Dopamin D2 receptorok függőség-szerű jutalmi diszfunkcióban és kényszeres étkezésben az elhízott patkányokban (2010)

A D2 receptor változás a pornográfia függősége mögött rejlikMegjegyzés: Ez a tanulmány bebizonyítja, hogy ha egy állat korlátlan hozzáférést kap, akkor egy erős természetes erősítő (nagyon stimuláló táplálék) a D2 receptorok csökkenését okozhatja. Ez a csökkenés szinte minden patkánynál megfigyelhető volt, és meglehetősen gyorsan bekövetkezett. Amikor eltávolították a „nagyon ízletes” ételt, a patkányok nem voltak hajlandók normális ételt enni. A patkányok továbbra is dühöngtek (amikor csak tehettek), annak ellenére, hogy az áramütés párosult a „nagyon ízletes” táplálékfogyasztással.


Nat Neurosci. 2010 május; 13(5):-635 641. Megjelent online 2010 március 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Absztrakt

Azt tapasztaltuk, hogy az elhízás kialakulása a neurális jutalmak válaszában fokozatosan romló hiány kialakulásával párosult. A kokain vagy a heroin által kiváltott jutalmi homeosztázis hasonló változásait döntő fontosságúnak tekintik az alkalmi és kényszeres kábítószer-fogyasztás közötti átmenet kiváltásában. Ennek megfelelően az elhízott, de nem sovány patkányoknál kompulzív jellegű táplálkozási viselkedést észleltünk, amelyet ízletes ételfogyasztásként mértünk, ami ellenálló volt egy elrettentő kondicionált ingerrel. A striatális dopamin D2 receptorokat (D2R) az elhízott patkányokban csökkentették, ahogyan azt a kábítószer-függőségben szenvedő embereknél jelentettek. Ráadásul a striatus D2R-ek lentivírus által közvetített knockdownja gyorsan felgyorsította a függőséghez hasonló jutalmi hiányok kialakulását és a kényszerszerű táplálékkeresés kialakulását patkányokban, amelyek széles körű hozzáférést biztosítanak az ízletes, magas zsírtartalmú ételekhez. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ízletes ételek túlfogyasztása függőségi jellegű neuroadaptív válaszokat vált ki az agyi jutalmak körében, és ösztönzi a kényszeres evés kialakulását. A közös hedonikus mechanizmusok ezért az elhízás és a kábítószer-függőség alapjául szolgálhatnak.

Bevezetés

Az etetést az öröm és a jutalom befolyásolja, és az étkezési jutalom megszerzése erőteljesen motiválhatja a fogyasztást1, 2. Mindazonáltal az elhízáshoz hozzájáruló hedonikus mechanizmusok továbbra sem ismeretesek. Veleszületett leptinhiányban szenvedő, hiperfágikus embereknél a dorsalis és a ventralis striatumban végzett aktivitás, amelyek az agy jutalomkörének központi elemei, jelentősen megnő az ételképekre3, és a leptin-helyettesítő terápia gyengíti mind a striatalis aktivitást, mind az önjelölt „ételkedvelést” 3 . Ez arra utal, hogy a striatum fontos az etetési viselkedés hedonikus vonatkozásaiban. Nemrégiben bebizonyosodott, hogy a striatum aktiválása a nagyon ízletes ételek hatására elhízott egyéneknél tompább, összehasonlítva a sovány kontrollokkal4. Ezenkívül a dorsalis striatum hipofunkciója és a hosszú távú súlygyarapodás a DRD2 – ANKK1 gén lokusz TaqIA alléljával rendelkező egyéneknél a legnyilvánvalóbb, ami csökkent striatális D2R expressziót eredményez, és kimutatták, hogy hajlamosítja az egyéneket az anyagfüggőség zavaraira4, 5 Ezek és hasonló megfigyelések arra a javaslatra vezettek, hogy a jutalom feldolgozásának hiányai fontos kockázati tényezők lehetnek az elhízás kialakulásában, és hogy az elhízott egyének kényszeresen fogyaszthatnak ízletes ételeket a jutalom túlérzékenységének ellensúlyozására6. Különösen nem világos, hogy a jutalom-feldolgozás hiányai konstitutívak-e és megelőzik-e az elhízást, vagy a jóízű étel túlzott fogyasztása ösztönözheti-e a jutalom diszfunkcióját, és ezáltal hozzájárulhat-e az étrend okozta elhízáshoz.

A túlsúlyos és elhízott egyének meghatározó jellemzője, hogy továbbra is túlzsúfolják a jól ismert negatív egészségügyi és társadalmi következmények ellenére. Valójában sok túlsúlyos egyén kifejezi azt a vágyát, hogy korlátozza az élelmiszer-fogyasztását, ugyanakkor küzd a bevitelük ellenőrzésében, és többször is elfogyasztja az energiaigényüket7, 8. A negatív kimenetelre érzéketlen táplálkozási viselkedés kialakulása analóg a humán drogfüggőknél tapasztalt kompulzív drogfogyasztási viselkedéssel, ami hasonlóan negatív következményekkel jár. Itt vizsgáltuk az ízletes, magas zsírtartalmú étrendhez való kiterjesztett hozzáférés hatását az agy jutalomrendszereinek érzékenységére patkányokban. Megvizsgáltuk az étrend által kiváltott hedonikus dysreguláció és a kényszeres ételkeresés közötti kapcsolatot is. Végül a striatális D9R-ek szerepét vizsgáltuk ezekben a függőség-szerű viselkedési válaszokban.

Függőség-szerű jutalomhiány az elhízott patkányokban

Az ízletes, magas zsírtartalmú étrend korlátozott vagy kiterjesztett hozzáférésének hatásainak teszteléséhez hím Wistar patkányokat (300-350 g) készítettünk egy bipoláris stimuláló elektródával az oldalsó hipotalamuszban, és 10–14 napig képeztük őket egy diszkrét vizsgálatban. a jelenlegi küszöbértékű agystimulációs jutalom (BSR) eljárás addig, amíg stabil jutalomküszöböket megállapítottak4. A BSR eljárás során a patkányok erőteljesen reagálnak arra, hogy a belső stimuláló elektródon keresztül jutalmazó elektromos önstimulációt kapjanak, az önstimulációs viselkedést fenntartó minimális stimulációs intenzitással, amelyet jutalomküszöbnek neveznek10. Mivel a jutalomküszöbök stabilak és hosszú ideig változatlanok maradnak a kiindulási körülmények között, ez az eljárás érzékeny mérőszámot nyújt az agy jutalmazási rendszereinek reakciókészségére. A stabil BSR küszöbértékek megállapítása után (három egymást követő ülésen a küszöbértékek <10% -os változásaként definiálva) három csoportba osztottuk a patkányokat, amelyek nem mutattak különbségeket a csoportok közötti átlagos testtömegben vagy jutalomküszöbökben. A három csoport differenciált hozzáférést kapott egy „cafeteria-stílusú” étrendhez, amely ízletes, energiasűrűségű ételeket tartalmaz, amelyek könnyen elérhetőek emberi fogyasztásra (lásd Online módszerek). A patkányok napi 0 órát (csak chow-patkányok; n = 9), 1 órát (korlátozott hozzáférésű patkányok; n = 11) vagy 18–23 órát (kiterjesztett hozzáférésű patkányok; n = 11) kaptak az étrendhez naponta 40 egymást követő napon. A cafeteria diétákról ismert, hogy az étrend okozta elhízást eredményez patkányokban11. Valamennyi patkánynak ad libitum hozzáférése volt a standard laboratóriumi chow-hoz, a jutalomküszöböket, a súlygyarapodást és a kalóriabevitelt mindvégig rögzítették.

A súlyosság jelentősen nőtt a patkányoknál, akiknek a kávéfogyasztás étrendjéhez való hozzáférése hosszabb volt, mint a csak chow-ra vagy korlátozott hozzáférésű csoportokra (1a. Ábra). A korlátozott hozzáférhetőségű patkányokban a testsúly is növekedett, mint a csak a patkányoknál, de ez a hatás nem érte el a statisztikai szignifikanciát. Az elhízás kialakulása a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban szoros kapcsolatban állt az agyi jutalmak funkciójának romló hiányával, amely a fokozatosan emelkedett BSR küszöbökben tükröződik (1b ábra). Mivel a BSR válaszadási latenciáiban nem volt különbség a három csoport (1 kiegészítő ábra) között, a viselkedési teljesítmény hiánya nem tudja figyelembe venni ezt a megfigyelést. Hasonló hiányosságokat jelentettek az agyi jutalom funkcióban patkányokban, akiknek kiterjesztett, de nem korlátozott hozzáférése van az intravénás kokainhoz vagy a heroin önadagolásához12, 13, 14. Így az ízletes, magas zsírtartalmú élelmiszerekhez való kiterjesztett hozzáférés függőségi jellegű hiányt okozhat az agy jutalmának funkciójában, amely fontos motivációs forrást jelent, amely a túlhevüléshez vezethet, és hozzájárulhat az obesity1, 6 fejlődéséhez.

