utolsó injekció után, az állatokat dekapitáltuk, és immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk, és az AFosB expresszió mennyiségi meghatározását az alábbiak szerint végeztük: kísérlet 4.

15 kísérlet: A HSV által közvetített ΔFosB túlexpresszió és a CaMKII gátlás hatása a NAc dendrites tüskékre (6A – E)

Felnőtt hím egereket (8 hét) sztereotaxikusan injektáltunk NAc-be HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson és munkatársai, 2006), HSV-GFPAC3I vagy HSV-GFPAC3I-AFosB. Ezekben a konstrukciókban az AC3I, a CaMKII aktivitás peptid alapú inhibitora, a GFP C-terminálisához van fuzionálva. A GFPAC3I-t PCR-sel klónoztuk GFPAC400I-t tartalmazó pMM3-vektor alkalmazásával templátként a következő primerekkel: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). A kapott PCR-terméket a p1005 + és p1005 + -A FosB vektorokba inszertáltuk NheI és BspEI helyeken. A konstrukciót szekvenálással validáltuk. A sztereotaxikus koordináták: 10 ° szög, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et al., 2002). A perfúziót és az agyszekciót az alábbiak szerint végeztük kísérlet 4.

A gerincelemzést a leírtak szerint végeztük (Christoffel és munkatársai, 2011). Röviden, az 50 – 150 µm dendritikus szegmensek a sómától távol vannak véletlenszerűen a GFP-t expresszáló HSV-fertőzött sejtekből választva. A képeket egy konfokális LSM 710-en (Carl Zeiss) szereztük be a morfológiai elemzéshez, a NeuronStudio alkalmazásával a rayburst algoritmussal. A NeuronStudio a gerinceket vékony, gomba vagy makacs csoportba sorolja az alábbi értékek alapján: (1) képarány, (2) fej-nyak arány és (3) fej átmérője. A nyakkal rendelkező tüskék vékony vagy gomba közé sorolhatók, és a jelentős nyak nélküliek közé tartozik, hogy nyakúak. A nyakú tüskék vékony vagy gomba alakúak, a fej átmérője alapján.

ábra 6

A CaMKII aktivitás blokkolása megakadályozza az ΔFosB morfológiai és viselkedési hatásait a NAc-ben

16 kísérlet: A HSV-közvetített ΔFosB túlexpresszió és a CaMKII gátlás hatása a kokain-válaszokra (6F)

A felnőtt hím egereket vírusokkal injektáltuk kísérlet 15és az egyetlen 5 mg / kg-os kokain-injekcióra adott lokomotoros válaszokat mértük Kísérlet 9. A mozgásszervi adatokat a kokaininjekció után az 30 min.

további információ

Állati ház

A hím Sprague Dawley patkányokat (250 – 275 g; Charles River Laboratories) párosítottuk. A nyolc hetes C57BL / 6J hím egereket (The Jackson Laboratory) csoportban tartották, legfeljebb öt állat ketrecenként. Minden állatot kísérleti manipulációk előtt ≥1 héten szoktattak az állatállomáshoz, és 23 órás fény / sötét cikluson (25: 12 AM) világítással, az élelmiszerhez hozzáféréssel ellátott, klímavezérelt helyiségekben (7 – 00 ° C) tárolták. és víz ad libitum. A kísérleteket a Sinai-hegyi Tudományos Társaság és az intézményi állatgondozási és használati bizottság (IACUC) iránymutatásainak megfelelően végeztük.

Kábítószer

A gyógyszereket IP-nek adták és steril sóoldatban oldottuk, beleértve a kokainot (5 – 20 mg / kg 10 µl egereknél, 1 ml-nél patkányoknál, NIDA) és SCH 23390-et vagy etikloprid-hidrokloridot (0.5 mg / kg 1 ml-ben, Tocris) . Sztereotaxikus műtét esetén az egereket steril sóoldatban ketamin (100 mg / kg) és xilazin (10 mg / kg) (Henry Schein) „koktéljával” érzéstelenítettük.

Az antitestek

CaMKIIα (összesen): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII foszfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (összesen): Cellás jelzés 5G4, 1: 250

ΔFosB-foszfo-Ser27: Foszfoszolúciók, 1: 500

GluA1 (összesen): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 foszfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 foszfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statisztikai elemzések

Minden statisztikai elemzést a Prism 6 szoftvercsomag (GraphPad) segítségével végeztünk. A diákok t-próbáit minden páros összehasonlításhoz használtuk (az eredményekben, ahol t értéket adtunk meg), és az egyirányú ANOVA-kat minden többszörös összehasonlításhoz használtuk (az eredményrészben, ahol az F-érték szerepel).

Ugrás:

Eredmények

A krónikus kokain CaMKII-t indukál a NAc Shell-ben

Számos tanulmány kimutatta, hogy a NAc-héjban és a magban lévő MSN-ek különböző biokémiai és fiziológiai reakciókkal rendelkeznek a kábítószerrel való visszaélés krónikus kitettségére (Kourrich és Thomas, 2009; Loweth és munkatársai, 2010) és hogy a két alrégió eltérően szabályozza a kábítószer-kereső viselkedést (Ito és munkatársai, 2004). A kokain különbségeinek meghatározása a NAc héj fehérje összetevőire vs magot használtunk, multiplexelt izobarikus címkézést (iTRAQ) és tandem tömegspektroszkópiát (MS / MS) használtunk. Felnőtt hím patkányokat IP-vel injektáltunk kokainnal (20 mg / kg) vagy sóoldattal naponta 7 napokon; 24 óra az utolsó injekció után a NAc héj és a mag mikrodisszektálták (1A) és fagyasztva villog. Ezekben a mintákban a fehérjéket ezután iTRAQ segítségével számszerűsítettük. Mind a négy CaMKII izoforma jelentősen emelkedett az expresszióban a kokain kezelés után, amely a NAc-héj specifikus volt a maghoz képest. Számos fehérje-foszfatáz, köztük a PP1 katalitikus és szabályozó alegységek és a PP2A, amelyek korábban más CaMKII-szubsztrátokhoz kapcsolódtak más rendszerekben (Colbran, 2004), hasonló mintát követett. Ezek az eredmények új, elfogulatlan bizonyítékokat szolgáltattak arra nézve, hogy a CaMKII jelátviteli útvonalat a kokain jelentősen szabályozza a NAc-ben héjspecifikus módon.

