A mezolimbikus dopamin neuronstimuláció elégtelensége a progressziótól a függőségig (2015)

Bevezetés

A függőség egy olyan betegség, amely több lépésben fejlődik ki (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). A diagnózist akkor állapítják meg, amikor a szabadidős használat kényszeressé válik, a negatív következmények ellenére is fennmarad. Míg egy vezető függőségi hipotézis azt állítja, hogy a bántalmazás kábítószerei okozzák a betegséget, mert túlzottan megnövelik az agy dopamin (DA) koncentrációját, nem világos, hogy ennek a rendszernek a kiváltása elegendő-e a rekreációs célú használattól a függőséghez való áttéréshez (Di Chiara és Bassareo, 2007, Volkow és Morales, 2015). A kábítószer-megerősítés DA-hipotézisének alátámasztó bizonyítékai több évtized alatt felhalmozódtak, és a gyógyszerek kezdeti hatására támaszkodnak. Például az addiktív gyógyszerek csökkentik a mediális előagyi köteg intracranialis önstimulációjának (ICSS) küszöbét, egy rosttraktust, amely többek között a középagyból emelkedő DA-vetületet tartalmaz (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). A farmakológia és az elváltozások vizsgálata ezután a mezokortikolimbikus DA rendszert azonosította ennek az áramkörnek a kiindulópontjaként (Wise és Bozarth, 1982). Az 1980-as évek végén az extracelluláris DA koncentráció mikrodialízissel végzett közvetlen mérése megerősítette, hogy az addiktív gyógyszerek közös tulajdonsága, hogy kiváltják a DA emelkedését az NAc-ben (Di Chiara és Imperato, 1988). Ez az addiktív szerek mechanisztikus osztályozásának javaslatához vezetett (Lüscher és Ungless, 2006).

Sokkal kevesebbet lehet tudni arról, hogy a kábítószer-használat e kezdeti hatásai hogyan segítik elő a függőségbe való átmenetet. A DA-független mechanizmusokat azért vették figyelembe, mert az addiktív gyógyszereknek más farmakológiai célkitűzéseik vannak. Például a kokain a DA transzporter (DAT) gátlása mellett a SERT-hez (szerotonin transzporter) és a NET-hez (norepinefrin transzporterhez) is kötődik, hogy csökkentse a szerotonin és a noradrenalin visszavételét, ezáltal növelve az összes főbb monoamin (Han és Gu, 2006, Tassin, 2008). Hasonló aggályok vonatkozhatnak más pszichostimulánsokra is. Ezenkívül állítás szerint az opiátok legalább kezdeti szakaszban DA-függetlenek (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee és van der Kooy, 2012). A DA hipotézist genetikai egérmodellek alapján is megkérdőjelezték, ahol a DA rendszerbe történő beavatkozás után a gyógyszer-adaptív viselkedés bizonyos formái még mindig nyilvánvalóak voltak. Például a DAT knockout egerek önállóan adják be a kokaint (Rocha et al., 1998), és a DA szintézisének akár farmakológiailag (Pettit et al., 1984), akár genetikailag (Hnasko et al., 2007) eltörlésével sem sikerült megakadályozni a gyógyszer önadagolását. vagy feltételes helypreferencia. Míg ezeknek a transzgénikus egereknek a jobb jellemzése és a kettős monoamin transzporterek létrehozása a kiütések megoldották ezeket a kérdéseket (Rocha, 2003, Thomsen és mtsai, 2009), a DA elegendősége a függőség kardinális jellemzőinek kiváltására nem ismert. A nem-specifitás kérdésének kijátszása érdekében ezért úgy döntöttünk, hogy engedélyezzük az egerek számára, hogy önstimulálják a VTA DA idegsejtjeit egy optogenetikai megközelítés alkalmazásával.

A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a DA idegsejtek aktiválása a középagyban előidézheti a helypreferenciát (Tsai et al., 2009) vagy megerősítheti az instrumentális viselkedést (Adamantidis et al., 2011, Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi és mtsai, 2013, McDevitt és mtsai, 2014, Ilango és mtsai, 2014). Míg a DA-utaknak ez a szelektív aktiválása megerősíti az intrakraniális önstimulációs (ICSS) vizsgálatokat, amelyeket több mint 30 évvel ezelőtt végeztek a jutalmazási rendszer körülhatárolásában (Fouriezos és mtsai., 1978), ezek nem mutatják be a késői stádiumú adaptív viselkedés indukcióját, amely meghatározza az addikciót, és nem azonosították a mögöttes neuronális adaptációkat sem. Itt optogenetikai manipulációt alkalmaztunk nem csak a fázisos DA jelzés elégségességi kritériumának közvetlen tesztelésének lehetővé tételére a megerősítés megindításakor, hanem a függőségre való átmenet tesztelésére is.

