PLoS One. 2013 Nov 25, 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
forrás
Magatartás-élettani laboratórium, Humán Egészségtudományi Doktori Iskola, Tokiói Metropolitan Egyetem, Tokió, Japán.
Absztrakt
A fizikai testmozgás javítja a hippocampus funkció több aspektusát. Összhangban azzal a meggyőződéssel, hogy a neuronális aktivitás kulcsfontosságú a neuronális funkciók előmozdításában, a korábbi szakirodalom következetesen kimutatta, hogy a testmozgás akut beavatkozása idegsejt aktiválódást idéz elő a hippocampusban. Az ismétlődő aktiváló ingerek az AFosB transzkripciós faktor felhalmozódásához vezetnek, amely közvetíti a hosszú távú neurális plaszticitást..
Ebben a tanulmányban azt a hipotézist vizsgáltuk, hogy a hosszú távú önkéntes kerékfutás a hippokampuszban ΔFosB expressziót vált ki, és megvizsgálta a hippokampális almezőkben a potenciális régióspecifikus hatásokat a dorso-ventrális tengely mentén. A hím C57BL / 6 egereket 4 héten futó kerékkel vagy anélkül tartottuk. Hosszú távú kerékfutás jelentősen megnövelte a FosB / ΔFosB immunreaktivitást minden hippokampális régióban (azaz a DG, CA1 és CA3 alsó mezőkben mind a hátsó, mind a ventrális hippocampus esetében). Az eredmények megerősítették, hogy a kerék futása indukálta a FosB / ΔFosB immunreaktivitás régióspecifikus expresszióját a kéregben, ami arra utal, hogy a FosB / ΔFosB egyenletes növekedése a hippocampusban nem a futás nem specifikus következménye. A Western blot adatok azt mutatják, hogy a megnövekedett hippocampális FosB / ΔFosB immunreaktivitás elsősorban a megnövekedett ΔFosB miatt következett be. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a hosszú távú fizikai edzés az osFosB indukciójának hatásos kiváltója a hippocampus egészében, ami megmagyarázza, miért javíthatja a testmozgás mind a háti-, mind a ventrális hippocampus-függő funkciókat. Érdekes módon azt találtuk, hogy a FosB / ΔFosB expresszió a DG-ben pozitívan korrelált a doublecortin-immunreaktív (azaz éretlen) neuronok számával.
Bár a mechanizmusok, amelyekkel az AFosB közvetíti a gyakorlat által indukált neurogenezist, még mindig bizonytalanok, ezek az adatok azt jelzik, hogy a testmozgás által indukált neurogenezis legalább aktivitásfüggő. Összefoglalva, jelenlegi eredményeink arra utalnak, hogy az ΔFosB egy új molekuláris célpont, amely részt vesz a testmozgás által indukált hippocampális plaszticitás szabályozásában.
Bevezetés
A gyakorlat különböző előnyöket biztosít a rágcsálók hippocampusának molekuláris, szerkezeti és funkcionális vonatkozásaihoz [1,2] amelyek közül néhányat emberi tanulmányok támogattak [3,4]. Azonban a hippocampális plaszticitás gyakorlás által indukált változásait alátámasztó mechanizmusok nem elégségesek. A korábbi szakirodalom következetesen kimutatta, hogy a testmozgás hippocampális idegsejt aktivációt idéz elő rágcsálókban. A tranziens neuronaktiválás markereit, a c-Fos-ot használó immunhisztokémiai vizsgálatok kimutatták, hogy mind a kényszerített, mind az önkéntes futás a rágcsáló hippocampus dentate gyrus (DG), CA1 és CA3 almezőiben fokozott c-Fos expressziója [5-7]. Ezenkívül a lézer-Doppler áramlásmérővel (LDF) végzett korábbi vizsgálat kimutatta, hogy a patkány CA1 almezőjében az enyhe futópad növeli a regionális agyi véráramlást (rCBF), amely a neuronális aktiváció alternatív markerje.8]. Az immunhisztokémiai vizsgálatok lehetővé teszik, hogy az edzés befejezése után részletes régióspecifikus elemzések történjenek, míg az LDF lehetővé teszi a lokális területen az rCBF valós idejű monitorozását edzés közben. Az egyes vizsgálatok előnyei és korlátai ellenére ezek a vizsgálatok hasonlóan igazolták a hippokampális neuronális aktivitásra gyakorolt akut rohamok hatását. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hosszú távú rendszeres testmozgás elősegíti a hippocampus plaszticitását az idegsejtek aktiválásának ismételt kiváltásával [9].