Ennek a megállapításnak a kvantitatív igazolására a fent leírt patkányokat kokainnal (változó dózisokban) vagy sóoldattal kezeltük, és meghatároztuk a lokomotoros válaszokat a kokain (5 mg / kg) vagy a fiziológiás sóoldat dózisára. Az 10 mg / kg kokain ismételt expozíciója a mozgásszervi szenzibilizáció tipikus mintáját eredményezte (1B). Ezzel az adagolási sémával végzett további vizsgálatok azt mutatták, hogy a Western-blot alkalmazásával az ismételt kokain szelektíven indukálja a CaMKIIα-t a NAc héjban 24 óra után a végső kokaininjekció után (1C és D ábra; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Emellett az AMPA receptor GluA831 alegységének kanonikus CaMKII szubsztrátjának Ser1 foszforilációja szignifikánsan nőtt a NAc héjban, és nem a mag (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), míg a CaMKIIα Thr286 autofoszforiláció erős, de nem csak a héj indukciójának jelentős tendenciája (1D). Számos más glutamát receptor nem volt hatással. Ezekkel a CaMKII-mérésekkel ellentétben ugyanazok a szövetminták mutatják az AFosB indukcióját mindkét héjban (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) és a mag (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) (1C és D ábra), összhangban a korábbi megállapításokkal (Perrotti és munkatársai, 2008).

Mivel az AMPA receptorok kokainszabályozásának számos korábbi vizsgálata a krónikus kokainból származó 14 nap elteltével elemezte az állatokat (lásd a Vita), e biokémiai elemzéseket ebben az időpontban ismételtük meg. Azt tapasztaltuk, hogy az 14 napok a kokain utolsó befecskendezése után az AFosB emelkedett marad a NAc-ben (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), míg a GluA1 Ser831 sem CaMKII, sem a foszforilációja nem emelkedik (1E). Azonban 1 óra egyszeri 10 mg / kg kokain-dózis után, a teljes CaMKII szintje (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) és GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) a foszforiláció egyaránt megemelkedik a kezdeti krónikus kokain-expozíció után tapasztalt mértékben;1E). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a NAc héj neuronokat CaMKII indukcióra alapozzák hosszabb absztinencia időszakokban, talán a CaMKII gén promóter közvetlen primálásával (lásd a Vita). Továbbá, az a tény, hogy az ΔFosB indukció sokkal tartósabb, mint a CaMKII indukció, arra utal, hogy léteznek olyan további mechanizmusok, akár kromatin alapúak, akár más módon, amelyek „fékeznek” a CaMKII szabályozásban, amint az a vita tárgya.

Ezeknek a megfigyeléseknek a további erősítése érdekében a kokain önadagolásának modelljeit vizsgáltuk, amelyek magukban foglalják a véletlen gyógyszer bevitelét. A felnőtt hím patkányoknak rövid vagy hosszú hozzáférést kaptak a kokainhoz; a vártnál (Ahmed és Koob, 1998), csak a hosszú hozzáférési feltételek vezetett a gyógyszer önadagolásának \ t2A). Az AFosB-t nagyobb mértékben indukáltuk hosszú ideig vs rövid távú hozzáférés a kokainhoz mindkét NAc héjban (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) és mag (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Ezzel ellentétben a CaMKIIα-t csak a kokainhoz való hosszú hozzáférés révén indukálták NAc-héjban.2B és C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Érdekes összehasonlítani az átlagos napi kokainbevitelt a rövid hozzáférést biztosító állatok (~ 12 mg / kg IV), a hosszú távú állatok (~ 70 mg / kg IV) és a kísérleti adagolt állatok (10 mg / kg) között, és Kérdezd meg, hogy miért vált ki ez utóbbi az AFosB és CaMKII robusztus indukcióját, míg a rövid hozzáférés nem. Ez az eltérés valószínűleg a kokainszintek csúcspontjainak különbségéből adódik (a kísérleti adagolt kokain egyetlen bolus IP-ben kerül beadásra, míg az önadagolt kokain többszörös IV-es dózisban kerül beadásra), vagy a hatóanyag-expozíció időtartamának különbsége (7 nap a kísérlethez) 19 napok az önadagoláshoz).

Annak ellenére, hogy a kokain fellépés során az ΔFosB és CaMKII-ról szóló nagy irodalomról van szó, ezekről a fehérjékről nincsenek tanulmányok a kokainhasználókban. Itt bemutatjuk az első bizonyítékot, hogy mind a ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34), mind a CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) szintje nő a kokainfüggő emberek NAc-ben (2D, Táblázat 1). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a kokain ΔFosB és CaMKII indukciójának vizsgálata rágcsáló NAc-ben klinikailag releváns az emberi kokain-függőség szempontjából.

Táblázat 1

A humán kokainfüggőkből és a megfelelő kontrollcsoportból származó minták jellemzése

ΔFosB szabályozza a CaMKII transzkripciót a NAc Shell D1-típusú MSN-jében

Az a megállapítás, hogy mind a CaMKII, mind az AFosB a kokain hatására felerősödik a rágcsáló NAc-ben, arra enged következtetni, hogy az AFosB szabályozza a CaMKII gén transzkripcióját. Korábban a CaMKIIα-t jelentettük az ΔFosB lehetséges célpontjaként a NAc objektív mikroarray analízisében (McClung és Nestler, 2003), de ez a megállapítás nem igazolódott tovább a tanulmányban. Először kvantitatív ChIP-et (qChIP-ChIP, majd kvantitatív PCR) használtunk annak megállapítására, hogy az AFosB kötődik-e a CaMKIIα gén promoterhez felnőtt hím patkányok NAc-jében, és feltűnően megállapította, hogy ez a kötődés jelentősen megnőtt a krónikus kokain-adagolással a héjban ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), de nem a mag, az alrégió (3A). A CaMKIIα promoterhez kötődő AFosB-kötődés ezen alrégióspecifikus különbségéhez kapcsolódó mechanizmusok további megértéséhez qChIP-et használtunk a hisztonmódosítások állapotának jellemzésére ebben a genomi régióban. A korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a kokain indukciója a H3 acetilációra a CaMKIIα promoterben teljes egér NAc-ben történt (Wang és munkatársai, 2010). Ezzel szemben azt tapasztaltuk, hogy a kokain csökkenti a H3 acetilezést a CaMKIIα promóterben szelektíven a NAc magban (3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), a héjban nem látható változás, összhangban a szubregion-specifikus kromatin változtatásokkal, mint az ΔFosB kötés. qChIP az elnyomó jel, a dimetilezett H3 lizin 9 (H3K9me2) esetében a héj és a magrégiók csökkenésének tendenciáit tárta fel (3C).