A betegség későbbi szakaszainak szembetűnő megfigyelése, hogy a leginkább addiktív gyógyszerek mellett is csak a felhasználók töredéke válik függővé (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Az emberi szenvedélybetegek a negatív következmények ellenére is folytatják a kábítószer-fogyasztást (lásd az American Society for Addiction Medicine „Definition of Addiction”, DSM5, American Psychiatric Association, 2013), jellemzően a gyakran késleltetett társadalmi és pszichológiai vereségekkel kapcsolatban. Hasonlóképpen, a rágcsálóknál nagyjából minden ötödik állat, amely önállóan adagolja a kokaint, végül szenvedélybetegnek minősül (Deroche-Gamonet és mtsai, 2004, Kasanetz és mtsai, 2010; de lásd George és mtsai, 2014). A gyógyszerfogyasztás kitartása a negatív következmények ellenére is modellezhető rágcsálóknál, ha egyszerű averzív ingert vezet be a fogyasztási ütemtervbe. Míg az emberi betegség összetettebb, a büntetés és a fogyasztás társítása a függőség egyik központi elemének egyenes modellje.

Itt enyhe láb sokkot használtunk a kokain, szacharóz önbeadásának és az optogenetikus önstimulációnak a következményei értékeléséhez. Azt is megvizsgáljuk, hogy a DA idegsejtek önstimulálása képes-e kiváltani két addiktív viselkedést - dákóval összefüggő jutalomkeresést és a fogyasztáshoz kapcsolódó kompultivitást a negatív következmények ellenére -, és jellemzi-e az ilyen viselkedéshez kapcsolódó idegi plaszticitást.

Eredmények

A DA idegsejtek aktivitásának ellenőrzésére Cre-indukálható adeno-asszociált vírust (AAV) fecskendeztünk egy kettős fluxusú, fordított nyitott leolvasási kerettel (DIO), amely ChR2 fokozott sárga fluoreszcens fehérjével (eYFP) (Atasoy és mtsai, 2008, Brown és mtsai, 2010) fuzionálva a DAT-Cre egerek VTA-jába. Ezenkívül optikai szálat helyeztek el a VTA célzásához (ChR2Lásd: Kísérleti eljárások). A ChR2 az expressziót megerősítette az eYFP és a tirozin-hidroxiláz (TH) együttes lokalizációja, amely a DA szintéziséhez szükséges enzim (1. ábraA). 

Először is, a lézerstimulációs protokoll megalkotásához az egereket egy operáns dobozba helyezték, ahol egy aktív kart megnyomhattak, amely számos változó (1, 2, 8, 32, 60 vagy 120 sorozat) lézerstimulációt váltott ki. két ülés. A fázisos tüzelési mintázat (Hyland és mtsai, 2002, Mameli-Engvall és mtsai, 2006, Zhang és mtsai, 2009) emulálására tipikusan természetes jutalom indukálta (Schultz, 1998). Az egyik sorozat öt 4 ms-os lézerimpulzusból állt, 20 Hz-en, és másodpercenként kétszer megismételték. Megállapítottuk, hogy az egerek a lézeres stimulációnkénti sorozatfelvételek függvényében adaptálták karjukat nyomó viselkedésüket, ezzel szabályozva a beérkező sorozatfelvételek teljes számát (1. ábraB). Ez a viselkedés az addiktív gyógyszerek önadagolására emlékeztetett, amikor az infúziónkénti dózist változtatták (Piazza és mtsai., 2000). Az ezt követő kísérletekhez úgy döntöttünk, hogy egy karnyomásonként 30 sorozatfelvételt adunk be, így a maximálisan feleannyi sorozatfelvételt kapjuk (1. ábraB). A DA növekedésének késleltetése, amelyet tipikusan akkor észlelünk, amikor a gyógyszereket intravénásan adják be (Aragona és mtsai., 2008), 5 másodperccel késleltettük a lézeres stimulációt, és 10 másodpercig villogó jelzőfényt adtunk hozzá (1. ábraC).

12 egymást követő nap alatt az egereknek legfeljebb 80-szor hagyták önmagukat stimulálni 2 óra alatt. Az egerek gyorsan megnövelték a lézeres stimuláció sebességét, elérve a 80 lézeres stimulációt (LS) a munkamenet első órájának vége előtt (Az 1 számokD és 1E). Az aktív és az inaktív kar közötti különbséget gyorsan megszerezték, és az aktív kar-megnyomások száma ennek megfelelően nőtt a rögzített arány (FR1, 2, 3) ütemezésének növekedésével (Az 1 számokF és 1G). Kontrollkísérletekben, amelyekben DAT-Cre-egereket vagy egereket használtunk, amelyek ChR2-et expresszálták γ-amino-vajsav (GABA) idegsejtekben (GAD-Cre + egerek, a VTA gátló idegsejtjeinek megcélzására), az önstimuláció sebessége alacsony volt, és folyamatosan csökkent. ülés. Ez vonatkozott két Cre + állatra is, ahol a post hoc validálás azt mutatta, hogy a VTA nem volt fertőzött ChR2-eYFP-vel (nem ábrázolva). Ezenkívül nem észleltek megkülönböztetést az aktív és az inaktív kar között (S1A és S1B).