1 ábra: Súlygyarapodás és jutalomfunkció a patkányokban, akik szélesebb körű hozzáférést biztosítanak egy kávézó-étrendhez.

(a) Átlagos (± fél) súlygyarapodás csak chow, korlátozott hozzáférésű és kiterjesztett hozzáférésű patkányokban (hozzáférés × napi interakció: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 a csak chow csoporthoz képest, post hoc teszt). (b) Átlagos (± fél) százalékos változás a kiindulási jutalomküszöbökhöz képest (hozzáférés × idő interakció: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 a csak chow-csoporttal összehasonlítva, post hoc teszt).

Amikor részletesen megvizsgáltuk a táplálkozási viselkedést (2.), Azt tapasztaltuk, hogy a teljes napi kalóriabevitel hasonló volt a chow-only és a korlátozott hozzáférésű patkányokhoz (2a, d). Ezzel szemben a kiterjesztett hozzáféréssel rendelkező patkányok teljes kalóriatartalma majdnem kétszer akkora, mint a korlátozott hozzáférésű és chow-only patkányoknál (2a, d). Bár a korlátozott hozzáférésű és csak chow-ban lévő patkányok körülbelül ugyanolyan napi kalóriabevitelt tartottak (2a. Ábra, d), a korlátozott hozzáférésű patkányok csak napi ~ 33% -ot kaptak a chowból származó napi kalóriájukból (2b, d). az 66-hez való belépésük során a diet1 kávézóhoz (15d) 2% -ot használtak fel a napi kalóriabevitelükből. A kiterjesztett hozzáférésű patkányok csak egy kis frakciót (~ 5%) kaptak a chowból származó teljes kalóriabevitelükből (2b ábra); szinte kizárólag a kávézó étrendjét fogyasztották (2d. ábra). A korlátozott és kiterjesztett hozzáférési csoportokban a táplálkozási preferenciák eltolódása is tükröződött a zsírbevitel szignifikáns növekedésében, csak a chow-only patkányokhoz képest (2c. Ábra és 2 kiegészítő ábra). A korábbi jelentések16 szerint a kávéfogyasztás étrendjének fogyasztása idővel csökkent a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban. Ez tükrözheti a kávézó étrendjében az idő múlásával biztosított élelmiszerek ízét illető tolerancia alakulását. Mindazonáltal ezekben a patkányokban a kávéfogyasztás étrendjének és a standard chownak a preferenciája továbbra is magas maradt (kiegészítő 3.). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ízletes, magas zsírtartalmú étrendhez való kiterjesztett, de nem korlátozott hozzáférés a függőséghez hasonló jutalmi hiányt, túlhevülést és a homeosztatikus energiaegyensúly csökkenését okozza. Ezzel szemben az ízletes ételek korlátozott hozzáférhetősége haszontalan fogyasztási mintákat eredményez, de nem zavarja a homeosztatikus energiaegyensúlyt és az agyi jutalmat. Lehetséges azonban, hogy a kávézó étrendjének korlátozott hozzáférése több mint 40 egymást követő napon jelentős súlygyarapodást és az agy jutalmi funkciójának megszakítását okozná.

2 ábra: A patkányok fogyasztási mintái, amelyek szélesebb körű hozzáférést biztosítanak egy kávézó-étrendhez.

a) átlagos (± fél) napi kalóriabevitel csak chow, korlátozott hozzáférésű és kiterjesztett hozzáférésű patkányokban (hozzáférés: F1,324 100.6 = 0.0001, P <18,324; idő: F7.8 0.0001 = 18,324, P <4.6; hozzáférés × idő interakció: F0.0001 = 0.05, P <2,504; * P <349.1 a csak chow-csoporttal összehasonlítva, post hoc teszt). (b) átlagos napi kalóriabevitel (± sem) chow-ból (hozzáférés: F0.0001 = 18,504, P <5.9; idő: F0.0001 = 36,504, P <3.52; hozzáférés × idő interakció: F0.0001 = 0.05, P <2,486; * P <118.7 a csak chow-csoporttal összehasonlítva, post hoc teszt). c) átlagos napi kalóriabevitel (± fél) zsírból (hozzáférés: F0.0001 18,486 = 8.8, P <0.0001; idő: F36,486 6.2 = 0.0001, P <0.05; hozzáférés × idő interakció: F40 2,54 = 25.0, P <0.0001; * P <2,54 a csak chow-csoporttal összehasonlítva, post hoc teszt). d) Az átlagos (± fél) teljes kalóriabevitel és a kizárólag chow-ból fogyasztott kalóriák összehasonlítása a teljes 1235.2 napos hozzáférési időszak alatt (hozzáférés: F0.0001 = 2,54, P <485.7; kalóriaforrás: F0.0001 = 0.001, P <0.001; hozzáférés × kalóriaforrás-interakció: FXNUMX = XNUMX, P <XNUMX; *** P <XNUMX a csak chow-csoportban található összes kalóriához képest, ### P <XNUMX az összes kalória arányához képest patkánycsoport, post hoc teszt).

40 nap elteltével a patkányoknak már nem volt engedélyük az ízletes étrendhez, de továbbra is ad libitum hozzáféréssel rendelkeztek a standard laboratóriumi állathoz. Naponta értékeltük a jutalomküszöböket és a chow fogyasztást ebben a kényszerített „absztinencia” időszakban. A jutalomküszöbök emelkedése legalább 2 hétig fennmaradt a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban, amikor már nem jutottak hozzá az ízletes étrendhez (3a. Ábra). Ez ellentétben áll a jutalomfunkció viszonylag átmeneti (~ 48 órás) hiányával az önadagolt kokaintól elzárkózott patkányokban13. Ebben az absztinencia periódusban jelentősen csökkent a kalóriabevitel (3b. Ábra) és a testtömeg fokozatosan csökkent (3c. Ábra) a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban, és kisebb mértékben a korlátozott hozzáférésű patkányokban is. korábbi jelentések11, 15. 14 d absztinencia után a patkányokat leöltük, és az elektróda elhelyezkedését krezil-ibolya festéssel határoztuk meg (3d. ábra).

3 ábra: Állandó jutalmi diszfunkció és hypophagia az absztinencia során patkányokban, akik szélesebb körű hozzáférést biztosítanak egy kávézó-étrendhez.

a) Az ízletes, magas zsírtartalmú étrend absztinencia alatti átlagos százalékos változása a kiindulási jutalomküszöbökhöz képest (± sem) (hozzáférés: F2,112 = 3.7, P <0.05; idő: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 a csak chow-csoporttal összehasonlítva, post hoc teszt). b) Átlagos kalóriabevitel (± fél) a magas zsírtartalmú étrendhez való hozzáférés utolsó napján (kiindulási érték) és a 14 d absztinencia során, amikor csak standard chow állt rendelkezésre (hozzáférés: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; idő: F6,168 = 65.6, P <0.0001; hozzáférés × idő interakció: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 a csak chow-csoporttal összehasonlítva, post hoc teszt). (c) Az átlagos testtömeg (± fél) változása a testtömeghez képest a magas zsírtartalmú étrendhez való hozzáférés utolsó napján (kiindulási érték) és a 14 napos absztinencia során, amikor csak a standard chow állt rendelkezésre (hozzáférés: F1,126, 37.2 = 0.0001, P <7,126; idő: F3.1 = 0.01, P <7,126; hozzáférés × idő interakció: F40.9 = 0.0001, P <0.05; * P <XNUMX a csak chow-csoporttal összehasonlítva, post hoc teszt). d) A BSR stimuláló elektródák helyének szövettani rekonstrukciója csak a chow (háromszögek), a korlátozott hozzáférésű (négyzetek) és a kiterjesztett hozzáférésű (körök) patkányok laterális hipotalamuszában.

Striatális D2R-ek az elhízott patkányokban: szerepe a jutalomhiányban

Ezután teszteltük azt a hipotézist, miszerint az ízletes cafeteria diéta túlfogyasztása csökkentheti a striatalis D2R sűrűségét, hozzájárulva az addikciószerű jutalom hipoérzékenység kialakulásához. A csak a chow, korlátozott hozzáférésű és a kiterjesztett hozzáférésű patkányok új kohorszának engedélyezték a cafeteria étrendhez való hozzáférést, amíg a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban a testtömeg statisztikailag szignifikánsan meg nem nőtt a csak chow csoporthoz képest (P <0.05 ; 4a. Ábra). A D70R állítólag erősen glikozilezett (~ 2 kDa) membránhoz kötött formájának sztriatális expressziója alacsonyabb volt a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban, mint a korlátozott hozzáférésű vagy csak a chow-ban (4b. Ábra; lásd Online módszerek). Amikor az egyes hozzáférési csoportokban lévő patkányokat két alcsoportra osztottuk a testtömegek (könnyű vagy nehéz) medián megoszlása ​​alapján, egyértelmű inverz kapcsolatot találtunk a testtömeg és a striatális D2R expresszió között (4a., C. Ábra). Nem észleltünk statisztikailag szignifikáns csökkenést a D39R glikozilálatlan éretlen (~ 51 kDa) és közepesen glikozilezett citoplazmatikus (~ 2 kDa) expressziójában (4. kiegészítő ábra) 17, ami azt jelzi, hogy a striatális D2R expresszió kiterjesztett hozzáférésű patkányokban valószínűleg utáni transzkripciós mechanizmusok révén szabályozva.