Annak megállapítására, hogy az AFosB szabályozza-e a CaMKIIα transzkripciót in vivo, két, a D1-ben kifejezetten ΔFosB-t expresszáló bitransgénikus egérvonalat használtunk. vs D2-típusú MSN-ek a doxiciklin adagolásával ivóvízben (Chen és munkatársai, 1998; Kelz és munkatársai, 1999; Werme és munkatársai, 2002). A kizárólag D1-típusú MSN-ekben ΔFosB-t túlzott mértékben expresszáló felnőtt hím egerek szignifikánsan megnövelték a CaMKIIα mRNS szintjét a NAc-ben (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), ami nem észlelhető az AFosB túlnyomó többségében D2 típusú MSN-ekben.3D). A CaMKIIα mRNS növekedését, amit az AFosB expresszió indukál D1 típusú MSN-ekben, a CaMKIIα fehérje egyidejű növekedése kísérte mindkét NAc héjban (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) és a mag (p = 0.0392; = 2.275; df = 14; Az 3E és az F). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az AFosB képes a CaMKIIα gén expresszióját a D1 típusú MSN-ekben mindkét szubregionban vezetni, bár 3B ábra azt sugallja, hogy a kokain által közvetített kromatin változások a CaMKIIα promóteren (pl. csökkent acetilezés) megakadályozzák az AFosB-t a CaMKII felemelkedésében a mag alrégióban a kokain után.

Mivel transzgénikus egéradataink azt jelezték, hogy a CaMKII génexpresszió ΔFosB indukciója specifikus a D1 típusú MSN-ekre az NAc-ben, ezután azt kerestük, hogy szükséges-e a CaMKII kokainfüggő újraszabályozásához a D1 dopamin receptor aktiválása. Felnőtt hím patkányoknak krónikus kokaint vagy sóoldatot adtak, mint korábban, de minden egyes injekció beadása előtt 30 perccel a kokaincsoportba tartozó patkányoknak sóoldatot adtak be IP-ben, a D1 antagonistát SCH 23390 (0.5 mg / kg) vagy a D2 receptor antagonista etiklopridot. (0.5 mg / kg). Az állatokat 24 órával az utolsó kokaininjekció után elemeztük. Western-blottolással kiderült, hogy a D1, de nem a D2 antagonista teljesen blokkolta a ΔFosB kokain által közvetített növekedését (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), amint arról korábban beszámoltunk (Nye et al., 1995), valamint a CaMKII-ban (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; 3G és H). Ezek az adatok alátámasztják azt a hipotézist, hogy a kokain a CaMKII gén expressziójának ΔFosB-közvetített növekedését vonja maga után a NAc héj D1 típusú MSN-jében. Fontos lenne, hogy a jövőbeni vizsgálatokban a kokain közvetlenül a sejt-specifikus hatását mutassák be a CaMKII expresszióra ezen agyi régióban.

Az AFosB mind a CaMKII kokainindukciójához szükséges, mind a NAc Shell-ben megfelelő

A bitransgénikus egerek használatának kiegészítésére a következő vizsgálatban vizsgáltuk az AFosB szerepét a CaMKIIα kokainindukciójának közvetítésében vírus által közvetített gén transzfer alkalmazásával patkányokban. Kétoldalúan adeno-asszociált vírusos (AAV) részecskéket injektáltunk a felnőtt hím patkányok NAc-héjába (ahol a héj szelektíven célozható), hogy az AFosB plusz GFP vagy GFP túltermelésére szolgáljon. Az állatokat ezután egyetlen 10 mg / kg kokain-injekcióban adtuk be. Az AFosB / GFP-t túlzottan expresszáló állatok fokozott lokomotoros választ mutattak, mint a csak GFP-t túlzottan expresszáló állatok (4A). 24 óra az egyszeri kokaininjekció után a GFP-pozitív NAc szövetet kivágtuk ezekből az állatokból fluoreszcens fényforrás alatt végzett szétválasztással. A szövet nyugati blotolása (4B és C) az AFosB túlzott mértékű expresszióját, valamint a teljes CaMKIIα-fehérje szignifikáns növekedését mutatta ki a GFP-állatokhoz képest (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), hasonlóan a krónikus kokain-adagolásnál tapasztalt indukcióhoz. Ezenkívül a Thr286-en (enzimaktiválásra utaló) CaMKIIa autofoszforilációját a FosB túlexpressziója (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28) növelte, mint a CaMKII szubsztrát, a GluA831 Ser1 foszforilációja (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), ismételten utánozva a krónikus kokain hatását (1C és D ábra). TEzek az adatok további bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a NAF-héjban az ΔFosB-expresszió elegendő a kokainnal szembeni mozgásszervi szenzibilizációhoz és a CaMKII-indukcióhoz és az aktiváláshoz ebben a kistérségben.