Megfigyeltük, hogy a DAT-Cre + egerek gyakrabban nyomódtak az aktív karra, mint amennyire a lézerstimulációhoz szükségük volt. Valójában az ilyen „hiábavaló” aktív kar-prések az összes aktív kar-megnyomás több mint 30% -át tették ki (S2. ÁbraA) és - a szekciók előrehaladtával - leginkább a dákó és a lézeres stimuláció kezdete között jelentkeztek (S2B és S2C). Ez az egyedi viselkedés az akvizíció során alakult ki, és impulzív válaszokat tükrözhet.

Összegezve, a VTA DA idegsejtekben a robbantási aktivitás erősen megerősíti a kar reagálását.

A VTA DA neuron önstimulációjának elzárása kokain által

Annak tesztelésére, hogy a VTA DA neuron önstimulációja függ-e ugyanazon agyi áramköröktől, amelyekre a függőséget okozó gyógyszerek irányulnak a viselkedés megerősítése érdekében, közvetlenül az önstimulációs foglalkozások előtt intraperitoneálisan (ip) injektáltunk kokaint (szabad hozzáférés a lézerhez 45 percig, 2. ábraA). A kiindulási helyzetben a jól kiképzett állatok körülbelül 400-szor szorítottak nyomást, hogy 85 perc alatt 45 LS-t kapjanak az FR3 ütemterv szerint. A kokaininjekció után a teljesítmény dózisfüggő módon jelentősen csökkent, körülbelül 30 LS-re 100 karos présnél, a legnagyobb dózisnál (2. ábraB). Ez az elzáródás a munkamenet első 30 percében volt a legnyilvánvalóbb, tükrözve a gyógyszer farmakokinetikáját (2. ábraC). Ez a kísérlet azt jelzi, hogy az optogenetikus önstimulációval történő megerősítés és a kokainnal történő megerősítés megosztja az idegi áramkörök alapját.

Az optogenetikus önstimuláció és az addiktív gyógyszerek további összehasonlítása érdekében azt kérdeztük, hogy az egerek visszatérnek-e a VTA DA idegsejtjeinek önstimulációjához néhány hetes megvonás után. Mivel a jelzéssel társított gyógyszerkeresés a visszaesés bevett modellje (Epstein és mtsai., 2006, Soria és mtsai., 2008, Bossert és mtsai., 2013), az egereket 30 nappal az utolsó önvizsgálat után visszahelyeztük az operáns kamrába. stimulációs munkamenet, ahol az aktív kar megnyomása váltotta ki a jelzőfényt nélkül lézeres stimuláció (3. ábraA). A robusztus dákóhoz társított kereső magatartás, amelyet az aktív karos prések magas aránya mutat be, csak az eYFP-ChR2 VTA DA idegsejtekben (DAT-Cre +, de nem DAT-Cre-egerek, 3. ábraB).

Korábbi tanulmányok kimutatták az okozati összefüggést a jelzéssel összefüggő relapszus és a kokain által kiváltott szinaptikus plaszticitás között a DA D1R-t expresszáló NAc neuronok egyik altípusában (Pascoli, Terrier et al., 2014). Ezért ennek a szinaptikus plaszticitásnak az értékeléséhez DAT-Cre egereket állítottunk elő keresztezve Drd1a-tdTomato egerek azonosítják a közepes méretű tüskés idegsejtek (MSN-k) altípusát a NAc-ben. A kereső teszt helyett NAc szeleteket készítettek, ahol a D1R-MSN vörös volt, ellentétben a flox-ChR2-eYFP-vel fertőzött VTA DA idegsejtek zöld szálaival (3. ábraC). Az ex-vivo teljes cellás patch-clamp felvételek az AMPAR által kiváltott posztszinaptikus áramok (AMPAR-EPSC) egyenirányító áramfeszültség-kapcsolatát és az AMPAR / NMDAR arány megnövekedését mutatták (Az 3 számokA D3R-MSN-ekben, de a D1R-MSN-ekben nem. A kokain önadagolásának megvonása után korábban kapott hasonló eredményekről kimutatták, hogy a hiányzó GluA2 és a GluA2-tartalmú AMPAR-ok együttes beépülését jelzik a D2R-MSN-ekre külön bemeneten (Pascoli, Terrier et al., 1).