4 ábra: A súlygyarapodás fordítottan kapcsolódik a striatális D2R szintekhez.

(a) A csak a chow, korlátozott hozzáférésű és a kiterjesztett hozzáférésű patkányokat hozzáférési állapotonként két csoportba osztottuk a testtömeg medián elosztása alapján: könnyű (L) vagy nehéz (H). (b) A teljes sztriatális komplexet összegyűjtöttük az összes patkányból és az egyes csoportok D2R-szintjét Western-blottolással mértük. A membránhoz kapcsolódó D2R sáv 70 kDa nyomáson feloldódott, és a fehérjetöltő kontrollt alább mutatjuk be (β-aktin, 43 kDa). A teljes hosszúságú immunblotokat a 12. ábra szemlélteti. (C) A D2R relatív mennyiségét a csak állati, korlátozott hozzáférésű és kiterjesztett hozzáférésű patkányok striatumában denzitometriával határoztuk meg (F2,6 = 5.2, P <0.05, fő a hozzáférés hatása; * P <0.05 és ** P <0.01 a csak chow-L csoporthoz képest).

Ezután teszteltük az étrend-indukált striatális D2R redukciók funkcionális jelentőségét az agy jutalom funkciójához, és úgy terveztünk és validáltunk egy lentivirális vektort, hogy egy rövid hajtű zavaró RNS-t (shRNS) juttassunk el a D2R (Lenti-D2Rsh; 5 és kiegészítő ábra 5). A Lenti-D2Rsh-szel kezelt patkányok esetében a jutalomküszöbök szinte azonnal növekedtek, miután a kávéfogyasztás étrendjére kiterjesztett hozzáférést engedélyeztek, míg az üres lentivírus-vektorral (Lenti-kontroll) kezelt patkányok esetében a jutalmi küszöbértékek változatlanok maradtak a viszonylag rövid idő alatt a cafeteria étrendhez való hozzáférés (14 d; 6a. ábra). A válasz latenciái változatlanok voltak mindkét patkánycsoportban, ami azt mutatja, hogy ez a hatás nem volt másodlagos a feladat teljesítésének hiányára (kiegészítő ábra 6). A Lenti-D2Rsh vagy Lenti-kontrollokkal kezelt patkányok esetében a jutalmi küszöbértékek változatlanok voltak, és csak az ugyanezen időszak alatt hozzáférhetnek a chow-hoz (6b ábra).

A küszöbértékek tartósan megnövekedtek az extra 15 d absztinencia idején, amikor minden patkány csak a standard chow-hoz volt hozzáférhető (kiegészítő 7 ábra). A striatális D2R kiesése ezért fokozta a táplálékindukált jutalmi hipofunkciót, de nem változtatta meg az agyi jutalmazási rendszerek kiindulási aktivitását.

5 ábra: A striatal D2R expresszió Lentivírus által közvetített knockdownja.

(a) A sztriatális területek grafikus ábrázolása, amelyeken a Lenti-D2Rsh túlzottan expresszálódott. A bal sztriatális féltekén található zöld körök jelzik azokat a helyeket, amelyekre a vírusos infúziókat célozták. A jobb sztriatális féltekén a zöld festés reprezentatív immunkémiai festés a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) festésére egy Lenti-D2Rsh patkány agyából. (b) A csökkent D2R expresszió reprezentatív immunblotja a Lenti-D2Rsh patkányok striatumában. A teljes hosszúságú immunblotokat a 13. ábra szemlélteti. (C) A D2R relatív mennyisége a Lenti-kontroll és a Lenti-D2Rsh patkányok striatumában, densitometriával számszerűsítve (* P <0.05 a Lenti-kontroll csoporthoz képest, post hoc teszt) ). (d) A striatumban található gliasejtek Lenti-D2Rsh vektor általi fertőzését nem sikerült kimutatni. A zöld festés a vírusból származó GFP; a vörös az asztrocita marker glia fibrilláris savas fehérje (GFAP); a sejtmagokat a kék színű DAPI festés emeli ki. A fehér nyilak a gliosis lokalizált területét jelzik, amely csak a vírus injekciójának helyén található meg a striatumban, és nem a környező szövetekben, amelyekbe a vírus diffundált. Még ezen a területen sem az asztrociták GFP-pozitívak. A nagyított kép sárga nyilai kiemelik a tipikus GFP-negatív asztrocitákat, amelyeket észleltek. (e) Magas neuronfertőzés a striatumban a Lenti-D2Rsh vektor által. A zöld festés GFP vírusból; a vörös a NeuN neuronális nukleáris marker; a sejtmagokat a DAPI kék színű festése emeli ki. A megnagyított kép sárga nyilai kiemelik a striatum GFP-pozitív és NeuN-pozitív idegsejtjeit. (f) A ventiálisan fertőzött (GFP-pozitív) neuron nagyobb nagyítású képe a Lenti-D2Rsh patkányok striatumában, amely a közepes tüskés neuronok tipikus morfológiai jellemzőit mutatja.

6 ábra: A striatális D2R kiesése megnöveli a sérülékenységet a diszfunkció jutalmazására patkányokban, akik szélesebb körű hozzáférést biztosítanak egy kávézó-étrendhez.

(a) Átlagos (± fél) százalékos változás a kiindulási jutalomküszöbökhöz képest azoknál a Lenti-control és Lenti-D2Rsh patkányoknál, amelyek 14 egymást követő napon át kiterjesztették a hozzáférést a cafeteria étrendhez (vírus: F1,156 = 5.9, P <0.05; idő: F13,156 = 2.2, P <0.05; vírus × idő interakció: F13,156 = 2.2, P <0.05; # P <0.05, interakciós hatás). (b) Átlagos (± fél) százalékos változás a kiindulási jutalomküszöbökhöz képest a csak chow hozzáféréssel rendelkező Lenti-kontroll és Lenti-D2Rsh patkányokban. (c) Patkányok átlagos (± fél) kalóriabevitele csak 14 d chow vagy kiterjesztett hozzáférés során (hozzáférés: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). d) Az átlagos (± fél) súlygyarapodás csak 14 nap chow vagy kiterjesztett hozzáférés során (hozzáférés: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, a hozzáférés fő hatása).

Megállapítottuk, hogy a kalóriabevitel (6c. Ábra) és a súlygyarapodás (6d. Ábra) hasonló volt a Lenti-D2Rsh-ben és a megfelelő Lenti-kontroll csoportokban csak chow- vagy kiterjesztett hozzáférési feltételek mellett (kiegészítő ábrák 8 és 9). Így a striatális D2R knockdown nem változtatott sem a kávéfogyasztás étrendjére, sem a teljes kalóriabevitelre, ha az ízletes étel szabadon fogyasztható volt.