Az AFosB transzkripciós faktort, a teljes hosszúságú FosB csonkolt splice izoformáját, különböző típusú ismétlődő ingerek indukálják bizonyos agyi régiókban, ahol fokozatosan felhalmozódik az egyedülálló stabilitása miatt (a hét felezési ideje) [10-12]. Egyre több bizonyíték bizonyítja, hogy a ΔFosB megnövekedett szintje közvetíti a tartós neurális és viselkedési plaszticitást, amely az adott ingerekhez kapcsolódik [11,13]. Például a visszaélésszerű gyógyszerek, például a kokain és a morfin krónikus adagolása általában növeli az AFosB expressziót a nukleáris accumbensben, ami egyike azoknak a molekuláris mechanizmusoknak, amelyek ezen gyógyszerek fokozott érzékenységét képezik. [11,14,15]. Shasonlóan más jutalmi ingerekhez, beleértve a magas zsírtartalmú étrendet és a szexuális élményt [16,17], laz önkéntes kerékpáros futás is növelte a FosB / ΔFosB immunreaktivitást patkánymagokban, ami arra utal, hogy az önkéntes futás természetes juttatás a rágcsálók számára [18,19]. Legjobb tudomásunk szerint azonban egyetlen szakirodalom sem vizsgálta, hogy a fizikai testmozgás ismételt expozíciója ΔFosB expressziót vált ki a hippocampusban. Mivel a testmozgás idegsejt-aktiválást vált ki a hippocampusban, feltételeztük, hogy a hosszú távú önkéntes kerékfutás ΔFosB kifejezést is indukál a hippocampusban. Míg a pontos mechanizmusok, amellyel az AFosB szabályozza a hippokampusz plaszticitását, továbbra is bizonytalanok, a vizsgálatok kimutatták, hogy az egerek nem rendelkeznek fosB gén a hippocampus neurogenesisét és a depresszióhoz hasonló viselkedést mutatott20,21]. énAz edzésről ismert, hogy fokozza a neurogenezist és antidepresszáns tulajdonságokkal rendelkezik [22-25]. énA hipotézisünk helyes, az ΔFosB egy új potenciális molekuláris célközvetítő testmozgás-indukált hippocampus plaszticitás.
A hippocampus hosszanti (dorso-ventrális) tengelye mentén anatómiai és funkcionális gradienssel rendelkezik [26]. A dorsalis hippocampus kulcsszerepet játszik a térbeli tanulásban és a memóriában [27,28], míg a ventrális hippocampus előnyben részesíti az érzelmi viselkedés szabályozását [29,30]. Továbbá, a vizsgálatok kimutatták, hogy a fiziológiai ingerek különböző c-Fos expressziós mintákat indukálnak a hippocampus hátsó és ventrális részében [31-33]. Mivel a testmozgás javítja mind a hátizatot [34-37] és a ventrális hippocampus-függő funkciók [24,25,38] Fontos megvizsgálni, hogy a hosszú távú önkéntes futás a ΔFosB régióspecifikus expresszióját okozza-e a hippocampusban.
A vizsgálat elsődleges hipotézise az volt, hogy a hosszú távú önkéntes kerékfutás az egér hippocampusban ΔFosB expressziót vált ki. Ezt a hipotézist a FosB / ΔFosB immunhisztokémia vizsgálta a dorzális és ventrális hippocampális almezőkben, a DG, CA1 és CA3, különös hangsúlyt fektetve a régióspecifikus indukció azonosítására. Az eredményeket nyugati blotolással igazoltuk, amelyet az izoformának a meghatározására használtunk fosB a hippocampusban indukált géntermékek. Azt is megvizsgáltuk a régióspecifikus FosB / ΔFosB indukció kéregét, hogy kizárjuk annak lehetőségét, hogy a hosszú távú gyakorlat nem kifejezetten növelte a FosB / ΔFosB immunreaktivitást az agyban. Végül a FosB / AFosB expresszió és a neurogenezis közötti korrelációs összefüggést elsőként vizsgáltuk a hippokampális plaszticitás szabályozása során a testmozgás által indukált ΔFosB indukció funkcionális következményeinek keresésére.
Anyagok és módszerek
1: Állatok és etikai nyilatkozat
Húsz hím C57BL / 6 egeret (8 hetes kor) vásároltunk egy kereskedelmi tenyésztőtől (SLC, Shizuoka, Japán). Tíz egeret használtunk az 1 kísérlethez, a másik tíz pedig az 2 kísérlethez. Az egereket szabályozott hőmérsékleti körülmények között tartottuk (22 – 24 ° C) és fényt (12 / 12-h fény / sötét ciklus, világít az 0500-on), és táplálékot és vizet kaptak ad libitum. Minden kísérleti eljárást a Tokyo Metropolitan University állatkísérleti etikai bizottsága hagyott jóvá.
Minden egyes kísérletben, az érkezéskor, az egereket véletlenszerűen hozzuk létre egy kontrollcsoporthoz (Control, n = 5) vagy egy futó csoporthoz (Runner, n = 5). Az első héten az összes egeret standard műanyag ketrecekben tartottuk csoportokban (5 egerek / ketrec) az első akklimatizációhoz. Ezután a Runner egereket egy futókerékkel ellátott ketrecbe vittük át (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Mivel a társadalmi elszigeteltségről ismert, hogy elnyomja a hippocampus gyakorlati indukálta neurogenezist [39] A Runner egereket egy további 5 héten át csoportként (4 egerek / ketrec) tartottuk. A kerekek forgását minden reggel rögzítettük, és a testsúlyt (g) hetente mértük.