Ösztönzés a büntetés ellenére

Az anyaghasználat a negatív következmények ellenére a függőség meghatározó jellemzője (lásd DSM5 meghatározás, American Psychiatric Association, 2013). Patkánymodelleket hoztak létre (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013), ahol a kokain önadagolási ütemtervében bevezetett áramütés elnyomja a kokaint fogyasztása néhány állatnál. 12 napos kezdeti expozíció (megszerzés) után az egereknek további három ülést engedélyeztek FR3-nál, de csökkentett munkamegszakítással (maximum 60 perc vagy 40 jutalom). Ez a három munkamenet szolgált kiindulási alapként a következő négy munkamenetnél, ahol minden harmadik lézeres stimulációt egy új jelzéssel megjósolt láblökéssel (500 ms; 0.2 mA) párosítottak (4. ábraA). A láb sokkának intenzitását és időtartamát úgy állítottuk be, hogy teljesen elfojtottuk a kar nyomását a szacharóz jutalma érdekében (lásd az alábbi adatokat is). A büntetés ütemezése két ellentétes viselkedési reakcióhoz vezetett (4. ábraB). Egyes egerek gyorsan nem reagáltak a büntetés bevezetésekor (úgynevezett „érzékeny”), míg mások továbbra is reagáltak a maximális lézerstimulációk elérése érdekében, és „büntetésnek ellenállónak” tekinthetők. A két állati csoport teljesen felbukkant a négy büntetési szakasz végén (4. ábraC). A „rezisztens egerek” fenntartották a lézerstimulációk számát (kevesebb, mint 20% -os csökkentés), míg az „érzékeny egerek” több mint 80% -kal csökkentették az önstimulációt. Ezekkel a kritériumokkal csak egy állatot (szürke pontok) nem lehetett kiosztani. Ez a megfigyelés igazolja, hogy a VTA DA idegsejtek önstimulációja által kiváltott kényszerkitöréses aktivitás elegendő a fogyasztás kitartásának indukálására, az egerek egy töredékén fellépő negatív következmények ellenére. Kontrollként egy olyan független egércsoportban, amelynek ellenállása vagy érzékenysége bizonyult az önstimulációval járó büntetéshez, a nocicepciót farokcsillapítási módszerrel értékeljük. Az érzékeny és az ellenálló képesség között nem észleltek különbséget a forró vízbe merített farok visszahúzódásának késleltetésében (S3. Ábra).

Ezután post hoc kérdést tetünk arra, hogy az önstimuláció megszerzésének fázisa során valamely sajátos tulajdonság megjósolta-e a büntetés ellenállását. Az érzékeny és rezisztens egerek azonos számú aktív és inaktív kar-megnyomást hajtottak végre a kiindulási ülés során, és az összes egér elérte az 80 LS maximális értékét (S4A és S4B), hasonló ideig (S4A és S4C). Míg a hiábavaló aktív kar nyomása nem volt különbözõ a két alpopulációban (Az 4 számokD és S4D), a hiábavaló lenyomások száma a lézerstimuláció megkezdése előtt szignifikánsan nagyobb lett az ellenálló egerekben az akvizíciós szakasz végére (Az 4 számokE és S4E). Mivel ez a viselkedés a megszerzés során alakult ki, hozzájárulhat a veleszületett impulzivitáshoz (Economidou és mtsai, 2009, Broos és mtsai, 2012, Jentsch és mtsai, 2014) a büntetéssel szembeni ellenállás megalapozásához. Ezenkívül a 11. napon egy progresszív arányú vizsgálatot hajtottak végre az optogenetikus stimuláció motivációjának számszerűsítésére (Richardson és Roberts, 1996). A rezisztens egerek töréspontja statisztikailag nem különbözött az érzékeny egerekétől (S4. ÁbraF).

Büntetésállóság kokain, de nem a szacharóz esetében

Annak tesztelésére, hogy a fogyasztás paradigmája a káros következmények ellenére, az impulzuskar megnyomásával is megjósolhatja-e az addiktív gyógyszer kényszeres bevitelét, egy új egércsoport 12 napos kokain önadagoláson esett át. A kokain önadagolásának kísérleti paramétereit a megszerzés során 80 órán belül maximum 4 kokain-infúzióra, a négy büntetést megelőző három kiindulási ülésen pedig 40 órán belül 2 infúzióra állították be (Az 5 számokA és S5A). Két csoport ismét kialakult, miután a kokaint jutalmazták elektromos sokkokkal. Valójában az 5 egerek közül az 22 rezisztens besorolást kapott (kevesebb, mint az 20% -os csökkenés a kiindulási értékhez képest), míg az 17 érzékenynek minősült (több mint 80% csökkenés), és egy állat közé esett (13 infúziók az 19 napon) (5. ábraB). Ezután viselkedésbeli prediktorokat kerestünk a büntetés ellen. A két csoport között az infúziók száma, az infúzió sebessége és az aktív vagy inaktív emelőgombok száma nem különböztek egymástól (S5B – S5D), és a törési pontok hasonlóak voltak (S5. ÁbraE). Különbséget mutatott az aktív kar hiábavaló nyomásainak időbeli eloszlásának alakulása. Az első négy munkamenetben a hiábavaló emelőgombok rendszeresen csökkentek az időtúllépési időszakokban mind rezisztens, mind érzékeny egerekben, míg a beszerzés végén csak érzékeny egerek tartották ezt a viselkedést (Az 5 számokC és 5D és S5F). Ezzel szemben az ellenálló egerek hajlamosak voltak növelni a hiábavaló emelők teljes számát (Az 5 számokC és S5D), különösen az időkorlát utolsó negyedévében (5. ábraD). Noha minőségileg hasonló a DA idegsejtek optogenetikus stimulációjával korábban elvégzett megfigyeléshez (lásd fent), a korai időtúllépési időszakban a hiábavaló prések csoportosulása nem volt látható a kokain esetében, valószínűleg annak a lassabb kinetikának köszönhetően, amellyel a gyógyszer megnövekedett DA szint. Ugyanakkor hasonló következtetéseket lehet levonni a hiábavaló nyomógombok eloszlásának ezen egyedülálló evolúciója alapján a „DA túlfeszültség belső felismerését megelőző rövid időszak alatt”. Megfigyeléseink tehát arra utalnak, hogy a hiábavaló aktív nyomógombok eloszlása ​​előre jelzi a drogfogyasztást. a negatív következmények ellenére.

