A ciklinfüggő kináz 5 fokozott aktivitása a kokain által közvetített dopamin jelátvitel csillapításához vezet (2005)

Proc Natl Acad Sci USA A. 2005 február 1; 102(5):-1737 1742.

Megjelent online 2005 Január 21. doi:  10.1073 / pnas.0409456102
PMCID: PMC547862
Neuroscience
Ez a cikk már idézett egyéb cikkek a PMC-ben.

Absztrakt

A kokain, a visszaélés gyógyszere növeli a szinaptikus dopamin szinteket a striatumban, blokkolva a dopamin újrafelvételét az axon terminálokon. Úgy találták, hogy a ciklinfüggő 5 (Cdk5) és a p35 aktivátor, a posztototikus neuronok szubsztrátjainak foszforilációjában részt vevő fehérjék, fokozottan szabályozottak a krónikus kokain-expozíció után. A Cdk5 és a p35 indukció striatális dopamin jelátvitelre gyakorolt ​​hatásainak további vizsgálatára két független transzgenikus egérvonalat állítottunk elő, amelyekben a Cdk5 vagy a p35 kifejezetten neuronokban expresszálódott. Itt közöljük, hogy a megnövekedett Cdk5 aktivitás, a p35 hatására, de nem a Cdk5 túlzott expressziója, a kokain által közvetített dopamin jelátvitel gyengüléséhez vezet. A dopamin és a cAMP-szabályozott foszfoprotein megnövekedett Cdk5-közvetített foszforilációja, a 32 kDa molekulatömege (DARPP-32) a Thr-75-nál csökkent a Thr-32-on a DARPP-34 foszforilációjával. Az 5 extracelluláris szignál-szabályozott kináz kináz kinevezett Cdk1-közvetített foszforilációja a Thr-286-en az 1 / 2 extracelluláris szignálszabályozott kináz aktivációjának csökkenésével jár. Ezek a hatások hozzájárultak a cAMP válaszelem-kötő fehérje kokain által kiváltott foszforilációjának gyengítéséhez, valamint a c-fos kisebb mértékű indukciójához a striatumban. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy a Cdk5 aktivitás a krónikus kokain-expozíció után a megváltozott génexpresszióban szerepet játszik, és ezáltal befolyásolja a kokainfüggőség mögött álló idegrendszeri funkció hosszú távú változásait.

Kulcsszavak: kokainfüggőség, foszforiláció, striatum

A kokain növeli a szinaptikus dopamin szinteket a striatumban, és megváltoztatja a gén expresszióját a dopaminoceptív neuronokban azáltal, hogy aktiválja az intracelluláris utakat, amelyek a dopamin D1 receptor kezdeti jelét továbbítják a magra (1). A kokain krónikus expozíciója több transzkripciós tényezőt szabályoz, ami a génexpresszió tartós változását eredményezi, amelyekről úgy gondolják, hogy a kokainfüggőség neuronális adaptációi (2). ΔFosB, amely ilyen transzkripciós faktorként azonosított (3), kimutatták, hogy fokozza az állatok viselkedését a kokainra (4, 5). Ezért a αFosB indukció által szabályozott célgének azonosításának várhatóan hozzájárulnak a kokainfüggőség alapját képező molekuláris mechanizmus jobb megértéséhez. A közelmúltban kimutatták, hogy a kokainnal kezelt állatok krónikus kezelése a αFosB indukciójával fokozza a ciklinfüggő 5 (Cdk5) és aktiváló p35 aktivátor expresszióját a striatumban.6, 7).

A Cdk5 a szerin / treonin kinázok Cdk családjának tagja. A Cdk5 főként a szubsztrátok foszforilációjában van jelen a posztmitotikus neuronokban, ellentétben a sejtciklus progressziójának fő szabályozóival. (8). A Cdk5 aktivitásának neuronális specifitását a p35 vagy a p39 aktivátoraihoz való kötődés révén érik el, amelyek túlnyomórészt posztototikus neuronokban expresszálódnak (8). A Cdk5 alapvető szerepe mellett az agy fejlődésében is (9, 10), it is szerepet játszott a szülés utáni agyi dopaminerg transzmisszióban (11, 12). A Cdk5 aktivitás gátlása fokozott dopamin felszabadulást eredményez a striatumban, ami a Cdk5 preszinaptikus funkcióját jelzi a dopamin felszabadulás negatív szabályozójaként. (11). Továbbá a Cdk5 modulálja a posztszinaptikus dopamin jelátvitel hatékonyságát a dopamin- és cAMP-szabályozott foszfoprotein, az 32 kDa (DARPP-32) molekulatömegének foszforilezésével a Thr-75-on, amely a DARPP-32-t cAMP-függő kináz (PKA) inhibitorává alakítja (12).

Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy a Cdk5 és a p35 a dopamin jelátvitel hosszantartó aktiválásának folyamatos szabályozói a kokain krónikus expozíciója és így a kokainfüggőség után. A Cdk5 striatális dopamin jelátvitelre gyakorolt ​​szerepének további kezelésére két transzgénikus egérvonalat állítottunk elő, amelyekben a Cdk5 vagy a p35 túlzottan expresszálódott a neuronokban a p35 promoter irányítása alatt. Eredményeink azt mutatták, hogy a Cdk5 aktivitást fokozottan szabályozták a p35 fehérje szintjének növekedésével, de nem a Cdk5 fehérjével, ami arra utal, hogy a p35 fehérje szintje a Cdk5 aktivitás sebességkorlátozó. Itt nyújtunk in vivo bizonyíték arra, hogy a p5 túltermelés következtében a megnövekedett Cdk35 aktivitás a PKA és az extracelluláris szignálszabályozott kináz (ERK) kaszkádok gátlása révén a magra ható kokain által közvetített dopamin jelenségének gyengüléséhez vezet.

Anyagok és módszerek

Az antitestek. A Cdk5 (C-8) és a p35 (C-19) elleni poliklonális antitesteket a Santa Cruz Biotechnology cégtől szereztük be. Az ERK-kináz (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 és a cAMP-válaszelem-kötő fehérje (CREB) foszforilációfüggő és -független antitestjeit a Cell Signaling Technology (Beverly, MA) cégtől szereztük be. A foszfo-Thr-34 DARPP 32 elleni antitestek (13), foszfo-Thr-75 DARPP-32 (12), összesen DARPP-32 (12) és c-fos (14) a leírtak szerint használtuk. Az aktin elleni antitestet a Sigma-tól vásároltuk.

Kísérleti állatok. Korábban klónoztuk az egér p35 gént Cdk5r1, amely p35 fehérjét kódol, és genomi struktúráját jellemezte (15). A p35 (Tgp35) neuronális túlexpressziójával rendelkező transzgénikus egér létrehozásához az 6-kb EcoRIEcoAz 1.2-kb-promoter-régiót tartalmazó RI-fragmenst pGEM9Z (-) plazmidba szubklónoztuk, és az SV45-ből származó 40-bp címkét behelyeztük a KpnI hely a poli (A+) jel (Ábra 1A). A címke a SpeI. Az állatok genotipizálásának helye. Az 6-kb fragmentumot kivágtuk a plazmidból, és tisztítottuk, majd a transzgénnek a transzgénikus egerek előállításához való szubkután injekcióját. A transzgén expressziós profiljának vizsgálata az 1.2-kb p35 promoter szabályozási kontrollja alatt in vivoa kettős transzgénikus egeret (Tgp35; p35 - / -) továbbfejlesztettük egy kétlépcsős tenyésztési stratégiával, amellyel a Tgp35 egeret endogén p35-null háttérrel regeneráltuk. A vizsgálatban használt egyéb egérmodellek közé tartozik a p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– és egy transzgénikus egér, melynek Cdk5 (TgCdk5) neuronális túlexpressziója volt.9, 16, 17). Ezeknek az egereknek a genotípusait úgy határoztuk meg, hogy a farokbiopsziákból izolált genomiális DNS-sel Southern-blot analízist vagy PCR-t végeztünk. Az egereket 12-h fény / 12-h sötét ciklus alatt tartottuk. Minden gondosságot a laboratóriumi és kísérleti állatok gondozására és használatára vonatkozó nemzeti egészségügyi intézetek irányelveinek megfelelően végeztek.

Fig. 1.  

P35 promoter (Tgp35) által irányított p35 neuronális túlexpressziójával rendelkező transzgénikus egér generálása. (A) A transzgén konstrukciót vad típusú és célzott p35 allélok vázlatos szerkezetei mutatják. A vörös sávok jelzik a genotípushoz használt próbát. ...

Southern blot analízis. A farok biopsziából kivont genomiális DNS-t emésztettük EcoRI és SpeI, elektroforetizáltunk 0.9% agaróz gélen, és egy nylon membránra visszük át. A membránt véletlenszerűen alapozottan hibridizáltuk 32P-jelzett próbatest 42 ° C-on egy éjszakán át. A p485 knockout (p35 - / -) és Tgp35 egerek genotipizálására szolgáló 35-bp próbát PCR-rel állítottuk elő a következő primerek alkalmazásával: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'és 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. A hibridizált membránt kétszer mostuk 2 × SSC / 0.1% SDS-ben 42 ° C-on 10 percig, és kétszer 0.1 × SSC / 0.1% SDS-ben 65 ° C-on 20 percig, és röntgenfilm hatásának tettük ki.