2: Kísérlet 1. A FosB / AFosB expresszió és a hippokampális neurogenezis immunhisztokémiai vizsgálata
2.1: Perfúzió és szövetfeldolgozás
A reggel (0900 – 1100) a futási időszak utolsó napja után az egereket mélyen érzéstelenítettük pentobarbitál-nátriummal és transzkardiálisan hideg sóoldattal perfundáltuk. Az agyat gyorsan eltávolítottuk és 4% paraformaldehidben fixáltuk 0.1 M foszfát pufferolt sóoldatban (PBS, pH 7.4) egy éjszakán át. Az agyat ezután 30% -os szacharózban PBS-ben védettük, és további feldolgozásig fagyasztottuk. Egy félgömb koronális agyszakaszát (40 μm) fagyasztó mikrotom alkalmazásával nyertük, és PBS-ben gyűjtöttük 0.01% nátrium-aziddal.
2.2: Immunhisztokémia
A FosB / AFosB immunfestéshez véletlenszerűen kiválasztottunk egy-egy-hat szekciósorozatot. Egy szomszédos sorozatot használtunk a doublecortin (DCX) jelölésére, amely a neurogenesis értékelésére validált éretlen neuronok markere [40,41]. Az endogén peroxidáz-aktivitás leállítása után 1% H-vel2O2 PBS-ben a szabadon úszó szakaszokat előzetesen blokkoló oldattal inkubáltuk 10% normál lószérumot tartalmazó PBS-ben 2 h-ra. PBS-ben való öblítést követően a szakaszokat nyúl poliklonális pan-FosB antitesttel (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) inkubáltuk, PBS-ben hígítva 0.5% Triton X-100 és 0.5% BSA (PBST) -BSA) 24 h-ra 4 ° C-on. Egy másik szakaszsorozatot kecskepolonális anti-DCX ellenanyaggal (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) inkubáltunk PBST-BSA-ban 48 h-on 4 ° C-on. A szekciókat egy megfelelő biotinilált szekunder antitesttel (anti-nyúl IgG, 1: 1000, AP182B; anti-kecske IgG, 1: 1000, AP180B, mindkettő EMD Millipore, Billerica, MA, USA) PBST-BSA-ban tovább inkubáltuk. 2 h szobahőmérsékleten. A szakaszokat ezután avidin-biotin-peroxidáz komplex (Vectastain ABC peroxidase kit, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) kezeltük 90 percre a gyártó utasításai szerint. Az antigéneket végül 0.02% 3,3-diaminobenzidinnel (DAB) 0.1 M Tris-HCl-ben (pH 7.6) 0.01% H-t tartalmazó vizualizálással vizualizáltuk.2O2. A FosB / AFosB immunfestés esetében a reakciót nikkel-ammónium-szulfáttal intenzifikáltuk. A DCX festéshez a sejtmagokat Nissl festéssel ellensúlyoztuk. A szekciókat zselatin bevonattal ellátott csúszdákra helyeztük, és fedőlapokat helyeztünk.
2.3: A FosB / ΔFosB immunreaktivitás mennyiségi meghatározása képküszöbérték alkalmazásával
Az ebben a vizsgálatban használt pan-FosB ellenanyagot egy FosB és AFosB N-terminális régió által megosztott belső régió ellen emeltük, így nem lehet megkülönböztetni a két izoformát. Ezért az immunfestett szerkezeteket FosB / AFosB immunreaktív (FosB / AFosB-ir) magoknak nevezték. Az objektív vak kvantifikáláshoz a tárgylemezeket az elemzés előtt kódoltuk. Az egér agyi atlasz [42] a következő érdekes régiók (ROI) helyének azonosítására: a DG (3 szakaszok) granuláris sejtrétege (GCL), a CA1 (3 szekciók) piramissejtrétege és a CA3 (2 – 3 szakaszok) a dorsalis hippocampusban (-2.2 mm-re zárva a bregmától); DG (2 szakaszok), CA1 (2 szakaszok) és CA3 (2 szakaszok) a ventrális hippocampusban (zárva -3.4 mm-re a bregmától)ábra 4, balra). A caudalis szakaszok mind a hippocampus hátsó, mind a ventrális részeit tartalmazzák, de a ventrális rész célzott. A DG-ben a szuprapiramid (DGsp) és az infrapyramidális (DGip) pengéket külön vizsgáltuk. Motoros kéreg (2 – 3 szakaszok, -0.6 mm-re zárva a bregmától), szomatoszenzoros hordó kéreg (2 – 3 szakaszok, -0.6 mm-re zárva a bregmától), vizuális kéreg (3 szakaszok, -2.9 mm-re zárva a analóg (3 metszetek, a bregma-tól -2.9 mm-ig zárva) és a szaglási izzó (3 szakaszok, amelyek a bregma-tól + 4.3 mm-re vannak zárva).ábra 6, balra).
