Proc Natl Acad Sci USA, április 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Publikálva online április 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a és a Shigetada Nakanishia,1
Ez a cikk már idézett egyéb cikkek a PMC-ben.
Jelentősége
A ventrális faktormentális dopamin (DA) idegsejtek (VTA) az averszív ingerekre többnyire átmeneti némítás útján reagálnak. Nem tisztázott, hogy ez a reakció közvetlenül riasztó válaszokat indukál-e viselkedő egerekben. Megvizsgáltuk ezt a kérdést a VTA DA idegsejtjeinek optogenetikus irányításával és megállapítottuk, hogy a DA neuronok inaktiválása riasztó választ és tanulást eredményez. A nucleus activum (NAc), a VTA DA idegsejtek legfontosabb kimeneti atommagjainak, felelősnek tekintették ezt a választ, ezért a D1 vagy a D2 receptor leütésének felhasználásával megvizsgáltuk, hogy az NAc melyik alapvető útvonala volt kritikus e viselkedés szempontjából. és megállapította, hogy a D2 receptor-specifikus útvonal döntő jelentőségű ebben a viselkedésben.
Absztrakt
A dopamin (DA) transzmissziója a ventrális faktormentális területről (VTA) kritikus fontosságú mind a jutalmazás, mind a riasztó magatartás szabályozásához. A DA idegsejtek átmeneti elnémítása az egyik válasz az agresszív ingerekre, ám annak következményei és idegmechanizmusai az averz válaszok és a tanulás vonatkozásában nagyrészt továbbra is megfigyelhetetlenek.. Itt, beszámolunk arról, hogy a VTA DA idegsejtek optogenetikus inaktiválása azonnal csökkentette a DA szinteket és indukálta a neuron aktivitás felfokozódását a nucleus activumban (NAc)) a Fos expresszióval értékelve. Ta DA idegsejt tüzelésének optogenetikus elnyomása azonnal riasztó válaszokat váltott ki az előzőleg preferált sötét helyiségben, és az optogenetikailag kondicionált hely felé fordító tanulást eredményezett. Fontos szempont, hogy ezt a helytelenséget a dopamin D2 receptorok megsemmisítése szüntette meg, de nem az NAc D1 receptorok ellen.. A DA neuronok elhallgatása a VTA-ban tehát elengedhetetlen az averzív reakciók kiváltásához és a NAc dopamin D2 receptorokon keresztüli tanulásához.
A mezolimbikus dopaminerg rendszer nemcsak kulcsszerepet játszik a motiváció és a tanulás széles körében (1-3), de működési zavara súlyos neuropszichiátriai rendellenességekben is szerepet játszik, mint például a Parkinson-kór, a skizofrénia és a kábítószer-függőség. A ventrális testmental dopamin (DA) idegsejtek a jutalmazási ingerekre fázisos égetéssel reagálnak, és ennek a tüzelésnek a fő funkciója az, hogy „a jutalom előrejelzési hibáját” kódolja az előrejelzett jutalom és a tényleges jutalom (4). A jutalmazó ingerekre adott válaszokkal ellentétben az averz stimulusokra adott reakcióik messze nem homológok; Vagyis néhány DA idegrendszer az agresszív ingerekre válaszul aktiválódik, míg mások többsége úgy reagál, hogy átmenetileg elnyomja tüzet (5-9). Valójában a közelmúltbeli tanulmányok kimutatták, hogy a GABAergic neuronok optogenetikus aktiválása és a DA neuronok ebből fakadó inaktiválása elnyomja a jutalomfogyasztást, és riasztó választ vált ki (10, 11). Ugyanakkor nagyjából nem tudom megtudni, hogy az idegi áramkörök melyik mechanizmusai nélkülözhetetlenek az averzív tanulás megszerzéséhez, amikor a DA neuronok inaktiválódnak a VTA-ban, és hogyan lehet a viselkedési válaszokat irányítani a jutalomfogyasztás visszaszorítása és az ellentétes viselkedés indukálása érdekében.