Kábítószer-kezelés. A kokainot (Sigma) steril sóoldatban oldottuk. Az állatokat az 15 hónapok korában kokainnal (3 mg / kg) vagy azonos térfogatú sóoldattal injektáltuk, és az injekció beadását követően különböző időpontokban (15, 30, 60 és 120 min) leöltük. Az agyakat gyorsan eltávolítottuk és jéghideg PBS-ben hűtjük. A striata-t ezután kivágtuk és Northern vagy Western blot elemzésnek vetettük alá. Az immunhisztokémiai analízishez az injekció után az 2 h egerekből származó striatális szakaszokat kaptunk.

Northern Blot analízis. A teljes RNS-t a striata-ból TRIzol reagenssel (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) extraháltuk és Northern-blot elemzésnek vetettük alá, ahogyan leírtuk (18). A c-fos mRNS kimutatásához az egér c-fos cDNS 189-bp fragmentumát használtuk próbaként, ahogyan leírtuk (19). A c-fos mRNS szintjét a konkrét sáv optikai sűrűségének mérésével határoztuk meg egy képelemző rendszer segítségével, nih kép szoftverrel, 1.62 Version.

Western blot analízis. A striatális szöveteket 1% SDS-ben ultrahanggal kezeltük és 10 min. Az egyes mintákban a fehérjekoncentrációt BCA fehérje assay-vel (Pierce) határoztuk meg. Egy egyenlő mennyiségű fehérjét SDS / PAGE-val választottunk el, mielőtt nitrocellulóz membránra vittük át. A membránokat 1 × PBS-ben blokkoltuk, amely 5% sovány tejet és 0.05% Tween 20-et tartalmazott, és egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on. A peroxidázzal konjugált egér vagy nyúl IgG-vel (Sigma) végzett inkubálást szobahőmérsékleten végezzük 60 min. A jelet fokozott kemilumineszcenciával (Pierce) detektáltuk, és a sávok optikai sűrűségét a fentiekben leírt módon számszerűsítettük.

Cdk5 kináz vizsgálat. Striatális lizátumokat állítottunk elő lízis pufferrel, amely 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / ml ml leupeptin / foszfatáz inhibitorok (foszfatáz inhibitor keverék I és II, Sigma). A lizátumokat anti-Cdk5 (C-8) vagy anti-p35 (C-19) antitestekkel immunizáltuk. A Cdk5 immunprecipitátumokat úgy állítottuk elő, hogy az 300 μl (a fehérje 300 μg-jának megfelelő) lizátumot inkubáltuk anti-Cdk5 antitesttel (3 μg) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd további inkubálást végeztünk 25 μl fehérje A-agaróz gyöngyökkel (50 % -os szuszpenzió a lízis pufferben, Santa Cruz Biotechnology) 3 h-ra 4 ° C-on. A p35 immunprecipitátumok előállításához a lizátum 500 μl-ét (amely megfelel az 1 mg fehérjének) anti-p35 antitesttel (3 μg) inkubáltuk a fent leírtak szerint. Az immunprecipitátumokat kétszer mossuk a lízis pufferrel és kétszer egy 50 mM Tris-HCl, pH = 7.4 / 5 mM MgCl-t tartalmazó kináz pufferrel.2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, reszuszpendálva a kináz puffer 60 μl-ben. A kinázaktivitást a hiszton H1 szubsztrát alkalmazásával mértük.18).

Immunhisztokémia. Az egereket avertin (250 mg / kg, Fluka) ip injekcióval érzéstelenítettük, és transzkardiálisan perfundáltuk 0.1 M nátrium-foszfát pufferrel, pH 7.4, majd Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), egy nem térhálósító fixálószerrel. A leválasztott agyakat ugyanazon fixálószerben egy éjszakán át fixáltuk 37 ° C-on. Ezután az agyokat paraffinba ágyazottuk, 5-μm vastag koronális szakaszokra vágtuk és immunhisztokémiai hatásnak vetettük alá, avidin-biotin-peroxidáz komplex technikával (Vector Laboratories), szubsztrátként diaminobenzidinnel. A szekciókat egy c-fos elleni affinitás-tisztított poliklonális ellenanyaggal inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. A festési specificitást az elsődleges antitest kihagyásával értékeltük.

