Az optogenetika feltárja a dopamin D2 receptorokat expresszáló accumbal közepes tüskés neuronok szerepét a kokain által kiváltott viselkedési szenzibilizációban (2014).

Ugrás:

Absztrakt

Javasolták, hogy a nukleáris accumbensben (NAc) belül tartós, gyógyszer által kiváltott adaptációk hozzájáruljanak a kábítószer-közvetített addiktív viselkedéshez. Itt egy optogenetikai megközelítést alkalmaztunk a dopamin D2 receptorokat (D2R) expresszáló NAc közepes tüskés neuronok (MSN) szerepének vizsgálatára a kokain által kiváltott viselkedésérzékenységben. Az adeno-asszociált vírusvektort a Chr2-t kódoló csatorna-rodopszin-2-et adtuk be a D2R-Cre transzgenikus egerek NAc-be. Ez lehetővé tette számunkra, hogy szelektíven fotostimuláljuk a D2R-MSN-eket a NAc-ben. A D2R-MSN lokális gátló áramköröket képez, mivel a D2R-MSN fotostimulációja a szomszédos MSN-ekben gátló posztszinaptikus áramokat (IPSC) váltott ki. A NAc D2R-MSN fotostimulációja in vivo nem befolyásolta sem a kokain által kiváltott viselkedési érzékenység kialakulását, sem a kifejeződését. Azonban a fotostimuláció a gyógyszer megvonási periódusa alatt gyengítette a kokain által kiváltott viselkedési érzékenységet. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a NAc D2R-MSN-ek kulcsszerepet játszanak a megvonás által indukált plaszticitásban, és hozzájárulhatnak a visszaeséshez a kábítószer-használat megszűnése után.

Kulcsszavak: optogenetika, közepes tüskés neuronok, dopamin D2 receptorok, kokain, drogfüggőség

Bevezetés

A dopamin (DA) jelátvitelhez jutalmazási elvárás és célirányos viselkedés kapcsolódik (Wise, 2004; Goto és Grace, 2005; Berridge, 2007). A dopaminerg rendellenességek egyik jól ismert patológiája a drogfüggőség (Robinson és Berridge, 1993, 2003). Az addiktív anyagok ismételt expozícióját követően a DA-mezolimbikus úton molekuláris és celluláris szinten adaptív változások következnek be; ezek kábítószerfüggőséghez vezethetnek, ami egy krónikus, relapszív rendellenesség, amelyben a kényszeres kábítószer-keresés és a kábítószer-viselkedés viselkedése komoly negatív következményei ellenére is fennáll (Thomas et al., 2008; Baik, 2013). A drogfüggő dopaminerg rendszerben bekövetkező módosítások jellemzése tehát kulcsfontosságú a kábítószer-függőség megértéséhez.

A dopamin D1 receptorok (D1R) és a D2 receptorok (D2R) erősen expresszálódnak a striatum közepes tüskés neuronjaiban (MSN). Javasolták, hogy a ventrális striatumban, a nukleáris accumbens-ként (NAc) ismert hosszabb ideig tartó gyógyszerindukálások hozzájárulnak a függőség kialakulásához, valamint a kábítószer-kereső és visszaeső viselkedéshez (Lobo és Nestler, 2011; Smith és mtsai. 2013). A ventrális tegmentális területről származó dopaminerg sejtek többnyire a NAc-t idegzik. Az NAc-ben lévő sejtek több mint 95% -a az MSN-k, amelyek négy fő agyrégióból származó excitációs bemeneteket kapnak: a prefrontális kéreg, a hippocampus ventralis aliculumja, a bazolaterális amygdala és a thalamus (Sesack és Grace, 2010; Lüscher és Malenka, 2011). Az NAC-n belül az MSN-ek két fő alcsoportra oszthatók: közvetlen útvonali MSN-ek, amelyek D1R-eket expresszálnak, és közvetlenül a középső agyi DA-területekre, és a D2R-eket expresszáló közvetett útvonalú MSN-ekre és a ventrális pallidumra (Kreitzer és Malenka, 2008; Sesack és Grace, 2010; Lüscher és Malenka, 2011; Smith és mtsai. 2013). Mivel az MSN GABAerg, az MSN neuronok aktiválása gátolja a későbbi célpontjaikat, amelyek szintén GABAergic (Chevalier és Deniau, 1990). Ezért a D1R-MSN-ek aktiválása izgatja a középső agyi neuronokat, amelyek ezután hozzájárulnak a jutalomhoz kapcsolódó viselkedések szabályozásához (Lüscher és Malenka, 2011; Bocklisch és mtsai. 2013).

A géntechnológiával módosított egerek, amelyek sejt-specifikus módon expresszálják a Cre-rekombinázt, a legújabb vizsgálatokban a D1R-MSN-ek és a D2R-MSN-ek különböző szerepét mutatták ki a kokain-függőség viselkedésében. Az ilyen egerek lehetővé teszik a specifikus toxinok, optogenetikus szondák vagy DREADD (kizárólag egy tervező gyógyszer által aktivált tervező receptorok) genetikai célzását, hogy szelektíven manipulálják a D1R-MSN-t vagy a D2R-MSN-t. Ez a megközelítés bizonyos konszenzushoz vezetett az MSN-ek addiktív viselkedésében betöltött szerepéről: a D1R-MSN-ek nyilvánvalóan elősegítik az addiktív viselkedést, míg a D2R-MSN-ekre vonatkozóan nem javasoltak specifikus szerepet (vagy gátló szerepet) a gyógyszer okozta addiktív viselkedés kialakulásában. (Hikida et al., 2010; Lobo és mtsai. 2010; Ferguson és mtsai. 2011; Bock és mtsai. 2013). A kokain-expozíció nyilvánvalóan szinaptikus módosulást és a génexpresszió változását indukálja mindkét MSN populációban (Lobo et al., 2010; Lobo és Nestler 2011; Grueter és mtsai. 2013). Bár úgy tűnik, hogy a D1R-MSNs és a D2R-MSN ellentétes szerepet játszanak a kokain által közvetített addiktív viselkedésekben, a D2R-MSN-ek pontos szerepe nem világos.

Korábban kimutatták, hogy a D2R knockout (KO) egerek normál kokain által közvetített viselkedési szenzitizációt és kokain-kereső viselkedést mutatnak, a D2R hiányából adódó érzékenység csak kis mértékben csökken (Baik et al., 1995; Chausmer és mtsai. 2002; Sim és mtsai. 2013). Azonban a kábítószer-visszavonás során fellépő stressznek való kitettség elnyomja a kokain által kiváltott viselkedési szenzibilizáció, valamint a kokain-kereső és visszaeső viselkedések kifejeződését a D2R KO egerekben (Sim és mtsai. 2013). A D2R specifikus letörése a NAc-ben nem befolyásolja a bazális lokomotor aktivitást, sem a kokain által kiváltott magatartásérzékenységet, hanem a stressz képességét gátolja a kokain által kiváltott magatartásérzékelés kifejeződésének gátlására (Sim et al., 2013). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a D2R blokkolása a NAc-ben nem akadályozza meg a kokain által közvetített viselkedési szenzibilizációt. Inkább úgy tűnik, hogy a D2R az NAc-ben jelentős szerepet játszik a stressz által kiváltott szinaptikus módosítások szabályozásában a megvonás során, ami a kokainkeresés és a visszaesés viselkedésének növekedéséhez vezet (Sim et al., 2013).

Itt optogenetikát alkalmaztunk, hogy tovább értékeljük a NAc D2R-MSN-ek szerepét a kokain által kiváltott viselkedési érzékenységben. Az agyszeletek segítségével megállapítjuk, hogy a D2R-MSN fotostimulációja aktiválja a NAc-ben a szomszédos MSN-eket érintő lokális gátló áramköröket. Az NAc D2R-MSN-ek fotostimulációja in vivo nem befolyásolja sem a kokain által kiváltott viselkedési érzékenység kialakulását, sem a kifejeződését. Azonban a NAc D2R-MSN ismétlődő aktiválása a gyógyszer megvonási periódusában gyengíti a kokain által kiváltott addiktív viselkedést. Eredményeink azt mutatják, hogy a NAc D2R-MSN-ek kulcsszerepet játszanak a megvonás által indukált plaszticitásban, és hozzájárulhatnak a visszaeséshez a kábítószer-használat megszűnése után.