A felhalmozott bizonyítékok feltárták, hogy a pozitív és negatív ingerekre adott válaszként a motivációs és kognitív tanulást nagyrészt az idegi áramkörök szabályozzák, beleértve a bazális ganglionokat is.12), amelyek nagy mennyiségű dopaminerg vetületet kapnak a középső agyból. A striatumban két alapvető idegi áramkört meghatározott közepes méretű tüskés idegsejtek (MSN) alkotnak, amelyek mindegyike különféle DA receptorokat expresszál (13).
- Az egyik áramkör a közvetlen útvonal, amely az alapvető ganglionok kimeneti magjaihoz közvetlenül kiálló MSN-kből áll, a jusia nigra pars reticulata (SNr) és túlnyomórészt dopamin D1 receptorokat (D1R) expresszálnak..
- A másik az indirekt útvonal, amely az MSN-ekből áll, amelyek a globus palliduson keresztül közvetetten az SNr-hez jutnak, és elsősorban dopamin D2 receptorokat (D2R) expresszálnak.
A középagyból érkező DA jelek dinamikusan modulálják ezt a két párhuzamos pályát ellentétes módon a D1R-eken és a D2R-eken keresztül, és ez a moduláció állítólag elősegíti a motivációs tanulást (3, 14).
- Ami a jutalmazó ingereket illeti, a jutalmazó jelek által kiváltott, felfelé szabályozott DA szintek úgy vélik, hogy aktiválják a D1R-eket, és így túlnyomórészt elősegítik a közvetlen utat a nucleus accumbensben (NAc)..
- Másrészt, az averzív ingerekre adott válaszként a DA neuronok tüzelésének elnyomása csökkenti a DA-szintet a NAc-ben; és ez a reakció állítólag specifikusan elősegíti a jelátvitelt a közvetett úton, aktivált D2R-eken keresztül.
Bár a farmakológiai stratégiákat és a reverzibilis neurotranszmissziós blokkoló (RNB) módszert alkalmazó tanulmányok alátámasztották ezt a szabályozási mechanizmust a NAc-ben.15, 16), továbbra is ismeretlen maradt, hogy a DA neuronok tüzelésének elnyomása elegendő-e az indirekt útvonal aktivitásának elősegítéséhez, és ezt követően az elkerülő viselkedés indukálásához. Ebben a tanulmányban ezzel a kérdéssel foglalkoztunk a VTA-ban lévő DA neuronok szelektív inaktiválásával a membrán-hiperpolarizáló Arch fehérje optogenetikai manipulálásával (17), és egyértelműen kimutatta, hogy a DA neuronok elnyomása a VTA-ban ezt követően csökkentette a DA-szintet a NAc-ben, és averzív reakciót és tanulást váltott ki. Ezenkívül megvizsgáltuk ennek a reakciónak a szabályozásának mechanizmusait, és feltártuk, hogy ezt az averzív reakciót specifikusan a NAc-ben lévő D2R-ek szabályozzák.
Eredmények
A DA neuronok optogenetikai inaktiválása blokkolja a sötét szoba preferenciáját.
A DA idegsejtek tüzelésének szelektív inaktiválásához Cre-indukálható adeno-asszociált víruskonstrukciót injektáltunk Arch-eGFP-t [AAV-kettős fluxusú fordított nyitott leolvasási keret (DIO) -Arch] (17) egyoldalúan a felnőtt tirozin-hidroxiláz (TH) -Cre egerek VTA-ba18) és vad típusú (WT) alomtársakkal, és a VTA (S1 A és a C). Két héttel a műtét után az Arch-eGFP-t korlátozottan kimutatták a VTA-ban (S1B). Az Arch fehérje hiperpolarizáló hatását elektrofiziológiai felvételekkel teszteltük és megmértük az AAV-DIO-Arch-nal injektált TH-Cre egerek VTA optikai stimulációjának hatását. Az érzéstelenített TH-Cre egerek in vivo elektrofiziológiai felvételéből kiderült, hogy a feltételezett DA idegsejtek optikai stimulálása gátolja a tüzelésüket (S2), jelezve, hogy az optikai stimuláció megfelelően hiperpolarizálta az Arch-t expresszáló DA-sejtek membránpotenciálját, és így gátolja azok spontán kiürülését.
