A DeltaFosB stabilitásának szabályozása foszforilációval (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

forrás

Pszichiátriai Osztály, Alapvető Neurológiai Tudományok Központja, a University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.

Absztrakt

A DeltaFosB transzkripciós faktor (más néven FosB2 vagy FosB [rövid forma]) az agyban előidézett hosszú távú plaszticitás fontos közvetítője, amely többféle pszichoaktív ingerrel jár, beleértve a visszaélést, a stresszt és az elektrokonvulzív rohamokat. . A DeltaFosB különlegessége, hogy az indukálás után az agyban még hosszabb ideig fennmarad, további ingerlés nélkül. A látszólagos stabilitást alátámasztó mechanizmusok azonban ismeretlenek maradtak. Itt bemutatjuk, hogy a DeltaFosB viszonylag stabil transzkripciós faktor, amelynek felezési ideje körülbelül 10 h a sejttenyészetben. Továbbá kimutattuk, hogy a DeltaFosB egy foszfoprotein az agyban, és hogy a DeltaFosB-ben egy erősen konzervált szerin maradék (Ser27) foszforilációja megvédi a proteazomális lebomlástól. Számos bizonyítékvonalat adunk arra, hogy ez a foszforiláció a 2 kazein-kináz által közvetített. Ezek az eredmények az első bizonyíték, hogy a DeltaFosB foszforilálódik, és bizonyítja, hogy a foszforiláció hozzájárul a stabilitásához, ami az agyi tartós adaptációk közvetítésének középpontjában áll.

Bevezetés

Az AFosB transzkripciós faktor, amelyet FosB2-nek vagy FosB-nek is neveznek [rövid forma], az azonnali korai gén C-terminális csonkolt splice-változata. fosB (Dobrazanski és munkatársai, 1991; Nakabeppu és Nathans, 1991; Yen és munkatársai, 1991). A teljes hosszúságú FosB-hez hasonlóan az AFosB-nek van egy DNS-kötő bázikus doménje és egy leucin-cipzárja, amelyen keresztül Jun-fehérjékkel dimerizálódik, hogy aktiváló fehérje-1 (AP-1) transzkripciós faktor komplexeket képezzen, amelyek számos gén expresszióját szabályozzák (Morgan és Curran, 1995; Rylski és Kaczmarek, 2004). Annak ellenére, hogy a FosB C-terminálisában található transzaktivációs doménnek nincs része, az AFosB egyaránt hatékony transzkripciós aktivátorként és represszorként működik a tenyésztett sejtekben és az agyban (Dobrazanski és munkatársai, 1991; Nakabeppu és Nathans, 1991; Chen és munkatársai, 1997; McClung és Nestler, 2003; Kumar és munkatársai, 2005).

ΔA FosB-t a régióban specifikus módon az agyban a krónikus, de nem akut, különféle pszichoaktív ingerek, köztük a stressz, bizonyos léziók, antipszichotikus és antidepresszáns gyógyszerek, visszaéléscsökkentő szerek és természetes jutalmak hatására indukálják. (Hope és munkatársai, 1994b; Hiroi és Graybiel, 1996; Moratalla és munkatársai, 1996; Bing és munkatársai, 1997; Mandelzys és munkatársai, 1997; Kelz és munkatársai, 1999; Werme és munkatársai, 2002; Andersson és munkatársai, 2003; Colby és munkatársai, 2003; Peakman és munkatársai, 2003; Perrotti és munkatársai, 2004; Zachariou és munkatársai, 2006). Az ΔFosB indukciója közvetlenül összefügg az említett agyi stimulusok számos funkciójával. Az AFosB kitartása még további stimuláció hiányában is megkülönbözteti azt az összes többi Fos család transzkripciós faktorától, amelyeket az akut ingerekre adott válaszként gyorsan indukálnak, néhány órán belül visszaesnek a bazális szintre, és általában krónikus stimuláció után deszenzitizálódnak (Hope és munkatársai, 1992; Daunais és munkatársai, 1993; Persico és munkatársai, 1993; Hiroi és Graybiel, 1996; Perrotti és munkatársai, 2004). Ez teszi az ΔFosB-t vonzó jelöltnek, hogy közvetítse a génexpresszió hosszú távú változásait, amelyek bizonyos krónikus ingerek által okozott stabil neuronális adaptációk alapját képezik.

Mivel az AFosB tartós jelenléte az mRNS további indukciójának hiányában jelentkezik (Chen és munkatársai, 1995), azt feltételeztük, hogy a teljes hosszúságú FosB-vel és minden más Fos családfehérjével ellentétben az AFosB szokatlanul stabil transzkripciós faktor (Hope és munkatársai, 1994b; Chen és munkatársai, 1997; Nestler és munkatársai, 2001; McClung és munkatársai, 2004). Továbbá az akut-krónikusan stimulált agyszövet immunoblot analízise azt sugallta, hogy az ΔFosB eltolódás látható M_r (molekulatömeg) az ∼33 kDa-tól az akut állapotban ∼35 – 37 kDa-ig a krónikus kezelés alatt (Hope és munkatársai, 1994a; Chen és munkatársai, 1995). Mivel nincs bizonyíték arra, hogy léteznek további mRNS-ek, amelyek ezekre a különböző izoformákra kódolódnának, azt is feltételeztük, hogy az ΔFosB-t posttranszlációsan módosítjuk, és talán ez hozzájárul a szokatlan stabilitásához. A mai napig azonban nem számoltak be az ΔFosB forgalmának vagy posttranszlációs módosításainak biokémiai elemzéséről. Jelen tanulmány célja annak meghatározása volt, hogy az AFosB foszfoprotein, és hogy a foszforiláció szerepet játszik-e a stabilitásában.

Előző részKövetkező szakasz

Anyagok és módszerek

Az emlős sejtvonalak és a DNS-konstrukciók.

A PC12 sejteket (Clontech, Mountainview, CA) l-glutamint (L-Gln) tartalmazó magas glükóz DMEM-ben tenyésztettük, és 5% magzati szarvasmarha szérummal (FBS), 10% lószérummal (mindkettő Invitrogen, Carlsbad, CA) kiegészítettük. 100 U / ml penicillin és 100 μg / ml sztreptomicin (mindkettő Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A HeLa sejteket (American Type Culture Collection, Manassas, VA) L-Gln-t tartalmazó magas glükóz DMEM-ben tenyésztettük, és 10% FBS, penicillin és sztreptomicinnel kiegészítettük. Mindkét sejtvonalat 37 ° C-on tartottuk nedves 5% CO-ban₂ légkörben.

A DNS-sel történő átmeneti transzfekcióhoz a PC12 vagy HeLa sejteket 6 lyukú lemezekre (PC12 sejtekre kollagén I bevonattal) beoltottuk, hogy a következő napon elérjék az 90 – 100% konfluenciát, majd Lipofectamine 2000 (Invitrogen) alkalmazásával transzfektáltuk. Néhány kísérletben (lásd Ábrákon. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB átmenetileg expresszálódott PC12 sejtekben rekombináns herpes simplex vírus (HSV) fertőzéssel.

A FosB és FosB cDNS-eket saját pTetop-konstrukcióinkból (Chen és munkatársai, 1997), és egy pcDNA3.1 vektorba (Invitrogen) szubklónoztuk. Ezeket a pcDNA3.1-AFosB / FosB konstrukciókat emlős sejtekben való expresszióra és helyspecifikus mutagenezisre szolgáló sablonként használtuk. A rekombináns HSV-AFosB-t a fentiek szerint állítottuk elő.Neve és munkatársai, 1997), és a készítmény titerje ∼1 × 10 volt⁸ pfu / ml.

Pulse-chase kísérletek.

Körülbelül 24 h fertőzés / transzfekció után a sejteket (PC12 vagy HeLa) hat-lyukú lemezeken kétszer-háromszor mostuk 2 ml PBS-sel, és 37 ° C-on inkubáltuk 1 h-ra 2 ml Cys / Met-mentes DMEM-ben (Invitrogen) 5% dializált FBS-sel (Hyclone, Logan, UT) kiegészítve a Met és Cys intracelluláris medencéinek lebontására. E „éhezési” periódus végén gyógyszerek (ha a sejteket kezelték) hozzáadódtak, és a sejteket 12 – 25 μCi-vel jelöltük (pulzus). ³⁵S fehérje címkézési keverék (Perkin-Elmer, Wellesley, MA) ∼1 h-re az 37 ° C-on az összes újonnan szintetizált fehérje címkézésére. A radioaktív jelölést ezután eltávolítottuk úgy, hogy a sejteket kétszer-háromszor mostuk 2 ml PBS-sel és a ³⁵Az S-jelölt fehérjéket követtük, a tápközeget „hideg” (nem radioaktív) 5% FBS-sel kiegészített közeggel helyettesítve, és a sejteket különböző időpontokban összegyűjtjük. A sejtkezeléseket az egész fázis alatt tartottuk. Ezeknek a kísérleteknek az összes ábrája hasonló kezdeti mennyiségeket mutat a különböző fehérjékben, hogy optimalizálják a forgalmi sebességük összehasonlítását.

Állatok és krónikus elektrokonvulzív rohamkezelés.

A felnőtt Sprague Dawley hím patkányokat (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) naponta egyszer kezeltük elektrokontuláris rohamokkal (ECS) az 7 – 9 d esetében. Az ECS-t a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (Hope és munkatársai, 1994a) egy Ugo Basile (Comerio VA, Olaszország) ECS egység a következő beállításokkal: frekvencia, 100 impulzusok / s; impulzus, 0.5 ms; ütés időtartama, 1.0 s; és áram, 75 mA. Az ál-kontroll állatokat párhuzamosan kezeltük, amikor a fülkapocs elektródákat elektromos áram nélkül alkalmaztuk.

³² P metabolikus jelölés.

Az agyszeletek jelölésére patkányokat dekapitáltunk, az agyakat gyorsan szétválasztottuk, és 300 μm frontális kortikális szeleteket készítettünk DSK mikroszűrővel (Ted Pella, Redding, CA). A szeleteket műanyag csövekben inkubáltuk 2 ml foszfát-hiányos mesterséges CSF-ben (ACSF), és 30 ° C-on tartottuk állandó, enyhe buborékolással egy O₂/ CO₂ keverék (Hemmings és munkatársai, 1989). A szeleteket (két szelet csövönként) 1.3 mCi-vel jelöltük 8 – 10 h-re okadainsav jelenlétében vagy hiányában (100 ng / ml). Az inkubálás végén a szeleteket legalább háromszor leöblítettük hideg ACSF-sel, majd homogenizáljuk ultrahanggal 250 μl hideg radioimmun-kicsapódási vizsgálat (RIPA) pufferben [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) ) Igepal, 0.5% (tömeg / térfogat) nátrium-dezoxi-kolát, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA], amelyet az alkalmazás előtt az SDS-sel egészítettünk ki 0.6% -ig, az emlőssejtek proteázgátló koktéljához (5 μl / ml; Sigma-Aldrich), foszfatáz inhibitor koktélok I és II (1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF és 2% glicerin. A homogenizátumokat ezután 15 percre forraljuk, és centrifugálással tisztítjuk 15,000-on g az 15 min. A kapott felülúszókban a fehérje koncentrációját a BCA fehérje vizsgálattal (Pierce, Holmdel, NJ) értékeltük.

a ³²A tenyésztett sejtek P-jelölése, infection24 h a fertőzés / transzfekció után, a sejteket kétszer-háromszor mostuk foszfátmentes tápközeggel, és ebben a tápközegben inkubáltuk ∼1 h-ra. Ezt az éhezési időszakot követően 0.2 – 0.3 mCi ³²PH₃PO₄ (Perkin-Elmer) mindegyik lyukba adtuk, és a sejteket 4 – 12 h-ra jelöltük a kísérlet típusától függően (lásd az 1 – 7 ábrákat a specifikációkért). A sejteket ezután háromszor PBS-sel mostuk, és 15 percig jégen lizáltuk 50 μl kiegészített RIPA pufferrel. A lizátumokat kaparással összegyűjtöttük, és 10-időkön át 25-tűn át áthatoltuk a nyíró DNS-hez, forraltuk 10 percig, és 15,000-fordulatszámon 15 – 30 percig centrifugáltuk 4 ° C-on. A tisztított lizátumokat (felülúszók) egy új csőbe vittük át, és BCA fehérje vizsgálatot végeztünk (Pierce). Ezeknek a kísérleteknek minden alakja hasonló mennyiségű vad típusú (WT) és S27A AFosB fehérjét mutat, hogy optimalizálják a relatív foszforilációs szintjük összehasonlítását.