Eredmények

A p35 neuronális túlexpressziójával rendelkező transzgenikus egerek generálása. A p35 fokozott neuronális expressziójának eléréséhez használt transzgén a klónozott egér p6 gén 35-kb fragmentumát tartalmazza, amely tartalmazza az 1.2-kb promotert és a p35 teljes kódoló szekvenciáját (Ábra 1 A). Az egerek genotípusait Southern blot analízissel határoztuk meg egy próbával, amely a p35 - / - és a Tgp35 egerek vad típusú egerekből való megkülönböztetésére készült.Ábra 1 A és a B). A transzgén expresszió vizsgálatához az 1.2-kb p35 promoter szabályozása alatt kettős transzgenikus egereket (Tgp35; p35 - / -) állítottunk elő, amelyekben a p35 expressziót csak a transzgénből hajtottuk végre. A p35 expressziót Tgp35-ben, p35 - / - egerekben csak az agyban figyelték meg (Ábra 1C), ahol a térbeli expressziós minta hasonló volt a vad típusú egerekéi (Ábra 1D). Kimutatták, hogy a p35 hiánya abnormális réteges struktúrát eredményez az egerek agykéregében és hippocampusában (10). A Tgp35, p35 - / - egerek azonban a p35 - / - agy fenotípus teljes mentését mutatták (Ábra 1E). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az 1.2 kb. P35 promoter az endogén p35 génből származó p35éhoz hasonló expressziós profillal rendelkező transzgén expresszióját szabályozta.

A p35 fehérje szintje korlátozza a Cdk5 aktivitás szabályozását. A p35-et és a Cdk5-et kódoló gének géndózis-hatásait vizsgáltuk a p35-/ -, p35 +/–, vad típusú, Tgp35, Cdk5 +/– és TgCdk5 egerek fehérje expressziójára 3 hónapokban. A p35 és a Cdk5 fehérje szintje jól korrelált a géndózisokkal (Ábra 2 A és a B). A Tgp35 egerek ≈1.6-szeres növekedést mutattak a p35 fehérje szintjében a vad típusú egerekhez képest, míg a Cdk5 fehérje szintjét nem befolyásolták a p35 fehérje különböző szintjei. A TgCdk5 egerek ≈1.9-szeres növekedést mutattak a Cdk5 fehérje szintjében a vad típusú egerekhez képest, míg a p35 fehérje szintjét nem befolyásolták a Cdk5 fehérje különböző szintjei. A különböző mennyiségű p35-fehérje Cdk5-aktivitásra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára a Cdk5-t anti-Cdk5 ellenanyaggal és a kináz aktivitással mért striatális extraktumokból immunprecipitáltuk. Hasonlóképpen, a különböző mennyiségű Cdk5 fehérje kinázaktivitásra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára a p35-t anti-p35 antitesttel végzett striatális extraktumokból immunprecipitáljuk, és a kináz aktivitást mértük. A Cdk5 aktivitás jól korrelált a p35 fehérje szintjével, de nem a Cdk5 fehérje szintjével (Ábra 2 C és a D). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a p35 fehérje mennyisége a Cdk5 aktivitás sebességkorlátozó tényezője. Ezért Tgp35 egereket használtunk a megnövekedett Cdk5 aktivitás hatásának vizsgálatára a striatális dopamin jelátvitelre.

Fig. 2.  

A Cdk5 aktivitás fel-szabályozása a p35 fehérje szintjével korlátozott. (A) Western blotok, amelyek azt mutatják, hogy a p35 és a Cdk5 fehérje szintje korrelál a p35 és a Cdk5 gének dózisaival. (B) A p35 vagy Cdk5 fehérje relatív szintje ...

A DARPP-32 kokainindukált foszforilációja a Thr-34-en Tgp35 egerekben gyengül. A DARPP-32 funkciója több helyszín foszforilációs állapotától függ (20). A PKA foszforilálja a DARPP-32-et Thr-34-on, míg a Cdk5 foszforilálja a DARPP-32-et a Thr-75-on. Így a vad típusú és Tgp32 egerek striatális kivonataiban vizsgáltuk a DARPP-35 foszforilációs állapotát. A foszfo-Thr-75 DARPP-32 szintje magasabb volt a Tgp35 egerekben (Ábra 3A; 1.6 ± 0.2-szer nagyobb a vad típusú egerek értékénél). Ezt követően megvizsgáljuk a megnövekedett Cdk5 aktivitás hatását a striatális dopamin jelzésre. A TGp35 egerekben vizsgáltuk a kokain által indukált PKA aktivációt a DARPP-32 foszforilációs állapotának elemzésével a Thr-34-en. A foszfo-Thr-34 DARPP-32 szintjét a kokaininjekció után a vad típusú egerekben 15-ben növelték (Ábra 3B; 1.8 ± 0.2-szeres a bazális szint felett). Azonban a kokain hatása a DARPP-34 Thr-32 foszforilációjára a Tgp35 egerekben gyengült (1.2 ± 0.3-szer a bazális szint felett). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a Cdk5 aktivitás növekedése gyengítette a kokain által indukált PKA aktivációt, valószínűleg a DARPP-32 foszforilációján keresztül (Thr-75).6, 12). Az is előfordulhat, hogy a presinaptikus Cdk5 aktivitás növekedése a dopamin felszabadulásához vezet, és ez hozzájárul a kokain csökkent hatásához. Különösen a kokain egyetlen injekciója nem befolyásolta a p35 és a Cdk5 fehérje szintjét, valamint a kináz aktivitást (Ábra 3 C és a D). Ez ellentétben áll egy korábbi vizsgálatsal, amelyben kimutatták, hogy a kokain krónikus expozíciója szabályozza a p35 és a Cdk5 expresszióját (6).