Ezen egerek felhasználásával megvizsgáltuk, hogy a DA neuronok optikai inaktiválása a VTA-ban riasztó jelként szolgálhat-e a viselkedés megtanulásához. Az egereknek veleszületett hajlandósága a sötét környezet kedvelése (19). Olyan viselkedési eszközt terveztünk, amelyben az egerek szabadon felfedezhetik a sötét szobát és megnyithatják a világos teret (Ábra 1A). Szokás után a WT egerek előnyösen a sötét szobában maradtak, akár a sötét szobában, akár optikai stimulációval vagy anélkül (S1D), biztosítva, hogy az optikai stimuláció önmagában ne befolyásolja a sötét szobában részesülő viselkedést. Terveztük az állatok viselkedési kísérletét, hogy megvizsgáljuk a DA neuronok optikai inaktivációjának viselkedésükre gyakorolt hatását (S1E). A megszokás és az előzetes tesztelés után az egereket kondicionáltuk a DA neuronok optikai stimulálásával a VTA-ban, amikor a sötét szobában maradtak. A TH-Cre egerek még a kondicionálás első 5 percében sem maradtak az előzőleg előnyben részesített sötét helyiségből, és egymás után elkerülték a sötét szobát a kondicionálás során (Ábra 1B). A TH-Cre egerek nem fordították el az elkerülést a sötét szobával szemben, annak ellenére, hogy az utóvizsgálat során nem kaptak optikai stimulációt (Ábra 1C). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a DA idegsejtek hiperpolarizációja nemcsak átmenetileg riasztó viselkedést váltott ki, hanem jelként szolgált a sötét szobával szembeni agresszív tanuláshoz is, és azt is bizonyítja, hogy a DA neuronok inaktivációja okozati szerepet játszott mind az átmeneti, elkerülõ viselkedésben, mind az elhúzódó averzív tanulásban.
A NA szintek optogenetikus csökkent szabályozása a NAc-ban.
Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a DA neuronok inaktiválása a VTA-ban valóban módosította-e a DA koncentrációját annak fő célzó régiójában, a NAc-ben. A NA szintet NAc-ban gyorsan letapogatott ciklikus voltammetriával (FSCV) mértük érzéstelenített TH-Cre egerekben, amelyeket AAV-DIO-Arch-nal injektáltunk a VTA-ba. A NAc DA szintjét a VTA elektromos stimulálása azonnal megemelte, és a kiváltott DA felszabadulást jelentősen csökkentette a VTA egyidejű optikai stimulálása (S3). Ezután megvizsgáltuk, hogy a VTA optikai stimulálása csökkentheti-e a NAc tonikus DA szintjét. Ugyanezen kísérleti körülmények között megfigyeltük, hogy a NAc DA szintjét átmenetileg csökkentették a VTA optikai stimulációjának 20 s (Ábra 2), amely összhangban áll a riasztó ingerekkel szemben közölt FSCV reakcióval (20). Ezek az adatok bizonyítják, hogy a VTA optikai stimulálása elég hatékony volt a VTA DA neuronok inaktiválásához és a NAc DA szintjének csökkentéséhez a viselkedési kísérlet során.
A Fos gén expressziójának szabályozása a DA neuronok optikai inaktiválásával a VTA-ban.