Hasonló megközelítést alkalmaztunk annak meghatározására, hogy az AFosB szükséges-e a NAM-héjban a CaMKIIα kokain által közvetített indukciójához is. Az AAV-t egy csonkított JunD fehérje túltermelésére használtuk, amelyet aJJDD-nek nevezünk, amely az AFosB transzkripciós aktiválás negatív szabályozója (Winstanley és munkatársai, 2007) és csak GFP vagy GFP. Két héttel később, amikor a transzgén expressziója maximális, az állatokat naponta kaptuk (10 mg / kg) vagy sóoldatot 7 napokra, és az utolsó krónikus injekció után tesztelték a kokainproblémára (5 mg / kg) gyakorolt ​​lokomotoros választ (4D). A AJunD túlzott expressziója megakadályozta a kokainra gyakorolt ​​mozgásszervi szenzibilizációt, és megakadályozta a CaMKIIα indukcióját és aktiválódását NAc héjban (4E és F; p = 0.0437; F = 2.997; összesen df = 38), jelezve, hogy az AFosB transzkripciós aktivitás szükséges a kokain által közvetített CaMKIIα indukcióhoz ebben az alrégióban. Érdekes módon azt találtuk, hogy a ΔJunD csökkentette az AFosB szintjét mind a sóoldatban, mind a kokainban kezelt állapotban (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), növelve az új lehetőséget, hogy az ΔFosB az AP-1 aktivitásától függ saját expressziós szintjeihez.

CaMKII Foszforilátok ΔFosB a Ser27-on

<p></p> in vitro fehérje-kináz-vizsgálatokban megállapítottuk, hogy a tisztított AFosB egy stabil hordozó a CaMKIIα számára. Az Ő inkubálása₆-AFosB CaMKIIα-val és ATP-vel felfelé váltott az ΔFosB elektroforetikus mobilitásában (5A); a többféle sáv több foszforilációs helyet javasolt. Hasonló in vitro kináz vizsgálatokat [γ-³²P] ATP mutatta a radioaktívan jelölt foszfát beépülését az eltolt ΔFosB sávokba (5B), amely a fehérje közvetlen foszforilációját mutatja. Foszfo-specifikus antitestet állítottunk elő az ΔFosB korábban jellemzett Ser27-jére (Ulery és munkatársai, 2006). Bár ez az antitest nem termel jelet az agykivonatokkal szemben, amelyek Ser27-foszforilált ΔFosB-t tartalmaznak (az adatokat nem mutatjuk be), képes voltunk kimutatni a Ser27 foszforilációt a in vitro kináz assay CaMKII alkalmazásával (5B). Az ΔFosB CaMKII foszforilációjának kinetikai elemzése azt jelzi, hogy ez egy erős szubsztrát a kinázhoz (5C), látható K-vel_M 5.7 ± 2.0µM és K_CAT 2.3 ± 0.3min^-1. Ezek az eredmények összehasonlíthatók sok jól jellemzettsel in vivo CaMKII szubsztrátjai (Colbran és Brown, 2004). Ezenkívül megállapítottuk, hogy a CaMKII foszforilálja az AFosB-t 2.27 ± 0.07 mol / mol sztöchiometriájával (5D), ami azt jelzi, hogy legalább három CaMKII foszforilációs hely van az Hisben₆-AFosB fehérje, egyetértésben 5A.

Az egyes foszforilációs helyek vizsgálatához MS-analíziseket alkalmaztunk in vitro kináz vizsgálatok. 5E a korábban jellemzett Ser27-en és több további helyen mutatta be az FosB-foszforilációt (az adatokat nem mutatjuk be). A Ser27 korábbi funkcionális jellemzése miatt ezen a ponton a Ser27 foszfor- és nem-foszfátállapotát jelző, szintetikus szintetikus peptidek létrehozásával koncentráltunk, majd ezeket a peptideket az AFosB MRM-analízisében ismert mennyiségekben használtuk fel, mielőtt in vitro foszforiláció CaMKII által. Későbbi mennyiségi meghatározás (5F) megerősíti, hogy a Ser27 a CaMKII hatékony szubsztrátja. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az AFosB-ben lévő több foszforilezett maradék között a Ser27 különösen hatékony szubsztrát a CaMKII számára.

CaMKII közvetíti a kokainot A ΔFosB felhalmozódása az NAc Shell-ben

Mivel a CaMKII foszforilálhatja az AFosB-t in vitro olyan helyszínen, amely jelentősen növeli stabilitását in vitro és a in vivo (Ulery és munkatársai, 2006; Ulery-Reynolds és munkatársai, 2009) meghatároztuk, hogy a CaMKII aktivitás szabályozza-e az NAF-ben a FosB szinteket in vivo. A kérdés megoldásához először egy egérvonalat használtunk, amely a CaMKIIα (T286D) kalcium-független mutánsát túlzott mértékben fejezte ki több agyi régióban, beleértve a NAc-t (Mayford és munkatársai, 1996; Kourrich és munkatársai, 2012). Az 20 mg / kg kokain vagy fiziológiás sóoldat naponta egyszer 14-napra injektáltunk felnőtt korú, hím mutáns és vad típusú alomtársakat, majd az utolsó injekció után egy nappal elemeztük az állatokat. Megállapítottuk, hogy az ΔFosB bazális szintje nőtt a mutáns állatokban NAc-héjban (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), de nem a mag (5G és H). Meglepő módon az AFosB kokainfüggő indukciója mind a héjban, mind a magban gátolták a mutáns állatokban, ami arra utal, hogy bár a CaMKII közvetlenül szabályozhatja az AFosB stabilitását NAc héjban, a NAO alrégiókban a kokain által aktivált útvonalakban is lehet az FosB felfelé. .

A CaMKII aktivitás szükséges az AFosB-közvetített strukturális és viselkedési plaszticitás esetében