Az egyes ROI-k digitális képeit (2070 × 1548 pixel) egy optikai mikroszkóp (BX-51, Olympus, Tokyo, Japán) segítségével készítettük CCD-kamerával (DP-73, Olympus) és képalkotó szoftverrel (cellSens, Olympus). az objektív lencse nagyítás 10 × a hippokampális ROI-khoz és 4 × a kérgi ROI-khoz. A mérsékelt-erős FosB / ΔFosB immunreaktivitás (1D – G ábra), előzetesen több szakaszt használva, mind a képszerzési beállítások (fényintenzitás, terepi állomásméret, expozíciós idő és fehéregyensúly), mind az egyes RGB-komponensek küszöbértékei optimalizálták a hippokampális és a kortikális ROI-k esetében. A következő elemzést az optimalizált körülmények között végeztük (1). A ROI-kat egy szabálytalan alakú sokszög választotta ki (1A, B) (2). A kép küszöbértékű volt, amely a FosB / ΔFosB-ir magokat vörös színré alakította át (1C-G) (3). A% ROI-t ezután automatikusan kiszámítottuk:% ROI = (átalakított terület (piros) / teljes ROI-terület) × 100.
A képküszöbérték elemzésének validálásához az 20 régiókat véletlenszerűen választottuk különböző agyterületeken, különböző régióméretekkel. A képküszöbérték meghatározása mellett a kiválasztott régiókban a FosB / ΔFosB-ir magok számát manuálisan számoltuk, és a FosB / ΔFosB-ir magok sűrűségét a FosB / ΔFosB-ir magok számának a mért terület (mm2).
2.4: A DCX-ir éretlen idegsejtek kvantitatív meghatározása a gyrus fogpótlásában
A DG Runner egerek DCX-ir éretlen idegsejtjei bőségesek voltak és átfedtek, ami megnehezítette a DCX-ir soma diszkrét számának pontos számítását optikai mikroszkóp segítségével. Egy korábbi vizsgálatban azonban a morfológiai értékelésre vonatkozó Sholl-elemzés kimutatta, hogy minden DCX-ir neuron átlagosan egyetlen dendritet tartalmaz, amikor a soma 40 μm-jében mérik [43]. Ezért a következő eredeti elemzést dolgozták ki a DCX-ir neuronok régióspecifikus mennyiségének meghatározására.
- (1) A GCL képét számítógépes kijelzőn vetítették fel képalkotó szoftverrel és 40 × objektívvel (2). Az élő képen egy vonalszakasz (150 ± 0.1 μm) készült a GCL közepén (ábra 2) (3). A fókuszmélység megváltoztatásával a DCX-ir dendrites keresztmetszet számát (4) számoltuk. A ROI-k (dorsalis DGsp, dDGsp; dorzális DGip, dDGip; ventral DGsp, vDGsp; ventral DGip, vDGip) megfelelnek azoknak a régióknak, ahol a FosB / AFosB immunreaktivitást elemezték (5). Minden ROI-ben 2 – 3 vonalszakaszokat vettünk szekciónként, és az átlépések számát átlagoltuk az 2 – 3 szakaszonként egérenként. Mivel a GCL vastagsága megközelítőleg 60 – 80 μm, a kereszteződések számának tükröznie kell a korlátozott régióban lévő DCX-ir neuronok számát.
A DCX-ir éretlen idegsejtek reprezentatív képe és egy vonalszakasz (150 ± 0.1 μm) a DCX-ir dendrites keresztezések számának kiszámításához.
3. Kísérlet 2. A kerék futásával kiváltott FosB / ΔFosB izoformának azonosítása
3.1: Perfúzió és szövetfeldolgozás
Az egerek további csoportját az 1 kísérletben leírtak szerint kezeltük. 4 hetes beavatkozás után az egereket mélyen érzéstelenítéssel átkristályosítottuk hideg sóoldattal. A hippocampust gyorsan eltávolítottuk és folyékony nitrogénnel fagyasztottuk, és -80 ° C-on tároltuk. Az egyes egerek hippocampi-ját RIPA pufferben homogenizáltuk (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% nátrium-dezoxi-kolát, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, USA). inhibitorok (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Németország). A lizátumokat 15 percen át centrifugáltuk 5000 fordulatszámon 4 ° C-on, és a felülúszókat összegyűjtöttük. A fehérjekoncentrációkat BCA Protein Assay kit (#23227, Thermo Scientific, IL, USA) segítségével mértük.
3.2: Western blotting
Egy egyenlő mennyiségű fehérjét (30 μg / sáv) elektroforetizáltunk egy 10% poliakrilamid gélen, majd PVDF membránra (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, USA) vittük át. A nemspecifikus kötődést blokkoltuk úgy, hogy a membránt 1-hez előzetesen inkubáltuk TBST-ben (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20), amely 3% BSA-t tartalmazott. A membránt inkubáltuk a fentiekben ismertetett pan-FosB antitesttel (1: 1000), amelyet immunhisztokémiai célra használtunk, és az oldatot 3% BSA-t tartalmazó TBST-ben oldottuk. TBST-vel való mosást követően a membránt HRP-konjugált anti-nyúl IgG ellenanyaggal (1: 5000 TBST-ben, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 h-ra. A TBST-vel való mosás után a fehérje sávokat Enhanced Chemiluminescence-vel (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) inkubáltuk, és Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) alkalmazásával rögzítettük. Ezután a membránt anti-glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) antitesttel (# 2275, 1: 5000, TBS-T, Trevigen, MD, USA) ismételten feltöltjük. A protein-sávok optikai sűrűségét Image-J segítségével számszerűsítettük és a GAPDH szintjére normalizáltuk.