Kompulzív táplálkozás az elhízott patkányokban: a striatális D2R szerepe

Ezután azt a hipotézist teszteltük, hogy a kényszerszerű étkezés előfordulhat a cafeteria étrendhez hosszabb hozzáféréssel rendelkező patkányokban, és hogy a striatalis D2R jelátviteli hiány hozzájárulhat ehhez a hatáshoz. A csak chow, korlátozott hozzáférésű és kiterjesztett hozzáférésű patkányok új csoportjának engedélyezték a cafeteria étrendhez való hozzáférést 40 napig, amíg statisztikailag szignifikáns súlynövekedés nem következett be a meghosszabbított patkányokban (P <0.05 a csak chow patkányokkal összehasonlítva; Látható). Ezután a patkányok mindhárom csoportjának csak napi 30 perces hozzáférést engedélyeztek a cafeteria étrendhez 5–7 napig egy operáns kamrában, amíg a stabil bevitel el nem ér (a napi bevitel <10% -os variációjaként definiálva). A patkányok felét minden hozzáférési állapotban ezután fénynek (kondicionált ingernek) tették ki, amely párosult a lábrázkódások leadásával (megbüntetett csoport), míg az egyes csoportok fennmaradó patkányait lábütés hiányában kitették a jelzőfényre (büntetlen csoport) ). A tesztnapon megvizsgáltuk a jelzőfénynek való kitettség egyedüli ízletes ételfogyasztásra gyakorolt ​​hatását (7. ábra; lásd Online módszerek). Megállapítottuk, hogy az átlagos kalóriabevitel a 30 perces kiindulási munkamenetek alatt magasabb volt a csak a chow és korlátozott hozzáférésű patkányokban, mint a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban (7a. Ábra, b). Ez azt sugallja, hogy a csak a chow és a korlátozott hozzáférésű patkányok az ízletes táplálékra falatoztak az időszakos 30 perces hozzáférési munkamenetek során, ami abban tükröződik, hogy ezek a patkányok napi kalóriabevitelük ~ 40–50% -át, jellemzően ~ 100 kCal-ot fogyasztották, ezeken az üléseken (7a., b. ábra). Ezzel szemben a kiterjesztett hozzáférésű patkányok rezisztensnek tűnnek ennek a falatozásszerű táplálkozási magatartásnak a kialakulásában, talán azért, mert 40 éven keresztül egymást követő napokon át szinte korlátlan hozzáférés az ízletes táplálékhoz olyan étkezési mintákat hozott létre, amelyek viszonylag rugalmatlanok voltak a változtatáshoz. A tesztnapon nem figyeltünk meg statisztikailag szignifikáns hatást a cue light replay táplálékfogyasztására a csak a chow, a korlátozott hozzáférésű vagy a kiterjesztett hozzáférésű csoportok büntetlen patkányaiban, összehasonlítva a kiindulási periódus bevitelével (7a. Ábra). Egyedül a jelzőfénynek nem volt motivációs nyoma. Büntetett patkányokban a sokk-páros jelzőfény jelentősen csökkentette az ízletes táplálékfelvételt a csak a chow és korlátozott hozzáférésű patkányokban. A jelzőfény azonban nem volt hatással az ízletes táplálékfelvételre a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban, ami azt mutatta, hogy fogyasztásuk érzéketlen az averzív környezeti jelekre, amelyek előre jelzik a nehézségeket. A kiterjesztett hozzáférésű patkányok alapszintű energiafogyasztása alacsonyabb volt, mint a többi csoportban. Mivel azonban a chow-bevitel hasonló időszakokban jóval alacsonyabb volt (7d. Ábra), nem valószínű, hogy ez olyan „padlóhatást” jelentene, amely megzavarja eredményeinket. Adataink együttesen alátámasztják azt az elképzelést, hogy a kényszerszerű étkezési magatartás a kiterjesztett hozzáférésű patkányokban hasonló módon alakulhat ki, mint a kényszeres kokainfogyasztás, amelyet olyan patkányokban tapasztaltak, akiknek a kórtörténetében kiterjedt hozzáférés volt a gyógyszerhez18.

7 ábra: Kompozitív jellegű válasz az ízletes ételekre.

(a) Az átlagos (± fél) ízletes táplálékfogyasztás büntetlen patkányokban a 30 perces kiindulási munkamenetek során és a tesztnapon, amikor a patkányokat semleges kondicionált ingernek tették ki, amely korábban nem volt párosul mérgező láblökéssel = 2,20, P <5.2; # P <0.05, csak a chow-patkányokkal összehasonlítva). (b) A büntetés alatt álló patkányok átlagos (± fél) ízletes táplálékfogyasztása a 0.05 perces kiindulási munkamenetek során és a tesztnapon, amikor a patkányokat kondicionált ingernek tették ki, amely korábban káros láblökéssel párosult (hozzáférés: F30 = 2,21 , P <3.9; jel: F0.05 = 1,21, P <8.6; hozzáférés × jel kölcsönhatás: F0.01 = 2,21, P <4.7; * P <0.05 a kiindulási munkamenet alatti bevitelhez képest, # P <0.05 összehasonlítva csak chow-patkányok). (c) Az átlagos (± fél) ízletes étrend-fogyasztás a 0.05 perces kiindulási munkamenetek során és a tesztnapon olyan Lenti-kontroll és Lenti-D30Rsh patkányokban, amelyek korábban csak chow-val vagy hosszabb hozzáféréssel rendelkeztek egy cafeteria étrendhez (jel: F2, 1,26 = 29.7, P <0.0001; * P <0.05, ** P <0.01, összehasonlítva a kiindulási munkamenetek utáni bevitelével, post hoc teszt). d) átlagos (± fél) chow fogyasztás a 30 perces kiindulási munkamenetek során és a tesztnapon Lenti-kontroll és Lenti-D2Rsh patkányokban, amelyek korábban csak chow-val vagy hosszabb hozzáféréssel rendelkeztek egy cafeteria étrendhez (jel: F1,26 = 44.9, P <0.0001; * P <0.05, ** P <0.01, összehasonlítva a kiindulási munkamenetek utáni bevitelével, post hoc teszt).

Végül megvizsgáltuk a büntetéssel párosított kondicionált inger táplálékfelvételre gyakorolt ​​hatását a Lenti-kontroll és a Lenti-D2Rsh patkányokban, amelyek korábban csak chow-hez vagy kiterjesztett hozzáféréshez jutottak a cafeteria étrendhez (patkányok a 6. ábrából). Megállapítottuk, hogy a 30 perces kiindulási munkamenetek során a kiindulási ízletes ételbevitel hasonlóan magas volt (~ 40 kCal) mind a négy csoportban (7c. Ábra). Ezenkívül a teljes napi chow-fogyasztás (az otthoni ketrecben) hasonló volt mind a négy patkánycsoport között a kondicionáló munkamenetek alatt és a tesztnapon (10. kiegészítő ábra). A cafeteria étrendhez való 14 napos előzetes hozzáférés ezért nem volt elegendő ahhoz, hogy blokkolja a mértéktelen étkezési magatartást hasonló módon, mint azoknál a patkányoknál, amelyeknél 40 napnál hosszabb ideig volt hozzáférés a cafeteria étrendhez (7a., B. Ábra). Az averzív jelzőfény-inger megzavarta az ízletes táplálékfelvételt azokban a Lenti-control és Lenti-D2Rsh patkányokban, amelyek korábban csak állattenyésztéshez jutottak (7c. Ábra). Hasonlóképpen, az averzív feltételes inger megzavarta az ízletes táplálékfelvételt azokban a Lenti-kontroll patkányokban, amelyek korábban 14 napos kiterjedt hozzáférést kaptak a cafeteria étrendhez. Ezzel szemben az averzív feltételes inger nem volt hatással az ízletes ételfogyasztásra azokban a Lenti-D2Rsh patkányokban, amelyek korábban 14 napos kiterjedt hozzáférést kaptak a cafeteria étrendhez (7c. Ábra). A BSR küszöbértékek szignifikánsan magasak maradtak ezeknél a patkányoknál, amikor a vizsgálati munkamenet után 48 órával rögzítették őket, míg a küszöbértékek stabilak és változatlanok maradtak a másik három patkánycsoportban

(Kiegészítő ábra 11). Annak igazolására, hogy a Lenti-D2Rsh kiterjesztett hozzáférésű patkányokban az ízesített táplálékfelvétel szabályozott inger-indukált szuppressziójának ellenállása nem volt másodlagos a klasszikus kondicionálási folyamatok károsodásához, teszteltük az averzív kondicionált inger hatását a kevésbé ízletes standard chow fogyasztására. mind a négy patkánycsoport. Ellentétben az ízletes ételfogyasztással, azt tapasztaltuk, hogy a patkányok mind a négy csoportja keveset fogyasztott (~ 2 kCal) az 30 min alapfolyamatok alatt (7d. Ábra), és hogy a chow bevitel mind a négy csoportban megszakadt hasonló mértékű az averzív kondicionált ingerrel való érintkezéskor (7d. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a striatális D2R kiesése jelentősen felgyorsította az ízletes étel kompulzív táplálkozásának kialakulását, de csak olyan patkányoknál, akiknek előzménye kiterjesztett hozzáférés volt. Továbbá, mivel a kényszeres táplálkozás csak a Lenti-D2Rsh patkányokban volt észlelhető, amelyek emelkedett BSR-küszöbértékekkel rendelkeztek, az étrend-indukált jutalmi hipofunkció szükségszerű előfeltétele lehet az kényszeres ételkeresésnek.