Vegyi anyagok és sejtkultúrák.

Az Okadaic savat (OA; Sigma-Aldrich) etanolban oldottuk és végső 100 ng / ml koncentrációban használtuk. 5,6-Diklór-1-β-d-ribofuranozil-benzimidazolt (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) feloldottunk dimetil-szulfoxidban (DMSO, Sigma-Aldrich) és a sejttenyészetben 50 μm végkoncentrációban használtuk. A spermint (Sigma-Aldrich) vízben oldottuk és 200 μm végkoncentrációban használtuk. A Calphostin-C-t (Biomol) DMSO-ban oldottuk és 0.2 μm-ben használtuk, míg az 12-mirisztát 13-acetát (PMA; Promega, Madison, WI) DMSO-ban feloldott és 0.1 μm-nél használtuk. myristoilált-autocamtid-2-hez kapcsolódó gátló peptidet (m-AIP; Biomol) vízben oldottunk, és 1 és 10 μm végkoncentrációban használtuk. A H-7 és H-8 (Biomol) széles spektrumú protein kináz inhibitorokat vízben oldottuk, és 150 és 200 μm végkoncentrációban használtuk. Az MG132-et (Calbiochem, San Diego, CA) és epoxomicint (Peptides International, Louisville, KY) mindkét esetben DMSO-ban oldottuk, és 12.5 és 7.5 μm végkoncentrációban használtuk. Minden kísérletben DMSO-t (vivőanyagot) adtunk a sejtekhez, amint szükséges a DMSO állandó mennyiségének fenntartása érdekében. mert ³²P-jelölési kísérletekben a gyógyszereket közvetlenül a címke előtt adták hozzá, és a címkézési időszak hátralévő részében tartották. A pulzus-chase-kísérletekhez a Cys / Met „éhezés” idején gyógyszert adtunk a címkézési periódus alatt, majd visszavittük a táptalajba. A proteaszóma-gátlók minden 3 – 4 h-t az egész chase-be szedték, hogy kompenzálják e peptidek gyors forgalmát.

AFosB immunprecipitáció, immunoblot és autoradiográfia.

Az immunprecipitációkhoz a lizátumokat 1: 5-t hígítottuk egyszerű RIPA-val, hogy az SDS-koncentrációt 0.1% -ra csökkentjük, mielőtt folytatnánk az immunprecipitációt (IP). A nemspecifikus kötődés korlátozására a lizátumokat először nemimmun IgG-vel és G-Sepharose-val (Sigma-Aldrich) végzett immunprecipitálással tisztítottuk legalább 4 h-ra. Az AFosB-t ezután immunizáltuk a tisztított lizátumokból egy kecske poliklonális ellenanyaggal, amely felismeri a FosB-ben és az AFosB-ben (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) jelen lévő belső epitópot 0.5-1 μg IgG-nként 10 μg lizátumfehérjében (50 – 300 μg teljes fehérje) 0.5 ml teljes térfogatában. Az IP-ket óvatosan kevertük 4 ° C-on egy rotoron legalább 8 h-ra, majd 15 μl G-Sepharose-proteint adtunk hozzá, és az IP-ket kevertettük legalább egy másik 4 h-on. Az IP-ket 3000-nál centrifugáltuk g 3 – 5 min 4 ° C-on, háromszor mossuk 0.5 ml hideg sima RIPA-val és kétszer 0.1% Tween 20-ot tartalmazó hideg PBS-sel. Az IP-ket ezután újraszuszpendáltuk 0.5 ml hideg PBS-ben, átvittük, új csőbe granuláltuk, majd az immunprecipitált fehérjéket 15-25 μl 2 × redukáló Laemmli fehérje mintapuffer hozzáadásával eluáltuk. Ez az IP-protokoll azt eredményezte, hogy a lizátumban gyakorlatilag az összes FosB-t specifikusan és hatékonyan kicsapjuk. Az immunprecipitált fehérjéket SDS-PAGE-nak vetettük alá azáltal, hogy az egész IP-t 12.5% Tris-HCl Criterion gélre (Bio-Rad, Hercules, CA) töltjük, majd PVDF-re vagy nitrocellulózra visszük át. Átvitel után a membránt levegőn szárítottuk és ³²P- és ³⁵Az S-radioaktívan jelölt fehérje sávokat autoradiográfiával figyeltük meg Kodak (Rochester, NY) autoradiográfiás fóliával, valamint egy Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager alkalmazásával végzett foszforimálással. A teljes (nem foszforilált és foszforilált) AFosB sejt-lizátumokban vagy agyhomogenizátumokban az immunprecipitált fehérje immunoblotolásával detektálták (ugyanazt a membránt használva, hogy a sejteket kimutassák). ³²P-jelzett fehérje), vagy azonos mennyiségű lizátum / homogenizátum fehérje, amelyet SDS-PAGE-nak vetünk alá, és PVDF-re vagy nitrocellulózra visszük át. A membránt először blokkoltuk 1% (tömeg / térfogat) zsírmentes száraz tejjel (Bio-Rad) inkubáltuk PBS-ben, amelyet 0.1% (v / v) Tween 20-nel (Sigma) kiegészítettünk 1 h-on 25 ° C-on. Ezután a membránt egy éjszakán át immunizáltuk 4 ° C-on, saját nyúl anti-FosB poliklonális ellenanyagunkkal, amelyet az 1-16 aminosavai ellen készítettünk (1: 10,000). Az elsődleges inkubálás után a membránokat négyszer mossuk 5 percig blokkoló pufferrel, majd 25 ° C-on inkubáltuk ∼1 h-ra egy kecske anti-nyúl IgG-vel, amelyet torma-peroxidázzal konjugáltunk (az 1-nál: 5000 blokkoló pufferben, a Vector Laboratories, Burlingame, CA). A membránokat ezután háromszor mossuk 10 percig blokkoló pufferrel és egy alkalommal 5 percig PBS-sel. A teljes AFosB fehérje sávokat a Kodak MR filmen fokozott kemilumineszcenciával (Pierce) és / vagy az fluoreszcencia detektálásával, az ECL-Plus reagensek (Amersham Biosciences) és a Storm PhosphorImager segítségével detektáltuk.

A rekombináns AFosB túlzott expressziója és tisztítása rovarsejtektől.

Az AFosB-t Sf9 rovarsejtekben N-terminális hexa-His-jelölt fehérjék (N-His (6) AFosB) túltermelték a Bac-to-Bac baculovírus expressziós rendszer (Invitrogen) alkalmazásával és a gyártó utasításait követve. Röviden, az AFosB cDNS (2-237 maradék), amelyet az MGHHHHHHAG affinitású N-terminális tag előz meg, a pFASTBacTM1 vektorba szubklónoztuk, amelyet rekombináns bakulovírus előállítására használtunk. Az Sf9 sejteket rekombináns vírussal fertőztük meg, és N-His (6) AFosB-t több sejtkromatográfiás lépéssel tisztítottunk, beleértve az affinitáskromatográfiát nikkel-oszlop (Qiagen, Valencia, CA) alkalmazásával, anioncserét mono-Q oszlop alkalmazásával (Amersham Biosciences) és a méretkizárás gélszűrő oszlop segítségével (Amersham Biosciences).

In vitro foszforilációs vizsgálatok.

In vitro időbeli és sztöchiometriai analízis foszforilációs reakcióit végeztük 30 μl 10 μm szubsztrátot (N-His (6) ΔFosB vagy pozitív kontroll szubsztrátot), 250 μm ATP-t és 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, a kináz gyártó által szolgáltatott puffer, és az alábbi kinázok egyike: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) vagy p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Az időbeli reakciókat úgy hajtottuk végre, hogy a reakcióoldatból az 5 μl alikvotokat eltávolítottuk a megadott időpontokban, és azonos térfogatú 4 × redukáló Laemmli fehérje mintapuffert adtunk. A CK2 reakció Michaelis-Menten kinetikai paramétereit empirikusan meghatározott lineáris egyensúlyi állapotokban határoztuk meg. Ezeket a reakciókat 15 min-vel végeztük 10 μl 2 ng / μl enzimet, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP és N-His (6) ΔFosB koncentrációi az 2.5 – 30 μm-től. Az összes reakciót 30 ° C-on vízfürdőben végeztük. SDS-PAGE után és a gél Bio-Safe Coomassie-vel (Bio-Rad) történő festése után a gélt megszárítjuk, és ³²A P-foszfát beépülését foszforimációs analízissel értékeltük (lásd alább, Adatszámozás, számítások és statisztikák).

Kétdimenziós foszfopeptid térkép és foszfo-amino-sav analízis.

Mindkét elemzést az alábbiak szerint végeztük Ploegh és Dunn (2000). Röviden, száraz gélfragmentumokat tartalmaz ³²P-jelzett ΔFosB (vagy a in vitro reakciók vagy metabolikusan jelölt sejtek immunprecipitátumai), kivágtuk, rehidratáltuk, mostuk és triptikus emésztésnek vetettük alá. A triptikus emésztési termékeket tartalmazó felülúszót liofilizáltuk, és a liofilizátumot többször mostuk, és 10 μl pH-értékű, pH = 1.9 pufferben szuszpendáltuk. A mintát (3 μl) egy cellulóz vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) lemezen (Analtech, Newark, DE) tapasztaltuk, és az egyik dimenzióban elektroforézissel és a másik dimenzióval elválasztottuk TLC-vel. Az eredményül kapott foszfopeptid térképeket autoradiográfiával és foszforimázással végeztük. A foszfo-aminosav-analízishez az elektroforézis-pufferben újra szuszpendált triptikus emésztések 2 μl-jét 105 ° C-on 25 m-es HCl-hidrolízissel tovább hasítottuk 3 m HCl alatt N₂ légkör. A reakciót 6-szoros vízzel hígítottuk, és az elegyet liofilizáltuk. A liofilizátumot újraszuszpendáltuk 5 μl elektroforézis pufferben, pH 1.9-ben, és egy foszfo-Ser, -Thr és -Tyr standardokkal együtt cellulóz TLC lemezre rátapasztottuk. Az elektroforézist a vékonyréteg-kromatográfiás lemez hossza felénél, pH = 1.9 elektroforézis pufferrel végeztük, majd a lemezt a pH 3.5 pufferbe helyeztük, és az elektroforézist befejeztük. A foszfo-aminosav-standardokat úgy ábrázoltuk, hogy a TLC-lemezt 1% (v / v) ninhidrin-oldattal acetonban, és ³²A P-jelölt aminosav mintákat mind az autoradiográfiával, mind a foszforimálással vizualizáltuk.

siRNS-indukálta CK2α knock-down.

RNS interferencia módszert alkalmaztunk a CK2 szintek szelektív leállítására (Di Maira és munkatársai, 2005). A PC12 sejteket kollagén I bevonattal ellátott hat-lyukú lemezekre vittük fel, hogy a következő napon elérjék a ∼70 – 80% konfluenciát, amikor átmenetileg transzfektálták a katalizátor mRNS-jére irányuló, nem-orientáló siRNS vagy siRNS 20 nm-sel (végső koncentráció). α patkány CK2 alegysége, a SilentFectin (Bio-Rad) transzfekciós ágens 5 μl-ét használva és a gyártó utasításait követve. Körülbelül 24 h később a sejteket átmenetileg transzfektáltuk AFosB plazmiddal, amint azt fentebb említettük. Kb. 24 h később (∼48 h siRNS transzfekció után) a sejteket vagy ³²P anyagcsere-jelölés vagy pulzus-chase-analízis a fentiek szerint. A következő négy CK2α siRNS-eket használjuk hasonló eredmények: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Negatív kontrollként használtuk Silencer negatív kontroll #3 siRNS az Ambionból (Austin, TX). A CK2 knock-down mértékét az anti-CK2 poliklonális antitesttel (a katalógus # 06-873 az Upstate-től) egy éjszakán át 1: 1000-hígítással vizsgáltuk. A β-tubulint töltési kontrollként alkalmaztuk, és monoklonális antitesttel detektáltuk (05-661 katalógus: Upstate) egy éjszakán át 1: 20,000 hígításban.