Végül megismételtük a kísérletet ad libitum táplálással ellátott egerekkel, amelyek nyomást gyakoroltak a szacharózért. A büntetés bevezetése után az összes egér abbahagyta a szacharóz önellátását (5. ábraE), bemutatva, hogy ez az ütemterv elnyomta a nem alapvető természetes jutalom bevitelét, de lehetővé tette az addiktív gyógyszer kényszeres bevitelének vagy az erős DA-idegsejtek stimulációjának kimutatását.

Összegezve, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a VTA DA önstimuláció elegendő a kompultivitás indukálásához, amint azt az egerek egy részhalmazában a büntetéssel szembeni ellenálló képesség (68%) is mutatja. Hasonlóképpen, a kokain SA után egyes egerek ellenálltak a büntetésnek (23%), ami soha nem volt a helyzet a szacharóz SA után (5. ábraF).

Hogy meghatározzuk azt az agyterületet, amely a negatív következmények ellenére is befolyásolhatja az önadagolásban való kitartás eldöntését, először a generikus „idegsejtek aktivitását” figyeltük meg, megszámolva azon idegsejtek számát, amelyekben a büntetés során a közvetlen korai gén cFos expressziója vált ki 15-ben. különböző régiókban. Az egereket intracardialisan perfundáltuk PFA-val 90 perccel az utolsó büntetés befejezése után. A kontrollcsoportba naiv állatok, valamint érzékeny vagy rezisztens egerekhez emelt egerek tartoztak annak érdekében, hogy ellenőrizzék a kapott sokkok lehetséges zavaró hatását.

Míg a választott régiók többségében a cFos-pozitív neuronok száma a legtöbb volt a rezisztens egerek szeleteiben, szemben a naiv egerek szeleteivel, a válaszok két típusa jelent meg, amelyek közül példák az prebicikus kéreg (PL) és az oldalsó OFC. A PL-ben hasonló mértékű cFos-pozitív sejtek növekedését találtunk rezisztens egerekben és azok kontrollált kontrolljaiban, míg az OFC-ben ez a növekedés csak a rezisztens és nem a megfelelő yoked egerekben volt látható (Az 6 számokA és 6B). Ennek a különbségnek a számszerűsítéséhez az összes adatot először normalizáltuk a naiv állatok expressziós szintjére. Ezután kiszámítottuk az arányt az érzékeny feletti ellenállás között, elosztva a javakkal szemben ellenállóval szemben, szemben az érzékenyekkel szemben (arány_cfos = (R / S) / (YR / YS), 6. ábraB). Ez az eljárás a cinguláris kérget, az OFC-t és a VTA-t azonosította azon régiókként, amelyek rezisztens, de nem érzékeny egerekben aktiválódnak, és ahol alig volt különbség a járom kontrollok mindkét csoportjában (valójában hasonló alacsony cFos-pozitív idegsejtek a járomban) . A VTA megtalálása nem meglepő, mivel ez a lézerrel stimulált idegsejtek régiója. Ez összhangban áll egy korábbi jelentéssel, amely azt mutatja, hogy a ChR2 stimuláció kiváltja a cFos aktivációt (Lobo és mtsai, 2010, Van den Oever és mtsai, 2013). Alacsony arány_cfos olyan régiókban található, ahol az aktiváció hasonló volt érzékeny és rezisztens (például CeA és PAG). Az arány_cfos szintén alacsony volt, amikor az aktiválást párhuzamosák voltak a kontrollos kontrollok nagy különbségei (például a PL, 6. ábraC az összegzett arányhoz_cfos adat). Ennélfogva a cFos expresszióját rezisztens és ízben ellenálló egerekben valószínűleg a lábütés száma vezetett, és kevés köze volt a büntetés ellenállásához. Összességében a magas arány_cfos az OFC-ben arra utal, hogy az idegi aktivitás ebben a régióban a büntetés-ellenálláshoz kapcsolódik, és ezáltal elősegítheti a függőségre való áttérést.