Megbeszélés

Az ízletes, magas zsírtartalmú élelmiszerekhez való könnyű hozzáférés fontos környezeti kockázati tényezőnek számít az obesity19 számára. Azt tapasztaltuk, hogy a széles körű hozzáférés egy nagyon ízletes kávézó-stílusú táplálkozáshoz túlfáradást és súlygyarapodást eredményezett, ami a BSR küszöbértékeinek fokozatos emelkedését eredményezte patkányokban. Ez a hatás a BSR küszöbértékekre azzal magyarázható, hogy fokozatosan csökken az agyi jutalmak áramlási képessége, amely értelmezés összhangban van azzal a ténnyel, hogy az élelmiszer-korlátozás és a fogyás fokozhatja20-ot, míg az akut túladagolás átmenetileg csökkentheti az 21-t, válaszolva a BSR-re patkányokban. Ez a megállapítás olyan munka kiterjesztését mutatja, amely azt mutatja, hogy a patkányok akut túladagolása egy intragastrikus táplálócsövön21, és a gyomorfertőzés vagy az intravénás glükagon infúzió után, amely utánozza a posztprandialis televerzitást22, 23, 24, csökkenti a válaszadást a kedvező laterális hipotalamikus BSR-re, és növeli az ellenszenves reakciókat a stimulation25. A korábbi munkák azt is kimutatták, hogy a patkányok intagasztikus csöveken keresztül történő ismételt táplálása addig, amíg a testsúlyuk 200 g-kal nő, hasonlóan csökkenti a BSR reagálási sebességét, ami addig tart, amíg a testsúly normalizálódik23. Mint a patkányokban tapasztaltaknál, a macskákban az oldalsó hypothalamic BSR-re való reagálást gátolta az előző táplálás a satiation26-re, ami azt mutatja, hogy az agy jutalomfunkció és az anyagcsere állapot közötti kölcsönhatások konzerválódnak, és így valószínűleg emberekben is előfordulnak. A nyugati társadalmak jelenlegi elhízás-járványának fontos környezeti hozzájárulásnak tekintik a kávézó-stílusú táplálkozás egyszerű hozzáférhetőségét és ennek következtében történő túlmelegedését. Adataink azt mutatják, hogy a jutalom-hipofunkció olyan patkányokban jelentkezik, amelyek az ember által fogyasztottéhoz hasonlóan ízletes kávézó-étrendet túladagolnak, és ez a hatás fokozatosan rosszabbodik, amikor nagyobb súlyt szereznek. Nevezetesen, minden nyereség küszöbértéket meghaladó patkány, amelynek ≥19% volt, a BSR elektródák a fornix dorsolateralisan ~ 20 μm-en belül voltak. A nyereséggel kapcsolatos neuronok érzékenységét ezen a területen növeli az élelmiszer-korlátozás olyan módon, amely érzékeny a zsírból származó leptinre, és ez az agyi régió fontos élelmiszer-szubsztrátnak tekinthető. Az élelmiszer-hedonikákat szabályozó agyi áramköröket ezért gátolják az utókövető jelek, amelyek megjósolják a telítettséget, összhangban a legutóbbi emberi képalkotó vizsgálatokkal, amelyek azt mutatják, hogy a gyomor-distention500 és az YY27-28 (PYY) 3-bél eredetű postprandialis faktor peptid modulálja az agyi régiók aktivitását részt vesz a jutalom feldolgozásában. Emellett a jutalomrendszereket a túlzott súlygyarapodás is gátolja. A közelmúltbeli jelentések azt mutatják, hogy a keringő leptin, amely az energiaegyensúly kulcsszabályozója, behatolhat az agyszövetekbe, és gátolhatja a nyereségkörök aktivitását36, 29, 3, 27.

A túlsúlyos patkányok jutalomhiánya tükrözheti az agy jutalomköreinek alapszintű érzékenységének ellenadaptív csökkenését, hogy szembeszálljon az ízletes táplálékkal történő túlstimulálásukkal. Az ilyen étrend által kiváltott jutalom-hipofunkció hozzájárulhat az elhízás kialakulásához azáltal, hogy fokozza a magas jutalmú „obesogén” diéták fogyasztásának motivációját a negatív jutalom ezen állapotának elkerülése vagy enyhítése érdekében. 6, 32. Ez a hipofágia következménye lehet a kiterjesztett hozzáférés során patkányoknál és kisebb mértékben korlátozott hozzáférésű patkányoknál, amikor a jóízű ételt kivonták, és csak a kevésbé ízletes chow állt rendelkezésre. Egy ilyen szcenárió összhangban van az emberi agy képalkotási tanulmányainak adataival is, amelyek során a striatum tompított aktiválása az ízletes ételek hatására, különösen azoknál az egyéneknél, akiknél genetikai polimorfizmus állítólag csökkenti a striatális D2R expressziót, hosszú távú súlygyarapodáshoz kapcsolódik4. Nem világos, hogy az elhízott egyének ilyen jutalom hipoérzékenysége az elhízás kialakulása előtt nyilvánul-e meg és kizárólag genetikai tényezőkhöz kapcsolódik („jutalomhiányos szindróma”), vagy a túlevés okozhat-e zavart a jutalom feldolgozásában. Adataink azt mutatják, hogy az ízletes, nagy energiájú élelmiszerekhez való kiterjesztett hozzáférés és az azt követő túlfogyasztott tompa jutalmazza az érzékenységet, ezért fontos hedonikus mechanizmust jelenthet, amely elősegíti az elhízás kialakulását. Az elhízott patkányoknál itt leírtakhoz hasonló jutalom-diszfunkciót észlelnek azoknál a patkányoknál is, akiknek az anamnézisében kiterjedt az intravénás kokain vagy a heroin önadagolása, de nem azoknál, akiknek korlátozott hozzáféréssel rendelkeznek a kórelőzményben12, 13, 14. A véletlenszerű és kényszeres kábítószer-keresés azt javasolja, hogy megkíséreljék enyhíteni a csökkenő jutalom tartós állapotát, amelyet ez a gyógyszer okozta jutalom-diszfunkció okoz, 12, 32, 33. Így adataink azt mutatják, hogy az elhízás és a kábítószer-függőség megoszthatja a mögöttes hedonikus mechanizmusokat.

A striatális D2R expresszió csökkenése jelentős ízületi válasz az ízletes ételek túlfogyasztására. Valójában a striatális D2R sűrűség csökkenése a túlsúlyos 4, 34 és a rodents35, 36 egyéneknél fordul elő. Ezzel ellentétben az anorexia nervosa-val rendelkező egyéneknek emelkedett striatális D2R37-értéke van, és az elhízott személyek testsúlycsökkenése a bariatrikus (gyomor-bypass) műtét után emelkedett striatális D2R-sűrűséggel. A TaqIA A28 allélnak nevezett gén-polimorfizmus a striatális D1R-sűrűség csökkenését eredményezi, és az allélet hordozó egyének túlzottan jelen vannak az elhízott populációkban2. A TaqIA allél növeli az alkohol, az opioid és a pszichomotoros stimulánsok függőségét4. A striatális D38R-sűrűség csökkenése a konstitutív genetikai tényezők vagy a túlmelegedés következményeként előfordulhat az elhízás neurobiológiai mechanizmusaihoz. Azt tapasztaltuk, hogy az 2 kDa D70R izoformának, a membránhoz kapcsolódó D2R-t tükröző striatumszintek fordítottan kapcsolódtak a testtömeghez, csak a korlátozott hozzáférésű és a kiterjesztett hozzáférési csoportokból származó patkányokban (2. Ábra). A striatum D4R expressziójának lebomlása, leginkább a dorsolaterális striatumban (2. Ábra), a BSR küszöbértékét szinte azonnal megnövelte a kávézó étrendjének kitettsége után. A striatális D5R expressziójának csökkenése ezért gyorsan felgyorsította a jutalmazott hipofunkció kialakulását patkányokban, amelyek széles körű hozzáférést biztosítanak a nagyon ízletes ételekhez, ami az emberi agyi képalkotási adatokkal összhangban állt, ami azt jelzi, hogy a striatális D2R sűrűség hiánya hozzájárul az elhízott egyedek jutalmi hipofunkciójához2.

A Lenti-D2Rsh patkányok három jellemzője szintén figyelemre méltó. Először is, bár a striatális D2R knockdown és az ízletes táplálkozáshoz való szélesebb körű hozzáférés a BSR küszöbértékek emelkedéséhez vezetett, ezekben a patkányokban nem volt különbség a kalóriabevitelben vagy a súlygyarapodásban, összehasonlítva a kontroll patkányokkal. Ez tükrözheti azt a tényt, hogy a patkányoknak csak 14 d volt hozzáférése a kávézó étrendjéhez; a hosszabb hozzáférési idők idővel nagyobb súlygyarapodást eredményezhetnek, hasonlóan a nagyobb súlyérzékenységhez, amelyet a striatális D2R jelátviteli 4-ben szenvedő embereknél tapasztaltak. Azonban az a lehetőség, hogy a kávézó étrendjéhez való hozzáférést csak az 14 d-re korlátozzuk, az, hogy a kiterjesztett hozzáféréssel rendelkező knockdown patkányok az egyetlen olyan csoport, amely magasabb BSR-küszöbértékeket mutatott, és ez lehetővé tette számunkra, hogy felmérjük a jutalomfüggvény potenciális szerepét a kényszeres fejlődésben. eszik (lásd alább). Másodszor, a BSR küszöbértékei stabilak és változatlanok maradtak a csak leeső patkányokban. Ez azt jelzi, hogy a csökkent striatális D2R expresszió önmagában nem volt elegendő a jutalom-hipozenzitás indukálásához; ehelyett úgy tűnt, hogy kölcsönhatásba lép az ízletes ételek túlfogyasztásával, hogy felgyorsítsa a csökkent jutalomérzékenység ilyen állapotának kialakulását. Az agyi jutalmak más adaptív válaszai ezért a patkányok jutalom-hipozenzitását váltják ki, amelyek kiterjesztett hozzáféréssel rendelkeznek a kávézó étrendjéhez. Ezt szem előtt tartva megjegyezzük, hogy a D2R agonista bromokriptin csökkenti a keringő leptin39-szinteket, és a leptin legalább részben gátolja a táplálék-válaszokat a food3, 30, 31, 2, 2, XNUMX, XNUMX, hedonikus válaszok ellen. Így lehetséges, hogy a striatális DXNUMXR csökkenése a növekvő testtömegre reagálva növeli a leptin jelátvitelét, és ezáltal növeli az adipokin gátló hatását az agy jutalomrendszerein. Végül megjegyezzük, hogy a lentivírus vektorainkat a dorsolaterális striatum felé irányítottuk. Ez elsősorban technikai okokból következett be, mivel a kanülek oldalirányú elhelyezése a striatumba történő bejuttatáshoz lehetővé tette számunkra, hogy a BSR küszöbérték meghatározásához a lakossági hipotalamusz stimuláló elektródát is befogadhassuk. Így lehetséges, hogy a DXNUMXR-eknek a striatum más területein, különösen a dorsomedialis és a ventrális területeken (mag-accumbens mag és héj) történő megcélzása célzottan emelkedett BSR-küszöbértékek is lehetnek, még a ízletes diéta hiányában is.