4: Statisztikai elemzés
Az egér testtömegének változásait kétirányú ismétlődő mérésekkel (ANOVA) elemeztük (csoport × idő). Egy páratlan t-tesztet használtunk a csoportok közötti statisztikai különbségek meghatározására (Control vs. Runner). Pearson-féle korrelációs analízist alkalmaztunk a FosB / ΔFosB immunreaktivitás elemzésének validálására (manuális számlálás vs. képküszöbölés), valamint a FosB / ΔFosB expresszió szintje és a DG DCX-keresztmetszetek száma közötti összefüggés vizsgálatára. Az adatokat átlag ± SEM értékként adtuk meg. A statisztikai szignifikancia küszöbértéke: P <0.05.
Eredmények
1: Testtömeg és futási távolság a 1 és 2 kísérletekben
Az 1 és 2 kísérletekben mind a kontroll, mind a futó egerek testtömegének változásait összevontuk és bemutatjuk ábra 3. Az ANOVA kétirányú ismételt mérések jelentős kölcsönhatást jeleztek (csoport × idő, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) és a csoport fő hatása F(1, 18) = 6.07, P <0.05), ami szignifikánsan alacsonyabb testsúlyt jelez Runner egerekben. A ketrecenkénti futási távolság a Táblázat 1. Bár az egyes egerek pontos futási távolsága bizonytalan volt, mert az egereket együtt helyeztük el, a rendszeres megfigyelés megerősítette, hogy az összes egér gyakran hajtott kerék. Az 2 kísérletben a Runner egerek hosszabbak voltak, mint az 1 kísérletben, de az átlagos futási távolság (m / nap / ketrec) minden kísérlet során következetes volt.
2: A FosB / ΔFosB immunreaktivitás mennyiségi meghatározásának validálása képküszöböléssel
Jelentős korreláció volt a FosB / ΔFosB-ir terület között, amelyet képküszöböléssel és FosB / ΔFosB-ir magok sűrűségével kaptunk, manuális számlálással (r = 0.941, P <00001, ábra 4).
3: FosB / AFosB immunreaktivitás a hippocampusban
A FosB / ΔFosB immunfestés reprezentatív képeit a dorsalis és ventrális hippocampus almezőkben mutatjuk be ábra 5. Az összes elemzett ROI-ban a FosB / ΔFosB immunreaktivitás a Runner egerekben (ábra 5jobbra) jóval magasabb volt, mint a kontroll egerekbenábra 5, központ). A Runner egerekben a kvantitatív elemzés a FosB / ΔFosB-ir terület jelentős növekedését jelezte mind a hátsó (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) és a ventrális hippocampalis részmezők (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; ábra 6).
4: FosB / ΔFosB immunreaktivitás a kéregben
A FosB / ΔFosB immunfestés reprezentatív képeit a kortikális ROI-kben mutatjuk be ábra 7. A mennyiségi elemzés a FosB / ΔFosB immunreaktivitás régiófüggő változásait mutatta ki hosszú távú futással (ábra 8). A Runner egerekben a FosB / ΔFosB-ir terület jelentősen magasabb volt a motoros kéregben (P <0.05) és a szomatoszenzoros hordókéreg (P <0.05), de nem a vizuális kéregben (P = 0.662) vagy a szaglási izzó (P = 0.523). A hallókéregben a FosB / ΔFosB-ir terület a Runner egerek növekedésére irányult (P = 0.105).
5: Neurogenezis
A DCX immunfestés reprezentatív képeit a ábra 9. A dorsalis hippocampusban DCX immunreaktivitás a Runner egerekben (ábra 9jobbra) jóval magasabb volt a kontroll egerekhez képest (ábra 9, balra). A dorsalis hippocampushoz képest a DCX immunreaktivitás a ventrális hippocampusban gyengébb volt mind a kontroll, mind a Runner egereknél. A Runner egerekben az átkelések száma szignifikánsan magasabb volt a dDGsp-ben (P <0.01) és a dDGip (P <0.01; ábra 10). A ventrális hippocampusban a Runner egerekben a keresztezések száma növekedett, de a csoportok között nem volt szignifikáns különbség (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; ábra 10).
6: FosB / AFosB expresszió és neurogenezis közötti korreláció
A FosB / ΔFosB-ir terület és a DCX kereszteződések száma között korrelációs analízist végeztünk.ábra 11). Mivel mindegyik adatkészlet (pl. Dorsalis DGsp a kontroll egerekben) csak 5 párokból áll, az elemzést először minden 40 párral végeztük. Érdekes módon jelentős összefüggés volt a FosB / ΔFosB-ir terület és a DCX kereszteződések száma között (r = 0.885, P <0.0001). Ezenkívül szignifikáns összefüggéseket is azonosítottak, amikor a háti DG (r = 0.762, P <0.05) és a ventrális DG (r = 0.816, P <0.01) külön elemeztük.