Anyagok és metódusok

Egér

A C2Bl / 57 háttérrel rendelkező D6-Cre BAC transzgenikus egereket az MMRRC-től (Mutant Mouse Regional Resource Centers, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd) szereztük be. A D2-Cre egerek kontrolljaként viselkedési kísérletekben a D2-Cre transzgént hiányzó alomtársakat használtuk. Az egereket egy specifikus kórokozómentes gátlószerkezetben tartottuk állandó hőmérséklet és páratartalom mellett, és 12-h fényben, 12-h sötét ütemezésben. Az állatok gondozását és kezelését a Koreai Egyetem Állat-egészségügyi és Felhasználási Bizottságai által jóváhagyott szabványoknak és a KIST-nek megfelelően hajtották végre.

Vírusvektor előkészítése

A pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE-t nagyszerűen Karl Deisseroth (Stanford Univ.) nyújtotta. Az AAV előállításához a HEK293T sejteket DMEM táptalajban tenyésztettük antibiotikumokkal és FBS-sel. A transzfekciót megelőző napon az 90 cm-es edényekből az 10% -os konfluencia után négy lemezt helyeztünk öt 15 cm-es edényre, és 18-22 h vagy 60-ig 70% konfluenciaig inkubáltuk. A HEK293T sejteket pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ és pHelperrel transzfektáltuk jetPEI transzfekciós reagenssel (QBiogene). A DNS / DMEM / PEI koktélt vortexeltük és szobahőmérsékleten inkubáltuk 20 min. Inkubálás után a transzfekciós keveréket minden egyes 15 cm edénybe adagoltuk. A transzfektált sejteket a transzfekció után 48 h-on gyűjtöttük, és 0.5 ° C-on 6750 h-ra 50% nátrium-dezoxikolát (Sigma; D1014) és 37 egység / ml benzonáz nukleazt (Sigma; E1) inkubáltuk. A sejttörmeléket 3000 x g-vel 15 percen végzett centrifugálással eltávolítjuk, majd a felülúszót egy 0.45 mm PVDF szűrőn (Millipore) szűrjük. Az AAV-DJ részecskék tisztítását HiTrap heparin affinitás oszlopokkal (GE Healthcare) végeztük. Az AAV koncentrációjára az Amicon ultra-15 centrifugális szűrőegységeket használtuk 100,000 molekulatömeggel. A koncentrált vírust aliquotként és −80 ° C-on való tároláshoz lefagyasztottuk. A végső víruskoncentráció 3 ~ 6 × 10 volt12 AAV vírusrészecskék ml-enként.

Sztereotaxikus injekció és optikai szálas elhelyezés

Az állatokat 1.6 µl Zoletil és 0.05 µl xilazin (Rompun, Bayer) / testtömeg-gramm ip injekcióval altattuk és sztereotaxiás készülékbe helyeztük (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). A vírusok injektálásához 31 g-os fecskendő tűt használtunk 2 µl vírus kétoldalú infúziójához 0 ° -os szögben (AP +1.7; ML ± 1.3; DV −4.5) 0.1 ul / perc sebességgel. Az injekció beadása után a tűt 10 percig a helyén hagyták, mielőtt lassan kihúzták volna. A beültetésre szálas optikai kanül cirkóniumhüvelyből (1.25 mm átmérőjű és 4.5 mm hosszú) és lapos optikai szálból (200 um átmérőjű) állt. A száloptikai kanül beültetését NAc-be a D2-MSN-ek megvilágításához közvetlenül a vírusok injektálása után hajtottuk végre. A száloptikai kanül beültetésének koordinátái 0 ° -os szögben voltak (AP +1.7; ML ± 1.35; DV -4.2) az NAc célzásához. Az optikai szál lehorgonyzásának elősegítése érdekében két csavart rögzítettek a koponyába a száloptikai kanül beültetési helyének hátsó részén. A száloptikai kanül rögzítésére a koponyára a C&B Superbond-ot (Sun Medical) vezették a koponya felületére a kanül alapja körül. Miután a C&B Superbond megkeményedett, a kanült kiszabadították a tartóból, és a kanült és a csavarokat körbevitték a fogcementet (Poly-F, Dentsply). A kanülációs hely körüli bemetszés lezárásához Vetbond szövetragasztót (3 M, 7003449) alkalmaztunk. A beültetés után az egereknek szubkután antibiotikumot (Enrofloxacin, 5 mg / kg, q 12 óra) és fájdalomcsillapítást (Carprofen, 5 mg / kg, q 24 óra) injektáltak 3 egymást követő napon keresztül.

In vivo photostimulation

Az 200 µm patch kábelt a krónikusan implantálható optikai szál külső részére csatlakoztattuk egy hüvely segítségével. Az optikai szálakat egy FC / PC adapteren keresztül csatlakoztattuk egy kék lézerdiódához (473 nm, MBL-III 473-150 mW), és a fényimpulzusokat egy stimulátoron (BNC 575) generáltuk. A ChR2-t expresszáló neuronok fotostimulációjához a stimulációs paradigma 20 Hz frekvencia, 5 ms impulzus időtartam és 2 – 5 mW volt. A patch kábel által kibocsátott fényerőt egy mérőműszerrel (PM100D) mértük egy S121C fényérzékelővel.

Viselkedési elemzés

A viselkedési kísérleteket hím D2-Cre egerekkel végeztük 11 – 13 hetes korban, kivéve az elektrofiziológiai elemzésnek alávetett egereket, amelyek 5 – 6 hetes koruk voltak. Az életkorhoz igazított D2-Cre és Cre negatív kontroll egereket vírussal injektáltuk, és egyedileg helyeztük el, és a viselkedési tesztig a ketrecbe aklimatizálódtak. Minden manipulációhoz az egereket a kísérleti helyiségbe helyeztük min. A kísérlet megkezdése előtt, hogy lehetővé tegyük a habituációt és a stressz csökkentését (a kísérleti hely fényereje 60 lux). Minden kísérleti készüléket 70% etanollal tisztítottunk a kísérletek között, hogy eltávolítsuk az esetleges szagjeleket.

Kokainszenzibilizáció

A kokainszenzibilizáció megkezdéséhez az egereket 3 egymást követő napokon szokásos sóoldat-injekciókhoz (ip) szoktattuk, majd sóoldattal vagy kokainnal (15 mg kg) adtuk be.-1, ip) 5 egymást követő napokban. Az egereket intraperitoneálisan (ip) injektáltuk kokain-hidrokloriddal (Johnson Mattney, Edinburgh, UK), sóoldatban (0.9% NaCl) vagy sóoldatban 30 G tűvel. Közvetlenül az egyes injekciók után az egereket vízszintes mozgási aktivitásra teszteltük egy szabadtéri kamrában 30 min. A fotostimuláció hatásának mérésére az érzékenyítés kezdetére és expressziójára (ábra...5) 5), az egereket kék fényben megvilágítottuk kettős száloptikás patch zsinórral az NAc-hez négy 3 perces periódus alatt az otthoni ketrecekben. Az egér koponyán található száloptikás kanülből származó patch zsinórokat eltávolítottunk, és az egereket legalább 30 min. Az egereket ezután kokain vagy sóoldattal (coc 10d-coc 1d) injektáltuk. A szenzibilizáció megkezdése után a kokainot 5 napokra visszavonták sóoldat injekció nélkül. Ebben az elállási időszakban nem alkalmaztak fotostimulációt. A viselkedési érzékenység fokozását a kokainnal szemben a hatóanyag kihívó adagjának (14 mg kg) injekciójával határoztuk meg.-1, ip) az NAc fotostimulációja után, amint az az 1. ábrán látható Figure5A.5A. A fotostimuláció hatásának mérése a kokain visszavonási periódusában (1. \ T (Figure6), 6), az egereket ugyanezen protokollnak vetettük alá a fentiekben leírt szenzitizáláshoz (az 1. ábra szerint) Figure5) 5), kivéve a fotostimulációt. A kokainszenzibilizáció megkezdése után az 1 h naponta alkalmazták a fotostimulációt az 14 h-nál az 14 h napok teljes elvonási ideje alatt. 10 napok kivonása után az egerek minden csoportját beoltottuk a kokain hatásos dózisával (XNUMX mg kg-1).