A DA neuronok kondicionált inaktivációja által okozott viselkedésváltozás a VTA-ban arra utalt, hogy az optikai stimuláció közvetlenül megváltoztatta az idegi aktivitást, és a viselkedésbeli teljesítmény eltolódását eredményezte. Ezért aztán megvizsgáltuk azokat a régiókat, amelyekben az idegi aktivitást fokozta a DA idegsejtek kondicionált inaktiválása az Fos, egy azonnali korai gén expressziójának vizsgálatával. Nem sokkal azután, hogy a kondicionálást elvégezték a sötét szobában végzett teszttel, az egereket gyorsan feldolgozták, hogy a Fos expressziójának mennyiségét kvantitatív in situ hibridizációs elemzéssel meghatározzák (Ábra 3 és a S4). Az NAc, a régió, amely nagy mennyiségű dopaminerg vetületet kap a VTA-tól, a Fos expressziójának szignifikánsan megnövekedett mennyiségét mutatta a TH-Cre egerekben (Ábra 3). Ezt a felszabályozást az optikai stimuláció kontralaterális oldalán is kimutatták, amelyet állítólag egy kis mennyiségű vírusfertőzés okozott az oldalra. Ugyanakkor a fel-szabályozás sokkal nagyobb volt az ipszilaterális oldalon, mint az optikai stimuláció kontralaterális oldalán, ami arra utal, hogy a DA-idegsejtek optikai inaktiválása közvetlenül feljebb szabályozta a NAc idegi aktivitását. A megnövekedett Fos expressziót megfigyelték más agyi régiókban is, beleértve a septumot, a striatum periventrikuláris régióit, a basolateral amygdala (BLA) és az oldalsó hipotalamusz, de az oldalsó habenulában vagy a mediális prefrontalis kéregben (mPFC; S4). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a DA-idegsejtek optikai inaktivációjával aktivált régiók nem korlátozódtak a VTA DA-idegsejtek közvetlen célterületeire, hanem azok a régiók, amelyek közvetett módon aktiválhatók egy idegi áramkörtől függő módon. Ez a megfigyelés azt sugallja, hogy a DA neuronok optikai inaktiválása módosította az egész körüli idegrendszeri aktivitást, és nemcsak riasztó reakciót válthat ki, hanem számos más agyi funkciót kiválthat, például szorongást, félelmet és stresszválaszokat (21).
A DA jelzés a D2R-en keresztül kritikus az optogenetikusan indukált kondicionált helymegfordulás szempontjából.
A VTA-ból származó dopaminerg jelek nagy része az NAc-ben lévő MSN-ekhez továbbadódik DA receptorok, D1R és D2R útján. A D1R szinte kizárólag a P anyagban (Tac1 gén által kódolva) expresszáló MSN-ekben expresszálódik, és a D2R elsősorban az enkefalinban (Penk gén által kódolva) expresszáló MSN-ekben expresszálódik; az MSN-ek mindegyik típusa képviseli a közvetlen és közvetett útvonalakat az NAc-ban (3). Mivel a DA iránti affinitás sokkal nagyobb a D2R esetében (nM sorrend), mint a D1R esetében (µM sorrend) (22, 23), úgy gondolják, hogy a DA szint csökkentése a G inaktiválását eredményeziikapcsolt D2R, de nincs érzékelhető hatása a D1R-re (3, 24), ezáltal fokozva az idegi aktivitást, különösen a közvetett úton. Ezenkívül a Fos aktiválódást jobban megfigyelték a Penk- vagy Drd2 (D2R) -t expresszáló sejtekben, mint a Tac1- vagy Drd1a- (D1R) -kifejező sejtekben (S5). Ezen megfigyelések alapján feltételeztük, hogy a DA jelzése a D2R-en keresztül nagy szerepet játszhat a megfigyelt averzív kondicionálásban.
Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez elvégeztük a háromkamrás kondicionált helymegfordítási (CPA) tesztet (S6). Készítettünk egy viselkedési eszközt, amely két kamrát tartalmaz gyakorlatilag azonos körülmények között és egy kis folyosót. A CPA tesztben ez az elfogulatlan környezeti állapot lehetővé tette számunkra, hogy tovább vizsgáljuk, vajon a VTA DA idegsejtek inaktiválása képes-e riasztó reakciót és tanulást indukálni, amellett, hogy blokkolja a sötét hely preferenciáját. Amikor az állatoknak szabadon mozoghattak az egész készülék körül, többségük két kamrában maradt, tipikus viselkedésbeli különbség nélkül. Az optikai kondicionálást ezután úgy végeztük, hogy az optikai stimulációt párosítottuk egy rögzített kamrával. A TH-Cre egerek még akkor is, ha az egyik kamrát a kondicionáláshoz használták, tartósan és jelentősen elkerülték az optikailag kondicionált kamrában tartózkodást a kondicionálás és az utóteszt során (S6 B-E). A statisztikai elemzés validálta a TH-Cre egerek tartózkodási idejének szignifikáns csökkenését az optikailag kondicionált kamrában az utóvizsgálat során, összehasonlítva a WT egerek tartózkodási idejével (S6F).