7: A FosB / ΔFosB izoformának hosszú távú futtatása által okozott azonosítása
Végül, hogy azonosítsuk a fosB a hippocampusban a hosszú távú működésre adott válaszként indukált géntermékek, az egerek egy további kohorszából származó hippocampi-t ugyanolyan pan-FosB antitest alkalmazásával Western blottal kezeltük. Az 35 – 37 kDa több sávja, amelyek a ΔFosB módosított izoformáit képviselik [44], a Runner versus Control egereknél szignifikánsan nőttek (ábra 12, P <0.01). Másrészt a 48 kDa-os FosB izoform egyik csoportban sem volt kimutatható. Egy másik 25 kDa felett halványan látható sáv valószínűleg a Δ2ΔFosB izoformát (27 kDa) képviseli. Két másik sáv volt, 50 kDa és 37 kDa felett, amelyek valószínűleg a nem specifikus kötődés miatt voltak. Számszerűsítve nem találtunk különbséget ezekben a nem ΔFosB sávokban a csoportok között (az adatokat nem mutatjuk be).
Megbeszélés
Összefoglalva, a jelen tanulmány először immunhisztokémiai elemzést végzett az 1 vizsgálatához, hogy a hosszú távú önkéntes kerékfutás a FosB / ΔFosB expressziót indukálja-e a hippocampusban; és 2), hogy a dorso-ventrális tengely mentén létezik-e egy régióspecifikus válasz.
Négy hetes önkéntes kerékfutás jelentősen megnövelte a FosB / AFosB immunreaktivitást az összes vizsgált hippocampalis régióban (azaz a DG, CA1 és CA3 almezői mind a hippocampus dorsalis, mind ventrális részében). Megerősítettük, hogy az 35 – 37kDa ΔFosB izoform volt a fő fosB a hosszú távú működésre válaszul halmozódó géntermék. Ezek az eredmények egyértelműen alátámasztják azt a hipotézist, hogy a hosszú távú rendszeres testmozgás az AFosB indukciójának a hippocampus során történő teljes kiváltása, és hogy az indukció új molekuláris mechanizmus lehet, melynek hatására a dorsalis és / vagy ventrális hippocampusfüggő funkciók különböző típusait érinti.
1: A FosB / ΔFosB immunreaktivitás számszerűsítésének validálása és korlátozása képküszöböléssel
A célsejtek számának számítására és a sejt morfológiájának értékelésére szolgáló immunhisztokémiai vizsgálatokban széles körben használt képküszöbölési technikát ebben a tanulmányban a FosB / ΔFosB immunreaktivitás régióspecifikus kvantifikációjára [15,45,46]. Kimutatták, hogy a FosB / ΔFosB immunreaktivitás szintjei a képküszöbértékkel és a kézi számlálással számszerűsítettek.ábra 4). Mivel azonban a sűrűség és az átfedés megakadályozta a FosB / ΔFosB-ir magok számolását nagyon sűrű területeken, a bemutatott korreláció csak akkor jelenti a képküszöbölési módszer pontosságát, ha a FosB / ΔFosB-ir területek a teljes ROI <~ 40% -át képviselik terület. Ezért a teljes ROI terület 40% -át meghaladó FosB / ΔFosB-ir területekre alapos értelmezés szükséges.
Különösen a Runner egerek főigazgatóságában (ábra 4), A FosB / ΔFosB expresszióját nagyban indukálta a kerék futása, és a FosB / ΔFosB-ir magok többsége átfedött. Ezekben a területeken a FosB / ΔFosB expressziójának fokozott indukciója az expressziós szint nagyobb alulbecsléséhez vezet, függetlenül az alkalmazott mennyiségi meghatározási módszertől (képküszöbölés vagy manuális számlálás). Az alulbecslés kockázata ellenére fontos megjegyezni, hogy a jelen tanulmány sikeresen kimutatta a FosB / ΔFosB-ir terület jelentős növekedését a Runner egerek főigazgatóságában. Ez azt sugallja, hogy a módszertani korlátok nem veszélyeztetik eredményeinket. Ehelyett a potenciális alulbecslés növeli annak a megállapításnak a megbízhatóságát, hogy a hosszú távú FosB / AFosB immunreaktivitás a hippocampusban.