ábra 1 

Közepes tüskés idegsejtek szelektív fotostimulációja a nukleáris accumbensben. (A) A ChR2 szelektív expressziója a NAc D2R neuronokban az AAV-DIO-ChR2-EYFP vírusvektorok bejuttatásával. méretarányok: háttérkép, 1 mm: betét, 200 µm. (B) Konfókális képek ...
ábra 2 

A D2RCre-MSN-ek fotostimulációja helyi gátló áramköröket vezet. (A) Egy élő NAc szelet konfokális képe, amely olyan festékkel töltött neuront mutat, amely nem expresszálja a ChR2-et és egy szomszédos cellát (nyílhegy), amely ChR2-et expresszált és fotostimulálható. (B) IPSC ...
ábra 3 

A NAc sejtek tulajdonságai. (A) Alexa 594-tel töltött neuronok két foton fluoreszcens képe. (A1) egy neuront mutat a ChR2 + / AP csoportból, míg (A3) egy neuront mutat a ChR2− / IPSC csoportból. (A2) és a (A4) nagy nagyítású képek a ...
ábra 4 

A D2-MSN-ek in vivo optogenetikus aktiválásának hatása a NAc-ben a bazális lokomotor aktivitásra. (A) A D2 Cre egereknek az AAV-DIO-ChR2-EYFP-vel beinjekciózott sagittális nézete, amelyet a száloptikás kanül kétoldalú beültetése követett. 473 nm kék fény stimuláció ...
ábra 5 

A D2-MSN aktiválásának hatása a kokainra való szenzibilizáció során. (A) Kísérleti séma a D2-MSN fotoszimulálására a kokainra való szenzibilizáció megindítása és expressziója során. A kék fény megvilágítása (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) négy ...
ábra 6 

A D2-MSN aktiválásának hatása a visszavonáskor a ismételt kokain-expozícióra. (A) Kísérleti séma a D2-MSN fotoszimulálására a kokainra való visszavonás során. Kék fényű megvilágítás (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) nyolc 3-perc periódusban került szállításra ...

Immunofluoreszcencia és konfokális lézer mikroszkópia

Immunfluoreszcencia esetén az egereket Zoletil-nel (Virbac, 1.6 / l, gél, intraperitoneálisan) és 0.05 µl / g Rompun-val (Bayer) érzéstelenítettük, és szűréssel sterilizált 0.1 M PBS-sel perfundáltuk, majd 4% paraformaldehid / PBS oldat (Sigma) alkalmazásával rögzítettük. Ezután az agyat eltávolítottuk és 4-hez rögzítettük jéghideg fixálószerrel, mint fent. Az agyat ezután 30% -os szacharóz / 0.1 M PBS-ben dehidratáltuk 2 napokra. Ezután az agyakat fagyasztottuk és 40-µm vastag, egymást követő koronális metszeteket készítettünk egy kriosztáton (Leica CM 1900, Németország). 40 h PBS-t tartalmazó 1 M PBS-ben 0.1-hez és 5% Triton X-0.2-hez tartozó 100 M PBS-eket blokkoltunk, és 2 ° C-on egy éjszakán át inkubáltuk nyúl poliklonális anti-D1R (500: 5084, Millipore, AB4P). 0.2% Triton X-100-et tartalmazó PBS-sel való mosás után a mintákat RT-n 1 h-on inkubáltuk Alexa Fluor 568 kecske anti-nyúl IgG-vel (1: 500; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) és 0.2 µl / ml 4, 6-diamidino-2-fenil-indol-HCl (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, USA) 1% normál kecske szérumot és 0.2% Triton X-100-t tartalmazó PBS-ben. Negatív kontrollként a mintákat csak DAPI-val és a másodlagos antitesttel inkubáltuk. A szakaszokat C1 Plan Apo × 40 / 1.4 vízkonokális lézer szkenner rendszeren (LSM 700, Zeiss, Berlin, Németország) vizsgáltuk.

Elektrofiziológia és fotostimuláció a magvakban

Az egereket a vírus injekciót követő hetekben 4 kísérletekhez alkalmaztuk, hogy elérjük a ChR2-EYFP optimális expresszióját. Az egereket ezután érzéstelenítettük és akut agyszeletek előállítására dekapitáltuk. Az agyot gyorsan eltávolítottuk és azonnal jéghideg vágóoldatba helyeztük, amely (mM-ban) 250 szacharózt, 26 NaHCO-t tartalmazott.310 D-glükóz, 3 Myo-inozit, 2.5 KCl, 2 Na-piruvát, 1.25 NaH2PO4, 0.5 aszkorbinsav, 1 kinurénsav és 7 MgCl2 amelyet 95% O-val buborékoltattunk2/ 5% CO2 (pH = 7.4). A NAc-t tartalmazó koronális agyszeleteket (250 µm vastag) vibratom (Leica VT 1200 S) alkalmazásával állítottuk elő, majd gáztalanított mesterséges cerebrospinális folyadékban (ACSF) inkubáltuk (mM): 11 D-glükóz, 125 NaCl, 25 NaHCO.3, 1.25 NaH2PO42.5 KCI, 1.25 MgCl2 és 2.5 CaCl2 34 ° C-nál 1 h felvétel előtt. A szeleteket ezután egy bemerülő rögzítő kamrába vittük át, amelyben O2a telített ACSF-oldatot folyamatosan szuperfundáltuk. A NAc-ben és a VTA-ban lévő sejteket 2-fotonmikroszkóppal (Olympus FV1000 MPE, Tokió, Japán) egy 25X vízzel merevítő objektívvel és infravörös DIC optikával ábrázoltuk. A teljes sejtes patch clamp felvételeket NAc cellákból nyertük egy Multiclamp 700B erősítővel és Digidata 1440A digitalizálóval (Molecular Devices, LLC). Az adatokat pCLAMP 10.2 szoftverrel vettük, és tovább elemeztük a Clampfit 10.2 szoftverrel (Molecular Devices, LLC). Az 3 – 5 MΩ ellenállásokkal rendelkező patchelektródokat egy belső oldattal töltöttük (mM-ben): 130 K-glükonát, 2 NaCl, 2 MgCl220 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA és 10 Na2- foszfokreatin, pH-ját 7.3 N-re állítva 1 N KOH alkalmazásával. Bicukullint (10 µM) alkalmaztunk fürdőn az agyszeletre a GABA receptorok blokkolására a kísérletek egy részében.

A ChR2-EYFP-t expresszáló NAc-sejteket egy LED-es fényforrással (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix) fényképeztük. A LED-ből származó kék fényt tovább szűrjük és gyengítettük egy gerjesztőszűrővel (470 – 495 nm) felszerelt szűrőkockával; villog a fény (10 ms időtartam, 0.0366 – 0.354 mW / mm2) az 25X objektív lencse segítségével az 5 – 40 Hz frekvenciákon keresztül szállították az agyszeletre. A kísérletek egy részhalmazában ChR2-t expresszáló sejtekben a fényáramokat mértük, az 2 időtartamának fénye villog.