Ezután megpróbáltuk meghatározni az ellentmondásos viselkedésben részt vevő DA receptor altípusokat azáltal, hogy kifejezetten elnyomja az egyes NA receptorokat a NAc-ben (Ábra 4 és a S7). Megterveztük és validáltuk az egyes DA-receptorokra specifikus, rövid hajtűs RNS-t (shRNS) tartalmazó lentivírusvektoreket, konstitutív mCherry expresszióval. Három héttel a lentivírus NAc-ba történő injektálása után az mCherry robusztus expressziója lokalizálódott a NAc-ben (Ábra 4B). Az egyes receptorok mRNS-expressziójának hatékony leütését kvantitatív valós idejű PCR-elemzés igazolta (S7. ÁbraA). A proteinszintek Western blot módszerrel történő mérése azt is feltárta, hogy az egyes lentivírusok injektálása szelektíven csökkentette célfehérje-termékét anélkül, hogy befolyásolta volna a DA receptor másik altípusának expresszióját (Ábra 4C és a S7 B-G). Az shD1R-t és az shD2R-t expresszáló lentivírusok 46.2 ± 1.1% -ra és 38.4 ± 4.9% -ra csökkentették a célfehérje szintjét, összehasonlítva a kontroll vírus szintjével (Ábra 4C). Ezek az eredmények igazolják, hogy a D1R-re és a D2R-re specifikus shRNS-t expresszáló lentivírusvektorok szelektíven és megfelelően elnyomják a cél RNS-eket, és alulszabályozzák a megfelelő fehérjetermékek mennyiségét. Megállapítottuk azt is, hogy az mCherry vírus által közvetített expresszióját a VTA nem észlelte, kizárva annak lehetőségét, hogy a lentivírus által közvetített shRNS közvetlenül befolyásolja a VTA-t.
Ezen shRNS-t tartalmazó lentivírusok felhasználásával megvizsgáltuk, hogy a DA-receptor milyen típusú felelős az DA idegsejtek optogenetikus inaktivációja által kiváltott averz viselkedésért. ShRNS-t tartalmazó lentivírust vagy kontroll lentivírust fecskendeztünk a kétoldalú NAc-be, az AAV-DIO-Arch-nal együtt a TH-Cre egerek bal VTA-jába. Az optikai szálat a VTA (Ábra 4A). Amikor a háromkamrás CPA-tesztet három héttel a műtét után végezték el, a lenti: shD1R-mCherry injekcióval injektált TH-Cre egerek továbbra is kifejezett CPA-t mutattak az optikai stimulációval párosított kamra ellen, hasonlóan a TH-Cre egerekhez, amelyeket befecskendezték a a lentivírusok (lenti: mCherry) ellenőrzése. Ezzel szemben a lenti injekcióval beadott TH-Cre egerek: az shD2R-mCherry nem mutatott nyilvánvaló CPA-t a kondicionálás során (Ábra 4D). A lenti injekcióval beadott TH-Cre egerek exkluzív tanulási hiányát: shD2R-mCherry tovább igazolta az utóvizsgálaton az averzív tanulás elemzésével (Ábra 4E). Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a DA idegsejtek inaktivációja által előidézett helyzet iránti elkerülő viselkedést kifejezetten a D2R, és nem a D1R révén, a NAc váltotta ki.
Megbeszélés
A striatumban a tanulmányok kimutatták, hogy a Gskapcsolt D1R megkönnyíti az égetést, míg a G aktiválásai-kapcsolt D2R eredményt veszít az égetés hatékonyságáról (25). AcA DA receptor expressziójának sajátosságai szerint a DA idegsejtek fázisos kirúgása főként a D1R-en keresztüli közvetlen útvonalat aktiválja, míg a DA-idegsejtek átmeneti csökkenése elsősorban a D2R révén elősegíti a közvetett út kompetenciáját. (3, 26). A szabályozási mechanizmus alapján javasolták, hogy a DA idegsejtek elhallgattatása az averzív ingerekre adott válaszként főleg a közvetett úton történjen, és averzív viselkedést eredményezzen. (3). A legfrissebb tanulmányok kimutatták, hogy a közvetett út szinaptikus transzmissziójának blokkolása akadályozza az áramütéssel kiváltott agresszív viselkedés megszerzését (15), és hogy ezt a károsodást a D2R által közvetített jelátvitel gátlása okozza (16). énEzenkívül a D2R-t expresszáló MSN-k optogenetikus up-regulációja a közvetett útvonalon magatartás-elkerülést idéz elő. (27). Mivel azonban a DA idegsejtek fokozott és elnyomott löket mutatnak az averzív ingerekre adott válaszként, és mivel más sokkkal kapcsolatos szenzoros információt egyidejűleg dolgoznak fel az agyban, továbbra is tisztázni kell, vajon a DA-idegsejtek elnémítása közvetlenül kiválthat-e riasztó reakciót és tanulást, és hogy ezt a reakciót a közvetett úton D2R-t expresszáló MSN-ekkel szabályozzuk-e.