Helyspecifikus mutagenezis.

A Ser27 Ala-ra vagy Asp-re történő mutációját a Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) segítségével végeztük, és a gyártó utasításait követve. A Ser27 mutációk bejuttatásához az egér AFosB fehérjébe a következő mutagenezis primereket használtuk. Ser27 - Ala: (fordított primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ". Ser27 - Asp (előreindító primer) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ". A mutált bázisok félkövérek, és a Ser27 kodon dőlt betűvel van ellátva.

Bioinformatikai.

Az ΔFosB potenciális foszforilációs helyeit és kinázjait az egérfehérje szekvencia specifikus adatbázisokba, köztük a ProSite-be történő elküldésével kerestük.http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost és munkatársai, 2004) és a NetPhosK (Blom és munkatársai, 2004).

Adatmennyiség, számítások és statisztikák.

A PVDF vagy a nitrocellulóz membránban jelenlévő fehérje mennyiségét egy Storm PhosphorImager és a hozzá tartozó ImageQuant szoftver (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics) segítségével számszerűsítettük. A sejttenyészet és az agyszelet foszforilációs tanulmányaiban a kapott értékek a ³²A P-jelzett fehérjét ezután megosztottuk az összes ΔFosB értékre, és arányban fejeztük ki. Ban,-ben in vitro foszforilációs vizsgálatok, a mennyiség ³²A αFosB (sztöchiometria) móljára vonatkoztatva P-jelzett ΔFosB-t kiszámítottuk a korábban leírtak szerint (Sahin és munkatársai, 2004). Az összes mérést a használt lineáris tartományon belül végeztük. A kinetikai paramétereket a Michaelis-Menten modell segítségével számítottuk ki V = V_max[S] / ([S]+K_M) És V_max = k₂[E_Végösszeg]. A felezési idő (t_1/2ΔFosB és FosB értékeit a pulzus-chase grafikonokból becsülték meg (a nemlineáris regressziót használva, amely a legjobban illesztette az adatpontokat), és megfelel az időnek, amikor a fennmaradó fehérje mennyisége az eredeti 50% -a. Minden ábrán a bemutatott eredmények legalább két-három független kísérletet reprezentálnak. Minden grafikonban a bemutatott adatok átlagok ± SEM-ek (3 ≤ n ≤16). A különbségek statisztikai szignifikanciáját nem párosítottuk t teszt, korrigálva több összehasonlításra, és a csillagok jelzik p ≤ 0.05.

Előző részKövetkező szakasz

Eredmények

Az AFosB szokatlanul stabil transzkripciós faktor

Annak ellenére, hogy korábban feltételeztük, hogy ΔFosB viszonylag stabil transzkripciós faktor (Nestler és munkatársai, 2001), a fehérje forgalmi profiljának közvetlen elemzése még nem történt meg. Ennek a kérdésnek a kezelésére PC12 sejteket használtunk, amelyek neuron-szerű sejtvonalaként széles körben használtak, ahol az AFosB átmenetileg expresszálódott egy rekombináns herpes simplex vírussal (HSV-ΔFosB) való fertőzés útján. Az újonnan szintetizált fehérjéket metabolikusan jelöltük ³⁵S-Met / Cys és a degradációs mintázat ³⁵S-jelölt ΔFosB (³⁵Az S-AFosB-t úgy figyeltük meg, hogy a radioaktívan jelölt aminosavak eltávolítása után különböző időpontokban kapott sejtlizátumokból immunprecipitáltuk. Az immunprecipitátumok SDS-PAGE módszerrel történő elemzése és autoradiográfia azt mutatta, hogy a ΔFosB felezési ideje PC12 sejtekben ∼10 h (Ábra 1). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ΔFosB felezési ideje magasabb, mint a legtöbb indukálható transzkripciós faktor (lásd a Megbeszélés), beleértve a teljes hosszúságú FosB-t is, amelynek a felezési ideje a sejtkultúrában ∼90 min.Dobrazanski és munkatársai, 1991; Carle és mtsai. 2004). Emellett érdemes megjegyezni, hogy az ΔFosB lebomlása nem illeszkedik az első fokú exponenciális bomlási görbéhez, hanem kétfázisú, lassabb lebomlási sebességgel kezdve. Ez arra utal, hogy több mint egy FosB faj és / vagy egynél több lebontási út létezik.

Nagyobb verzió megtekintése:

• Ezen az oldalon
• Új ablakban

• Töltse le a PowerPoint Slide-t

Ábra 1.

Az AFosB szokatlanul stabil transzkripciós faktor. Az AFosB felezési ideje cell10 h a sejttenyészetben. A FosB-t PC12 sejtekben expresszáltuk HSV-AFosB fertőzéssel vagy az AFosB-tartalmú plazmiddal végzett átmeneti transzfekcióval, és a sejteket pulzáló-kísérletnek vetettük alá az Anyagok és módszerek szerint. Az ΔFosB túlexpresszálására alkalmazott módszertől függetlenül egyenértékű eredményeket kaptunk. Az ábrán az AFosB lebontásának időbeli lefutása (és reprezentatív autoradiogramja) látható. Az ábrázolt adatok legalább öt független kísérletből nyert legalább 15 egyedi adatpontok átlag ± SEM. Összehasonlításképpen a teljes hosszúságú FosB felezési ideje látható.

Az AFosB egy foszfoprotein az agyban

Feltételeztük, hogy az ΔFosB poszt-transzlációs módosítása hozzájárulhat annak látható stabilitásához. Mivel kimutatták, hogy a foszforiláció sokféle módon modulálja a transzkripciós faktorok aktivitását, beleértve a stabilitást is (lásd a felülvizsgálatot) Desterro és munkatársai, 2000; Whitmarsh és Davis, 2000), azt vizsgáltuk, hogy az AFosB egy foszfoprotein. Ebből a célból az AFosB expresszióját patkány agyban indukáltuk krónikus ECS alkalmazásával, amely ismert, hogy nagy mennyiségű ΔFosB-t indukál, különösen a frontális kéregben (Hope és munkatársai, 1994a). Az utolsó ECS kezelés után egy nappal, amikor a ΔFosB szintek továbbra is magasak, vékony előlapi kéregszeleteket készítettünk, és metabolikusan jelöltük. ³²P-ortofoszfát. Egy párhuzamos szeletkészletet nem jelöltek ki radioaktívan, és ezeket a teljes AFosB szintek kimutatására használjuk. Specifikus anti-FosB / AFosB antitesttel végzett immunprecipitációval és az immunprecipitált fehérjék SDS-PAGE-val történő elválasztásával foszforiláltuk ³²A P-jelzett AFosB-t autoradiográfiával detektáltuk, míg a teljes AFosB-t immunoblot segítségével detektáltuk. Ez az elemzés rámutatott, hogy az AFosB az agyban foszforilálódik, amint azt egy specifikus ³²Ron35 kDa P-jelölt sávja jelen van a krónikusan kezelt agyi mintákban, de gyakorlatilag nem észlelhető a szégyen kezelt kontrollokban (Ábra 2A). Ez összhangban van azzal a ténnyel, hogy krónikus stimuláció hiányában az ΔFosB bazális szintje nagyon alacsony. Az immunprecipitációs reakció specifitását a nemimmun IgG csapadékban lévő jel hiánya szemlélteti.

Nagyobb verzió megtekintése:

• Ezen az oldalon
• Új ablakban

• Töltse le a PowerPoint Slide-t

Ábra 2.

Az AFosB egy foszfoprotein az agyban. AAz AFosB foszforilálódik az agyban. Az endogén AFosB-t patkány agyban indukálták krónikus ECS kezeléssel, ahogy azt az Anyagok és módszerek című fejezetben leírtuk. A frontális kérgi szeleteket metabolikusan jelöltük ³²PH₃PO₄ több órán át. A szeletek homogenizálása után AFosB-t immunprecipitáltuk és foszforiláltuk AFosB-t (³²P-ΔFosB-t detektáltunk autoradiográfiával (felső panel). A nem-radioaktív immunprecipitátumokban a teljes ΔFosB-t immunoblottal detektáltuk (alsó panel). Negatív kontrollként az ál-kezelt állat és a nemimmun IgG immunprecipitátumát mutatjuk be. BAz egér AFosB fehérje szekvenciájának megfelelő predikciós pontszámokkal rendelkező jelölt foszforilációs helyeket és kinázokat bioinformatikai analízissel kaptunk. A magasabb predikciós pontszámmal rendelkező jelölt helyek a fehérje szekvenciában kerülnek kiemelésre, és a táblázatban szerepelnek. A DNS-kötő (bázikus) domén és a leucin cipzár a fehérje szekvenciában félkövér. C, DAz AFosB foszforilációját a Ser / Thr foszfatáz inhibitor OA növeli. C, ³²Az 100 ng / ml OA (grafikon és felső panel) hiányában (Ctr) vagy XNUMX ng / ml jelenlétében jelzett frontális kortikális szeletekből származó P-AFosB szinteket autoradiográfiával detektáltuk. Az alsó panelen a nem jelzett szeletekből származó immunprecipitátumban kimutatott összes AFosB immunoblottálással látható. DA PC12 sejteket HSV-AFosB vagy HSV-LacZ-vel (vektor) fertőztük meg, és metabolikusan jelöltük ³²PH₃PO₄ az 100 ng / ml OA hiányában (Ctr) vagy jelenlétében. ³²Az immunprecipitátumok P-ΔFosB szintjét autoradiográfiával (grafikon, felső panel) detektáltuk. Az alsó panel a sejt lizátumokban kimutatott összes AFosB-t immunoblotolással mutatja.

Első lépésként annak meghatározása érdekében, hogy melyik kináz (ok) és hely (ek) van jelen az AFosB-foszforilációban, az aminosav-szekvenciáját több bioinformatikai elemzésnek vetettük alá. Ez azt mutatta, hogy bár az AFosB nem tartalmaz Tyr foszforilációs jelölt helyeket, több Ser / Thr kináz konszenzus helyet is tartalmaz, köztük három CaMKII helyet, három CK2 helyet és két nagyon magas foszforilációs predikciós pontszámmal rendelkező PKC helyet (Ábra 2B). Ha a bioinformatika alapján az AFosB csak Ser- vagy Thr-maradékokon foszforilálódik, akkor a foszforilációját a Ser / Thr-foszfatázok aktivitásával jelentősen módosítani kell. A hipotézis teszteléséhez a frontális kérgi szeleteket jelöljük ³²P-ortofoszfát OA, Ser / Thr fehérje foszfatáz inhibitor jelenlétében vagy hiányában. Ahogy látható ábra 2C, OA nagy (∼2.5-szeres) növekedést okozott ³²P-ΔFosB. Az összes ΔFosB szint kis mértékű növekedését okozza, ami összhangban van az OA rákkeltő hatásait a korábbi közvetlen gének indukálására, beleértve a Fos fehérjéket is.Miller és munkatársai, 1998; Choe és munkatársai, 2004). A nettó eredmény a foszforilált ΔFosB-szintek jelentős általános növekedése (increase60%).

Ezután azt vizsgáltuk, hogy a kísérleti manipulációra jobban alkalmas PC12 sejtekben az AFosB foszforilációs mintázatot mutatott-e az agyban megfigyelthez hasonlóan. A PC12 sejtekben ΔFosB-t expresszáltunk HSV-ΔFosB fertőzéssel, és metabolikusan jelöltük a sejteket ³²P-ortofoszfát OA jelenlétében vagy hiányában. A fehérje sikeres expresszióját és immunprecipitálását a HSV-AFosB-vel fertőzött sejtekből az immunoblot jelenlétében mutatjuk be.Ábra 2Degy alsó panel) és egy N35 kDa sáv autoradiográfiája (felső panelje), hiányzik a vektor-fertőzött sejtekben. Amint az agyban megfigyelhető, az OA az ΔFosB szintek kis mértékű növekedését okozza, de sokkal nagyobb (kb. Kétszerese) növekedést mutatott ³²P-ΔFosB, ami jelentős (∼50%) nettó növekedést eredményez az AFosB foszforilációban. Továbbá, összhangban a bioinformatikai előrejelzésekkel, a PC12 sejtek Tyr foszfatáz inhibitorral történő kezelése nem eredményezett jelentős változásokat ³²P-ΔFosB szintek (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az eredmények együttesen kiderítették, hogy az AFosB foszforilálódik az agyban és a PC12 sejtekben lévő Ser és / vagy Thr maradékokban, és megerősítette, hogy ez egy jó sejttenyésztési rendszer, amelyben tovább tanulmányozza az ΔFosB foszforilációs és lebontási profiljait.