Statisztikai elemzés

Az adatokat átlag ± fél értékként mutatjuk be, és a kétfős hallgatóval elemeztük t-teszt vagy kétirányú varianciaanalízis, amelyet Bonferroni követ post hoc teszt. A PA <0.05 értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

Közepes tüskés idegsejtek szelektív fotostimulációja a nukleáris accumbensben

A NAc D2R-MSN-eknek a kokain által közvetített addiktív viselkedésben betöltött szerepének meghatározásához optogenetikai megközelítést alkalmaztunk a NAc D2R neuronok stimulálására. A D2R-MSN-ek NAc aktivitásának fényes szelektív szabályozására az AAV-DIO-ChR2-EYFP-t kódoló vírusvektorokat sztereotaxikusan injektáltuk a D2R-Cre BAC transzgenikus egerek NAc-be. 4 héttel a vírusinjekció után, a ChR2-EYFP erős expresszióját figyelték meg a NAc-ben (ábra). (Figure1A) .1A). A D2R-MSN-ekben a ChR2-expresszió specifitását immunfluoreszcens konfokális analízissel igazoltuk: az YFP-vel jelölt ChR2 expresszióját a D2R-rel együtt lokalizáltuk NAc-ben (ábra). (Figure1B), 1B), ami azt mutatja, hogy a ChR2-et expresszálták D2R-t expresszáló neuronokban a NAc-ben.

Bár egy ilyen megközelítést más tanulmányokban is alkalmaztak (pl. Lobo et al., 2010), a vírusbeviteli eljárások részletei laboratóriumokban változnak, ezért fontos, hogy az optogenetikai szabályozást speciális kísérleti körülményeinkben dokumentáljuk. Meghatároztuk a ChR2 funkcionális expresszióját azáltal, hogy a teljes sejtes patch clamp felvételeket az MSN-ekről NAc szeletekben készítettük. Az MSN-eket (1) egy viszonylag hiperpolarizált nyugalmi membránpotenciál (RMP) azonosította, jellemzően negatívabb, mint a -80 mV; (2) az AP áramütés szokásos mintája az alkalmazott áramimpulzusok hatására; (3) hosszú késleltetés az első AP tüzeléséhez áramimpulzus alatt; (4) hiperpolarizáció által aktivált kationáram (Ih); és (5) viszonylag kis méretű sejtük (Chang és Kitai, 1985; O'Donnell és Grace, 1993; Le Moine és Bloch, 1996; Taverna és mtsai. 2008). A teljes látómezőn (470 mm) kék fényt (0.78 nm) alkalmaztunk2) miközben az MSN-eket feszültség-szorítással rögzítik a −69 mV tartási potenciáljával. Egyes MSN-ek ChR2-et fejeztek ki, amelyek nyilvánvalóak YFP fluoreszcenciájukban (nyilak a számokban) 1C1, C3). Az ilyen neuronok jelentős fényáramokat mutatnak, és a fényesebb ingerek nagyobb fényáramokat váltottak ki (Figure1D) .1D). A csúcsfényképes amplitúdó és a fényintenzitás közötti kapcsolat (1. \ T (Figure1E) 1E) az 0.054 ± 0.0023 mW / mm feletti maximális fényérzékenysége volt2 és az 1.16 ± 0.16 nA maximális csúcs amplitúdója (átlag ± sem, n = 4).

Aktuális szorító körülmények között a fényimpulzusok vonatára adott válaszként megbízhatóan válaszolnak a ChR2 tüzelt AP-k kifejező MSN-ek (10 ms időtartam; Figure1F) .1F). Ilyen körülmények között a fényintenzitás nagyobb, mint az 0.1 mW / mm2 elegendő volt az AP-k kiváltásához (1. ábra) (Figure1G, 1G, n = 5). Az AP-ket megbízhatóan kiváltottuk a fotostimulációs frekvenciáknál 20 Hz-ig, míg az 40 Hz-en a fény által kiváltott válaszok összeadódtak ahhoz, hogy tartós depolarizációt okozzanak, amely kevésbé volt hatékony az AP-k kiváltásakor (ábra) 1F, G).

A D2R-MSN-ek fotostimulációja helyi gátló áramköröket vezet

A D2R-MSN-eknek a NAc helyi áramkörökre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára a ChR2-et expresszáló preszinaptikus MSN-t fotostimuláltuk, miközben a posztszinaptikus válaszokat ChR2-negatív MSN-ekben mérjük (ábra). (Figure2A) .2A). A neuron az 1. ábrán látható Figure2A2A nem expresszálja a ChR2-et, amint azt az EYFP fluoreszcencia hiánya, valamint a rövid latenciájú fényáramok hiánya jelzi, mint amilyeneket az 1. ábra mutatja. Figure1D.1D. Azonban, ha a posztszinaptikus MSN-eket a -69 mV potenciálaként tartották, az 10 ms időtartamjelző fénye az 9.0 ± 0.42 ms késleltetése után kiváltott kifelé irányuló áramokat villog (ábra). (Figure2B, 2B, n = 15). Ezen válaszok természetének meghatározásához a posztszinaptikus membránpotenciál a -99 mV és -39 mV között változott, miközben egy villanófényt alkalmaztunk (ábra). (Figure2C) .2C). A fény által kiváltott válaszok a membránpotenciáloktól függtek (Figure2D, 2D, n = 6) és megfordította a polaritást a -81 ± 3.4 mV-nál. Figyelembe véve, hogy a kloridionok egyensúlyi potenciálja - 80 mV ionos körülmények között, a fény által kiváltott kifelé irányuló áramok a posztszinaptikus GABA által közvetített kloridáramnak tudhatók be.A receptorokhoz. A lehetőség teszteléséhez a GABAA A külső oldathoz a receptor antagonista bicuculline-t (10 uM) adtuk. Ez a gyógyszer teljesen blokkolta a fény által kiváltott válaszokat (Figure2B), 2B), megerősítve, hogy a fény által kiváltott válaszok GABAerg gátló posztszinaptikus áramok (IPSC) voltak.

A fotostimulációra adott válaszuk alapján az általunk rögzített MSN-ket a 4 csoportok egyikébe sorolhatjuk: (1) sejtek, amelyek a fentiekben ismertetett fotostimulációra (ChR2 + / AP) megfelelő mennyiségű ChR2-t expresszálnak. (2) sejtek, amelyek kis mennyiségű ChR2-et expresszálnak, amely a fényre adott válaszként alsó küszöbértékű depolarizációt mutatott (ChR2 + / No AP); (3) csendes sejtek, amelyek nem mutattak ki ChR2-et, de ChR2-et (ChR2− / IPSC) expresszáló preszinaptikus MSN-ekből fényindukált IPSC-ket kaptak; és (4) ChR2-negatív sejtek, amelyek nem mutattak IPSC-ket más MSN-ek fotostimulációjára adott válaszként (ChR2− / No IPSC). Az egyes kategóriákban a sejtek relatív arányát az 1. ábrán mutatjuk be Figure2E2E (n = 53). Összességében a sejtek közel fele (45.3%) kifejezte ChR2-ot (csoportok (1) és (2) összege). Az általunk felvett MSN-ek egyike sem mutatott ki fotokeveréseket és IPSC-ket a fotostimulációra adott válaszként; ez azt jelzi, hogy a D2R-pozitív MSN-ek nem inerválják ugyanezen sejtpopuláció más tagjait a NAc-ben.

A fényre adott válaszok osztályozása azt mutatja, hogy a ChR2 + / No AP sejtek (2 csoport) és a ChR2− / No IPSC sejtek (4 csoport) fotostimulációja nem generál semmilyen elektromos jelet, amely hozzájárulhat az áramkör tevékenységéhez. Tehát a fotostimuláció áramkörökre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához részletesen jellemeztük a ChR2 + / AP MSN-ek (1 csoport) tulajdonságait, amelyek AP-ket generálnak, amikor a NAc fotostimulálódik, és ChR2− / IPSC sejtek (3 csoport), amelyek posztszinaptikusak a ChR2 + / AP MSN-ekhez, mert fényindukált IPSC-ket kapnak. A NAC-ben a ChR2 + / AP és a ChR2- / IPSC sejtek mind tüskés neuronokként azonosultak (ábra). (Figure3A) .3A). Ezekben a két csoportban nem volt szignifikáns különbség a neuronok morfológiai vagy elektrofiziológiai tulajdonságaiban. Például a két csoportban a neuronok egy része hasonló méretű volt (Figure3B) .3B). RMP-k (-83.0 ± 1.7 vs. -85.0 ± 1.8 mV; átlag ± sem; n = 10, ábra Figure3C) 3C) és bemeneti ellenállások (113 ± 15 vs. 133 ± 13 MΩ, n = 6, ábra Figure3D) 3D) szintén nem különböztek (p > 0.05 kétfarkú diák t-teszt), míg az AP impulzusmintáik az áramimpulzusok alapján válaszolnak 3E, F) hasonlóak voltak (p > 0.05 kétfarkú diák t-teszt, n = 6). Összefoglalva, a D2R-MSN-ek fotostimulációja NAc-ben aktiválja a lokális gátló áramköröket a posztszinaptikus neuronokkal, amelyek nagyon hasonlóak a D2R-MSN-ekhez, de nem expresszálják a D2R-t.