A büntetésnek ellenálló egerekben az OFC-ben megnövekedett idegsejt-aktivitás szubsztrátumának azonosításához 24 órával az utolsó büntetés után elkészítettük a PL és az L-OFC szeleteit, hogy teszteljük a belső ingerlékenységet. A két régiót a korábbi kísérletekben a c-Fos expresszió nagyon eltérő mintázata miatt választották. Az idegsejtek ingerelhetőségét úgy számszerűsítettük, hogy megszámláltuk az akciós potenciálok (AP) számát, amelyek növekvő árammennyiségek (0 és 600 pA közötti) injektálásával váltak ki az egész sejtes felvételekben. Ezek a felvételek tartós hipo-ingerlékenységet mutattak ki a rezisztens egerek (és azok igás kontrolljuk) PL piramissejtjeiben az érzékeny vagy naiv egerekhez képest (7. ábraA). A rögzített idegsejtek nyugalmi membránpotenciálja (RMP) nem különbözött a kísérleti csoportok között (7. ábraB). Ezek az eredmények határozottan azt sugallják, hogy a neuronok ingerlékenysége a PL-ben közvetlenül korrelál a kapott sokkok számával, és talán nem a büntetés ellenállásának döntésével. Ez valószínűleg a negatív visszacsatolás-adaptációt tükrözi, amelyet a láb sokkjai által kiváltott idegi gerjesztés vált ki az előző napon. Ezzel szemben az L-OFC-ből származó neuronok csak rezisztens egerekben voltak jobbak. A kipróbált egerek idegsejtjeinek ingerlékenysége nem különbözött a naiv egerek neuronjainak ingerlékenységétől, kizárva maga a láb sokkját (Az 7 számokC és 7D). Az OFC idegsejteknek ez a megnövekedett aktivitása valószínűleg a cFos expresszió alapját képezi, és fokozhatja a büntetés ellenállását.

A fokozott OFC idegsejtek ingerlékenysége és a büntetéssel szembeni ellenállás közötti ok-okozati összefüggések teszteléséhez a DAT-Cre + egerek OFC-jének piramidális idegsejtjeiben kifejeztük a gátló DREADD-t (kizárólag tervezői gyógyszerekkel aktivált tervező receptorok: CamKIIα-hM4D) (8. ábraA). Az OFC-ből származó akut szeletekben a CNO (klozapin-N-oxid) fürdőben történő alkalmazása lassú külső áramot váltott ki, amelyet valószínűleg a GIRK csatornák közvetítenek, és amelyet a bárium (Ba²⁺), a káliumcsatornák nem-specifikus blokkolója (8. ábraB). A CNO a bemeneti / kimeneti görbét is jobbra tolta (8. ábraC). Az AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry-vel fertőzött DAT-Cre + egerek az OFC-ben (8. ábraD) megszerzett DA neuron önstimulációs paradigma, amelyet két egymást követő blokk követ a büntetés ütemezésével, az elsőt CNO jelenlétében, a másodikat CNO nélkül. A két blokkot büntetés nélkül 6 nappal szakították meg (8. ábraE). Az első büntetési blokk végén, CNO jelenlétében, csak az 5 egerek 16 volt rezisztens (8. ábraF, bal oldali panel). Ezzel szemben, OFC gátlás nélkül, a második büntetési időszak alatt az 14 közül az 16 „rezisztens” besorolású (Az 8 számokF, jobb oldali panel és 8G). Más szavakkal, a rezisztens egerek aránya szignifikánsan alacsonyabb volt CNO jelenlétében, összehasonlítva az 34 egerek első korcsoportjával, amelyet korábban ugyanazon körülmények között tesztelték (csoportok közötti összehasonlítás, 8. ábraH) és hasonló lett az első kohorthoz CNO nélkül (csoporton belüli összehasonlítás). Végül, a kilenc olyan egér esetében, amelyek érzékenyről rezisztensre változtak, a CNO nem változtatta meg a farok becsapódásának késleltetését, amikor meleg vízbe merítették (8. ábraI).

Összegezve, ez a kísérlet bemutatja, hogy az OFC piramis idegsejtjeinek aktivitása meghozza a döntést az önstimuláció folytatásáról a negatív következmények ellenére, amelyek a rágcsálók függőségre való áttérésének kulcseleme.

Megbeszélés 

Egy nemrégiben javasolt függőségi modell a betegség előrehaladásának három lépését különbözteti meg: szórványos szabadidős kábítószer-fogyasztás, amelyet intenzívebb, tartósabb, fokozatosabb kábítószer-fogyasztás követ, és végül a kontroll elvesztésével járó kényszeres használat (Piazza és Deroche-Gamonet, 2013; de lásd: George és mtsai., 2014). Vizsgálatunk bizonyítja, hogy a VTA DA idegsejtjeinek stimulálása elegendő ahhoz, hogy ezt a progressziót viszonylag gyors idővel lefuttassák.

A természetben előforduló robbanásmintázat utánzásával a DA hatékony felszabadulását idézik elő a VTA célrégióiban, például az NAc-ben (Bass et al., 2010). Az NAc DA szintje tehát valószínűleg szabályozza az önstimulációt, ahogy a rágcsálók is beadják a következő kokain vagy heroin infúziót, amint a DA koncentráció a küszöbérték alá csökken (Wise et al., 1995). Ezt támasztja alá az a megfigyelésünk is, miszerint a kokain, injektálva ip-vel, elzárhatja az önstimulációt. Így a DA neuron önstimulációja szorosan hasonlít a gyógyszer önadagolására, annak ellenére, hogy kinetikája minden más farmakológiai anyagnál gyorsabb, mint a kokain, amint azt a jelen tanulmányban megfigyelt eltérő válaszarány is sugallja.