Fig. 3.  

A Cdk5 aktivitás fel-szabályozása növeli a foszfo-Thr-75 DARPP-32 szintjét, és gyengíti a kokain által indukált PKA aktivációt. (A) Immunoblot, amely a DARPP-32 fokozott foszforilációját mutatja a Thr-75-on (P-D32 Thr-75) a Tgp35 egerek striatális kivonataiban. Ban ben ...

A Cdk5 tevékenység felfelé állítása Az ERK1 / 2 kokainindukált aktiválásának gyengítése. A legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy a dopamin receptor aktiválás a striatumban más jelátviteli kaszkádokat is aktivál, beleértve az ERK útvonalat is.21, 22), amely fontos szerepet játszik a kokain viselkedési reakciójában (23). Ezért megvizsgáltuk, hogy a Cdk5 aktivitás befolyásolhatja-e az ERK útvonal kokainindukált aktiválását. Az ERK útvonal aktiválódását a kokain injekció után figyelték meg vad típusú egerek striatális kivonataiban, amint azt a MEK1 / 2 Ser-217 és Ser-221 (1.5 ± 0.2-szer feletti) fokozott foszforilációja jelezte. / 1 Thr-2 és Tyr-202 (ERK204 foszforiláció: 2 ± 1.5-szer a bazális szint felett)Ábra 4 A és a B). Azonban a MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-szer a bazális szint fölött) és az ERK1 / 2 (ERK2 foszforiláció: 1.2 ± 0.2-szer feletti szint) kokainindukált aktivációja Tgp35 egerekben gyengült (Ábra 4 A és a B). Ezenkívül a foszfo-ERK1 / 2 bazális szintjei alacsonyabbak voltak a Tgp35 egerekben (0.8 ± 0.2-szer a vad típusú egerek értéke alatt), míg ez a tendencia nem volt statisztikailag szignifikáns. Ez utóbbi eredmény a MEK5 Cdk1-függő foszforilációjának tulajdonítható a Thr-286-on, ami a katalitikus aktivitás csökkenését eredményezte (24). Ennek a lehetőségnek a kiértékeléséhez a Thr-1-on vizsgáltuk a MEK286 foszforilációs állapotát, és megállapítottuk, hogy a Tgp286 egerek striatális kivonataiban magasabb a foszfo-Thr-1 MEK35 szintje.Ábra 4C; 1.3 ± 0.1-szer nagyobb a vad típusú egerek értékénél). Továbbá, a MEK1 foszforilációs állapota a Thr-286-nál egyetlen kokainfecskendővel nem változott, összhangban azzal a megállapítással, hogy a kezelés nem befolyásolta a Cdk5 aktivitást (Ábra 3D).

Fig. 4.  

A MEK5 / 1 Cdk2 által közvetített gátlása a kokain által kiváltott ERK1 / 2 aktiváció gyengüléséhez vezet. Striatus extraktumokat állítottunk elő vad típusú (WT) és Tgp35 egerekből 15 min után a kokain vagy fiziológiás sóoldat beadása után, és immunblotolásnak vetettük alá ...

A Dopamin jelátvitele a Nucleus-ra fokozott Cdk5 aktivitással gyengül. A PKA-t és az ERK-t érintő többszörös jelátviteli kaszkádok kokain által indukált aktiválása a CREB transzkripciós faktor későbbi aktiválódásához vezet a sejtmagban lévő foszforilációval (22, 25). Annak vizsgálatához, hogy a PKA és ERK aktivációs kaszkádok Cdk5 által közvetített gátló hatásai a CREB foszforilációjához közeledhetnek-e, a CREB foszforilációs állapotát a Ser-133-ben vizsgáltuk vad típusú és Tgp35 egerek striatális kivonataiban. A foszfo-CREB alapszintje alacsonyabb volt a Tgp35 egerekben (0.7 ± 0.1-szer a vad típusú egerek értékétől) (Ábra 5). A kokain injekciójára adott válaszként a foszfo-CREB szintje növekedett a vad típusú egerek striatumában (1.5 ± 0.1-szer a bazális szint felett), de a kokainra adott válasz gyengült a Tgp35 egerekben (1.2 ± 0.1- a bazális szint felett)Ábra 5).