A NAc D2R-MSN-ek optogenetikus stimulációja a kokain által kiváltott viselkedésérzékenységben

Ezt követően megvizsgáltuk a in vivo a NAc D2R-MSN-ek fotostimulációja. Mivel a D2R-MSN fotoreakciója a dorsalis striatumban csökkenti a lokomotoros aktivitást (Kravitz et al., 2010), elkezdtük az accumbens D2R-MSN aktiváció hatásának jellemzését a bazális lokomotor aktivitásra. Ebből a célból a D2R-Cre egereket DIO-AAV-ChR2-EYFP vírussal kétoldalúan injektáltuk az NAc-be (D2-Cre (+) NAc-ChR2). A D2R-MSN-eket ezután fotoszimuláltuk kék fénygel (473 nm, 5 ms impulzus időtartama, 20 Hz) egy optikai szálon keresztül. A fotostimulust négy 3-perc időtartam alatt alkalmaztuk az 50 min-munkamenetben, amikor az egereket a mozgásszervi felvételi kamrában tartottuk (ábra). (Figure4A) .4A). Ezzel párhuzamosan, mint egy kontroll nem Cre WT alomtárs egeret hasonlóan injektáltunk vírussal, és hasonló kék fény megvilágítást kaptak. D2-Cre (+) NAc-ChR2 egerek összehasonlított vagy enyhén emelt szintű bazális lokomotoros aktivitást mutattak a kontroll D2R-Cre (-) NAc-ChR2 egerekhez képest. 4B, C). A D2R-MSN-ek fotostimulációja D2-Cre (+) NAc-ChR2 egerekben a mozgásszervi aktivitás szignifikáns csökkenését eredményezte, amely a megállt fény ingerlése után helyreállt. (Figure4B) .4B). Ilyen hatás nem volt megfigyelhető a kontroll D2R-Cre (-) NAc-ChR2 egerekben 4B, C), ami azt jelzi, hogy a fotostimuláció hatását a ChR2 aktiválása okozta, nem pedig lehetséges nem specifikus hatások, mint például az agyszövet melegítése. Ezért adataink azt mutatták, hogy a D2R-MSN-ek fotostimulációja NAc-ben a lokomotoros aktivitás csökkenését váltotta ki.

Ezek az eredmények megállapították, hogy képesek vagyunk a D2R-MSN-ek aktivitásának ellenőrzésére NAc-ben in vivo. Ezt követően ezt a képességet arra használtuk, hogy megvizsgáljuk a D2R-MSN aktivitásának a viselkedési érzékenységre gyakorolt ​​hatását a kokain ismételt adagolására. A viselkedési szenzibilizáció olyan folyamatra utal, amely lehetővé teszi a pszichostimulánsok, például a kokain kezdeti expozícióját, hogy fokozzák a későbbi hatóanyag-expozíciók képességét a mozgásszervi aktivitás stimulálására. Ezt az eljárást iniciációs és expressziós fázisokra lehet szétválasztani: az iniciálás a viselkedési érzékenységet kiváltó közvetlen neurális eseményeket írja le (Vanderschuren és Kalivas, 2000; Sim és mtsai. 2013), míg az expresszió ismert, hogy a viselkedési plaszticitás tartós formája, amely a gyógyszer visszavonása után is fennáll (Vanderschuren és Kalivas, 2000; Sim és mtsai. 2013). Ezért megvizsgáljuk a kokain által kiváltott viselkedési érzékenységet a kokain ismételt intraperitoneális (ip) injekciói során, miközben az optogenetikát alkalmaztuk a D2R-MSN-ek NAc aktivitásának szabályozására mindegyik fázisban.

Az 3 napokon végzett fiziológiás sóoldat beadása után 15 egymást követő napokon egereket injektáltunk kokaint (5 mg / kg), és az egyes injekciók után 30-re lokomotoros válaszokat regisztráltunk. (Figure5A) .5A). A fotostimulusokat 30 min-szekciók során szállították a kokain-befecskendezés előtt, az 3 min. (Figure5A) .5A). Tekintettel arra, hogy a D2R-MSN-ek fotostimulációja NAc-ben csökkenti a bazális lokomotoros aktivitást ( (Figure4), 4), a fotostimulusokat közvetlenül a kokain beadása előtt adták be, hogy elkerüljék a kokain injekcióra adott viselkedési válaszok esetleges interferenciáját.

Mind a kontroll D2-Cre (-) NAc-ChR2 egerek, mind a D2-Cre (+) NAc-ChR2 egerek az ismétlődő kokaininjekciók hatására szignifikánsan növekedtek a mozgásszervi aktivitásban (ábra). (Figure5B), 5B), ami a szenzibilizáció megkezdését jelzi. Úgy tűnt, hogy a D2R-MSN-ek fotostimulációja a NAc-ben nem befolyásolja a viselkedési érzékenység kialakulását, mivel a kokain által kiváltott viselkedési szenzibilizáció hasonló volt a D2-Cre (+) NAc-ChR2 egerekben és a kontroll D2-Cre (-) NAc-ChR2 egerekben.

A viselkedésérzékenyítés indukálása után az 15 napokban megismétlődő ilyen kokain-injekciók (5 mg / kg) megismétlésével a gyógyszert 14 napokra visszavonták, és a szenzibilizáció mértékét vizsgáltuk az egerek kisebb kokaindózissal való megfertőzésével (10 mg / kg). A szenzitizáció kifejeződése a viselkedési plaszticitás tartós formája, amely a gyógyszer visszavonása után is fennáll (Steketee és Kalivas, 2011; Sim és mtsai. 2013). A D2R-MSN-ek szenzitizáció kifejeződésében betöltött szerepének vizsgálatára a NAc-t közvetlenül a kokain beadása előtt fotostimulálták. (Figure5A) 5A) és a szenzibilizációt a kokain injekció által indukált mozgásszervi aktivitás mennyiségének mérésére használtuk.

Mindkét kokain előkezelt egércsoportban - D2-Cre (-) NAc-ChR2 egerek (D2-Cre (-) :: coc-coc) és D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : coc-coc) - a szenzibilizáció szilárd expressziója következett be (Figure5C) .5C). A kokain által stimulált mozgás időbeli változása szintén hasonló volt a két csoport között (1. ábra) (Figure5C), 5C), és két csoport között nem volt szignifikáns különbség. Összefoglalva, ezek a két fotostimulációs kísérlet azt mutatják, hogy a D2R-MSN aktiválása a NAc-ben nem befolyásolja a kokain által kiváltott viselkedési érzékenység kialakulását vagy expresszióját.

A NAc D2R-MSN-ek fotostimulációja a gyógyszer eltávolítása során

A ismételt kokain-expozíció után a gyógyszer visszavonása utáni krónikus stressz egy D2R-függő alkalmazkodási mechanizmus szelektív felvételét eredményezi, amely szabályozza a kokain-kereső és a visszaeső viselkedés stressz által kiváltott növekedését a NAc szinaptikus plaszticitásának változásaival összefüggésben (Sim et al., 2013). Ez azt jelzi, hogy a kábítószer-elvonással járó mechanizmusok különböznek a kábítószerrel kiváltott szenzibilizációban részt vevőektől. Következésképpen azt vizsgáltuk, hogy a D2R-MSN-ek fotostimulációja NAc-ben a kokain visszavonásakor befolyásolja-e a kokain által kiváltott viselkedési érzékenység kialakulását.