A CK2, de nem PKC vagy CaMKII foszforilál in vitro

Amint azt fentebb leírtuk, az AFosB aminosav-szekvencia elemzése a CK2, a PKC és a CaMKII foszforilációs helyekre vonatkozó magas predikciós pontszámokat tárt fel. Annak megállapításához, hogy melyik kináz foszforilálhatja az AFosB-t, sorozatot hajtottunk végre in vitro foszforilezési reakciók tisztított kinázok és tisztított rekombináns ΔFosB alkalmazásával. Ahogy látható ábra 3Aa három jelölt kináz közül csak a CK2 foszforilálta a ΔFosB-t szignifikánsan. Emellett számos más kinázt is teszteltünk (pl. GSK3 és p70S6K), de nem sikerült szignifikánsan foszforilálni az ΔFosB-t (az adatokat nem mutatjuk be). A CK2 reakció időbeli elemzéssel történő további jellemzése azt mutatta, hogy ez a kináz katalizálhatja a ∼0.5 mol foszfát móljára vonatkoztatva a αFosB móljára (Ábra 3B). Az a tény, hogy a CK2 foszforilálhatja az ΔFosB-t in vitro jelentős sztöchiometriás (N50%) egy fiziológiailag releváns reakcióra utal. Ezt követően a CK2 inkubálásával növekvő mennyiségű tisztított AFosB jelenlétében vizsgáltuk a reakció kinetikáját, és megállapítottuk, hogy a CK2 foszforilálja a ΔFosB-t egy V_max 5.8 pmol · perc^-1 · Μg^-1 enzim, a K_M 18.4 μm, és a k_hogyan 0.2 / s (Ábra 3C). Ezeknek a kinetikai paramétereknek az értékei tovább erősítik ennek a reakciónak a fiziológiai jelentőségét. Például a K_M A CK2 DARPP32, az egyik legismertebb szubsztrátja, az 3.4 μm és a k_hogyan ∼0.3 / s (Girault és munkatársai, 1989); a K_M az ATP tartományban a ∼10 – 40 μm (Cochet és munkatársai, 1983; Silva-Neto és munkatársai, 2002) és a kazein esetében a ∼10 – 50 μm (Meggio és munkatársai, 1977; Pyerin és munkatársai, 1987). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy az ΔFosB egy jóhiszemű szubsztrát a CK2 számára in vitro.

Nagyobb verzió megtekintése:

• Ezen az oldalon
• Új ablakban

• Töltse le a PowerPoint Slide-t

Ábra 3.

A CK2, de nem PKC vagy CaMKII foszforilál in vitro. Az autoradiográf (felső panel) a foszforilált terméket mutatja, és a Coomassie-festett gél (alsó panel) a reakcióban jelen lévő összes AFosB-t mutatja. AA tisztított rekombináns AFosB-t alávetettük in vitro foszforiláció különböző jelölt kinázokkal (amelyek közül három látható). BAz időfolyamat és a sztöchiometriai elemzések azt mutatják, hogy a CK2 foszforilálhatja az ΔFosB-t in vitro o50% sztöchiometriájával. CA CK2 reakció kinetikai elemzése azt mutatta, hogy az ΔFosB egy jóhiszemű in vitro szubsztrát. A reakció linearizálását kettős reciprokális diagramon (alul) mutatjuk be, de a kinetikai paramétereket a Michaelis-Menten görbéből (felső) kaptuk.

A CK2 modulálja az ΔFosB foszforilációját és stabilitását sértetlen sejtekben

A ΔFosB CK2 által közvetített foszforilációjának fiziológiai jelentőségének felméréséhez összehasonlító foszfopeptid térképezést végeztünk in vitro foszforilált és PC12-sejt-foszforilált AFosB. SDS-PAGE és gélelúció után ³²P-ΔFosB (a in vitro a reakciók vagy a. \ t ³²P-jelzett sejtek), a fehérjét tripszinnel emésztettük, és a kapott foszfopeptideket kétdimenziós elválasztásnak vetettük alá. Ez az elemzés rámutatott, hogy a CK2-reakcióból származó foszfopeptid a PC12 sejtekben foszforilált AFosB két fő foszfopeptidjének egyikével migrált.Ábra 4A), míg a PKC vagy CaMKII (adat nem látható) reakcióból származó foszfopeptidek nem voltak. A PC12 sejtekből egy második osFosB foszfopeptid volt jelen a térképen, de a kinázok képtelensége miatt teszteltünk egy hasonló foszfopeptidet. in vitrojelenleg nem tudjuk, hogy ez a második foszfopeptid tartalmaz-e más foszforilációs helyet, vagy különbözõ triptikus peptidet tartalmaz, amely ugyanazt a foszforilációs helyet tartalmazza.

Nagyobb verzió megtekintése:

• Ezen az oldalon
• Új ablakban

• Töltse le a PowerPoint Slide-t

Ábra 4.

A CK2 modulálja az ΔFosB foszforilációját és stabilitását sértetlen sejtekben. AA CK2, de nem PKC foszforilálódik a sejtekben. A CK2 vagy PKC által foszforilált ΔFosB kétdimenziós foszfopeptid térképei in vitro vagy ép PC12 sejtekkel. A nyilak mutatják a CK2-foszforilált peptid, de nem a PKC-foszforilált egy PC12-sejtekből származó egyik FosB-foszfopeptiddel való elvándorlását. BA PC12 sejtekben az AFosB foszforiláció fokozódik a sejtek hatásos CK2 aktivátor sperminnel (SP) történő kezelésével és a CK2 inhibitor DRB-vel történő kezeléssel csökkentve. Ezzel szemben a PC12 sejtekben az AFosB foszforilációját nem befolyásolta sem PKC aktivátor (PMA), sem a PKC-specifikus calphostin-C (Calph) inhibitor. Egy reprezentatív autoradiogram (felső panel) és immunoblot (alsó panel) látható. C-F, CK2 aktivitás hatása az AFosB stabilitására. Az ábrák a ΔFosB lebontásának időbeli lefutását (és reprezentatív autoradiogramját) mutatják. Az AFosB-t átmenetileg expresszáló PC12 sejteket pulzáló-kísérleti kísérletnek vetettük alá, a CK2 inhibitor DRB jelenlétében vagy hiányában.C), a CK2 aktivátor spermin (D), vagy a H-8 széles spektrumú kináz inhibitor (E), amelyet a DRB nemspecifikus hatásainak szabályozására használtak. F, A CK2 katalitikus alegységének az AFosB stabilitására gyakorolt ​​leállításának hatása. A PC12 sejteket transzferáltuk egy nem-célzó siRNS-sel (Ctr) vagy siRNS-sel, amely a CK2a-t és 24-t célozta, amelyet később egy FosB plazmiddal transzfektáltunk. A felső panel az egész sejtes lizátumok immunoblotjait mutatja be, amelyek a CK2 siRNS hatását mutatják CK2 és ΔFosB fehérje szintekre. A megfelelő p-tubulin immunoblotját betöltő kontrollként mutatjuk be.

A CK2 AFosB-kinázként való fiziológiai jelentőségének további kezelésére két FKB-expresszáló PC12-sejtet kezeltünk két CK2-aktivitást módosító gyógyszerrel. Ahogy látható ábra 4BAz AFosB foszforilációt csökkentettük a PC12 sejtek sejt-áteresztő CK2 inhibitor DRB kezelésével.Meggio és munkatársai, 1990; Szyszka és munkatársai, 1995), és a poliamin-sperminnel történő kezeléssel megnövekedett, ami ismert, hogy hatásos CK2 aktivátor (Cochet és Chambaz, 1983; Meggio és munkatársai, 1983). Ezzel ellentétben a PC12 sejtek PKC inhibitor calphostin-C-vel történő kezelése (Kobayashi és munkatársai, 1989; Tamaoki és munkatársai, 1990) vagy a PMA aktivátor PMA (Schmidt és Hecker, 1975; Beh és munkatársai, 1989) nem eredményezett jelentős változást az AFosB foszforilációban. A PMA esetében a csekély (és nem szignifikáns) növekedés a. \ T ³²A P-ΔFosB-t a gyógyszer által előidézett összes ΔFosB-szint növekedése okozza; valójában arról számoltak be, hogy a forbol-észterek több Fos családfehérje expresszióját indukálják, beleértve a FosB-t is.Yoza és munkatársai, 1992; Suh és munkatársai, 2004). Továbbá, a sejtek specifikus sejt-áteresztő CaMKII inhibitorral m-AIP kezelése (Ishida és Fujisawa, 1995; Stevens és munkatársai, 1999) szintén nem eredményezett csökkentett AFosB foszforilációt (az adatokat nem ábrázoltuk). Ezek az eredmények együttesen összhangban vannak a mi in vitro megállapítások, és az intakt sejtekben az AFosB valószínűleg a CK2 által foszforilálódik, de nem PKC vagy CaMKII. Az a tény, hogy a CK2-gátlás nem gátolja meg teljesen az AFosB-foszforilációt, azt jelzi, hogy a proteinben további foszforilációs helyek vannak.

Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a CK2 szerepet játszik-e az AFosB forgalmában és ezáltal stabilitásában. Ebből a célból impulzuskísérleteket végeztünk a foszforilációs vizsgálatban használt CK12 inhibitorral vagy CK2 inhibitorral kezelt AFosB-expresszáló PC2 sejtekkel. Ahogy látható ábra 4Ca sejtek kezelése a CK2 inhibitor DRB-vel jelentős hatást gyakorolt ​​az ΔFosB forgalmi sebességére, amit a lebomlási görbe alakváltozása igazolt a kétfázisú és egy exponenciális bomláshoz közelebbi görbe között. Ezzel ellentétben a CK2 aktivátor spermin jelenléte az AFosB lebomlási sebességének jelentős csökkenését okozza, ami a fehérje felhalmozódásához vezetett a hajsza első órái alatt.Ábra 4D).

Mint sok kináz aktivátor és inhibitor esetében, a spermin és a DRB metabolikus hatást fejthet ki a CK2 aktivitás modulációján kívül. Valójában kimutatták, hogy a DRB gátolja a transzkripciós faktor IIH (TFIIH) -hoz kapcsolt kinázt (Yankulov és munkatársai, 1995), amely az RNS-polimeráz II-közvetített transzkripció gátlását eredményezi. Mivel ez a hatás valószínűleg befolyásolhatja az ΔFosB stabilitását, elemeztük a H-8 széles spektrumú kináz inhibitor hatását (Hidaka és Kobayashi, 1992) a ΔFosB-forgalomról olyan koncentrációban (200 μm), amelyről ismert, hogy gátolja a TFIIH-asszociált kinázt, de nem CK2 \ tYankulov és munkatársai, 1995). Ahogy látható ábra 4EA H-8-kezelés nem befolyásolta az ΔFosB forgalmi sebességét. Hasonló eredményeket kaptunk egy másik széles spektrumú kináz inhibitor H-7-sel, amelyet olyan koncentrációban alkalmaztunk, amely gátolja a TFIIH-asszociált kinázt, de nem CK2-et (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az adatok azt is alátámasztják, hogy a DRB által okozott AFosB stabilitás csökkenése valószínűleg a CK2 gátlásának tulajdonítható.