Míg szelektíven célozzuk meg a VTA DA idegsejtjeit, optogenetikus önstimulációjuk különböző élettani funkciójú sejtcsoportokkal rendelkezhet. Például nemrégiben felvetették, hogy egyes DA neuronok kódolják az averzív ingereket (Lammel és mtsai, 2012, Gunaydin és mtsai, 2014). Ezek a sejtek mPFC-re vetülnek, míg az laterális NAc héjra vetülő VTA DA neuronok pozitív megerősítést közvetítenek (Lammel et al., 2012). Érdekes lenne szelektív célzással értékelni az önstimulációt és a progressziót (Gunaydin et al., 2014). Mivel manipulációnk az összes VTA DA idegsejtet aktiválta, éppúgy, mint a kokain az összes DAT-expresszáló idegsejtre, elképzelhető, hogy egyes DA idegsejtek erősítő tanulást, míg más DA idegsejtek az idegenkedést tanulják. A nettó hatás továbbra is a viselkedés megerősítését jelentené; az „idegenkedő idegsejtek” azonban hozzájárulhatnak az ellenfél folyamatának indukciójához (Koob, 2013, Wise és Koob, 2014).

Kényszerű absztinencia után a kontextusba történő újbóli expozíció indukálta az önstimuláció, a gyógyszer relapszusának bevált rágcsálómodelljének keresését. Figyelemre méltó, hogy a mögöttes idegi plaszticitás nem különböztethető meg attól, amelyet a kokain önadagolásának visszavonása után figyeltek meg (Pascoli, Terrier et al., 2014). Ez hozzáadódik egy olyan tanulmányhoz, amely korábban azonos szinaptikus plaszticitást jelentett a VTA DA idegsejtjeiben, amelyet egyetlen optikai stimuláció vagy egy addiktív gyógyszer első injekciója váltott ki (Brown és mtsai, 2010). A szinaptikus adaptációk mintája kialakul, amely az összes addiktív kábítószerre jellemző adaptív viselkedés.

Vizsgálatunk markáns vonása az averszív ingerre adott válasz dichotómiája, amely elég erős ahhoz, hogy minden állatban megzavarja a nem alapvető természetes jutalom fogyasztását. Környezetünkben a rezisztens egerek nem mutattak szignifikánsan magasabb motivációt a jutalom önszállítására, ami ellentétben áll a patkányok kokainnal végzett vizsgálatával (Pelloux et al., 2007). Az egerek büntetéssel szembeni ellenállásának viselkedési előrejelzője azonban hiábavaló kart nyomott a DA idegsejt-stimuláció kezdetét megelőző 5 másodperc alatt. A jutalom kézbesítéséig való várakozás képtelensége tehát az impulzivitás jelzőjeként értékelhető (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton and Vezina, 2014). Érdekelt bennünket az a megfigyelés, hogy az impulzív szedés csak többszöri önstimuláció után alakult ki. Ez felveti annak lehetőségét, hogy a büntetéssel szembeni ellenállás (és a függőséggel szembeni sebezhetőség) nem lehet teljesen veleszületett, hanem a függőség felé vezető kezdeti szakaszban alakul ki. Ha ez a helyzet, akkor az általunk és mások által megfigyelt dichotómiát (Deroche-Gamonet és mtsai, 2004) nem csak genetikai tényezők határozhatják meg. Ez azt is megmagyarázná, hogy az egyének hasonló része a genetikailag viszonylag homogén egér törzsek és genetikailag bizonyosan sokszínűbb emberi populációk függővé válik.

Ha a büntetéssel szembeni ellenállás feltárja a függőséggel szembeni egyéni kiszolgáltatottságot, amely becslések szerint az embereknél még a kokain mellett is a 20% -ot teszi ki (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), akkor az itt található jóval nagyobb arány tükrözheti a közvetlen és szelektív DA neuron stimuláció erejét. Más szavakkal, a szelektív DA idegsejt stimuláció sokkal addiktívabb lehet, mint bármely gyógyszer. Ez a farmakológiai anyagok nem szelektív hatásával magyarázható. A kokain esetében például a DA-tól eltérő monoaminok késleltethetik a függőség kiváltását. A szerotonin valóban szembeszállhat a DA-függő adaptív viselkedéssel, például a feltételes jutalomra, az önstimulációra és a feltételes helypreferenciára való reagálással (Wang et al., 1995, Fletcher és Korth, 1999, Fletcher et al., 2002) az asszociáció megkönnyítésével. az averzív ingerekre utaló jelek (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternatív megoldásként a különbség az optogenetikus önstimuláció és az extracelluláris DA növekedés farmakológiai indukciója közötti kinetikai különbségben rejlik. Ilyen addiktív-potenciaváltozás is létezhet a bántalmazás különböző kábítószerei között (George et al., 2014).