A kokain ismételt injekcióval történő viselkedési érzékenységének indukálását követően a D2-Cre (-) és a D2-Cre (+) egereket két csoportra osztottuk az 14 napos elvonási periódusban: az egyik csoportot napi kék-fény stimulálásnak vetettük alá. NAc az 1 h (3 min × 8 idők) esetén, míg a másik csoport nem (ábra (Figure6A) .6A). A D2R-MSN ismételt fotostimulációja NAc-ben a kokain visszavonása során nem befolyásolta a szenzibilizáció expresszióját a D2-Cre (-) :: coc-coc egerekben (Figure6B) .6B). Ezzel ellentétben a D2-Cre (+) :: coc-coc egerekben a szenzibilizáció expressziója szignifikánsan gyengült a hatóanyag visszavonása során fellépő ismételt fotostimulációval (ábra). (Figure6B), 6B), bár a kokain által indukált mozgás stimulálásának időbeli lefutása nem változott (1. ábra) (Figure6C) .6C). Tehát a NAc D2R-MSN-ek fotostimulációja a kábítószer-visszavonás során csökkentette a kokain által kiváltott viselkedési szenzibilizáció expresszióját (kokain × fotoszimulációs kölcsönhatás) F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, ábra Figure6B) .6B). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a D2R-NAc MSN-ek aktiválása a kábítószer-megvonás időszakában befolyásolja a kokain-kereső és a visszaeső viselkedést.

Megbeszélés

Jelentős bizonyítékok arra utalnak, hogy a kokain által kiváltott viselkedési szenzibilizáció a fokozott dopaminerg transzmisszióhoz kapcsolódik a mezokortikolimbikus rendszerben, amely a ventrális tegmentális területet, a prefrontális kéregeket és a nucleus accumbens-t (NAc) tartalmazza. Közelebbről, a viselkedési szenzibilizáció expressziós fázisa a gyógyszer abbahagyása utáni tartós gyógyszer-hiperreaktivitással jellemezhető, amely az adaptációs mechanizmusok kaszkádjával (Kalivas és Duffy) kapcsolódik. 1990; Robinson és Berridge, 1993; Kalivas és mtsai. 1998), amely hozzájárulhat a kényszeres kábítószer-vágyhoz (Robinson és Berridge, \ t 1993; Kalivas és mtsai. 1998; Steketee és Kalivas, 2011). Javasolták, hogy a NAc-ben a DA-molekuláris, celluláris és viselkedési plaszticitásban bekövetkezett, a DA-receptorok jelátvitelében bekövetkező változások szabályozzák a gyógyszer által közvetített addiktív viselkedést (Lobo et al., 2010; Schmidt és Pierce, 2010; Ferguson és mtsai. 2011; Pascoli és mtsai. 2011; Bocklisch és mtsai. 2013; Grueter és mtsai. 2013).

A géntechnológiával módosított egereken, amelyek feltételesen expresszálják a Cre rekombinázt, a közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a D1R-MSN-ek vagy a D2R-MSN-ek szerepet játszanak a kokain-addiktív viselkedésben. Az NAc D1R-MSN-ek optogenetikus aktiválása az ismétlődő kokain-beadás 6-napja után növeli a lokomotoros aktivitást, míg a D2R-MSN-ek aktiválása nem áll rendelkezésre (Lobo et al., 2010). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a kokain ismételt expozíciója növeli az NAc D1R-MSN-ek kimenetét. A D1R expresszáló MSN-ek gátlása tetanusz toxinnal (Hikida et al., 2010) csökkenti a kokain-kondicionált helypreferenciát (CPP), míg a kokain-CPP-ben nem észleltek változásokat a szinaptikus transzmisszió eltörlése után a D2R-MSN-ekben (Hikida et al., 2010). A D1R-MSN-ek optogenetikus aktiválása dorsalis striatumban tartós megerősítést vált ki, míg a stimuláló D2 receptor-expresszáló neuronok átmeneti büntetést okoznak (Kravitz et al., 2012). Egy közelmúltbeli tanulmány azt is kimutatta, hogy a D2R-MSN-ek gátlása kemikogenetikai megközelítéssel növeli a kokain-szerzés motivációját, míg a D2R-MSN optogenetikus aktiválása elnyomja a kokain önadagolását (Bock et al., 2013). Másrészt Bocklisch et al. (2013) arról számolt be, hogy a NAC-projekt D1R-MSN-e a VTA-hoz, különösen a VAB-on belüli GABAerg neuronokhoz, míg a D2R-MSN-ek nem közvetlenül a VTA-ra irányulnak. Ez az áramkör azt jelenti, hogy a D1R-MSN optogenetikus aktiválása gátolja a DA neuronokat, amelyek végül fokozzák a kokain által indukált addiktív viselkedést (Bocklisch et al., 2013).

A két MSN-populáció látszólag egyszerű szervezete ellenére az a tény, hogy az MSN-ek több bemenetet kapnak, és különböző kimenetekkel rendelkeznek más agyterületekre, illetve helyi áramkörök kialakítására az MSN-ek és az interneuronok más osztályai között, a D1R- Az MSN-ek és a D2R-MSN komplex és különböző molekuláris, celluláris és viselkedési következményekkel járhatnak.

Korábban kimutatták, hogy a D2R hozzájárul a kábítószer-visszavonás során indukált szinaptikus módosításokhoz, és ezek fokozzák a kokainkeresés visszaesését anélkül, hogy befolyásolnák a gyógyszer kezdeti beszerzését vagy a kábítószer-keresést (Sim et al., 2013). Jelenlegi adatok azt mutatják, hogy a D2R-MSN-ek fotostimulációja NAc-ben a bazális lokomotor aktivitás csökkenését váltja ki. Lobo és mtsai. (2010) nem észleltek változást a mozgásban, amikor bármelyik MSN altípus aktiválódott, de csak a teljes mozgásszervi aktivitást vizsgálták, nem pedig a bazális lokomotoros aktivitásnak a fotostimulációra adott közvetlen válaszainak vizsgálatát. Kravitz és mtsai. (2010) azt is megállapították, hogy a D2R-MSN-ek optogenetikus aktiválása a hátsó striatumban szintén csökkenti a lokomotoros aktivitást. Adataink tehát elsőként bizonyítják, hogy a bazális lokomotoros aktivitást gátolja a NAc D2R-MSN-ek fotostimulációja, és az első, hogy szisztematikusan megvizsgálják a bazális lokomotoros aktivitás idejét ezeknek a neuronoknak a fotostimulációja során.

A jelen tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a D2R-MSN-ek optogenetikus aktiválása NAc-ben nem befolyásolta a viselkedési érzékenység kialakulását vagy kifejeződését. A D2R-MSN-ek fotostimulációja a gyógyszer-megvonási periódus alatt a kokain által kiváltott szenzibilizáció kifejeződését tompította. Ezért adataink arra utalnak, hogy a D2R-MSN egy bizonyos jelet kifejezetten visszavon a visszavonási időszak alatt, amely megváltoztatja a génexpressziót vagy a jelzés egyéb formáit, és ezáltal változásokat vált ki a szinaptikus plaszticitásban, ami a kokain által kiváltott viselkedési szenzibilizáció megváltozásához vezet. Nem ismert, hogy ezek az MSN-ek sejttípus-specifikus adaptációkat alkalmaznak, amelyek a függőséggel kapcsolatos viselkedésükben különálló következményeiket okozhatják. Grueter és mtsai. (2013) azt javasolta, hogy a NAc ΔFosB-je differenciálisan modulálja a szinaptikus tulajdonságokat és a jutalmakkal kapcsolatos viselkedéseket egy sejttípus- és szubregion-specifikus módon. A közelmúltban Chandra et al. (2013) arról számoltak be, hogy a D2R-MSN-ek ismételt ChR1-aktiválása, de nem a D2R-MSN-ek a Tiam1-gén, az aktin-citoszkeleton átrendeződésében szerepet játszó fehérje lefelé történő szabályozását okozzák, hasonlóan a kokain hatásához. Ezért annak a mechanizmusnak a megértéséhez, amely a gyógyszer által kiváltott viselkedés tartós hatásait eredményezi, fontos, hogy meghatározzuk a molekuláris események sejt-szelektív indukcióját ezekben az MSN-ekben, amelyek szabályozzák a szinaptikus alkalmazkodást az ismétlődő hatóanyag-expozícióhoz.