A dendritikus gerincek kokainindukciója az NAc-en Az MSN-ek az egyik legjobban megállapított gyógyszerindukció ebben az agyi régióban, és az ilyen gerincindukció korrelált a szenzitizált viselkedési válaszokkal a gyógyszerrel (Robinson és Kolb, 2004; Russo és munkatársai, 2010) és arról számoltak be, hogy szelektívek a D1 típusú \ tLee és munkatársai, 2006). A közelmúltban kimutattuk, hogy a dendritikus tüskék NAc-ben történő indukciója a ΔFosB-től és az azt követő transzkripciós programtól függ.Maze és munkatársai, 2010). Bár van egy kiterjedt szakirodalom a CaMKII dendritikus gerinc morfológiájában és indukciójában más agyrégiókban és kísérleti rendszerekben való részvételről (Jourdain és munkatársai, 2003; Penzes és munkatársai, 2008; Okamoto és munkatársai, 2009), a NAc MSN gerincképződésében betöltött szerepét nem vizsgálták. Ezért meghatároztuk, hogy CaMKII-aktivitás szükséges-e az ACNBII-gátló peptid AC3I-fuzionált HSV-közvetített túlzott expressziójának alkalmazásával, amely korábban kimutatták, hogy gátolja a CaMKII-aktivitást. in vivo (Zhang és munkatársai, 2005; Klug és munkatársai, 2012). A ΔFosB vírusos túlzott expressziója felnőtt egerek NAc-héjában az MSN dendritikus gerincsűrűségének jelentős növekedését indukálta (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; 6A és B) a korábban bejelentett módon (Maze és munkatársai, 2010), és ezt a növekedést elsősorban vékony (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) és a nyaki (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) gerinctípusok hajtották végre (mindkettő éretlen tüskéknek számított) (6C – E ábra). Az érettebb gomba alakú tüskéknél nem volt hatás. Azonban, amikor GFP-AC3I-t együtt expresszáltunk, az AFosB gerinc indukciója teljesen megszűnt (6A – E), ami azt jelzi, hogy CaMKII aktivitás szükséges a dendritikus tüskék ΔFosB indukciójához NAc héjban.

Ezután ugyanazt a víruseszközt használtuk, hogy megállapítsuk, hogy CaMKII aktivitás szükséges-e a ΔFosB hatására a kokain viselkedési érzékenységére. 72 óra a NAc héjba való beadás után az állatoknak egyszeri 5 mg / kg kokain-injekciót adtunk be, és lokomotoros aktivitásukat rögzítettük. Amint azt korábban bemutattuk, az ΔFosB nagyobb kiterjedésű AAV-túllépése (4A), Az AFosB HSV-közvetített túlexpressziója fokozta a lokomotoros érzékenységet a kokainra (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; 6F). A dendritikus gerincek indukciójához hasonlóan, a GFP-AC3I koexpressziójával a CaMKII-aktivitás gátlása teljesen blokkolta a aineFosB által közvetített kokainérzékenység növekedését, ami azt jelzi, hogy CaMKII aktivitás szükséges a kokain viselkedési hatásainak ΔFosB által kiváltott változásához.

Ugrás:

Megbeszélés

A jelen tanulmány egy új, előremutató mechanizmust mutat be, ahol a kokain a NAc-ban ΔFosB-t indukál, ami felújítja a CaMKIIα gén transzkripcióját szelektíven NAc héjban. A CaMKIIα ezt követően foszforilálja és stabilizálja az AFosB-t, ami nagyobb AFosB felhalmozódáshoz és további CaMKIIα indukcióhoz vezet.6G). A két fehérje krónikus expozíciós ideje alatt együttesen növekvő szintje lényeges módon hozzájárul a gyógyszerrel szembeni viselkedési válaszok érzékenyítéséhez. Ez különösen vonzó hipotézis, mivel mind a ΔFosB, mind a CaMKII mindegyikét már korábban bizonyították a kokain fokozott viselkedési válaszaihoz. (Pierce és munkatársai, 1998; Peakman és munkatársai, 2003), és ezt az eredményt replikáljuk a ΔFosB-hez NAc-héjban, speciálisan egy vírusos megközelítéssel (4 és a and66).

Bár a transzgenikus AFosB túlzott expressziója a D1-típusú MSN-ekben a CaMKII indukciót mind a NAc-héjban, mind a kokainban nem kezelt állatok magjában hajtja végre, a kokain összefüggésében az endogén ΔFosB felhalmozódása, amely mindkét régióban előfordul, CaMKII indukcióját kifejezetten a NAc-héjban hajtja végre. . Ez a különbség a bitransgénikus modellünkben előidézett magasabb FFBB-szintekre vonatkozhat, azonban a kokain azon képességét is tükrözi, hogy differenciáltan megváltoztassa a CaMKIIα promotert héjban vs az MSN-ek, amelyek vagy az αFosB kötődését előmozdítják, vagy kizárják az utóbbi alrégióban. Valójában ChIP-adataink, amelyek kimutatják a hisztonok kokain által közvetített dezacetilezését a CaMKIIα gén promoterben csak NAc magban, támogatják a kromatin mechanizmus lehetséges bevonását. E hipotézisnek megfelelően a D1-típusú MSN-ekben az AFosB túlzott expressziója képes volt CaMKIIα indukciót vezetni NAc magban kokain hiányában.3F), ami arra utal, hogy a CaMKIIα promoter aktív módosulása megakadályozza az indukciót a krónikus kokain expozíció során. A kromatin táj szabályozása a CaMKII promóteren is megmagyarázhatja, hogy miért indukálta a CaMKII-t a krónikus kokainkivonatban a krónikus kokainkivonó patkányokban (1E), de nem a kábítószerrel nem \ t1D). Ez az ΔFosB epigenetikus „gén primer” hatását jelentheti (Robison és Nestler, 2011), és így lehet a kokain vágy inkubálásának egy molekuláris mechanizmusa.Pickens és munkatársai, 2011). Ahhoz azonban, hogy ez a kromatin megváltozzon, hogy okozati összefüggésben legyen a vágy inkubálásával, az idővel növekednie kell. Érdekes lesz meghatározni, hogy ez az eset áll-e fenn, és megvizsgáljuk, hogy más gének a ΔFosB-függő, szubregion-specifikus szabályozást mutatják-e a kokain. Fontos megjegyezni, hogy az általunk leírt előremenő hurok nem vezet a CaMKII vagy a ΔFosB végtelen felhalmozódásához (1E); A jövőbeni tanulmányok fontos célja a molekuláris „fék” feltárása.