2: Egységes ΔFosB indukció a hippocampuson belül hosszú távú futással
A hippocampus hosszanti tengelye mentén anatómiai és funkcionális gradiensekkel rendelkezik [26így a jelen vizsgálatban a FosB / AFosB immunreaktivitást a hippocampus hátsó és ventrális részében külön-külön elemeztük. Az adatok azt mutatták, hogy a hosszú távú futás egyenletesen növelte a FosB / ΔFosB expressziót minden mért hippokampusz ROI-ban. A FosB / ΔFosB immunreaktivitásának ez az egységes indukciója nem kifejezetten a hosszú távú működéssel összefüggő szisztémás metabolikus változásokból eredhet. Fontos azonban megjegyezni, hogy a kéregben a FosB / AFosB immunreaktivitás régióspecifikus növekedése volt tapasztalható. Ezt az eredményt alátámasztják a közelmúltbeli megállapítások, amelyek azt mutatják, hogy a futópad akut ütése fokozott regionális agyi véráramlást mutat a hippocampusban, de nem a szaglási izzóban [8]. Továbbá Rhodes et al. (2003) kimutatta, hogy az önkéntes kerék 7 napjai indukált c-Fos expressziót mutatnak a hippocampus DG és CA2 / 3-ban (CA1 nem mért) és az érzékszervi kéregben, de nem a vizuális kéregben [47]. Összességében ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy a FosB / ΔFosB expressziójának egyenletes indukciója a hippokampuszban nem a hosszú távú futás nem specifikus következménye. Érdekes módon Hawley et al. a közelmúltban jelentették, hogy a krónikus kiszámíthatatlan stressz növelte a FosB / ΔFosB expressziót a dorsalisban, de nem a ventralis, a patkány hippocampus DG-jében [48]. A további vizsgálatok során a FosB / ΔFosB indukció különféle mintái, például a testmozgás vagy a stressz által kiváltott minták, továbbra is betekintést nyújtanak a hippocampusra gyakorolt ingerfüggő hatásokba.
Az ebben a vizsgálatban használt primer pan-FosB antitest ismert, hogy felismeri a FosB fehérjék összes izoformáját. A nyugati blot elemzés során azt tapasztaltuk, hogy a hosszú távú futás után a hippocampusban megnövekedett egyedüli izoformák a FosB (35 – 37 kDa) módosított izoformái, az egyetlen stabil izoforma a Fos családfehérjék között [11]. Ez a megállapítás összhangban van a Pan-Fos ellenanyaggal végzett korábbi munkával annak bizonyítására, hogy az 35 – 37 kDa ΔFosB a domináns Fos család fehérje, amelyet a krónikus stressz okoz a frontális kéregben [44]. Ezért a hippocampális FosB / ΔFosB immunreaktivitás hosszú távú indukciójának növekedése valószínűleg a ΔFosB szintjét tükrözi.
Kevésbé ismert a hippocampus molekuláris és szerkezeti szempontjainak gyakorlásának régióspecifikus hatásairól. Ugyanakkor számos viselkedési vizsgálat azt mutatja, hogy a testmozgás által indukált javulások mind a dorsalis, mind a ventrális hippocampus funkciókban jelentősek. A gyakorlat bizonyítottan javítja a térbeli tanulást és a memóriát [34-38] és a térbeli és kontextusos feldolgozás főleg a dorsalis hippocampustól függ [27,28]. Ezzel szemben az edzésről ismert, hogy anxiolitikus és antidepresszáns tulajdonságokat fejt ki [24,25,38] és ezeket az érzelmi válaszokat elsősorban a ventrális hippocampus szabályozza [29,30]. Az αFosB egységes indukciója a hosszú távú futtatás során azt mutatja, hogy a neuroplasztikus változások valamilyen formája az egész hippocampusban történt. Ez megmagyarázza, miért befolyásolhatja a testmozgás mind a háti, mind a ventrális hippocampus függő funkciókat.
3: A testmozgás által indukált neurogenezis régióspecifikus elemzése
A neurogenezis funkcionális disszociációja a hátsó és a ventrális hippocampus között is egyre nagyobb figyelmet kapott [49]. Ebben a tanulmányban a DCX-ir éretlen neuronok morfológiai jellemzőit kihasználva [43], számoltuk a DCX-ir dendritek és a GCL közepe mentén húzott vonalszakaszok számát. Ez a mérés nem adta meg a DCX-ir neuronok teljes számát a DG-ben, de lehetővé tette a régióspecifikus kvantifikációt, amely szükséges a korrelációs analízishez a FosB / ΔFosB expressziós adatokkal (lásd alább). Hosszú távú futás után a DCX-ir neuronok száma szignifikánsan nőtt a hátsó, de nem a ventrális DG-ben. Ez arra enged következtetni, hogy a testmozgás a neurogenesist a dorzálisan jobban stimulálhatja, mint a DG középső része. A korábbi vizsgálatok azonban ellentmondásos eredményeket mutattak, amelyekben a kerék futása megnövekedett neurogenezist eredményezett mind a hátsó, mind a ventrális DG-ben [50,51]. A jelen tanulmányban a DCX-ir átkelések száma a ventrális főigazgatóságban a futás során hajlamos volt növekedni, bár a kis mintaméret (5 egerek csoportonként) esetleg korlátozta a csoportok közötti statisztikailag szignifikáns különbség kimutatásának képességét. Ezért valószínű, hogy korai lenne kizárni annak lehetőségét, hogy az önkéntes kerékvezetés stimulálhatja a ventrális hippocampus neurogenezist. További részletes tanulmányokra van szükség ahhoz, hogy megértsük a testmozgás által indukált neurogenezis régióspecifitását a többlépéses folyamatban (sejtproliferáció, differenciálás, migráció és túlélés).