Az ismétlődő kábítószer-expozícióval összefüggésben a visszavonás fontos szerepet játszik, mivel néhány változás csak néhány héttel a kokain végső expozíciója után jelentkezik. Ez arra utal, hogy az absztinencia fontos közvetítő a plaszticitás kialakulásában (Robinson és Berridge, 2003; Boudreau és Wolf 2005; Boudreau és mtsai. 2007; Kourrich és mtsai. 2007). Ezek a megfigyelések felvetik annak a lehetőségét, hogy a visszavonás maga is kiváltó lehet a NAc változásaiban, amelyek a D2R-függő jelzés vezérlése alatt állnak. Eredményeink azt mutatják, hogy a D2R-MSN-ek aktiválása a NAc-ben a kábítószer-visszavonás során befolyásolja a kokain által kiváltott viselkedési érzékenységet.

Korábban kimutatták, hogy a kábítószer-visszavonás során a ismétlődő stressz-expozíció elnyomja a kokain által kiváltott viselkedési szenzibilizáció, valamint a kokain-kereső és visszaeső viselkedés expresszióját a D2R KO egerekben (Sim et al., 2013). Érdekes tehát, hogy a D2R-MSN fotostimulációja a gyógyszerfelvétel során is gyengíti a szenzibilizáció expresszióját. A stressz által kiváltott szinaptikus plaszticitás a glutamategikus szinapszisokban a D2R KO egerek NAc-jében megváltozik (Sim et al., 2013). Bár még nem ismert, hogy a D2R MSN-ek fotostimulációja vagy a krónikus stressz a kivonási időszak során hasonló változásokat idéz-e elő a szinaptikus plaszticitásban, a jelenlegi megállapítások alátámasztják azt a hipotézist, hogy a NAc D2R-MSN-ek kulcsszerepet játszanak a kivonás által indukált plaszticitásban és hozzájárulhatnak a visszaesés a kábítószer-használat megszűnése után. További vizsgálatokra lesz szükség annak megállapításához, hogy a D2R MSN-ek részt vesznek-e a kábítószer-visszavonás során, és hogy elemezzék és összehasonlítsák a D2R-MSN fotostimulációjának és a krónikus stressz következményeinek következményeit ezen a körön.

A D2R-t expresszáló MSN-ek másik lehetséges szerepe lehet a D1R-MSN-eknek a NAc-től származó kimenetének gátlása. Korábbi kutatások azt mutatják, hogy bár az MSN-ek hosszú axonokat terveznek távoli célpontokhoz, az axon-fedőlapok és a szomszédos tüskés vetületi neuronok dendritikus fái közötti kiterjedt átfedés következik be (Grofová, 1975; Preston és mtsai. 1980; Wilson és Groves, 1980). Ez jelezheti az MSN-nek az NAc-en belüli lehetséges helyi szinaptikus kapcsolatát. Az intracelluláris felvételek a tüskés vetületi neuronok párjaiból azonosítottak funkcionális gátló kapcsolatokat az MSN-ek között patkány striatumban (Czubayko és Plenz, 2002; Tunstall és munkatársai, 2002; Koos et al. 2004; Gustafson és mtsai. 2006). Arról is beszámoltak, hogy a striatumban az MSN-ek recidivális kollaterális axonjainak képződő szinapszisai nem véletlenek, a D2R-MSN-ek szinaptikus kapcsolatokat hoznak létre más D2R-MSN-ekkel és D1R-MSN-ekkel, míg a D1R-MSN szinte kizárólag szinaptikus kapcsolatokat alkot más D1R-MSNs (Taverna et al., 2008). Habár a GABAerg kapcsolatok lokális recidiváló axonális kollagénjei között is beszámoltak az Accumbal MSN-ek között (Taverna et al., 2004) még mindig nem világos, hogy a D2R-MSN-ek véletlenszerűen képeznek-e helyi áramköröket, vagy hozzájárulnak-e a NA-ban lévő mikrociklusokhoz a preferált csatlakozással, mint a striatumban. Adataink arra utalnak, hogy a D2R-MSN-ek a ChR2-et expresszáló NAc-ben szinaptikus kapcsolatot létesítenek a szomszédos MSN-ekkel, amelyek D1R-t expresszálnak, és hogy a D2R-MSN-ek a D1-MSN-ekkel gátló érintkezést alkalmaznak az addiktív viselkedés D1R által közvetített promóciójának modulálására.

Összefoglalva, kimutattuk, hogy a NAc D2R-MSN-ek optogenetikus aktiválása megváltoztatja a kokainfüggőség során fellépő megvonás által kiváltott plaszticitást. Tekintettel arra, hogy a D2R-függő jelzés aktivitása a visszavonási periódus során a kokain által kiváltott magatartásérzékelés kifejeződésének kulcsszabályozója, javasoljuk, hogy a D2R-MSN-ek fontos mediátorak maradjanak a kábítószer-keresés és a visszaesés hosszú távú alkalmazkodásában. A D2R-függő jelzés molekuláris szubsztrátjainak azonosítása, valamint az ismétlődő hatóanyag-expozíció során alkalmazott NAc D2R-MSN specifikus áramkörének azonosítása új terápiás beavatkozás célpontjait kell biztosítani a kábítószer-visszaesés során.

Érdekütközési nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában hajtották végre, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát támogatta a Koreai Nemzeti Kutatási Alapítvány (NRF) támogatása, amelyet a Tudományügyi Minisztérium, az IKT és a jövőbeni tervezés az Agykutatási Program (Ja-Hyun Baik; 2013M3C7A1056101) és a Bio- és Orvosi Technológia támogatott. Fejlesztési program (a Ja-Hyun Baiknak; 2013M3A9D5072550) és a Koreai Nemzeti Kutatási Alapítvány (NRF) World Class Institute (WCI) programja, amelyet a Tudományügyi Minisztérium, az IKT és a jövőbeli tervezés finanszíroz. WCI 2009-003), valamint egy Koreai Egyetemi Grant (a Ja-Hyun Baiknak) és egy CRP támogatás a Szingapúri Nemzeti Kutatási Alapítványtól (George J. Augustine).