A CK2 ΔFosB-forgalomban betöltött szerepének további megállapításához megvizsgáltuk a CK2-nek az siRNS-en keresztül történő leütésének következményeit. Ezeket a kísérleteket olyan PC12 sejtekkel végeztük, amelyeket először kontroll (nontargetáló) siRNS-sel vagy siRNS-sel transzfektáltunk, amely a patkány CK2 (CK2α) katalitikus alegységének mRNS-jét célozza meg, majd később ΔFosB-vel transzfektált 24 h. Ahogy látható ábra 4F, a CK2α siRNS-sel történő transzfektálás hatékonyan és specifikusan letörölte a CK2α fehérje szinteket anélkül, hogy befolyásolná az AFosB szinteket (felső panel). A pulzus-chase-elemzés kimutatta, hogy a CK2 leütése jelentősen növelte az ΔFosB-sebességet, amint azt a fehérje gyorsabb lebomlása is bizonyítja. Az a tény, hogy a CK2-aktivitás gátlása (akár DRB-kezelés, akár siRNS-en keresztül) növeli az AFosB forgalmát, és a kétfázisú görbe lassú sebességű komponensének eltűnését eredményezi, míg a CK2 aktiválása növeli a görbe lassú fázisát, erős támogatást nyújt a az a gondolat, hogy a CK2 szerepet játszik az ΔFosB stabilitásának szabályozásában.

A CK2 foszforilálja a ΔFosB-t a Ser27-on

A CK2 által foszforilált AFosB helyszín (ek) azonosításához a CK2 által foszforilált rekombináns ΔFosB foszfo-aminosav analízisét végeztük el. in vitro és a PC12 sejtekben foszforilált AFosB. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy mindkét esetben az egyetlen detektált foszfo-aminosav foszfo-Ser (Ábra 5A). Ez a megállapítás a CK2-re kapott sztöchiometriával együtt in vitro foszforilezési reakció (∼50%) (Ábra 3B) és csak egy jelentős folt jelenléte a CK2 foszfopeptid térképen (Ábra 4A), arra utal, hogy az AFosB CK2 foszforilációja valószínűleg egyetlen szerinmaradékra korlátozódik. Ez a következtetés összhangban van a foszforilációs konszenzus helyszínelemzéssel (Ábra 2B), amely a CK27 esetében csak egy jelöltet, azaz a Ser2-et előrejelzett. A taxonómiai elemzések azt mutatták, hogy a Ser27 a Fos családtagjainak evolúciója révén erősen konzerváltÁbra 5B), ami arra utal, hogy fontos fiziológiai funkcióval rendelkezik.

Nagyobb verzió megtekintése:

• Ezen az oldalon
• Új ablakban

• Töltse le a PowerPoint Slide-t

Ábra 5.

CK2 Foszforilátok ΔFosB a Ser27-on. A, CK2-foszforilált foszfo-aminosav-analízis (in vitro) és a PC12 sejtfoszforilált AFosB, amely azt mutatja, hogy mindkét esetben a fő maradék foszforilált szerin. BA FosB / AFosB aminosav szekvencia keresztfajta-analízise a Ser27 magas megóvását tárta fel a Fos családtagok között az embertől a zebronyig (sötét fény). A CK3 konszenzus helyén szükséges + 2 pozícióban lévő savas maradék azonban nem konzerválódik (könnyű fény). CA HeLa-sejteket átmenetileg transzfektáltuk vad típusú AFosB (WT) vagy AFosB-vel, amely egy pontmutációt tartalmazott, hogy a Ser27-t Ala-val (S27A) helyettesítse. A sejteket metabolikusan jelöltük ³²PH₃PO₄ és a CK2 aktiválásához hordozóval vagy sperminnel (SP) kezeltük. A kapott AFosB immunprecipitátumok reprezentatív autoradiogramját (felső lapja) és immunoblotját (alsó paneljét) mutatjuk be. Az ál-transzfektált sejtek (vektor) immunprecipitátumát mutatjuk be.

Annak megállapítására, hogy a Ser27 foszforilálódik -AfosB-ben, ezt a maradékot Ala-ra mutáltuk, és elemeztük a fehérje foszforilációs állapotára gyakorolt ​​következményeket. Ebből a célból HeLa sejteket használtunk (amelyek nagyobb hatékonysággal transzfektálhatók), hogy átmenetileg kifejezzék a WT vagy S27A mutáns ΔFosB expresszióját. A transzfekció után körülbelül 24 óra elteltével a sejteket metabolikusan jelöltük ³²P-ortofoszfátot és egész sejt lizátumokat állítottunk elő. Az immunprecipitáció és az SDS-PAGE után ³²A P-AFosB-t autoradiográfiával és teljes AFosB-vel detektáltuk immunoblotolással. Ahogy látható ábra 5C (alsó panel), az AFosB nem volt kimutatható a vektor-transzfektált sejtekben, míg a WT vagy S27A mutáns ΔFosB-vel transzfektált sejtek sikeresen expresszálták a fehérjét. Megállapítottuk, hogy az S27A mutáció jelentős (N30%) csökkenést okozott ³²P-ΔFosB szintek (Ábra 5C, felső panel és grafikon), jelezve, hogy az élő sejtekben a ΔFosB a Ser27-on foszforilálódik. Annak érdekében, hogy megállapítsuk, hogy a Ser27 sejtekben valóban foszforilálódik-e a CK2, összehasonlítottuk a CK2 aktivátor spermin képességét a WT és S27A ΔFosB foszforilációjának modulálására. Mint korábban megfigyeltük a PC12 sejtekben (Ábra 4B), a HeLa sejtek sperminnel történő kezelése szignifikánsan megnövelte a WT fehérje foszforilációját. Az a tény, hogy ezt a hatást jelentősen csökkentette az S27A mutáció (Ábra 5C) támogatja azt az értelmezést, hogy a Ser27 az AFosB-ben egy fiziológiai szubsztrát a CK2 számára.

A Ser27 foszforilációja szabályozza az ΔFosB stabilitását

Miután megállapítottuk, hogy a CK2 aktiválásakor a CK2 gátlása és javulása csökkentette az ΔFosB stabilitásátÁbra 4), és hogy a CK2 foszforilálja a ΔFosB-t Ser27-en (Ábra 5), azt jósoltuk, hogy ennek a helynek a foszforilációjának megakadályozása destabilizálja a fehérjét. A WT- vagy S27A-mutáns ΔFosB-t tranziens módon expresszáló HeLa-sejtekkel végzett pulse-chase kísérletek azt mutatták, hogy az előre jelzett módon az S27A mutáció az AFosB lebomlási sebességének jelentős növekedését és a fehérje felezési idejének egyidejű csökkenését eredményezte. (Ábra 6A). Ezután megvizsgáltuk, hogy ez a szabályozó mechanizmus a neuronszerű PC12 sejtvonalban is előfordul-e. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy amint azt a HeLa sejtekben megfigyeltük, az S27A pontmutáció a ΔFosB felezési idejének drámai csökkenését okozza a PC12 sejtekben (∼11-tól N4 h-ig) (Ábra 6B). Az a tény, hogy ez a destabilizáció hasonló a CK2-gátlás vagy a leesés által okozotthoz (Ábra 4) további támogatást nyújt arra a gondolatra, hogy a Ser2 CK27 által közvetített foszforilációja szabályozza az ΔFosB stabilitását. További bizonyítékot kaptunk a Ser27 foszforiláció szabályozó szerepére az AFosB fehérje forgalmára foszfomimetikus Ser27-tól az Asp-mutációhoz (S27D). Az S27D mutációt foszfomimetikumnak tekintjük, mert egy nagy negatív töltésű (karboxil) csoportot helyez az 27 aminosavba, és ezáltal részben utánozza a Ser27 foszforilációját. Ahogy látható ábra 6Caz S27D mutáció az S27A mutáció ellentétes hatását okozza, és a fehérje szignifikánsan stabilabb volt, mint a WT fehérje. Hasonlóan a CK2 aktiválás után kapott hatáshoz (Ábra 4D), az S27D mutáció a felhalmozódást eredményezte, és ezáltal növelte az AFosB szinteket a hajsza első óráiban.

Nagyobb verzió megtekintése:

• Ezen az oldalon
• Új ablakban

• Töltse le a PowerPoint Slide-t

Ábra 6.

A Ser27 foszforilációja szabályozza az ΔFosB stabilitását. A, C, Pulse-chase elemzés, amely a Ser27 foszforiláció hatását mutatja az ΔFosB forgalmi sebességére. A vad típusú AFosB (WT), a Ser27 és az Ala mutáns (S27A), valamint a foszfomimetikus Ser27 és Asp mutáns (S27D) lebomlási profilját és becsült felezési idejét mutatjuk be. Ugyanezeket a megállapításokat kaptuk HeLa sejtekben (A) és PC12 sejtek (B, C).

A Ser27 foszforilációja stabilizálja az AFosB-t a proteazómális lebomlás megakadályozásával

Ahhoz, hogy a Ser27 foszforilációját stabilizálja az AFosB stabilizálása, megvizsgáljuk a proteaszóma inhibitorok MG132 képességét (Palombella és munkatársai, 1994; Tsubuki és munkatársai, 1996) és epoxomicin (Hanada és munkatársai, 1992; Kim és munkatársai, 1999) a WT és S27A mutáns ΔFosB lebontási sebességének módosítására. A pulzus-chase-kísérleteket PCTNUMX-sejtekkel végeztük, melyeket WT-t vagy S12A AFosB-t expresszáló rekombináns HSV-vel fertőzöttünk, vagy DMSO-val vagy a két proteaszóma-inhibitor egyikével kezeltük. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy bár a WT-fehérje lebomlási sebessége viszonylag érzéketlen a két proteaszóma-inhibitor egyikének jelenlétére (Ábra 7A), az S27A mutáns érzékeny ezekre a gyógyszerekre (Ábra 7B). Ez azt jelzi, hogy a WT-fehérjével ellentétben az S27A-mutáns a proteasomális lebomlás célpontja. Valóban, az MG132 vagy epoxomicin sejtek kezelése teljesen megfordította az S27A mutáció ΔFosB lebontási sebességére gyakorolt ​​hatását, amit az S27A mutáns féléletidejének növekedése in4-ról ∼9 h-re MG132 és ∼. 12 h epoxomicin esetén (Ábra 7B). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a ΔFosB foszforilációja a Ser27-en védi a proteint a proteasomális lebomlástól, és ezért elengedhetetlen a szokatlan stabilitásához.

Nagyobb verzió megtekintése:

• Ezen az oldalon
• Új ablakban

• Töltse le a PowerPoint Slide-t

Ábra 7.

A Ser27 foszforilációja stabilizálja az AFosB-t a proteazómális lebomlás megakadályozásával. A, B, Pulse-chase elemzés HSV-fertőzött PC12 sejtekkel, amely a vad típusú ΔFosB degradációs profilját és becsült felezési idejét mutatja (A) vagy S27A ΔFosB (B) két proteaszóma inhibitor [MG132 és epoxomicin (Epoxo)] hiányában vagy jelenlétében. Megjegyezzük, hogy egyik hatóanyag sem befolyásolja jelentősen a vad típusú AFosB forgalmát, míg a sejtek proteaszóma-gátlóval történő kezelése S27A ΔFosB stabilizálását eredményezte. C, A modell a Ser27 foszforiláció szerepének ΔFosB képességében a hosszú távú agyi plaszticitás közvetítésében. Az indukálást követően az AFosB egy részét az agyban stabilizálja az S2 CK27 által közvetített foszforilációja. Ez a felhalmozódását eredményezi, ami a génexpresszióban tartós változásokat eredményez. Ezek a stabil változások a génexpresszióban hozzájárulnak a stabil viselkedési adaptációkhoz. Ezzel ellentétben az S27 PP1 és / vagy PP2A szulfátos foszfatázokkal történő defoszforilációja a fehérje destabilizálását és a proteasomális gépek által történő feldolgozását eredményezi.