4: A testmozgás által indukált ΔFosB indukció funkcionális következményei a hippokampusz plaszticitásának szabályozására
Végül, a hippocampusban a testmozgás által indukált ΔFosB indukció funkcionális következményeinek felismerésében első lépésként megvizsgáltuk a FosB / ΔFosB immunreaktivitás összefüggését a DCX-ir átkelésekkel mind a hátsó, mind a ventrális DG-ben, és jelentős, pozitív korrelációt találtunk a két változót. Bár a pontos mechanizmusok, amelyekkel az AFosB szabályozza a testmozgás által indukált neurogenezist, továbbra is bizonytalan, egy nemrégiben végzett tanulmány kimutatta, hogy fosB-null egerek, amelyek nem rendelkeznek FosB-vel, ΔFosB-vel és Δ2AFosB-vel (az összes fosB a bazális hippocampális neurogenezis hiánya volt, beleértve a neuronális progenitor sejtek proliferációjának csökkenését, az újszülött neuronok ectopiás migrációjának növekedését és az abnormális DG struktúrákat [20]. Ezeket a változásokat azonban nem figyelték meg fosB(d / d) egerek, amelyek nem rendelkeznek FosB-vel, de nem ΔFosB / Δ2AFosB-vel. Érdekes, hogy fosB-null egerek, néhány neurogenezishez kapcsolódó gén expressziója, beleértve VGF (VGF ideg növekedési faktor indukálható) és lány (A Galanin prepropeptidet) csökkentették [20]. Mivel a VGF és a GAL szekréciós molekulák, az egyik ígéretet tartalmazó javaslat szerint az AFosB-t expresszáló neuronok autokrin / parakrin aktivitás révén szabályozzák a neurogenezist [20].
Ezenkívül meg kell jegyeznünk, hogy az a terület, ahol ΔFosB indukálódik a térbeli átfedésekkel a régióval, ahol a neurogén aktivitás magas. Ez a megállapítás arra utal, hogy a testmozgás által indukált neurogenezis a minimális aktivitástól függ. A központi idegrendszer működésének fenntartásához és javításához kulcsfontosságú a neurális aktiválás [9] az agy-eredetű neurotróf faktor (BDNF) expressziójával és felszabadulásával kapcsolatos mechanizmusok révén [52,53], a szérum inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1) felvétele a vér-agy gáton [54,55], az apoptózis elnyomása [56] és a mitokondriális mozgékonyság szabályozása [57]. Ezért a jelen tanulmány azt sugallja, hogy a hosszú távú gyakorlat ismételt idegrendszeri aktivációt váltott ki, ami a megnövekedett AFosB expresszióban nyilvánvaló, ami hozzájárul a hippokampusz plaszticitásának fokozásához, potenciálisan a fent leírt többszörös mechanizmusok révén.
Jelen tanulmány csak a testmozgás által indukált neurogenezist és annak FosB / ΔFosB expressziójával való összefüggését értékeli a DG-ben. Azonban a FosB / AFosB immunreaktivitást a CA1 és CA3 almezőkben is indukáltuk. Míg további vizsgálatokra van szükség ahhoz, hogy jobban megértsük a gyakorlatban indukált ΔFosB expresszió funkcionális szerepét ezen almezőkben, a korábbi irodalom ígéretes lehetőséget kínál. Guan és mtsai. (2011) kimutatta, hogy a ciklinfüggő kináz 5 (Cdk5) specifikus ablációja a CA1 vagy a CA3 piramis neuronokban csökkentette a memória konszolidációját, vagy [58]. Érdekes, hogy a Cdk5 az ΔFosB [59] és részt vesz a szinaptikus plaszticitás szabályozásában [60]. Ezért a testmozgás által indukált AFosB expresszió szerepet játszhat a szinaptikus plaszticitás szabályozásában a Cdk5 aktiválásával a CA1 és CA3 almezőkben.
Következtetés
Míg az akut testmozgások ismerték, hogy a hippocampusban a közvetlen korai génfehérjék expresszióját indukálják, a jelen tanulmány az első bizonyítékot szolgáltatja arra, hogy a hosszú távú rendszeres testmozgás jelentősen indukálja az ΔFosB expressziót a teljes hippocampusban. thaz ΔFosB egységes indukciója támogatja a jelenlegi megértést, hogy a testmozgás hatékony, nem farmakológiai beavatkozás, amely képes több hippocampus funkció javítására. A FosB / AFosB expresszió és a neurogenezis közötti szignifikáns korrelációval együtt ezek az adatok provokatívak és további tanulmányok szükségességét jelzik, amelyek meghatározzák az ΔFosB szerepét a hippokampális funkcióra gyakorolt hatások közvetítésében, beleértve a neurogenezist is.
Finanszírozási nyilatkozat
Referenciák
;