Ebben a tanulmányban a DA-idegsejtek tüzelésének optogenetikus vezérlését használtuk a két viselkedési teszten: a sötét helyiség preferencia tesztjén és a háromkamrás CPA tesztnél. Optogenetikus manipulációnk kimutatta a DA idegsejtjeinek hatékony elnyomását a VTA-ban és a DA szint csökkent szabályozását a NAc-ban. A DA idegsejt-tüzelés pontos optogenetikus inaktivációja csak abban az időszakban, amikor az állatok a kondicionált kamrában maradtak, kifejezetten idegesítő reakciót és tanulást váltott ki, megmutatva, hogy a tranziens DA elnémítása közvetlenül passzív elkerülési viselkedést váltott ki. Ez a vizsgálat rávilágított arra is, hogy a D2R által közvetített szignálfeldolgozás kulcsfontosságú meghatározó tényezője ennek a riasztó reakciónak és a tanulásnak.
Noha adataink azt mutatták, hogy a D1R nem volt hatással a CPA kiváltására szolgáló viselkedési kísérletekre, számos tanulmány dokumentálta, hogy a félelemre adott válaszok és az agresszív tanulás szempontjából DA-idegsejtek fokozatos elégetése szükséges (28, 29). Ez a különbség a kísérleti beállításnak köszönhető; Vagyis az optogén megközelítésünk kizárta az aktivált DA idegsejteken keresztül történő jelátvitel lehetőségét riasztó magatartás kiváltására, jelezve, hogy a DA idegsejtek inaktiválása elegendő volt az idegesítő viselkedés és tanulás indukálásához. Az aktivált DA-tüzelés funkciója és jelfeldolgozása, melyet az averzív ingerek idéznek elő, eltérő mértékben járulna hozzá az averzív viselkedéshez, mint az itt vizsgált, és tisztázni kell a jövőben.
A DA neuronok más régiókba is terjednek, beleértve az mPFC-t, amygdala-t és a hippokampust. Egy nemrégiben készült tanulmány rámutatott erre az oldalsó habenula idegsejtek optogenetikus aktivációja, amelyek a VTA DA neuronjaira vetülnek fel, képes averzív viselkedést indukálni, és ezek a DA neuronok elsősorban és kifejezetten az mPFC-t célozzák meg (30), bár az optogenetikus kondicionálásuk különbözött a jelenlegi vizsgálatunkban foglaltaktól, mivel optogenetikus stimulációjukat egész kondicionáló munkamenetre meghosszabbították. Mivel arról számoltak be, hogy az mPFC dopaminerg bemenete nemcsak averz stimulus, hanem krónikus stressz is aktiválódik (31, 32) lehetséges, hogy az mPFC-t kivetítő DA-idegsejtek folyamatos aktiválását erősen stresszes környezetből származó jelnek fogják érzékelni; és a stresszes kondicionálás felhalmozódása eredményeként az állatok riasztó viselkedést mutatnak a kondicionált kamrában. Ezzel szemben csak a DA-idegsejtek kirúgását gátoltuk, amíg az állatok a kondicionált kamrában tartózkodtak. Idővel megegyező kondicionálást alkalmazó viselkedési kísérleteink eredményei azt mutatták, hogy a DA jel hirtelen elnyomását hirtelen averzív bemenetként fogják felfogni, ami gyors averzív választ eredményez.