Előző részKövetkező szakasz

Megbeszélés

Jelen tanulmányunkban azt mutatjuk be, hogy a ΔFosB a culture10 h felezési ideje a sejttenyészetben stabil, ami a teljes hosszúságú FosB és a legtöbb más indukálható transzkripciós faktorhoz képest stabil, melynek felezési ideje a sejtkultúrában ugyanolyan rövid lehet néhány perc, és ritkán haladja meg az 3 h értéket (Hann és Eisenman, 1984; Dobrazanski és munkatársai, 1991; Roberts és Whitelaw, 1999; Ferrara és munkatársai, 2003; Hirata és munkatársai, 2004). Ezenkívül megállapítjuk, hogy az AFosB foszforilálódik az agyban, és foszforilációja érzékeny a PP1 / PP2A gátló okadainsavra. A sejttenyésztési vizsgálatok azt mutatják, hogy az AFosB stabilitását a CK2 modulálja, magasabb CK2 aktivitással stabilizálva a fehérjét. Végezetül, az eredményeink arra utalnak, hogy a CK2 foszforilálja az AFosB-t egy erősen konzervált N-terminális szerinen (S27), és bizonyítja, hogy az S27 foszforilációja megvédi az AFosB-t a proteasomális degradációtól. Ezért olyan modellt javasolunk, amely szerint a CK27 ΔFosB foszforilációja az S2-on kritikus szabályozási mechanizmusa az ΔFosB (Ábra 7C). Az AFosB ilyen foszforiláció által közvetített stabilizálása funkcionálisan fontos, mivel az AFosB megnövekedett szintjei különösen az agyi régiókban kimutatták, hogy közvetlenül szabályozzák számos neuronális gént in vivo és számos neuropszichiátriai rendellenesség állatmodelljében erőteljes viselkedési hatást fejt ki (lásd Bevezetés).

Bár a foszforiláció egy gyors és reverzibilis módja bizonyos transzkripciós faktorok, például a CREB (cAMP válaszelem kötő fehérje) transzkripciós aktivitásának szabályozására (Bohmann, 1990), a transzkripciós faktorok lebomlásának modulálása még erőteljesebb (kevésbé reverzibilis) szabályozási formát biztosít (Desterro és munkatársai, 2000). Azok a transzkripciós faktorok, amelyek funkcionális aktivitását a bomlásuk szintjén szabályozzák, az NFκB (Desterro és munkatársai, 2000), c-Myc (Sears és munkatársai, 1999) és c-Fos (Ferrara és munkatársai, 2003), többek között. Sok esetben a foszforiláció a transzkripciós faktor stabilitásának kulcsfontosságú szabályozója, amint azt a c-Fos esetében is kimutatták (Okazaki és Sagata, 1995; Tsurumi és munkatársai, 1995), Fos-rokon antigén-1 (Fra-1) (Vial és Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe és munkatársai, 2001), c-Jun (Fuchs és munkatársai, 1996), JunB (Fuchs és munkatársai, 1997), ATF2 (Fuchs és munkatársai, 2000) és p53 (Buschmann és munkatársai, 2001). Vizsgálataink így ΔFosB-t adnak a transzkripciós faktorok listájához, amelyek funkcionális aktivitását a foszforilált-függő stabilitás szabályozza.

A CK2 egy mindenütt jelen lévő és konstitutívan aktív Ser / Thr kináz, amelynek az eddig azonosított> 300 állítólagos szubsztrátja van, és több biológiai folyamatban vesz részt, beleértve a sejthalált és a túléléstLitchfield, 2003; Unger és munkatársai, 2004), sejtes stresszválaszok (Yanagawa és munkatársai, 1997; Kato és munkatársai, 2003) és a DNS-javítás és a kromatin-átalakítás (Barz és munkatársai, 2003; Krohn és munkatársai, 2003). A CK2 feltételezett szubsztrátjainak több mint egyharmada a génexpresszió szabályozásában részt vevő fehérjék (Meggio és Pinna, 2003). Valójában kimutatták, hogy a CK2 kiemelkedő nukleáris kináz (Krek és munkatársai, 1992) (felülvizsgálathoz lásd: Yu és munkatársai, 2001) és kölcsönhatásba lépnek több transzkripciós faktor bZIP doménjével (Yamaguchi és munkatársai, 1998). Kimutatták, hogy a CK2 által közvetített foszforiláció modulálja számos fehérje, köztük az IkB degradációját (akár fokozza, akár csökkenti).Schwarz és munkatársai, 1996), PTEN (Torres és Pulido, 2001), lencse connexin (Yin és munkatársai, 2000), kromatinhoz kapcsolódó fehérje HMG1 (Wisniewski és munkatársai, 1999), és több olyan transzkripciós tényező, mint a HMGB (Stemmer és munkatársai, 2002), Myf-5 (Winter és munkatársai, 1997) és c-Myc (Channavajhala és Seldin, 2002). A CK2 a leggyakoribb az agyban (Alcazar és munkatársai, 1988; Girault és munkatársai, 1990), és tevékenysége az agyfunkciók számos aspektusában érintett, beleértve a neuronális túlélést (Boehning és munkatársai, 2003), különbségtétel (Nuthall és munkatársai, 2004), ioncsatorna funkció (Jones és Yakel, 2003; Bildl és munkatársai, 2004), valamint a hosszú távú potencia és a neuronális plaszticitás (Diaz-Nido és munkatársai, 1992; Lieberman és Mody, 1999; Reikhardt és munkatársai, 2003).

Annak ellenére, hogy a CK2 szerepe a neuronális funkció szabályozásában egyre növekvő mértékben bizonyult, kevés a tudás arról, hogy mi irányítja a tevékenységét. Úgy gondolják, hogy a CK2 konstitutívan aktív, szabályozva annak képességét, hogy specifikus szubsztrátokat foszforiláljon, főként az intracelluláris lokalizáció változásaira támaszkodva (pl. Citoszol vs mag).Ahmed és Tawfic, 1994; Yu és munkatársai, 1999). Ez az információ fontos kérdést vet fel, hogy milyen jelek szükségesek az AFosB felhalmozódása az agyban a krónikus stimuláció után (Ábra 7C). Az egyik követelmény az fosB gén és az AFosB mRNS indukciója (Chen és munkatársai, 1995). Adataink azt mutatják, hogy az AFosB CK2 foszforilációja kritikus a stabilitása szempontjából, ami azt sugallja, hogy egy második jelre lehet szükség az AFosB hosszú távú hatásaira a génexpresszióra, nevezetesen egy olyan jelre, amely stimulálja a fehérje foszforilációját a CK2 által. Ez magában foglalhatja a CK2 aktiválását néhány ismeretlen mechanizmussal vagy annak áthelyezésével a magba. Alternatív módon az AFosB CK2 foszforilációja konstitutív lehet, úgyhogy az AFosB fehérje minden ingerre adott válaszként transzlálódik, ennek egy része foszforilálódik, és ezáltal stabilizálódik, így ismételt stimulálással az érintett neuronokban magas szintre halmozódik fel.

Eredményeink azt mutatják, hogy a CK2 és az S27 valószínűleg nem az egyetlen FoszB-foszforilációért felelős kináz és hely, mert sem a CK2, sem az S27A-mutáció nem tudta teljesen megakadályozni az AFosB-foszforilációt. Hasonlóképpen, az a tény, hogy az S27A mutáció a foszfo-AFosB 30% -os csökkenését eredményezi, azt állítja, hogy az S27 a fehérje fő foszforilációs helye. Mindazonáltal más, feltételezett kinázokat és foszforilációs helyeket vizsgálunk az ΔFosB-n. Végső soron fontos lesz az S27 és az AFosB bármely más foszforilációs helyének agyi foszforilációjának elemzése is. in vivo különböző típusú krónikus stimulációk után, például tömegspektrometria vagy foszfospecifikus antitestek alkalmazásával.

Amint fentebb említettük, az osFosB-ben az S27 az evolúció és más Fos családfehérjék között rendkívül konzervált. A CK2 konszenzus helyszíne azonban nem a következő: ábra 5Bcsak a FosB / AFosB (és a Zebrafish xenolog), de nem c-Fos vagy Fra-2, savas maradékot tartalmaz a + 3-on, amely a CK2 foszforiláció kulcsfontosságú meghatározója (Marin és munkatársai, 1986; Meggio és munkatársai, 1994). Tehát a CK2 foszforiláció hiánya az S27-nél magyarázhatja, hogy a többi Fos-család fehérje nem olyan stabil, mint az ΔFosB. Ez azonban nem magyarázza meg, hogy a teljes hosszúságú FosB, amely ugyanazzal a CK2 konszenzus oldallal rendelkezik, mint AFosB, nem stabilizálódik hasonlóan. Nem tudjuk, hogy a teljes hosszúságú FosB-t a CK2 foszforilálja-e ezen konzervált maradékon. A FosB egyetlen jelentéseSkinner és munkatársai, 1997) és c-Fos (Okazaki és Sagata, 1995; Chen és munkatársai, 1996) a foszforiláció leírja a fehérjék C-terminális régiójában lévő helyeket, amelyek hiányoznak az ΔFosB-ben. A teljes hosszúságú FosB és más Fos családfehérjék CK2 által történő lehetséges foszforilációja közvetlen vizsgálatot igényel. Azonban, még ha foszforiláltak is, a többi Fos családfehérje ismert, hogy C-terminálisukban olyan motívumokat tartalmaz, amelyek a fehérjéket a gyors lebomlásra irányítják (Papavassiliou és munkatársai, 1992; Jariel-Encontre és munkatársai, 1997; Acquaviva és munkatársai, 2002). Például kimutatták, hogy az összes Fos családfehérje C-terminálisában jelenlévő ∼21-csoportok szakaszai, de ΔFosB-ben hiányoznak, a c-Fos destabilizáló doménje (Acquaviva és munkatársai, 2001). Azt találtuk, hogy bár ez a sorrend hasonlóan destabilizálja a teljes hosszúságú FosB-t (Carle és munkatársai, 2004), a tartomány hiánya az ΔFosB-ben nem veszi figyelembe teljes mértékben a stabilizációját. Ehelyett a C-terminális domén és a Ser27-foszforiláció hiányának kombinációja teljes mértékben figyelembe veszi az ΔFosB és a FosB közötti stabilitás körülbelül ötszeres különbségét.

Bár a Fos családfehérjék lebomlása összetett és nem teljesen tisztázott, a proteasomális lebomlás az érintett fő útnak tűnik (Salvat és munkatársai, 1999; Acquaviva és munkatársai, 2002; Ferrara és munkatársai, 2003). Az itt bemutatott adatok, amelyekben a proteasom inhibitorok nem változtatják meg jelentősen az AFosB degradáció sebességét, azzal érvelnek, hogy a többi Fos család fehérjével ellentétben az AFosB kiküszöböli az 26S proteaszómát, és ez központi szerepet játszik a stabilizálásában. Ezért olyan rendszert javasolunk, amelyben az AFosB fokozott stabilitása két fő tényező kombinációjának tulajdonítható: (1) a C-terminális destabilizáló domén hiánya és (2) az S27 foszforilációja a CK2 által.

Összefoglalva, a jelen tanulmány mechanikus betekintést nyújt arra vonatkozóan, hogy az AFosB, a közvetlen korai gén terméke fosB, az összes többi Fos családtagtól eltérően viszonylag hosszú életű fehérje. Bár más Fos családfehérjékről úgy gondolják, hogy közvetítik a gyors, de átmeneti stimulus-transzkripciós kapcsolást (Morgan és Curran, 1995), az ΔFosB relatív stabilitása lehetővé teszi a krónikus stimuláció által indukált hosszabb ideig tartó transzkripciós változások közvetítését. Ez alátámasztja azt a nézetet, hogy az ΔFosB tartós molekuláris kapcsolóként működik az agyban, fokozatosan átalakítva az akut válaszokat krónikus adaptációvá. A Ser27-foszforiláció azonosítása az AFosB stabilitásának központi mechanizmusaként új utakat nyit meg az ΔFosB funkciójának szabályozására szolgáló eszközök kifejlesztéséhez, és ezáltal a neurális és viselkedési plaszticitás hosszú távú hatásainak modulálásához.

Előző részKövetkező szakasz

Lábjegyzetek

• Kapott november 21, 2005.
• A felülvizsgálat február 21, 2006.
• Elfogadott április 2, 2006.

• Ezt a munkát támogatta a PGU-nak, a PGU Országos Gyógyszerhasználati Intézetének (NIDA), a PGU-nak adott nemzeti szövetség, a skizofrénia és depresszió fiatal kutatói díjazása, valamint az Országos Mentális Egészségügyi Intézet és a NIDA az EJN-nek. köszönöm Dr. James Bibbnek a segítségét in vitro foszforilációs vizsgálatok, Dr. Ming-Hu Han segítségére az anyagcsere-jelöléshez használt agyszeletek elkészítéséhez, és Dr. Rachael Neve a rekombináns HSV-k csomagolásához nyújtott segítségért.
• G. Rudenko jelenlegi címe: Élettudományi Intézet és Farmakológiai Tanszék, Michigani Egyetem, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
• A levelezést Eric J. Nestler, az 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070 címre kell címezni. Email: [e-mail védett]

Előző rész

Referenciák

1. ↵

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) C-terminális tripeptid motívum azonosítása a c-Fos proto-onkoprotein gyors protea-merális lebomlásának szabályozásában a G (0) -S-fázisátmenet során. Onkogén 20:7563-7572.