Noha formálisan nem zárhatjuk ki a DA felszabadulásának és / vagy a relatív jelzésnek a különbségeket, hogy hozzájáruljanak a büntetési rezisztencia kialakulásához, ez a forgatókönyv valószínűtlen, mivel a vizsgálatban szereplő állatok fertőzésének szövettani validálása kimutatta eYFP-ChR2 kifejezés az egész VTA-ban. Ezenkívül a DA felszabadulásának telítettségére kifejlesztett optogenetikus stimulációs protokoll önstimulációhoz vezetett, amely az áttörés pontjának egységesen elosztott értékeiben tetőzött, tükrözve az ösztönző motivációt.

Egy másik meglepő eredmény, hogy az elektromos lábütések száma korrelált a PL idegsejtjeinek ingerelhetőségével. A piramis idegsejtek csökkent ingerlékenységét és az AMPAR / NMDAR arány növekedését ugyanazon sejtek piramis idegsejtjeiben figyelték meg „függő patkányokban”, ezek a vizsgálatok azonban önmagukban nem kontrollálták az elektromos sokkok hatását (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz és munkatársai, 2013, Chen és mtsai, 2013). A nem-disszociáció tehát az mPFC kettős szerepével magyarázható mind a döntési folyamatokban, mind a félelem integrációjában (Peters et al., 2009). Ezzel szemben az infralimbikus kéregben a piramis idegsejtek ingerlékenységének változása korrelál a lábrázkódásokkal (Santini et al., 2008). Ez a bizonyíték nem zárja ki annak lehetőségét, hogy az mPFC kiemelkedő szerepet játszik a bevitel utáni döntés meghozatalában. CFos elemzésünk és a belső ingerlékenység megfigyelései azonban az OFC és a cinguláris kéregre mutatnak. Ezenkívül a DREADD alkalmazásával az OFC neuronális ingerlékenységének gátlása megakadályozta a büntetéssel szembeni ellenállást. Ez az oksági kapcsolat fontos lépést jelent a függőségbe való átmenetért felelős sejtmechanizmusok megértésében. Jövőbeni tanulmányokra lesz szükség annak tesztelésére, hogy ez vonatkozik-e az addiktív szerek teljes körére is.

Eredményeink összhangban vannak azzal a megfigyeléssel, hogy az OFC diszfunkciója ronthatja a költség-haszon döntéshozatalt (Seo és Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011), és kényszeres viselkedést idézhet elő (Burguière et al., 2013 ). Emberekben a kábítószerrel való visszaélés összefügg a döntéshozatal zavaraival és az OFC működésének megváltozásával (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). Összességében az OFC neuronok aktivitása kulcsfontosságú tényezőként jelenik meg a kényszeres kábítószer-használatra való áttérésben (Everitt et al., 2007). Ez nem zárja ki az itt és más vizsgálatokban megfigyelt szerepet a drogok által kiváltott plaszticitásban az MSN-ekre gyakorolt ​​gerjesztő afferensekben (Kasanetz et al., 2010). Érdekes lesz értékelni, hogy az OFC ingerlékenységének ellenőrzésére irányuló manipulációk befolyásolják-e a szenvedélybetegek motivációját.

Itt javasoljuk a DA neuron önstimulációját, mint erőteljes modellt a függőséghez vezető szakaszok tanulmányozásához. Megismételjük a kábítószer-függőség alapvető összetevőit, például a visszaesést, a szinaptikus plaszticitást és a fogyasztás kitartását a negatív következmények ellenére. Bár a modell bizonyosan nem alkalmas egy adott gyógyszer specifikus hatásainak vizsgálatára (pl. Hasonlítsa össze az opioidokat a pszichostimulánsokkal), számos előnye van. Lehetővé teszi a jutalom pontos időbeli ellenőrzését, nagyon specifikusan csak a VTA DA idegsejteket aktiválja, és nem utolsósorban lehetőséget ad az egerek sokkal hosszabb ideig történő tanulmányozására, mint a gyógyszer önadagolásával. Az addiktív drogok meghatározó közös jellemzőire összpontosítva a remény az, hogy feltárja azokat az idegi mechanizmusokat is, amelyek a függőség nem anyagtól függő formái mögött állnak (Alavi et al., 2012, Robbins és Clark, 2015), és ezáltal hozzájárulnak a kábítószer általános elméletéhez. a betegség. Az optogenetikai betegségmodellek tehát döntő lépést tesznek lehetővé a függőség késői szakaszában fellépő idegsejtek diszfunkciójának alapos megértése érdekében, és új, racionális kezeléseket fognak irányítani a jelenleg gyógyítás nélküli betegségre.

A VP, a JT és az AH viselkedési kísérleteket végzett, míg a VP az elektrofiziológiai felvételeket végezte és koordinálta az elemzést. A tanulmányt az összes szerző készítette és írta.

A munkát a Svájci Nemzeti Alapítvány és az ERC haladó támogatása (MeSSI), a Carigest SA, a Genfi Tudományos Társaság és a Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève támogatta. JT MD-PhD hallgató, amelyet a Svájci Államszövetség fizet.

S1 dokumentum. Kiegészítő kísérleti eljárások és ábrák S1 – S6

S1 táblázat. Statisztikai elemzések