A DA neuronok az amygdala felé is kinyúlnak, amely régió nagyban hozzájárul a félelemre adott reakcióhoz. Valójában az amygdala felé jelző DA jelezte a félelemre adott reakciót és a félelemmemória megszerzését (33, 34). Vizsgálatunkban a DA idegsejtek jelölése a VTA-ban azonosította a BLA-ra kiálló DA neuronok halmazát, ám ezeknek a vetületeknek a mértéke jóval alacsonyabb volt, mint a NAc-re vetített. Noha nem lehetett volna kizárni az amygdala-előrejelzett DA jelátvitel megfigyelt riasztó viselkedését, a DA-idegsejtek optogenetikus inaktivációjának fő hatása a NAc-re kell, hogy álljon, mivel a D2R specifikus knockdown-jával végzett kísérleteink drámai módon csökkent a riasztó viselkedés. A célspecifikus DA jelátvitelre irányuló jövőbeni vizsgálatokhoz szükség van a DA neuronok áramköri szintű módosításának az averszív ingerekre és a félelem kondicionálására gyakorolt hatásainak tisztázására.
Anyagok és módszerek
Tárgyak.
Tirozin-hidroxiláz :: IRES-Cre (TH-Cre) beütésű egerek (EM: 00254) (18) az Európai Egér mutáns Archívumból szerezték be. Az összes kísérleti állatot keresztezték a C57BL / 6J törzsbe több mint 10 generáción keresztül. Az egereket a C57BL / 6J WT egerekkel párosítottuk, és egy standard 12-h világos / 12-h sötét ciklusban helyeztük el, és élelmet és vizet ad libitum szerint adtak. Cre+ és Cre- Ugyanazon alomból származó egereket (3 – 6 mo életkorú) használtunk a kísérletekhez. Az összes állatkísérletet az Oszaka Bioscience Intézet állatbizottsága hagyta jóvá az állatkísérletek iránymutatásai szerint.
Magatartási tesztek.
Az összes viselkedésvizsgálat során az egereket optikai szállal kötötték és hagyták, hogy az egész készülék körül mozogjanak. Az egerek mozgását úgy figyeltük, hogy akadályok nélkül mozoghassanak még akkor is, ha a fejükre szánt optikai szállal vannak összekötve. Az egér helyzetét a viselkedési berendezés fölé felfüggesztett videokamera segítségével észlelték és egy egyedi gyártású program segítségével elemezték a Labview szoftver segítségével.
Sötét szoba preferencia teszt.
A tesztben alkalmazott, személyre szabott viselkedési eszköz egy sötét helyiségből (15 × 9.5 cm) és egy világos, nyitott térből (15 × 11 cm) állt. A sötét szobának falai, padlója és tetője mind fekete színű volt, és bejáratuk (4.5 cm hosszú) volt a nyitott fényes térbe. A nyitott, világos hely ellipszis alakú volt, fémrácsos padlóval és tiszta, tető nélküli falakkal. A teszt előtt az egereket szokásos módon 10 percre szoktuk alkalmazni a készülékben. A teszt három ülésből állt: a nap korai felében az 1 (előteszt: 5 perc) az egereknek lehetővé tették, hogy felfedezzék a teljes készüléket. Az 1 nap késő felétől az 4 napig (kondicionálás: összesen 35 perc) az egerek optikai stimulációt kaptak, amikor a sötét szobában maradtak. Az 5 napon a sötét hely preferenciáját optikai stimuláció nélkül teszteltük (utóvizsgálat: 5 min; S1E).
Háromkamrás CPA-teszt.
A teszteléshez használt egyedi gyártású háromkamrás kondicionált helypreferencia / CPA készülék két kamrából (10 × 17 cm) és egy összekötő folyosóból állt. A teszt három ülésből állt. 1. Nap (elővizsgálat: 15 perc): Az egereknek szabadon felfedezhetik a teljes készüléket. Azokat az egereket, akik az egyik kamrában 1.5-szer hosszabb ideig maradtak, mint a másikban, kizártuk a tesztből. 2 és 3 napok (kondicionálás: mindegyik 15 min.): Az egerek optikai stimulációt kaptak, amikor a fénypáros kamrában maradtak. A fénypáros kamra kiválasztását ellensúlyoztuk. 4. Nap (utóvizsgálat: 15 perc): A tesztet ugyanolyan körülmények között végeztük, mint az előtesztben (S6A).