CrossRefMedline

2. ↵

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) A Fos családi fehérjék többszörös lebomlási útja. Ann NY Acad Sci 973:426-434.

Medline

3. ↵

Ahmed K, Tawfic S (1994) A protein-kináz intracelluláris szabályozásának mechanizmusa CK2: az inger által közvetített szubnukleáris szövetség szerepe. Cell Mol Biol Res 40:539-545.

Medline

4. ↵

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) A kazein-kináz II javítása az agyból. Neurochem Res 13:829-836.

CrossRefMedline

5. ↵

Andersson M., Westin JE, Cenci MA (2003) A striatális DeltaFosB-szerű immunreaktivitás és prodinorphin mRNS-ek időbeli lefolyása a krónikus dopaminomimetikus kezelés abbahagyása után. Eur J Neurosci 17:661-666.

CrossRefMedline

6. ↵

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) A genomra kiterjedő expressziós képernyők a protein-kináz CK2 globális szerepét mutatják a kromatin átalakításában. J Cell Sci 116:1563-1577.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

7. ↵

Beh I., Schmidt R, Hecker E (1989) A HL-60 sejtekben található két PKC izoenzim különbséget mutat a TPA forbolészter aktiválásában. FEBS Lett 249:264-266.

Medline

8. ↵

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) A CK2 fehérje kináz kis vezetőképességű Ca (2 +) - aktivált K + csatornákkal van összeszerelve, és szabályozza a csatornázást. Neuron 43:847-858.

CrossRefMedline

9. ↵

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) A Fos-hoz kapcsolódó antigén hosszú távú expressziója és a delta FosB átmeneti expressziója a patkány hippocampus és striatum görcsrohamokkal összefüggésben. J Neurochem 68:272-279.

Medline

10. ↵

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) A fehérjék aminosav-szekvenciából történő transzlációs glikozilezésének és foszforilációjának előrejelzése. proteomikai 4:1633-1649.

CrossRefMedline

11. ↵

Boehning D, Hold C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) A hem oxigenáz-2 CK2 foszforilációja által aktivált szén-monoxid neurotranszmisszió. Neuron 40:129-137.

CrossRefMedline

12. ↵

Bohmann D (1990) Transzkripciós faktor foszforiláció: a jelátvitel és a génexpresszió szabályozása közötti kapcsolat. Ráksejtek 2:337-344.

Medline

13. ↵

Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) A p2 júniusi NH53-terminális kináz foszforilációja a Thr-81-nál fontos a stresszre adott válaszként a p53 stabilizáció és transzkripciós aktivitás szempontjából. Mol Cell Biol 21:2743-2754.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

14. ↵

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) A konzervált Fos család C-terminális domének hiánya hozzájárul a deltaFosB egyedülálló stabilitásához. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

15. ↵

Channavajhala P, Seldin DC (2002) A protein-kináz CK2 és c-Myc funkcionális kölcsönhatása a lymphomagenesisben. Onkogén 21:5280-5288.

CrossRefMedline

16. ↵

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) A delta FosB és FosB-szerű fehérjék szabályozása elektrokonvulzív roham és kokainkezeléssel. Mol Pharmacol 48:880-889.

Absztrakt

17. ↵

Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Krónikus Fos-hoz kapcsolódó antigének: az AFosB stabil variánsai az agyban krónikus kezelésekkel indukálva. J Neurosci 17:4933-4941.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

18. ↵

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) A c-Fos foszforilációja a C-terminálison fokozza a transzformáló aktivitását. Onkogén 12:1493-1502.

Medline

19. ↵

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Az 1 / 2A fehérje foszfatáz gátló okadainsav növeli a CREB és az Elk-1 foszforilációját és c-fos expresszióját a patkány striatumban in vivo. J Neurochem 89:383-390.

CrossRefMedline

20. ↵

Cochet C, Chambaz EM (1983) Poliamin által közvetített fehérje-foszforilációk: az intracelluláris poliamin hatás lehetséges célpontja. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.

CrossRefMedline

21. ↵

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) A szarvasmarha tüdőszövetéből származó, nagy tisztaságú G-típusú kazein-kináz katalitikus és molekuláris tulajdonságai. Biochim Biophys Acta 743:1-12.

Medline

22. ↵

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) A DeltaFosB striatális sejttípus-specifikus túlexpressziója fokozza a kokain ösztönzését. J Neurosci 23:2488-2493.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

23. ↵

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) A kokain önadagolása növeli a preprodynorint, de nem c-fos, mRNS-t patkány striatumban. Neuro 4:543-546.

Medline

24. ↵

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) A transzkripciós faktorok szabályozása fehérje lebomlásával. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.

CrossRefMedline

25. ↵

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J. (1992) A citoplazmatikus kazein-kináz II-típusú aktivitás növekedése a NI-103 neuroblasztóma sejtekben a DNS-szintézis gátlása után a neuritok növekedésével jár. J Neurochem 58:1820-1828.

Medline

26. ↵

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) A CK2 fehérje-kináz foszforilálja és felemeli az Akt / PKB-t. Cell Death különbség 12:668-677.

CrossRefMedline

27. ↵

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) A foszB gén mindkét terméke, a FosB és a rövid formája, a FosB / SF, a fibroblasztok transzkripciós aktivátorai. Mol Cell Biol 11:5470-5478.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

28. ↵

Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) A c-Fos fehérje proteasomális lebomlásáért felelős strukturális determinánsok az expressziós feltételek szerint különböznek. Onkogén 22:1461-1474.

CrossRefMedline

29. ↵

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) A c-Jun ubiquitináció foszforilációfüggő célzása június N-kinázzal. Onkogén 13:1531-1535.

Medline

30. ↵

Fuchs SY, Xie B, Adler V., Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminális kinázok a hozzájuk tartozó transzkripciós faktorok ubiquitinációját célozzák. J. Biol. Chem 272:32163-32168.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

31. ↵

Fuchs SY, I. Tappin, Ronai Z (2000) Az ATF2 transzkripciós faktor stabilitását a foszforiláció és a defoszforiláció szabályozza. J. Biol. Chem 275:12560-12564.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

32. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) DARPP-32, egy dopamin- és cAMP-szabályozott foszfoprotein foszforilációja kazein-kináz II-vel. J. Biol. Chem 264:21748-21759.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

33. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) A kazein-kináz II-vel azonos DARPP-32-szerin kináz emlős-agyában történő jellemzése. J Neurochem 55:1772-1783.

Medline

34. ↵

Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, egy új mikrobiális eredetű tumorellenes szer. J Antibiot (Tokió) 45:1746-1752.

Medline

35. ↵

Hann SR, Eisenman RN (1984) A humán c-myc onkogén által kódolt fehérjék: differenciális expresszió a neoplasztikus sejtekben. Mol Cell Biol 4:2486-2497.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

36. ↵

Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, ciklikus AMP-szabályozott foszfoprotein (Mr = 21,000), dopamin-beidegzett agyrégiókban dúsítva. A helyén az aminosav-szekvencia ciklikus AMP-vel foszforilálódik intakt sejtekben és kinetikai vizsgálatai a foszforilációról in vitro. J. Biol. Chem 264:7726-7733.

37. ↵

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) A protein-kináz inhibitorok farmakológiája. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.

CrossRefMedline

38. ↵

Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) A Hes7 fehérje instabilitása döntő fontosságú a somitszegmentációs óra számára. Nat Genet 36:750-754.

CrossRefMedline

39. ↵

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Az atípusos és tipikus neuroleptikus kezelések különböző transzkripciós faktor expressziós programokat indukálnak a striatumban. J Comp Neurol 374:70-83.

CrossRefMedline

40. ↵

Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Azonnali korai génexpresszió és AP-1 kötődés szabályozása a patkánymagban krónikus kokain hatására. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

41. ↵

Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) A krónikus elektrokonvulzív rohamok (ECS) kezelése egy hosszan tartó AP-1 komplex kifejeződését eredményezi a megváltozott összetételű és jellemző tulajdonságú agyban. J Neurosci 14:4318-4328.

Absztrakt

42. ↵

Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, IJadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Egy hosszú ideig tartó AP-1-komplex kialakulása, amely az agyban megváltozott Fos-szerű fehérjékből áll, krónikus kokain és más krónikus kezelések révén. Neuron 13:1235-1244.

CrossRefMedline

43. ↵

Ishida A, Fujisawa H (1995) A kalmodulin-függő protein kináz II stabilizálása az autoinhibitor doménen keresztül. J. Biol. Chem 270:2163-2170.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

44. ↵

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) A c-fos és a c-jun degradáció komplex mechanizmusai. Mol Biol Rep 24:51-56.

CrossRefMedline

45. ↵

Jones S, Yakel JL (2003) A kazein-kináz ii (ck2 fehérje-kináz) szabályozza a szerotonin 5-ht (3) receptor csatorna funkcióját az ng108 – 15 sejtekben. Neuroscience 119:629-634.

CrossRefMedline

46. ↵

Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) A CK2 egy C-terminális IkappaB-kináz, amely az UV-válasz során az NF-kappaB aktiválásáért felelős. Mol Cell 12:829-839.

CrossRefMedline

47. ↵

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) A deltaFosB transzkripciós faktor expressziója az agyban szabályozza a kokain érzékenységét. Természet 401:272-276.

CrossRefMedline

48. ↵

Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) A proteazóma gátlása az epoxomicin és a dihidroeponemicin természetes termékei által: a specifitás és a hatásosság betekintése. Bioorg Med Chem. Lett 9:3335-3340.

CrossRefMedline

49. ↵

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) A calphostin C (UCN-1028C), egy új mikrobiális vegyület, egy nagyon erős és specifikus protein-kináz C inhibitor. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.

CrossRefMedline

50. ↵

Krek W, G folyosó, Nigg EA (1992) A kazein-kináz II elsősorban nukleáris enzim. J Cell Biol 116:43-55.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

51. ↵

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) A CK2 fehérje kináz foszforilálja az SSRP1 nagy mobilitású csoport domén fehérjét, ami az UV-károsodott DNS felismerését indukálja. J. Biol. Chem 278:12710-12715.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

52. ↵

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Önálló DW, Nestler EJ (2005) A kromatin-átalakítás a kokain által kiváltott plaszticitás egyik legfontosabb mechanizmusa a striatumban. Neuron 48:303-314.

CrossRefMedline

53. ↵

Lieberman DN, Mody I (1999) A kazein-kináz-II szabályozza az NMDA-csatorna funkciót a hippokampális neuronokban. Nat Neurosci 2:125-132.

CrossRefMedline

54. ↵

Litchfield DW (2003) Protein kináz CK2: szerkezet, szabályozás és szerep az élet és halál sejtes döntéseiben. Biochem J 369:1-15.

CrossRefMedline

55. ↵

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) N-metil- által expresszált c-foszfehérje lebomlásad-aspartinsav egér hippocampus nukleáris frakcióiban. Brain Res 905:34-43.

Medline

56. ↵

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) A kakainsavval kezelt fosB null egerekben az állandóan megnövekedett 37 kDa-foszfáthoz kapcsolódó antigén és AP-1-szerű DNS-kötő aktivitás hiánya. J Neurosci 17:5407-5415.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

57. ↵

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) A kazein-kináz-2 (TS) helyének specifitása patkány máj citoszolból. Vizsgálat modell peptid szubsztrátokkal. Eur J Biochem 160:239-244.

58. ↵

McClung CA, Nestler EJ (2003) A génexpresszió és a kokain jutalom szabályozása a CREB és a DeltaFosB által. Nat Neurosci 6:1208-1215.

CrossRefMedline

59. ↵

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: molekuláris kapcsoló az agy hosszú távú alkalmazkodásához. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.