Fig. 5.  

A Cdk5 aktivitás fel-szabályozása csökkenti a CREB foszforilációját a Ser-133-ben egerekben, sóoldat vagy kokain beadásával. A striatális extraktumokat vad típusú (WT) és Tgp35 egerekből készítettük 30 perccel az injekció után, és immunblotolásnak vetettük alá ...

A CREB foszforilációja Ser-133-ben fokozza transzkripciós aktivitását egy cAMP válaszelemen keresztül bizonyos gének promóter régiójában, beleértve a c-fos gént is.26). Ezért a kokaininjekció után megvizsgáltuk a vad típusú és Tgp35 egerek striatumában a c-fos indukcióját. Vad típusú egerekben a c-fos mRNS szintje a csúcsértékre emelkedett (1.8 ± 0.2-szer a bazális szint fölé) 30 min. A kokain beadása után, majd az injekció beadása után percenként 120-ba állt vissza.Ábra 6 A és a B). Azonban a c-fos mRNS szintjei p30% -kal alacsonyabbak voltak a Tgp35 egerekben, mint a vad típusú egerekben az 30 percig az injekció után (Ábra 6 A és a B). A c-fos kisebb mértékű indukcióját a Tgp35 egerekben tovább erősítette az immunhisztokémia (Ábra 6 C-F). A kokain beadása fokozta a c-fos immunreaktivitást, erősen a striatum dorsomedialis-dorsocentralis részében, és gyengén az oldalsó részekben mind vad típusú, mind Tgp35 egerekben. Azonban a kokain által indukált c-fos-immun-pozitív sejtek számának növekedése a Tgp35 egerek striatumában jelentősen gyengült (Ábra 6G). Ezek az eredmények együttesen azt mutatták, hogy a Tgp35 egerekben a kokain által közvetített, a sejtmagba irányuló striatális dopamin-jelenség fokozódását gátolták, ami a megnövekedett Cdk5 aktivitás valószínű eredménye.

Fig. 6.  

A Cdk5 aktivitás fel-szabályozása a striatum c-fos expressziójának csökkenését és a kokain beadását követő kisebb indukciót eredményezi. (A) Northern-blot mutatja a c-fos indukció idejét a vad típusú (WT) és a Tgp35 (Tg) egerekben a kokain injekció után. ...

Megbeszélés

A Cdk5-et és annak p35-aktivátorát olyan célgéneként azonosították, amelyeket a krónikus kokain-expozíció szabályoz. (6). Az itt bemutatott bizonyíték arra utal, hogy a fokozott Cdk5-aktivitás, a p35 fel-szabályozás helyett a Cdk5 felfelé-szabályozás, a kokain által közvetített dopamin jelátvitel gyengüléséhez vezet a striatális neuronokban. A Cdk5 vagy a p35 felfelé szabályozott expressziójának a striatális dopamin jelzésre gyakorolt ​​következményeinek vizsgálatára két transzgénikus egérvonalat, TgCdk5 és Tgp35 egereket vizsgáltunk. Azt tapasztaltuk, hogy a Cdk5 aktivitást a p35 fehérje megnövekedett szintjéhez viszonyítva fokozottan szabályozták, de a Cdk5 fehérje megnövekedett szintje nem volt hatással. Korábbi jelentésünk azt is kimutatta, hogy a Cdk5 aktivitás a TgCdk5 egér agyban alacsonyabb volt, mint a vad típusú egér agyban, amikor az aktivitást Cdk5 immunprecipitátumok alkalmazásával mértük (17), ami arra utal, hogy a Cdk5 túlzott expressziója a monomer Cdk5 szintjének emelkedését eredményezi, ha a p35 szint nem emelkedik. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a p35 fehérje szintje a Cdk5 aktivitás sebességkorlátozó tényezője.