A kondicionáló szakaszban az optikai stimulációt megszakítottuk az 30-ok számára, amikor az egerek a túlmelegedés elkerülése érdekében az 30-ek felett folyamatosan a sötét szobában vagy a fénypáros kamrában maradtak. A lézerteljesítményt körülbelül 5 mW értékre kontrollálták az optikai szál végén az összes viselkedésbeli vizsgálat során.
In vivo ciklikus voltammetria.
Az FSCV kísérleteket a korábbi vizsgálatokban ismertetett módszer alkalmazásával végeztük (35-37). Az egereket ketamin / xilazin keverékkel érzéstelenítettük, a SI anyagok és módszerek és sztereotaxikus keretbe helyezik. Az Arch-t expresszáló DA neuronok stimulálására használt optikai szál a stimuláló elektród közelében helyezkedik el. Az stimuláló opódot ezután a VTA-ba helyezték (bregma-tól: elülső – hátsó, –3.2 mm; oldalsó, 0.5 mm; hátsó – ventrális, 3.5 mm) és 0.25-mm intervallumokkal leengedve. A szénszálas mikroelektródot (300 µm hosszú) a voltammetrikus felvételhez lecsökkentük a NAc-be (bregma-tól: elöl-hátul, 1.0 mm; oldalsó, 1.0 mm; és hátsó-ventrális, 3.5 mm). A voltammetrikus méréseket minden 100 ms-en elvégeztük egy háromszög hullámforma (−0.4 V - + 1.3 V - −0.4 V vs. Ag / AgCl, 400 V / s-nál) alkalmazásával a szénszál mikroelektródra. A hullámforma elszigeteléséhez és az áram erősítéséhez egyedi gyártású potenciométert használtunk. A DA felszabadulását a DA neuronok elektromos stimulációja váltotta ki 24-impulzus stimulációval (100 µA, 5 ms időtartam, 30 Hz). A DA idegsejtek optikai stimulációját (532 nm, ∼5 mW teljesítmény a szál végén) alkalmazták az 10-ekre, kezdve az 5-ket az elektromos stimuláció megkezdése előtt. A szénszál mikroelektródákat oldatban kalibráltuk ismert DA koncentrációkkal (0.2 µM, 0.5 µM és 1.0 µM). Az összes voltammetriai adatot egyedi gyártású programok elemezték a Labview és a Matlab szoftver segítségével. A DA-szint csökkentését optikai stimulációval a főkomponens-elemzéssel oldottuk meg, az elektromos VTA-stimulációkból nyert DA-sablon hullámformák felhasználásával a dopaminjelek szétválasztására (35, 36).
Statisztikai analízis.
A statisztikai elemzést a GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software) alkalmazásával végeztük. Az adatokat ismételt ANOVA mérésekkel elemeztük (Ábrákon. 1B, , 4D,4Dés S6 D és a E) vagy egyirányú ANOVA (Ábrákon. 1C, , 3D,3D, 4 C és a Eés Ábrákon. S4 K-M, S6Fés S7A) és post hoc elemzéseket Bonferroni teszttel végeztünk. Minden jelölés / oszlop és oszlop ábrázolta az átlagot, illetve ± SEM.
Egyéb kísérleti eljárásokat, beleértve a vírus előkészítését és beinjekciózását, az elektrofiziológiai felvételt, valamint az immunhisztokémiai és mRNS analízist, részletesebben a SI anyagok és módszerek.
Köszönetnyilvánítás
Köszönjük E. Boydennek az Arch konstrukciót, Matsui R.-nak a lentivírusgyártás és -tisztítás technikai tanácsadásáért, valamint Y. Hayashi-nak az adatanalízis programozásának technikai tanácsát. Ezt a munkát az Oktatási, Kulturális, Sport-, Tudományos Minisztérium és az 22220005 (az SN-nek), az 23120011 (a SY-nek és az SN-nek), az 24700339 (a TD-nek) és az 25871080 (a SY-nek) támogatta. Japán technológia és a Takeda Science Foundation (az SN) támogatása.
Lábjegyzetek
A szerzők nem jeleznek összeférhetetlenséget.
Ez a cikk online információkat tartalmaz www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Referenciák
;