Medline

60. ↵

Meggio F, Pinna LA (2003) A CK2 fehérje-kináz egyezer és egy szubsztrátja? FASEB J 17:349-368.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

61. ↵

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) A kazeinfrakciók foszforilezése patkánymáj „foszvitin-kináz” segítségével. FEBS Lett 75:192-196.

Medline

62. ↵

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) 2 típusú kazein kináz TS autofoszforilációja mind az alfa-, mind a béta-alegységekben. A különböző effektorok hatása. FEBS Lett 160:203-208.

CrossRefMedline

63. ↵

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) A ribofuranozil-benzimidazol-származékok a kazein-kináz-2 és a kazein-kináz-1 inhibitorai. Eur J Biochem 187:89-94.

Medline

64. ↵

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) CK2 fehérje-kináz szubsztrátspecifitása. Cell Mol Biol Res 40:401-409.

Medline

65. ↵

Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) A ciklooxigenáz-2 gén transzkripciós indukciója a foszfatázaktivitás okadainsav gátlásával humán kondrocitákban: AP-1 és CRE nukleáris kötő fehérjék ko-stimulációja. J Cell Biochem 69:392-413.

CrossRefMedline

66. ↵

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Hálózati szintű változások az indukálható Fos-Jun fehérjék expressziójában a striatumban a krónikus kokain kezelés és visszavonás során. Neuron 17:147-156.

CrossRefMedline

67. ↵

Morgan JI, Curran T (1995) Azonnali korai gének: tíz évvel később. Trendek Neurosci 18:66-67.

CrossRefMedline

68. ↵

Nakabeppu Y, Nathans D. (1991) A FosB természetesen előforduló csonkított formája, amely gátolja a Fos / Jun transzkripciós aktivitást. Sejt 64:751-759.

CrossRefMedline

69. ↵

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: tartós molekuláris kapcsoló a függőséghez. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

70. ↵

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) A glutamát receptor alegység 1 bevezetése a motoros neuronokba in vitro és in vivo rekombináns herpesz szimplex vírus alkalmazásával. Neuroscience 79:435-447.

CrossRefMedline

71. ↵

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) A Groucho / TLE239 szerin 1-foszforilációja protein-kináz CK2 által fontos a neuronális differenciálódás gátlásához. Mol Cell Biol 24:8395-8407.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

72. ↵

Okazaki K, Sagata N (1995) A Mos / MAP kináz útvonal stabilizálja a c-Fos-t foszforilációval és növeli transzformációs aktivitását az NIH 3T3 sejtekben. EMBO J 14:5048-5059.

Medline

73. ↵

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Az ubiquitin-proteaszóma útvonal az NF-kappa B1 prekurzor fehérje feldolgozásához és az NF-kappa B aktiválásához szükséges. Sejt 78:773-785.

CrossRefMedline

74. ↵

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D. (1992) A c-Fos, de nem v-Fos célzott lebomlása egy c-Jun foszforiláció-függő jel által. Tudomány 258:1941-1944.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

75. ↵

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) A c-Jun domináns negatív mutánsának indukálható, agyi régióspecifikus expressziója a transzgenikus egerekben csökkenti a kokain érzékenységét. Brain Res 970:73-86.

CrossRefMedline

76. ↵

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) DeltaFosB indukálása a jutalmú agyi struktúrákban a krónikus stressz után. J Neurosci 24:10594-10602.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

77. ↵

Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Agy transzkripciós faktor expresszió: az akut és krónikus amfetamin és az injekciós stressz hatása. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.

Medline

78. ↵

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Post-transzlációs módosítás: foszforiláció és foszfatázok. In: Aktuális protokollok a fehérje-tudományban (Dunn BM, szerk.) Pp. 13.01-13.02. New York: Wiley és Sons.

79. ↵

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D., Kinzel V. (1987) A II. Típusú, nagy tisztaságú foszvitin / kazein-kináz katalitikus és molekuláris tulajdonságai a humán epiteliális sejtekből a tenyészetben (HeLa) és a ecto protein kinázhoz viszonyítva. Biol. Chem. Hoppe Seyler 368:215-227.

Medline

80. ↵

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) A „protein kináz CK2-HMG14” rendszer állapota patkányokban az életkorral kapcsolatos amnézia esetén. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.

Medline

81. ↵

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Az alapvető hélix-loop-hélix / Per-ARNT-Sim homológia domén dioxin receptor lebomlása az ubiquitin / proteaszóma útvonalon. J. Biol. Chem 274:36351-36356.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

82. ↵

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) A PredictProtein szerver. Nucleic Acids Res 32:W321-W326.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

83. ↵

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 célpontok az agyban. Első Biosci 9:8-23.

CrossRefMedline

84. ↵

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) A rekombináns egér adenozin-kináz molekuláris jellemzése és az értékelés mint a fehérje-foszforiláció célpontja. Eur J Biochem 271:3547-3555.

Medline

85. ↵

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Vannak-e több proteolitikus útvonal, amelyek hozzájárulnak a c-Fos, c-Jun és p53 fehérje lebomlásához in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.

CrossRefMedline

86. ↵

Schmidt R, Hecker E. (1975) A forbolészterek normál tárolási körülmények között történő autoxidálása. Cancer Res 35:1375-1377.

INGYENES teljes szöveg

87. ↵

Schwarz EM, Van Antwerp D., Verma IM (1996) Az IkappaBalpha konstitutív foszforilációja a kazein-kináz II-vel előnyösen a szerin 293-on történik: a szabad IkappaBalpha degradációjának követelménye. Mol Cell Biol 16:3554-3559.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

88. ↵

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras fokozza a Myc fehérje stabilitását. Mol Cell 3:169-179.

CrossRefMedline

89. ↵

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) A Rhodnius prolixus oocitákból tisztított II kazein kináz ciklikus nukleotid-független foszforilációja. Rovar Biochem Mol Biol 32:847-857.

CrossRefMedline

90. ↵

Skinner M, Qu S, Moore C, Bölcsesség R (1997) A FosB fehérje transzkripciós aktiválása és transzformációja a karboxil-terminális aktivációs domén foszforilezését igényli. Mol Cell Biol 17:2372-2380.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

91. ↵

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) A CK2 fehérje-kináz differenciáltan foszforilálja a kukorica kromoszóma-nagy mobilitású B-csoport (HMGB) fehérjéit, módosítva stabilitását és DNS-kölcsönhatásait. J. Biol. Chem 277:1092-1098.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

92. ↵

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) A cyk, egy ciklin B2 kináz, mint új kalcium / kalmodulin-függő protein kináz II azonosítása és szerepe a Xenopus laevis oocita érése során. Exp Cell Res 252:303-318.

CrossRefMedline

93. ↵

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) C-fos és c-jun génexpresszió szabályozása lipopoliszachariddal és citokinekkel primer tenyésztett asztrocitákban: PKA és PKC útvonalak hatása. Arch Pharm Res 27:396-401.

Medline

94. ↵

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) A riboszóma savas fehérjék élesztősejtből történő differenciált foszforilációja két endogén protein kinázzal: kazein-kináz-2 és 60S kináz. Acta Biochim Pol 42:357-362.

Medline

95. ↵

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) és a calphostin-rokon vegyületek, a protein-kináz C specifikus és hatékony inhibitorainak új osztálya. Adv Második Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.

Medline

96. ↵

Torres J, Pulido R (2001) A PTEN tumorszuppresszort a CK2 fehérje-kináz foszforilálja a C-terminálisán. A PTEN stabilitásának a proteaszóma által közvetített lebomlásra gyakorolt ​​hatása. J. Biol. Chem 276:993-998.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

97. ↵

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) A calpain és a proteaszóma aktivitásának differenciális gátlása di-leucin és tri-leucin peptidil-aldehidjeivel. J Biochem (Tokió) 119:572-576.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

98. ↵

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) A c-Fos által a 26S proteaszóma által okozott degradációt a c-Jun és több protein kináz gyorsítja. Mol Cell Biol 15:5682-5687.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

99. ↵

Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) A CK2 fehérje kináz mint a sejtek túlélésének szabályozója: a rákterápiára gyakorolt ​​hatás. Curr Cancer Drug Targets 4:77-84.

CrossRefMedline

100. ↵

Vial E, Marshall CJ (2003) A megnövekedett ERK-MAP kináz aktivitás megvédi az FOS család FRA-1 családtagját a vastagbélrákos sejtekben a proteasomális lebomlás ellen. J Cell Sci 116:4957-4963.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

101. ↵

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) A ΔFosB szabályozza a kerék futását. J Neurosci 22:8133-8138.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

102. ↵

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) A transzkripciós faktor funkciójának szabályozása foszforilációval. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.

CrossRefMedline

103. ↵

Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Két feltételezett protein-kináz CK2 foszforilációs hely fontos a Myf-5 aktivitás szempontjából. Biol Chem 378:1445-1456.

Medline

104. ↵

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) A 1 fehérjék magas mobilitású csoportjának savas farok konstitutív foszforilációja a kazein-kináz II-vel megváltoztatja konformációjukat, stabilitását és DNS-kötődési specificitását. J. Biol. Chem 274:20116-20122.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

105. ↵

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) A kazein-kináz II kölcsönhatásba lép számos transzkripciós faktor bZIP doménjével. Nucleic Acids Res 26:3854-3861.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

106. ↵

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Az A170 stresszfehérje foszforilációja a kazein-kináz II-szerű aktivitással a makrofágokban. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.

CrossRefMedline

107. ↵

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) A transzkripciós elongációs inhibitor 5,6-diklór-1-beta-d-ribofuranozil-benzimidazol gátolja a transzkripciós faktor IIH-hoz kapcsolódó protein-kinázt. J. Biol. Chem 270:23922-23925.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

108. ↵

Yen J, Bölcsesség RM, Tratner I, Verma IM (1991) A FosB alternatív spliced ​​formája a transzkripciós aktiválás és a Fos fehérjék transzformációjának negatív szabályozója. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

109. ↵

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) A kazein-kináz II foszforilálja a lencse connexin 45.6-et és részt vesz annak lebomlásában. J. Biol. Chem 275:6850-6856.

Absztrakt / ingyenes teljes szöveg

110. ↵

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Az AP-1 transzkripciós faktor komponensek indukálása az interleukin 1 és a forbol-észterek által T-sejt aktiválás során. A sejtek növekedése különbözik 3:677-684.

Absztrakt

111. ↵

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) A CK2 jelzés következményei a nukleáris mátrixra. Mol Cell Biochem 227:67-71.

CrossRefMedline

112. ↵

Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) A CK2 fehérje-kináz differenciális célzása a nukleáris mátrixra alegységei átmeneti túltermelésével. J Cell Biochem 74:127-134.

CrossRefMedline

113. ↵

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: az ΔFosB lényeges szerepe a morfin hatású magban. Nat Neurosci 9:205-211.

CrossRefMedline

A cikket idéző ​​cikkek

• A krónikus kokain viselkedési és szerkezeti válaszai A {Delta} FosB és a kalcium / kalmodulin-függő fehérje kináz II táplálékirányú hurkot igényel a Nucleus Accumbens Shellben Journal of Neuroscience, 6 március 2013, 33(10):4295-4307
  • Absztrakt
  • Teljes szöveg
  • Teljes szöveg (PDF)
• A {Delta} FozB Striatus túlzott expressziója Krónikus Levodopa által kiváltott akaratlan mozgásokat reprodukál Journal of Neuroscience, 26 május 2010, 30(21):7335-7343
• Absztrakt
• Teljes szöveg
• Teljes szöveg (PDF)
• Absztrakt
• Teljes szöveg
• Teljes szöveg (PDF)
• Absztrakt
• Teljes szöveg
• Teljes szöveg (PDF)
• Absztrakt
• Teljes szöveg
• Teljes szöveg (PDF)
• A függőség transzkripciós mechanizmusai: a {Delta} FosB szerepe A Royal Society B filozófiai tranzakciói: Biológiai tudományok, 12 október 2008, 363(1507):3245-3255
• Tartós sebezhetőség a metamfetamin kereső viselkedés visszaállítására a glia sejtvonalból származó neurotróf faktor mutáns egerekben A FASEB Journal, 1 július 2007, 21(9):1994-2004
• Az aktivátor fehérje-1 transzkripciós faktor a légzési epithelium karcinogenezisében Molekuláris rákkutatás, 1 február 2007, 5(2):109-120