A Tgp35 egereknek mind a CREB foszforilációja, mind a c-fos kevésbé indukálták a striatumban a kokain akut injektálása után, ami arra utal, hogy a kokainra adott striatumválasz meggátolta a megnövekedett Cdk5 aktivitást. A kokain által közvetített dopamin jelzés Tgp35 egerekben való csillapítása valószínűleg több jelátviteli kaszkád Cdk5 által közvetített gátlásával érhető el, beleértve a DARPP-32-et, a PKA-t és az ERK-t. A kokain beadása növelte a DARPP-32 PKA-foszforilációját Thr-34-ben vad típusú egerekben, míg ez a válasz gyengült a Tgp35 egerekben. A DARPP-32 PKA-foszforilációja a Thr-34-en kimutatták, hogy gátolja az 1 (PP1) fehérje foszfatáz aktivitását, amely a CREB Ser-133-féle defoszforilációért felelős enzim (27). Így a PP1 aktivitást nem lehet antagonizálni a DARPP-32 / PP1 útvonalon a Tgp35 egerekben.

A kokain által indukált ERK1 / 2 aktiváció Tgp35 egerekben is gyengült. Számos különböző mechanizmus létezik, amelyekkel a Cdk5 gátolhatja az ERK1 / 2 kokainindukált aktiválását. Először is, a DARPP-5 Cdk32-függő foszforilációja a Thr-75-nál gátolhatja a PKA-t, ami a PKA-közvetített MEK1 / 2 aktiváció későbbi gátlásához vezet, ami szükséges az ERK1 / 2 aktiválásához. Egy nemrégiben végzett vizsgálat azt is kimutatta, hogy a DARPP-32 foszforilációja a Thr-34-nál szükséges az ERK1 / 2 kokain által közvetített aktiválásához többféle úton, beleértve a MEK aktiválásának közvetett szabályozását, valamint a striatálisan dúsított foszfatáz, tirozin szabályozását. foszfatáz, amely közvetlenül az ERK1 / 2 \ t28). Erre a lehetőségre támaszkodik az a megállapítás, hogy a kokain által indukált foszforiláció a MEK1 / 2 Ser-217 és Ser-221 esetén megszűnt a Tgp35 egerekben. Egy másik lehetséges út a MEK5-nek a Thr-1-en keresztüli Cdk286-függő foszforilációján keresztül történik, ami a katalitikus aktivitásának csökkenéséhez és az ERK1 / 2 aktivitás gátlásához vezetne.24).

Kimutatták, hogy a striatumban a Cdk5-aktivitás gátlása erősíti a krónikus kokain-kezelés viselkedési hatásait az állatokban (6). Összhangban azzal a hipotézissel, hogy a Cdk5 aktivitás szabályozása hozzájárulhat az idegrendszeri adaptációhoz az ismétlődő kokain-kezelés hatásainak ellensúlyozásához (6) megállapítottuk, hogy a DARPP-5 és a MEK32 Cdk1 által közvetített foszforilációja hozzájárult az ERK1 / 2 kokainindukált aktivációjának gyengüléséhez, ami a CREB foszforiláció és a c-fos kisebb mértékű indukcióját eredményezte a striatumban. Eredményeink alátámasztják azt az elképzelést, hogy a fokozott Cdk5 aktivitás a p35 fel-szabályozása következtében megváltoztathatja a génexpressziót a striatumban a kokain krónikus kitettsége után. Ez a transzkripciós faktorok, például a CREB és a c-fos aktivitásának változásán keresztül fordulhat elő. Így a CXKUMNUMX aktivátor, a p5, a Cdk35 aktivitásra gyakorolt ​​sebességkorlátozó hatásai miatt hozzájárulhat a kokainfüggőség mögötti idegrendszeri funkciók tartós változásához..

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük dr. Mary Jo Danton, Philip Grant és Sashi Kesavapany a kézirat kritikus olvasására. Ezt a munkát a Z01DE00664-05 Nemzeti Egészségügyi Intézetek (ABK), az US Public Health Service Grant DA10044, valamint a Simons Alapítvány, a Peter J. Sharp Alapítvány és a Picower Alapítvány (PG) támogatásával támogatta.

Megjegyzések

Rövidítések: Cdk5, ciklinfüggő kináz 5; ERK, extracelluláris jelszabályozott kináz; DARPP-32, dopamin és cAMP szabályozott foszfoprotein, molekulatömeg 32 kDa; PKA, cAMP-függő kináz; MEK, ERK kináz; CREB, cAMP-válaszelem-kötő fehérje.