Az AFosB és a CaMKII ismert funkciói számos kísérleti rendszerben és agyi régiókban sok szinten konvergálnak (6F). Mindkét molekula szorosan kapcsolódik a dendritikus gerinc növekedéséhez: a CaMKII kölcsönhatásba lép az aktin citoszkeletonjával (Okamoto és munkatársai, 2009), szabályozza a gerincfej méretét (Matsuzaki és munkatársai, 2004), és mind szükséges, mind elégséges a plaszticitás által okozott filopodia-növekedések és a szinapszisok számának növekedése a hippokampális organotípusos szeletekben (Jourdain és munkatársai, 2003), wA hile ΔFosB egyaránt szükséges és elegendő a kokain által kiváltott dendritikus gerincképzéshez a NAc MSN-ekben (Maze és munkatársai, 2010). Ezenkívül mindkét molekulát az AMPA glutamát receptorok szabályozásával társították. A CaMKII nem szabályozza az AMPA receptor alegységek teljes szintjét, hanem az AMPA receptorok szinapszisokba történő behelyezését és az AMPA csatorna vezetőképességét növeli a GluA1 Ser831-ben történő foszforilezésével a hippokampális piramis neuronokban a kultúrában és in vivo (áttekintve (Malinow és Malenka, 2002; Colbran és Brown, 2004)). Az ilyen fokozott GluA1 emberkereskedelem a szinapszisba a krónikus kokainhatásba is beletartozik (Boudreau és Wolf, 2005). Továbbá, az AMPA receptor aktiválására vonatkozó viselkedési válaszok a NAc-ben fokozódnak a CaMKIIα túlzott expressziója D1 dopamin receptor-függő módon (Singer és munkatársai, 2010). Kimutatták, hogy az AFosB hosszú távú D1-specifikus túlexpressziója GluA2 transzkripciót indukál NAc-ben (Kelz és munkatársai, 1999), amely csillapítja a GluA1-on keresztül közvetített AMPA-válaszokat, miközben megmutatjuk, hogy a rövidebb időtartamú ΔFosB túlzott expresszió - valamint a rövidebb ideig tartó kokain-expozíció - nem befolyásolja ezt az alegységet (Ábra 1). Mindazonáltal a közelmúltban megállapítottuk, hogy a rövid távú ΔFosB túlexpresszió azonban csökkenti az AMPA válaszokat a D1 típusú MSN-ekben a NAc-ben (Grueter és munkatársai, 2013). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a kokainhoz képest időbeli függőségű mechanizmusok képezik az időfüggő neuroadaptációs sorozatot, amelyek a addiktivitás különböző aspektusainak alapját képezik, még nem tisztában. Viselkedési szinten mind a CaMKII, mind a ΔFosB szükséges a kokainhoz való lokomotoros szenzibilizációhoz (lásd fent), és mindkettő szükséges a kokain önálló beadásához rágcsálókban (Colby és munkatársai, 2003; Wang és munkatársai, 2010), ami arra utal, hogy a két fehérje fontos a rövid távú és hosszú távú viselkedésbeli adaptációkhoz a kábítószer-expozícióhoz, bár részben az elkülönülő mechanizmusok révén. Feltételezhető, hogy az AFosB és a CaMKII szabályozza az ilyen komplex viselkedési adaptációkat a NAc szinaptikus függvényében bekövetkező változásokon keresztül, bár sok további munkára van szükség ahhoz, hogy a szinaptikus jelenségeket közvetlenül a viselkedési változásokhoz kapcsolják.

A CaMKII holoenzim egyidejűleg különböző szinapszisokkal összefüggő fehérjékkel kölcsönhatásba lép (Robison és munkatársai, 2005), amelyekről úgy gondolják, hogy szabályozzák a posztszinaptikus sűrűségre (PSD) irányuló célzást, a jelenség a szinaptikus plaszticitás szempontjából fontos. Különösen a CaMKII és az NMDA-típusú glutamát receptor GluN2B-alegységének kölcsönhatását a közelmúltban kimutatták, hogy szabályozza mind a szinaptikus plaszticitást, mind a tanulást (Halt és munkatársai, 2012). Míg az AC3I peptid a CaMKII autoinhibitív doménjét utánozza, és ezáltal gátolja az enzim katalitikus aktivitását, szintén blokkolja a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat (Strack és munkatársai, 2000; Robison és munkatársai, 2005). Tehát az itt bemutatott HSV-GFP-AC3I viselkedési és morfológiai hatásai a CaMKII célfehérjék csökkent foszforilációjával, a CaMKII célzás változásával vagy a szinapszisokban a CaMKII javasolt strukturális szerepének megváltozásával járhatnak.Lisman és munkatársai, 2002).

A javasolt restrictionFosB-CaMKII huroknak az NAc héjra való korlátozása különös figyelmet fordít, mivel a közelmúltban végzett munka számos fiziológiai különbséget mutatott be a NAc héj és a mag között a kokain-kezelésre adott válaszként, amelyet az objektív iTRAQ (Table S1) adata megerősített. . A NAc-héjban lévő MSN-ek a krónikus kokain után a tüzelőanyag-kapacitás depresszióját mutatják, ami hetekig tart, míg az azonos állatokból származó mag MSN-ek átmeneti (1 – 3 nap) növekedést mutatnak az 2 héten belüli alapszintre.Kourrich és Thomas, 2009). Emellett számos szinaptikus fehérje szabályozható a NAc héjban vs krónikus kokainnak kitett állatok magja, beleértve a GluA2-ot (Knackstedt és munkatársai, 2010). Mivel a krónikus amfetamin CaMKIIα-t indukál kifejezetten NAc-héjban (Loweth és munkatársai, 2010), nem meglepő, hogy hasonló hatást találunk a kokainnal. Mivel azonban a ΔFosB-t mind a NAc héjban, mind a magban indukálja krónikus kokain (Perrotti és munkatársai, 2008) és mivel megmutatjuk, hogy a CaMKIIα indukció a shellben ΔFosB-függő, eredményeink új bizonyítékokat szolgáltatnak a CaMKIIα promóterben a két alrégió közötti különféle transzkripciós mechanizmusokra, amelyek felelősek a CaMKIIα héjban történő szelektív indukciójáért.