A dorsolaterális striatum erősen szerepet játszik az inger-válasz szokás típusú tanulásban, ez tükröződik a fogyasztói magatartás kialakulásában, amely érzéketlen a leértékelésre a szaturáció előzetes táplálása vagy a káros ingerekkel való párosítás révén40. Azáltal, hogy túlnyomórészt a dorsolaterális striatumot céloztuk meg, megdönthettük a D2R-k olyan populációit, amelyek szabályozzák a patkány sebezhetőségét a kényszeres étkezés kialakulása szempontjából. A sztriatális D2R-k kényszeres magatartásban betöltött szerepének megfelelően az emberi DRD2 – ANKK1 gén lokusz TaqIA allélja - amely alacsony striatalis D2R sűrűséget eredményez5, eltompítja a striatális aktivációt az ízletes ételek hatására4 és növeli a kiszolgáltatottságot az elhízással4 hiányosságok a negatív következményekkel járó cselekedetek elkerülésének megtanulásában41. A negatív kimenetelű magatartás gátló kontrolljának elvesztése mind az elhízás, mind a kábítószer-függőség egyik jellemző jellemzője, amelyben a fogyasztói magatartás a negatív társadalmi, egészségügyi vagy pénzügyi következmények ellenére is fennáll. A kokainfogyasztás olyan patkányokban, akiknek kórtörténetében kiterjedt a gyógyszerfogyasztás, rugalmatlanná válhat és rezisztenssé válhat egy negatív kimenetelt (láblökés) előrejelző, averzív feltételes inger által okozott zavarok miatt Hasonlóképpen, azok az egerek, amelyek korábban ízletes, magas zsírtartalmú étrendhez jutottak, több időt töltenek idegenkedő környezetben (erősen megvilágítva) a jó étel megszerzéséhez, mint azok az egerek, akiknek nem volt tapasztalata a diétával18. Megállapítottuk, hogy a cafeteria étrendhez való kiterjedt hozzáféréssel rendelkező patkányok ízletes táplálékfogyasztása hasonlóan érzéketlen egy averzív feltételes ingerre. A sztriatális D42R-eknek ebben a szerepben betöltött szerepével összhangban kényszeres étkezést találtak a striatális D2R leütési patkányokban, amelyek korábban 2 napos kiterjedt hozzáférést kaptak a cafeteria étrendhez, de nem a kontroll csoportokban. Neurokeringési szempontból az ízletes táplálékhoz való kiterjedt hozzáférés kiválthatja a plaszticitást a kortikosztriatális utakban, ezáltal az állatokat kiszolgáltatottabbá téve a kényszeres viselkedés kialakulása szempontjából, és a striatalis D14R jelátviteli hiányok fokozzák ezt a folyamatot. Valójában az elhízott egyének csökkent striatális D2R-sűrűsége korrelál a prefrontális és orbitofrontális kortikális területek csökkent metabolizmusával2, amelyek gátlóan befolyásolják a viselkedést43.

Nevezetesen, az ízletes ételek kompulzív fogyasztását csak a kieséses patkányokban észlelték, amelyek korábban kiterjesztették a kávézó étrendjéhez való hozzáférését, nem pedig olyan kontroll patkányoknál, amelyek ugyanabban az időszakban kiterjesztették a kávézó étrendjét, sem pedig a leütéses patkányokban, amelyek csak chow-hozzáférés. A főbb különbség az előzőleg kiterjesztett hozzáférést biztosító patkányok és a többi csoport között a tartósan emelkedett BSR küszöbértékek voltak. Ez tükrözheti a jutalmi hipofunkció közös neurobiológiai eredetét és a kényszerszerű táplálkozás megjelenését, amely időbeli egybeesés, de független jelenség. Alternatív megoldásként az étrend által kiváltott jutalmazási hipofunkció a negatív megerősítés szubsztrátaként szolgálhat, amely megkönnyíti a kényszerszerű, étkezési14, 32, 33. Bármi legyen is a mögöttes mechanizmus, az eredményeink azt mutatják, hogy az ízletes ételekkel kapcsolatos függőség-szerű kompulzív válaszok az elhízott patkányokban jelentkezhetnek, és azt jelzik, hogy a striatális D2R jelzés hiánya növeli a sebezhetőséget e viselkedés kialakulásával szemben.

Összefoglalva megállapítottuk, hogy az agyi jutalmazási rendszerek túlzott stimulálása az ízletes, energia-sűrű ételek túlzott mértékű fogyasztása révén a jutalom-hipozenzitás mélyreható állapotát és a kényszerszerű táplálkozás kialakulását váltja ki. Ezek a rosszindulatú viselkedési válaszok az elhízott patkányoknál valószínűleg a striatális D2R jelátvitel diéta által kiváltott hiányából erednek. A kábítószerek túlzott fogyasztása hasonlóan csökkenti a striatális D2R sűrűséget, a jutalom hipofunkciójának mély állapotát váltja ki, és kényszerszerű, kábítószer-viselkedési szokások megjelenését váltja ki. Eredményeink ezért támogatják a korábbi munka4, 19, 42, 45, 46, 47 jelzéseit, amelyek arra utalnak, hogy az elhízás és a kábítószer-függőség az agy jutalmának hasonló neuroadaptív válaszaiból eredhet.

Mód

Patkányokban.

A kísérletek kezdetén az 300 – 350 g tömegű hím Wistar patkányokat Charles River-től szereztük be. Érkezéskor a patkányokat egy állandó hőmérsékleten egy 12-h fény-sötét ciklusban helyeztük el (az 2200 h-on világít). A patkányok számára a kísérlet időtartama alatt ad normális hozzáférést a standard laboratóriumi chowhoz és a vízhez. Minden eljárást a Scripps Florida Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyott jóvá, és a patkányokat az Országos Egészségügyi Intézetek által az állat-gondozás elveire vonatkozó iránymutatások szerint kezelték.

Műtéti beavatkozások.

A BSR stimuláló elektródákkal készített patkányokat először az 1-3% izoflurán oxigén belélegzésével és sztereotaxikus keretbe (Kopf) helyeztük el. A bipoláris BSR-elektródokat (11 mm hosszú) beültettük a hátsó oldalsó hipotalamuszba (anteroposterior, −0.5 mm a bregmából, mediolateralis, ± 1.7 mm a középvonalból, dorsoventral, 8.3 mm a dura-ból, a bemeneti oszlopot 5 mm-re állítottuk az interauralis vonal felett) ) 47. A vírus injekciókat kapó patkányokat a striatum fölött elhelyezett kétoldali (23 mm-es, 14 mm hosszú) kanülekkel (anteroposterior, 2.8 mm a bregmától, mediolateralis, ± 3.1 mm-től a középvonaltól, dorsoventral, -2.4 mm-től a dura-tól) 48 és töltött 14-mm-es stilizálással. Négy rozsdamentes acél koponya csavar és fogászati ​​akril tartotta a helyén az elektródát és a kanüleket. A műtétet követően a sebészeti sebet 12-hez minden 5 h órában helyileg alkalmazott antibiotikummal kezeltük. A patkányoknak 7 – 10 d-t kaptak a sebészi beavatkozás után, majd a BSR küszöbértékét képezték.

BSR eljárás.

A patkányokat úgy képezték, hogy válaszoljanak a BSR stimulációra egy diszkrét próbaáram-küszöb eljárás szerint, hasonlóan a máshol10, 14. Röviden, a BSR jelenlegi szintjeit változó csökkenő és emelkedő sorozatokban változtattuk meg 5-μA lépésekben. Minden egyes tesztelés során négy váltakozó csökkenő / emelkedő sor került bemutatásra. Az egyes sorozatokra vonatkozó küszöböt két egymást követő áramintenzitás középpontjaként határoztuk meg, amelyekre a patkányok az öt vizsgálat közül legalább háromban reagáltak, és két egymást követő áramintenzitást, amelyekre a patkányok az öt vizsgálat közül három vagy több esetben nem reagáltak. A munkamenet teljes küszöbét a négy egyedi sorozat küszöbértékének átlagaként határoztuk meg. Minden tesztelési ciklus körülbelül 30 min. A stabil BSR küszöbértékeket az 10 egymást követő napokban a küszöbértékek ≤5% -os variációjával határoztuk meg, általában az 10 – 14 d képzés után. Az egyes vizsgálati munkamenetekre adott válasz késleltetését az összes kísérlet átlagos válaszidejének késleltetésére határoztuk meg, amelynek során pozitív válasz érkezett.