Referenciák

1. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, SE és Nestler, EJ (Proc. 1992). Natl. Acad. Sci. USA 89, 5764-5768. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
2. Nestler, EJ, Hope, BT és Widnell, KL (Neuron 1993, 11), 995-1006. [PubMed]
3. Hope, BT, Nye, HE, Kelz, MB, Self, DW, Iadarola, MJ, Nakabeppu, Y., Duman, RS & Nestler, EJ (1994) Neuron 13, 1235-1244. [PubMed]
4. Kelz, MB, Chen, J., Carlezon, WA, Jr., Whisler, K., Gilden, L., Beckmann, AM, Steffen, C., Zhang, YJ, Marotti, L., Self, DW, és mtsai. (1999) Természet 401, 272 – 276. [PubMed]
5. McClung, CA és Nestler, EJ (2003) Nat. Neurosci. 6., 1208-1215. [PubMed]
6. Bibb, JA, Chen, J., Taylor, JR, Svenningsson, P., Nishi, A., Snyder, GL, Yan, Z., Sagawa, ZK, Ouimet, CC, Nairn, AC, és mtsai. (2001) Természet 410, 376-380. [PubMed]
7. Chen, J., Zhang, Y., Kelz, MB, Steffen, C., Ang, ES, Zeng, L. & Nestler, EJ (2000) J. Neurosci. 20, 8965-8971. [PubMed]
8. Dhavan, R. & Tsai, LH (2001) Nat. Mol. Tiszteletes Sejt. Biol. 2, 749-759. [PubMed]
9. Ohshima, T., Ward, JM, Huh, CG, Longenecker, G., Veeranna, Pant, HC, Brady, RO, Martin, LJ & Kulkarni, AB (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11173-11178. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
10. Chae, T., Kwon, YT, Bronson, R., Dikkes, P., Li, E. és Tsai, LH (1997) Neuron 18, 29-42. [PubMed]
11. Chergui, K., Svenningsson, P. & Greengard, P. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2191-2196. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
12. Bibb, JA, Snyder, GL, Nishi, A., Yan, Z., Meijer, L., Fienberg, AA, Tsai, LH, Kwon, YT, Girault, JA, Czernik, AJ, és mtsai. (1999) Természet 402, 669-671. [PubMed]
13. Snyder, GL, Girault, JA, Chen, JY, Czernik, AJ, Kebabian, JW, Nathanson, JA & Greengard, P. (1992) J. Neurosci. 12., 3071-3083. [PubMed]
14. Young, ST, Porrino, LJ és Iadarola, MJ (Proc. 1991). Natl. Acad. Sci. USA 88, 1291-1295. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
15. Ohshima, T., Kozak, Kalifornia, Nagle, JW, Pant, HC, Brady, RO és Kulkarni, AB (1996) Genomics 35, 372-375. [PubMed]
16. Ohshima, T., Ogawa, M., Veeranna, Hirasawa, M., Longenecker, G., Ishiguro, K., Pant, HC, Brady, RO, Kulkarni, AB & Mikoshiba, K. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2764-2769. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
17. Tanaka, T., Veeranna, Ohshima, T., Rajan, P., Amin, ND, Cho, A., Sreenath, T., Pant, HC, Brady, RO és Kulkarni, AB (2001) J. Neurosci . 21, 550-558. [PubMed]
18. Takahashi, S., Saito, T., Hisanaga, S., Pant, HC & Kulkarni, AB (2003) J. Biol. Chem. 278, 10506-10515. [PubMed]
19. Grimm, C., Wenzel, A., Hafezi, F. & Reme, CE (2000) Mol. Vis. 6., 252-260. [PubMed]
20. Nairn, AC, Svenningsson, P., Nishi, A., Fisone, G., Girault, JA & Greengard, P. (2004) Neuropharmacology 47, 14-23. [PubMed]
21. Nestler, EJ (2001) Nat. Rev. Neurosci. 2, 119-128. [PubMed]
22. Zanassi, P., Paolillo, M., Feliciello, A., Avvedimento, EV, Gallo, V. & Schinelli, S. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11487-11495. [PubMed]
23. Valjent, E., Corvol, JC, Pages, C., Besson, MJ, Maldonado, R. & Caboche, J. (2000) J. Neurosci. 20, 8701-8709. [PubMed]
24. Sharma, P., Veeranna, Sharma, M., Amin, ND, Sihag, RK, Grant, P., Ahn, N., Kulkarni, AB & Pant, HC (2002) J. Biol. Chem. 277, 528-534. [PubMed]
25. Hyman, SE, Cole, RL, Konradi, C. & Kosofsky, BE (1995) Chem. Érzékek 20, 257-260. [PubMed]
26. Dash, PK, Karl, KA, Colicos, MA, Prywes, R. & Kandel, ER (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5061-5065. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
27. Greengard, P., Allen, PB és Nairn, AC (1999) Neuron 23, 435-447. [PubMed]
28. Valjent, E., Pascoli, V., Svenningsson, P., Paul, S., Enslen, H., Corvol, JC, Stipanovich, A., Caboche, J., Lombroso, P., Nairn, AC, és mtsai. (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103, 491-496.