Referenciák

  1. Baik JH (2013). Dopamin jelzés a jutalomhoz kapcsolódó viselkedésben. Elülső. Neurális áramkörök 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A., et al. (1995). Parkinsoni-szerű lokomotoros károsodás dopamin D2 receptorok hiányában. Természet 377, 424 – 428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Cross Ref]
  3. Berridge KC (2007). A vita a dopamin szerepéről a jutalomban: az ösztönző érdeklődés. Pszichofarmakológia (Berl) 191, 391 – 431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Cross Ref]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF és mtsai. (2013). Az elhúzódó közvetett útvonal megerősítése elősegíti a kényszeres kokainhasználatra való rugalmasságot. Nat. Neurosci. 16, 632 – 638 10.1038 / nn.3369 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, House DR, Yvon C., de Roo M., et al. (2013). A kokain a GABA transzmisszió fokozásával gátolja a dopamin neuronokat a ventrális tegmentális területen. Tudomány 341, 1521 – 1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Cross Ref]
  6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M., Wolf ME (2007). A sejtfelszíni AMPA-receptorok a patkánymagban az akumbensekben növekednek a kokain visszavonásakor, de a kokainprobléma után internalizálódnak a mitogén-aktivált protein kinázok megváltozott aktiválásával összefüggésben. J. Neurosci. 27, 10621 – 10635 10.1523 / stburosci.2163-07.2007 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). A kokainnal szembeni viselkedési szenzibilizáció az AMPA receptor felszíni expressziójának növekedésével jár együtt a magban. J. Neurosci. 25, 9144 – 9151 10.1523 / stburosci.2252-05.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH és mtsai. (2013). A D1R tartalmú nukleinsavakon neuronok optogenetikus gátlása megváltoztatja a Tiam1 kokain által közvetített szabályozását. Elülső. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  9. Chang HT, Kitai ST (1985). A nucleus accumbens projekciós neuronjai: intracelluláris jelölési vizsgálat. Brain Res. 347, 112 – 116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Cross Ref]
  10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). A kokain által kiváltott mozgásszervi aktivitás és a kokain-diszkrimináció a dopamin D2 receptor mutáns egerekben. Pszichofarmakológia (Berl) 163, 54 – 61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Cross Ref]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). A sztriatális funkciók kifejeződésének alapvető folyamata. Trendek Neurosci. 13, 277 – 280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Cross Ref]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Gyors szinaptikus átvitel striat spiny vetületi neuronok között. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 15764 – 15769 10.1073 / pnas.242428599 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y., et al. (2011). Az átmeneti neuronális gátlás a közvetett és közvetlen utak ellentétes szerepét tárja fel a szenzibilizáció során. Nat. Neurosci. 14, 22 – 24 10.1038 / nn.2703 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  14. Goto Y., Grace AA (2005). A nukleáris accumbens limbikus és kortikális meghajtásának dopaminerg modulációja a célirányos viselkedésben. Nat. Neurosci. 8, 805 – 812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Cross Ref]
  15. Grofová I. (1975). A materiális nigra felé irányuló striatális és pallidális neuronok azonosítása. Kísérleti tanulmány a torma peroxidáz retrográd axonális transzportjával. Brain Res. 91, 286 – 291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Cross Ref]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). A ΔFosB differenciálisan modulálja a nukleáris accumbens közvetlen és közvetett útvonalfunkcióját. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 110, 1923 – 1928 10.1073 / pnas.1221742110 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). A visszacsatolás és az előremutató szinaptikus transzmisszió összehasonlító feszültség- és áram-szorító elemzése in vitro a striatális mikrociklusban. J. Neurophysiol. 95, 737 – 752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). A szinaptikus transzmisszió megkülönböztető szerepe a közvetlen és közvetett striatális utakon a jutalom és az averzív viselkedés felé. Neuron 66, 896 – 907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Cross Ref]
  19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Az akut és napi kokain-kezelés hatása az extracelluláris dopaminra a sejtmagban. Szinapszis 5, 48 – 58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Cross Ref]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). A kokainfüggőségben a szenzitizáció szerepe a vágyban és a relapszusban. J. Psychopharmacol. 12, 49 – 53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Cross Ref]
  21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). A neostriatumban a tüskés és a gyorsan spontán neuronok által kiváltott IPSC-k összehasonlítása. J. Neurosci. 24, 7916 – 7922 10.1523 / stburosci.2163-04.2004 [PubMed] [Cross Ref]
  22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). A kokain-tapasztalat ellenőrzi a kétirányú szinaptikus plaszticitást a sejtmagban. J. Neurosci. 27, 7921 – 7928 10.1523 / stburosci.1859-07.2007 [PubMed] [Cross Ref]
  23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K. és munkatársai. (2010). A parkinsonizmus motoros viselkedésének szabályozása a bazális ganglion áramkör optogenetikus vezérlésével. Természet 466, 622 – 626 10.1038 / nature09159 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Különböző szerepek a közvetlen és közvetett striatális neurális neuronok megerősítésében. Nat. Neurosci. 15, 816 – 818 10.1038 / nn.3100 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Striatális plaszticitás és bazális ganglion áramkör funkció. Természet 60, 543 – 554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  26. Le Moine C., Bloch B. (1996). A D3 dopamin receptor expressziója a nukleinság accumbens peptiderg neuronjaiban: összehasonlítás a D1 és D2 dopamin receptorokkal. 73-131-143 (10.1016) 0306-4522 96-00029 2-XNUMX [PubMed] [Cross Ref]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D., et al. (2010). A BDNF jelátvitel sejttípus-specifikus elvesztése utánozza a kokain jutalom optogenetikus kontrollját. Tudomány 330, 385 – 390 10.1126 / science.1188472 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). A kábítószer-függőség striatális kiegyenlítője: a közvetlen és közvetett közepes közepes tüskés neuronok különálló szerepe. Elülső. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  29. Lüscher C., Malenka RC (2011). A kábítószer-kiváltott szinaptikus plaszticitás függőségben: a molekuláris változásoktól az áramkör remodelingig. Neuron 69, 650 – 663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  30. O'Donnell P., Grace AA (1993). Az in vitro rögzített accumbens mag és héj neuronok fiziológiai és morfológiai tulajdonságai. Szinapszis 13, 135 – 160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Cross Ref]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). A kokain által kiváltott szinaptikus potenciáció megfordítása visszaállítja a gyógyszer által indukált adaptív viselkedést. Természet 481, 71 – 75 10.1038 / nature10709 [PubMed] [Cross Ref]
  32. Preston RJ, Bishop GA, Kitai ST (1980). Közepes tüskés neuron vetítés a patkány neostriatumból: intracelluláris torma peroxidáz vizsgálat. Brain Res. 183, 253 – 263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Cross Ref]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). A kábítószer vágy idegi alapja: a függőség ösztönző-szenzitizációs elmélete. Brain Res. Brain Res. 18, 247 – 291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Cross Ref]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Függőség. Annu. Rev. Psychol. 54, 25 – 53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Cross Ref]
  35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). A kokain által kiváltott neuroadaptációk a glutamát transzmisszióban: potenciális terápiás célpontok a vágy és a függőség számára. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35 – 75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Cross Ref]
  36. Sesack SR, Grace AA (2010). Cortico-basal ganglion jutalomhálózat: mikrocirkuláris. Neuropszichofarmakológia 35, 27 – 47 10.1038 / npp.2009.93 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL, et al. (2013). A dopamin D2 receptorok szerepe a stressz által kiváltott addiktív viselkedések plaszticitásában. Nat. Commun. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Cross Ref]
  38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). A kokain által indukált adaptációk a D1 és a D2 elnyeli a vetületi neuronokat (a kettősség nem feltétlenül szinonimája a közvetlen és közvetett útvonalaknak). Akt. Opin. Neurobiol. 23, 546 – 552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). Kábítószer: a viselkedésérzékenyítés és a kábítószer-kereső viselkedés visszaesése. Pharmacol. 63, 348 – 365 10.1124 / pr.109.001933 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). A striatriás közepes tüskés idegsejtek ismétlődő fedezeti kapcsolatai megszakadnak a Parkinson-kór modelljeiben. J. Neurosci. 28, 5504 – 5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  41. Taverna S., van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Közvetlen fiziológiai bizonyíték a szinaptikus kapcsolatra a közepes méretű tüskés neuronok között patkánymagokban az in situ. J. Neurophysiol. 91, 1111 – 1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Cross Ref]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Neuroplasticitás a mezolimbikus dopamin rendszerben és a kokainfüggőségben. Br. J. Pharmacol. 154, 327 – 342 10.1038 / bjp.2008.77 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Cross Ref]
  43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Gátló kölcsönhatások a patkány striatumban lévő tüskés vetületi neuronok között. J. Neurophysiol. 88, 1263 – 1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Cross Ref]
  44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). A dopaminerg és glutamaterg transzmisszió megváltozása a viselkedési érzékenység indukciójában és expressziójában: a preklinikai vizsgálatok kritikus áttekintése. Pszichofarmakológia (Berl) 151, 99 – 120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Cross Ref]
  45. Wilson CJ, Groves PM (1980). A patkány neostriatum közös tüskés neuronjának finom szerkezete és szinaptikus kapcsolata: a torma peroxidáz intracelluláris injekcióját alkalmazó tanulmány. J. Comp. Neurol. 194, 599 – 615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Cross Ref]
  • Bölcs RA (2004). Dopamin, tanulás és motiváció. Nat. Rev. Neurosci. 5, 483 – 494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Cross Ref]