Vírusos csomagolás és szállítás.

Rövid hajtű RNS-t szállítottak és konstitutívan expresszáltak a pRNAT-U6.2 / Lenti vektorrendszer (GenScript) segítségével. A vírusrészecskéket a gyártó protokollja szerint állítottuk elő. Röviden: a HEK 293FT sejteket transzfektáltuk az shRNS inszertet tartalmazó vektorral (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3 ′) vagy az üres vektorral, plusz ViraPower Packaging 72 (híg táptalaj) után (Invitrogen). Ezután a felülúszót összegyűjtöttük és ultracentrifugálással (24 76,755 g, Beckman Coulter SW 32 TI rotor, 90 perc, 4 ° C) koncentráltuk, és a vírus titert fluoreszcenciával aktivált sejtek szortírozásával határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. A vírust alikvotizáltuk, és használatig fényvédett dobozokban -80 ° C-on tároltuk.

A stabil BSR-küszöbértékű patkányok két ponton kaptak kétoldali vírus injekciót az egyes agyfélteke striatumában (2 μl injekciónként, 1 μl min-1, 1 min injekció között, összesen hat injekciót patkányonként). A patkányoknak legalább 2 – 3 d helyreállítást engedélyeztek az intrastriatális injekciókból, mielőtt a BSR küszöbértékét folytatták. A BSR napi küszöbértékének vizsgálata folytatódott az 33 d esetében, miután a vírus injekciót a maximális striatális D2R letiltás érdekében elérték, mielőtt a patkányok hozzáférést kaptak a kávézó étrendjéhez. A Lenti-kontroll és a Lenti-D2Rsh patkányok között a BSR küszöbértékek között nem volt különbség ezen 33 d alatt (az adatokat nem mutatjuk be).

Immunoblot.

A patkányokat kb. A ~ 1 – 1 mm vastagságú agyszakaszokat koronális agy mátrix segítségével (2-mm szeletintervallum; Plastics One) készítettük jégtömbön, és szöveti lyukakat vettünk a dorsalis striatumból (bregma: ~ 1 – −2.2 mm). A striatusszövet-ütéseket gyorsan összegyűjtöttük, fagyasztottuk, és felhasználásig -0.26 ° C-on tároltuk. Az egyes mintákat jégen felolvasztottuk, és azonos mennyiségű striatális szövetet összegyűjtöttünk a hozzáférési csoportok tömegarányos mediánjainak (80 – 7 patkányok egy medencénként) alapján. A homogenizálás előtt a szövetet 10 μl jéghideg RIPA pufferben (Thermo Scientific) reszuszpendáltuk, amely nátrium-ortovanadátot, foszfatáz koktél inhibitorokat, 500-t és 1-et (Sigma-Aldrich), leupeptint és pepstatint tartalmaz. A szöveti lizátumokat 2 percre forraljuk a mintapufferben, és 10% -NNXX% vagy 4% Tris-glicin SDS gélekre (Invitrogen) töltöttük. A fehérjét nitrocellulóz membránokra vittük át, 20-hez 10-1 ° C-on blokkoltuk (23% zsírmentes száraz tej és 25% Tween-5 PBS-ben, pH 0.2), és az elsődleges antitestben éjszakán át inkubáltuk 20 ° C-on. A következő primer antitesteket hígítottuk blokkoldatban: D7.4R egér monoklonális (Santa Cruz, 4: 2) vagy β-aktin egér monoklonális (Santa Cruz, 1: 100). A kemilumineszcens ECL reagens a torma peroxidázzal konjugált szekunder antitestekkel (Amersham, 1: 200) végzett inkubálás után került hozzáadásra. A D1DR (~ 2,000 kDa) 2, az 70 érett membránhoz kapcsolódó formáját egy fehérje-betöltő kontrollra (β-aktin; 17 kDa) normalizáltuk, és denzitometriával számszerűsítettük NIH Image J szoftver segítségével.

Immunokémiai elemzés.

A patkányokat érzéstelenítettük és transzkardiálisan perfundáltuk 4% paraformaldehiddel PBS-ben (pH 7.6). Az agyakat eltávolítottuk, egy éjszakán át utólag rögzítettük, és szacharózban (30% -os oldat PBS-ben, pH 7.4) legalább 72 órán át tároltuk. Fagyasztott szövetrészeket (30 μm vastagság) gyűjtöttünk össze egy mikrotomból és blokkoltuk (3% BSA, 5% normál kecske szérum és 0.3% Triton X-100 PBS-ben) 1 h értékre ~ 23-25 ° C-on. A következő primer antitesteket adtuk a blokkoldathoz, és éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on: csirke poliklonális GFP-hez (Abcam, 1: 1,000); nyúl monoklonális a GFAP-hoz (Millipore, 1: 1,000); egér monoklonális a NeuN-hez (Millipore, 1: 1,000). A metszeteket fluoreszcens festékkel konjugált másodlagos antitestekkel inkubáltuk ~ 23 – 25 ° C-on: anti-csirke-488 nm-es festékkel (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), anti-nyúl – 594-nm festékkel (Invitrogen, 1: 1,000 ) és anti-egér-594 nm-es festék (Invitrogen, 1: 1000). A szakaszokat Vectashield szerelőanyaggal szereltük fel, amely DAPI-t (Vector Labs) tartalmazott, és fedett. A képeket Olympus BX61 fluoreszcens mikroszkóp (× 2 objektum) vagy Olympus konfokális mikroszkóp (× 10 és × 100 célok) alkalmazásával készítettük.

Etetés.

A patkányokat külön-külön helyeztük el papíralapú ágyneműre (alpha párnák, Shepherd Specialty Papers), hogy megakadályozzák, hogy az élelmiszeripari termékek laza ágyneművel szennyezzenek. A kávézó diéta szalonnából, kolbászból, sajttorta, pogácsából, fagyosan és csokoládéból állt, amelyeket egyenként megmértek, mielőtt a patkányok rendelkezésére bocsátották volna. A cafeteria diétás ételeket kis fémtartályokban szállították. Minden táplálékot, beleértve a standard laboratóriumi tehéneket is, ismételten mérjük az etetés befejezése után. A különböző makrotápanyagokból származó kalóriabevételt a gyártó által megadott táplálkozási információk alapján számítottuk ki.

A táplálkozási viselkedés cue-indukált elnyomása.

Az etetési eljárásokat zajcsökkentett operáns kamrákban végezték, amelyek méretei megegyeztek a BSR kísérleteiben használtakkal. A patkányokat egy operáns kamrába helyeztük, és 30 percen keresztül hozzáférhettek a cafeteria diétához vagy a chow-hoz. Az élelmiszeripari termékeket kis fémtartályokban szállították. Minden táplálékot lemértek az etetés előtt és után, amelyet a patkányok normál etetési periódusában hajtottak végre. A chow-fogyasztást 45 mg-os chow-pelletek fogyasztásával értékeltük, amelyek összetételükben megegyeztek a patkányok házi ketrecében biztosított chow-pelletek fogyasztásával. A patkányoknak ezután napi 30 perces hozzáférést engedélyeztek a cafeteria étrendhez, amíg a stabil bevitel nem érhető el (a napi bevitel <10% -os eltérésként definiálva), ami 5-7 napot igényel. Az ízletes táplálékbevitel stabilizálása után ebben a kiindulási periódusban a patkányokat minden hozzáférési állapotban két csoportba soroltuk: megbüntetett (lábsokkot kapott) és büntetlen (nem kapott lábsokk). A patkányokat ezután egymást követő napokon négy kondicionáló kezelésnek vetették alá ugyanabban az operáns kamrában, ahol korábban hozzáférhettek az ízletes táplálékhoz. A 30 perces kondicionáló munkamenetek során egy jelzőfény (kondicionált inger) 10 percre aktiválódott, 10 percre kikapcsoltuk, majd 10 percre visszakapcsoltuk. A megbüntetett patkányok csak a jelzőfény bemutatása alatt kaptak láblökést (0.5 mA 1.0 másodpercig; 10 stimuláció ~ 1 perc intervallummal). A büntetlen patkányokat ugyanígy mutatták be a jelzőfénnyel, de lábsokk nélkül. A tesztnapon, az utolsó kondicionáló munkamenet utáni napon, a megbüntetett csoportok patkányai szakaszos lábsokkot kaptak (összesen öt stimulációt), párosulva a jelzőfény 5 percig tartó aktiválásával. A büntetlen patkányokat lábütés nélkül ismét kitettük a jelzőfénybe. Az 5 perces büntetési periódus után az összes patkánynak engedélyezhettük az ízletes táplálékhoz való hozzáférést egy 30 perces munkamenethez, a kondicionált ingert szakaszosan aktiválva (10 perc jelzőfény világított, 10 perc jelzőfény világított, 10 perc jelzőfény világított).