A közelmúltban végzett munka nagy része a D1- és D2-típusú NAc MSN-ek közötti különbségek meghatározására összpontosított. Bár mind a D1, mind a D2 receptorok részt vesznek a kokain előnyös hatásaiban (Én, 2010), a legújabb munka azt mutatja, hogy a D1-típusú MSN-ek optogenetikus aktiválása növeli a kokainra adott viselkedési válaszokat, míg a D2-típusú MSN aktiválás ellentétes hatású (Lobo és munkatársai, 2010). Ezeknek a megállapításoknak megfelelően a D1-receptor knockout egerek hiányosak a kokain önadagolásában (Caine és munkatársai, 2007), míg a D2 kiütések nem (Caine és munkatársai, 2002). A D1 agonista beadása közvetlenül a NAc-be a kokain-kereső viselkedést váltja ki az újraképző paradigmákban (Én, 2010). Érdekes, hogy ez a hatás D1-receptor-függő CaMKII aktivitásnövekedést igényel a NAc héjban, de nem a mag (Anderson és munkatársai, 2008), amely jól illeszkedik az itt javasolt D1- és shell-specifikus ΔFosB-CaMKII hurokhoz.

Korábban arról számoltunk be, hogy a Ser27 az ΔFosB-ben foszforilálható kazein-kináz-2 segítségével (Ulery és munkatársai, 2006) itt azonban megállapítjuk, hogy a CaMKII foszforilálja az AFosB-t ezen és más, sokkal nagyobb kinetikával és sztöchiometriával rendelkező helyeken, és képes replikálni a magasabb látszólagos M_r ΔFosB esetén megfigyeltek (5A) kokain-expozícióval in vivo (Nestler, 2008). Már tudjuk, hogy a Ser27 foszforiláció növeli az ΔFosB stabilitását és a transzkripciós aktivitást (Ulery és munkatársai, 2006; Ulery és Nestler, 2007; Ulery-Reynolds és munkatársai, 2009). A jövőbeli munkák most a jelen tanulmány által feltárt ΔFosB foszforiláció új helyeinek azonosítására és funkcionális következményeire összpontosítanak.

Az itt leírt előremenő hurok hihetetlen új mechanizmust hoz létre, amellyel a kokain ismételt adagolása progresszív rendellenességeket okoz a NAc-ben. Mint ilyen, ez a biokémiai út fontos célpont lehet az addiktív zavarok jövőbeli terápiás beavatkozásához. Mivel a CaMKII mindenütt jelen van, és sok basális neuronális és viselkedési funkcióra van szükség, a CaMKII inhibitorok közvetlen használata elkerülhető, mint függőség kezelés. Adataink arra utalnak, hogy a CaMKII indukció mechanizmusának finomabb célzása, amely specifikus az egyes sejttípusokra és az agyi jutalmi áramkör alrégiójára, terápiás célt szolgálhat, amely elkerülné a szisztémás CaMKII gátlás komplikációit.

Ugrás:

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az Országos Kábítószer-visszaélési Intézet (EJN), a NIDA-Yale Proteomics Központ DA018343 (AJR és EJN) és Hartwell Alapítvány (AJR) támogatásával támogatták. A szerzők szeretnék megköszönni Gabby Rundenko-nak a tisztított ΔFosB és Roger Colbran nagylelkű ajándékát a tisztított CaMKIIα nagylelkű ajándékért.

Ugrás:

Referenciák

1. Ahmed SH, Koob GF. Átmenet a mérsékelt és a túlzott kábítószer-bevitel között: változás a hedonikus alapértékben. Tudomány. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Híres KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: egy biokémiai híd, amely összeköti az accumbens dopamin és glutamát rendszereket a kokainkeresésben. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. A kokainnal szembeni viselkedési szenzibilizáció az AMPA receptor felszíni expressziójának növekedésével jár együtt a magban. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. A Ca2 + / calmodulin-függő protein kináz II alfa-alegységének expressziója és jellemzése a bakulovírus expressziós rendszer alkalmazásával. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. A dopamin D2-szerű receptorok szerepe a kokain önadagolásában: D2 receptor mutáns egerekkel és új D2 receptorokkal végzett vizsgálatok antagonisták. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. A kokain önadagolásának hiánya a dopamin D1 receptor knock-out egerekben. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. A FosB destabilizációjának proteaszóma-függő és független mechanizmusai: a FosB degron domének azonosítása és a DeltaFosB stabilitására gyakorolt ​​hatások. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Az agyban indukálható, célzott génexpresszióval rendelkező transzgenikus állatok. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. Az IkappaB kináz szabályozza a társadalmi vereség stressz által kiváltott szinaptikus és viselkedési plaszticitását. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
10. Colbran RJ. Ca2 + / kalmodulin-függő protein kináz II inaktiválása bazális autofoszforilációval. J. Biol. Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Protein-foszfatázok és kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II-függő szinaptikus plaszticitás. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II és szinaptikus plaszticitás. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. A DeltaFosB striatális sejttípus-specifikus túlexpressziója fokozza a kokain ösztönzését. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. A hiszton dezacetiláz inhibitorok antidepresszáns hatásai. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. A caveolin-1 által szabályozott fehérjék kvantitatív proteomikája: a polimeráz i és a transzkriptum felszabadulási faktor / CAVIN-1 IN endothelsejtek jellemzése. Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2109-2124. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Az öngyilkosság befejezésének kockázati tényezői a súlyos depresszióban: az impulzív és agresszív viselkedés esettanulmány vizsgálata férfiak. J J Pszichiátria. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. A ΔFosB differenciálisan modulálja a nukleáris accumbens közvetlen és közvetett útvonalfunkcióját. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 a sajtóban. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. A CaMKII-kötés a GluN2B-hez kritikus a memóriakonszolidáció során. EMBO J. 2012, 31: 1203 – 1216. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB mutáns egerek: a Fos-rokon fehérjék krónikus kokain-indukciójának elvesztése és fokozott érzékenység a kokain pszichomotorjára és jutalmazó hatásaira. Proc Natl Acad Sci, US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. A kokain-kereső magatartás megkülönböztetett ellenőrzése a mag és a héj között. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizáció és a DeltaFosB transzkripciós faktor DNS-kötő tulajdonságai. Biokémia. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. A kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II hozzájárul az aktivitásfüggő filopodia növekedéshez és a gerincképződéshez. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Duman RS Nestler EJ. A deltaFosB transzkripciós faktor expressziója az agyban szabályozza a kokain érzékenységét. Természet. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. A CaMKII genetikai gátlása a Dorsalis Striatum Közepes Spiny Neuronokban Csökkenti a funkcionális excitatory szinapszisokat és fokozza a belső ingerlékenységet. PLoS One. 2012; 7: e45323. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. A kokain önadagolása utáni kihalásképzés glutamatergikus plaszticitást vált ki a kokainkeresés gátlására. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Hasonló neuronok, ellentétes adaptációk: a pszichostimuláns tapasztalatok eltérően változtatják az égéstulajdonságokat az accumbens magban a héjhoz képest. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. Az AMPAR-Független hatása a Striatus alphaCaMKII-nak A kokain-jutalom érzékenységének fokozása. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . A nukleáris faktor kappaB szerepe a petefészekhormon által közvetített stressz túlérzékenységben női egerekben. Biol Psychiatry. 2009; 65: 874-880. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. A kokain által kiváltott dendritikus gerincképződés D1 és D2 dopamin receptor-tartalmú közepes tüskés neuronokban a nukleáris accumbensben. Proc Natl Acad Sci US A. 2006, 103: 3399 – 3404. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. A CaMKII funkció molekuláris alapja a szinaptikus és viselkedési memóriában. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. A BDNF jelátvitel sejttípus-specifikus elvesztése utánozza a kokain jutalom optogenetikus kontrollját. Tudomány. 2010; 330: 385-390. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. A CaMKII gátlása a nukleáris accumbens héjában csökkenti a fokozott amfetamin bevitelét az érzékenyített patkányokban. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamin H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Az alfa-Ca2 + / kalmodulin-függő protein kináz II átmeneti túlzott expressziója a magban accumbens héjban fokozza az amfetaminra adott viselkedési reakciót. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA-receptor-kereskedelem és szinaptikus plaszticitás. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Egyetlen dendritikus tüskékben a hosszú távú potencírozás strukturális alapja. Természet. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. A memória kialakulásának szabályozása CaMKII transzgén szabályozott expressziójával. Tudomány. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. A hiszton-metil-transzferáz G9a lényeges szerepe a kokain által indukált plaszticitásban. Tudomány. 2010; 327: 213-216. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. A génexpresszió és a kokain jutalom szabályozása a CREB és a DeltaFosB által. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Felülvizsgálat. A függőség transzkripciós mechanizmusai: a DeltaFosB szerepe. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakológiai tanulmányok a kokain okozta krónikus FOS-hoz kapcsolódó antigén indukció szabályozására a striatumban és a nucleus accumbensben. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. A CaMKII és az F-aktin szerepe a dendritikus gerincek szerkezeti plaszticitásában: a szinaptikus tag potenciális molekuláris identitása? Fiziológia (Bethesda) 2009, 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. A DeltaFosB a magmagban szabályozza az élelmiszer-megerősített hangszeres viselkedést és motivációt. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. A patkány agya sztereotaxikus koordinátákban. 6th Edition. Amszterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ Schaeffer E. Inducible, a c-Jun domináns negatív mutánsának agyi régióspecifikus expressziója a transzgenikus egerekben csökkenti a kokain érzékenységét. Brain Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. A konvergens CaMK és a RacGEF vezérli a dendritikus struktúrát és funkciót. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. A deltaFosB indukálása a jutalmú agyi struktúrákban a krónikus stressz után. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. A DeltaFosB indukciójának megkülönböztető mintái az agyban a visszaélésszerű gyógyszerek által. Szinapszis. 2008; 62: 358-369. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. A kábítószer-vágy inkubálásának neurobiológiája. Trendek Neurosci. 2011; 34: 411-420. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. A kalcium által közvetített második hírvivők modulálják a kokainra gyakorolt ​​viselkedési érzékenységet. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Az emberi agyi receptor autoradiográfia teljes félteke-szakaszokat használ: egy általános módszer, amely minimálisra csökkenti a szöveti tárgyakat. Szinapszis. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. A kábítószerekkel való visszaéléshez kapcsolódó szerkezeti plaszticitás. Neuropharmacology. 2004, 47 (Suppl 1): 33 – 46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. A függőség transzkripciós és epigenetikai mechanizmusai. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. A kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II többértékű kölcsönhatásai az NR2B, a densin-180 és az alfa-aktinin-2 posztszinaptikus sűrűségű fehérjékkel. J. Biol. Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. A Saccharomyces cerevisiae-ban a multiplexelt fehérjék mennyiségi meghatározása aminreaktív izobarikus jelölő reagensekkel. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. A függő szinapszis: a nukleáris accumbens szinaptikus és szerkezeti plaszticitásának mechanizmusai. Trendek Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
56. Önálló DW. In: A dopamin receptorok. Neve KA, szerkesztő. New York: Humana Press; 2010. 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Az alfa-kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II átmeneti vírus által közvetített túlexpressziója a nukleáris accumbens héjban az alfa-amino-3-hidroxil-5 hosszú távú funkcionális felszabályozásához vezet. -metil-4-izoxazol-propionát receptorok: dopamin típusú 1 receptor és protein kináz A függőség. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. A N-metil-D-aszpartát receptor NR2B alegységére irányuló kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II célzás mechanizmusa és szabályozása. J. Biol. Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. A DeltaFosB foszforilációja a stabilitását in vivo közvetíti. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. A DeltaFosB transzkripciós aktivitás szabályozása Ser27 foszforilációval. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. A DeltaFosB stabilitásának szabályozása foszforilációval. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V. és munkatársai. A DeltaFosB agyi jutalmak körében a stressz ellenálló képességét és az antidepresszáns válaszokat közvetíti. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. A krónikus kokain által kiváltott H3 acetilezés és CaMKIIalpha transzkripciós aktiválása a nukleáris accumbensben kritikus a kábítószer-megerősítés motivációjához. Neuropsychop. 2010; 35: 913-928. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB szabályozza a kerék futását. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. A deltaFosB indukció az orbitofrontális kéregben a kokain által indukált kognitív diszfunkció toleranciáját közvetíti. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. A DeltaFosB lényeges szerepe a morfin hatású magban. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Price EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Gurevich VV, Salama G Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. A kalmodulin-kináz II gátlása véd a strukturális szívbetegségek ellen. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]