Statisztikai elemzések.

Az alapszintű jutalmi küszöbértékeket az 5 d átlagos küszöbértékének definiálták, mielőtt az egyes témákhoz a kávézó étrendjéhez jutnának. A jutalom küszöbértékeket az alapvonal küszöbértékének százalékos változásaként fejeztük ki. Az alapszintű jutalmi küszöbértékek, a súlygyarapodás, a kalóriafogyasztás és a zsírból származó kalóriafogyasztás százalékos adatainak elemzését kétfaktoros, ismételt mérési varianciaanalízissel elemeztük, csak hozzáféréssel (csak chow, korlátozott hozzáférés vagy kiterjesztett hozzáférés), kalóriaforrással ( standard chow vagy cafeteria diéta), vírus (Lenti-control vagy Lenti-D2Rsh) és cue (párosítva vagy párosítva a büntetéssel), mint az alanyok közötti tényezők és az idő, mint az alanyokon belüli tényező. Adott esetben a varianciaanalízisek főbb hatásait Bonferroni post hoc tesztekkel elemeztük. Minden statisztikai elemzést a GraphPad Prism szoftverrel végeztünk.

Referenciák

Referenciák

1. Saper CB, Chou TC, Elmquist JK. A takarmányozás szükségessége: az homeosztatikus és hedonikus ellenőrzés az étkezésről. Neuron. 2002;36: 199-211. [PubMed]
2. Zheng H, Berthoud HR. Étkezés öröm vagy kalória miatt. Curr Opin Pharmacol. 2007;7: 607-612. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
3. Farooqi IS, et al. A Leptin szabályozza a striatális régiókat és az emberi étkezési viselkedést. Science. 2007;317: 1355. [PubMed]
4. Stice
E, Spoor S, Bohon C, kis DM. Az elhízás és a tompa kapcsolat
A táplálékra adott striatális reakciót a TaqIA A1 allél szabályozza. Science. 2008;322: 449-452. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
5. Nemes EP. Függőség és annak jutalom folyamata a D2 dopamin receptor gén polimorfizmusain keresztül: áttekintés. Eur Pszichiátria. 2000;15: 79-89. [PubMed]
6. Wang GJ, Volkow ND, Fowler JS. A dopamin szerepe az emberek élelmezési motivációjában: az elhízás következményei. Szakértői vélemények. 2002;6: 601-609. [PubMed]
7. fülke
ML, Wilkenfeld RL, Pagnini DL, Booth SL, King LA. A felfogások
túlsúlyos és elhízott serdülők: a véleménykutatás súlya. J Paediatr Gyermekegészségügy. 2008;44: 248-252. [PubMed]
8. Puhl
RM, Moss-Racusin CA, Schwartz MB, Brownell KD. Súlyos megbélyegzés
és torzításcsökkentés: túlsúlyos és elhízott felnőttek perspektívái. Health Educ Res. 2008;23: 347-358. [PubMed]
9. Amerikai Orvosi Szövetség. Mentális Betegségek Diagnosztikai és Statisztikai kézikönyve. Negyedik kiadás (DSM-IV) 1994.
10. Markou
A, Koob GF. Egy önstimulációs küszöb érvényességének megalkotása
paradigma: a jutalom és a teljesítmény manipulációk hatása. Physiol Behav. 1992;51: 111-119. [PubMed]
11. BJ tekercs, EA Rowe, RC Turner. Állandó elhízás patkányokban, vegyes, nagy energiatartalmú étrend fogyasztása után. J Physiol. 1980;298: 415-427. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
12. Ahmed SH, Kenny PJ, Koob GF, Markou A. A kokain fokozódó növekedésével járó hedonikus allosztázis neurobiológiai bizonyítékai. Nat Neurosci. 2002;5: 625-626. [PubMed]
13. Markou A, Koob GF. Postcocaine anhedonia. A kokain kivonásának állati modellje. Neuropsychop. 1991;4: 17-26. [PubMed]
14. Kenny
PJ, Chen SA, Kitamura O, Markou A, Koob GF. Feltételes visszavonás
a heroin-fogyasztást és csökkenti a jutalomérzékenységet. J Neurosci. 2006;26: 5894-5900. [PubMed]
15. Pamut
P, Sabino V, Steardo L, Zorrilla EP. Opioidfüggő előrejelző
negatív kontraszt és binge-szerű evés a korlátozott hozzáféréssel rendelkező patkányokban
nagyon előnyös étel. Neuropsychop. 2008;33: 524-535. [PubMed]
16. Llado
I, et al. A kávézó étrendjének hatása a béta3-adrenoceptorra
expresszió és lipolitikus aktivitás a férfi és a fehér zsírszövetben
nőstény patkányok. Int. J Obes Relat Metab Disord. 2000;24: 1396-1404. [PubMed]
17. Halégés
CS, Elazar Z, Fuchs S. Differenciális glikoziláció és intracelluláris
a D2 dopamin receptor hosszú és rövid izoformáinak kereskedelme.
J. Biol. Chem. 1995;270: 29819-29824. [PubMed]
18. Vanderschuren LJ, Everitt BJ. A kábítószer-keresés kényszerítővé válik a kokain hosszantartó önbeadása után. Science. 2004;305: 1017-1019. [PubMed]
19. Volkow ND, Wise RA. Hogyan segíthet a kábítószer-függőség az elhízás megértésében? Nat Neurosci. 2005;8: 555-560. [PubMed]
20. Blundell
JE, Herberg LJ. A táplálkozási hiány és a fogyatékosság relatív hatásai
az oldalirányú hypothalamus elektromos önstimulációjának sebessége. Nature. 1968;219: 627-628. [PubMed]
21. Hoebel BG, Teitelbaum P. A táplálkozás és az önstimuláció hipotalám kontrollja. Science. 1962;135: 375-377. [PubMed]
22. Mount Mount, Hoebel BG. Oldalsó hipotalamusz önstimuláció: Az önmeghatározott küszöbérték megemelkedik az étkezés által. Psychon Science. 1967;9: 265-266.
23. Hoebel BG. Etetés és önstimuláció. Ann NY Acad Sci. 1969;157: 758-778. [PubMed]
24. Hoebel BG, Balagura S. Az oldalsó hipotalamusz önstimulálása inzulinnal és glukagonnal módosítva. Physiol Behav. 1967;2: 337-340.
25. Hoebel BG, Thompson RD. Intézisstruktúrájú táplálkozás vagy elhízás által okozott oldalsó hipotalamusz stimuláció iránti vonzás. J Comp Physiol Psychol. 1969;68: 536-543. [PubMed]
26. Wilkinson HA, Peele, TL. Az intrakraniális önstimuláció módosítása éhsőség útján. Am J Physiol. 1962;203: 537-540. [PubMed]
27. Fulton S, Woodside B, Shizgal P. Az agy jutalmazási áramkörének modulálása leptin segítségével. Science. 2000;287: 125-128. [PubMed]
28. Wang GJ, et al. A gyomor-disztencia aktiválja az emberi agy telítettségét. Neuroimage. 2008;39: 1824-1831. [PubMed]
29. Batterham RL és munkatársai. A kéreg és a hypotalamus agyterületeinek PYY-modulációja előrejelzi az emberek táplálkozási viselkedését. Nature. 2007;450: 106-109. [PubMed]
30. Hommel JD és munkatársai. A középső agy dopamin idegsejtjeiben a leptin receptor jelzése szabályozza a táplálkozást. Neuron. 2006;51: 801-810. [PubMed]
31. Fulton S és munkatársai. A mezoakkumbensek dopamin útjának leptin szabályozása. Neuron. 2006;51: 811-822. [PubMed]
32. Kenny PJ. Agyi jutalmazási rendszerek és kényszeres kábítószer-használat. Trends Pharmacol Sci. 2007;28: 135-141. [PubMed]
33. Wang GJ, et al. Agy dopamin és elhízás. Gerely. 2001;357: 354-357. [PubMed]
34.Huang
XF et al. Dopamin transzporter és D2 receptor kötési sűrűsége. \ T
egerek, amelyek hajlamosak vagy rezisztensek a krónikus, magas zsírtartalmú étrend-\ t Behav Brain Res. 2006;175: 415-419. [PubMed]
35. Thanos
PK, Michaelides M, Piyis YK, Wang GJ, Volkow ND. Élelmiszer-korlátozás
jelentősen növeli a dopamin D2 receptor (D2R) értékét az elhízás patkánymodelljében
in vivo muPET képalkotás ([11C] raclopride) és in vitro vizsgálattal
([3H] spiperon) autoradiográfia. Szinapszis. 2008;62: 50-61. [PubMed]
36.Frank
GK et al. Megnövekedett dopamin D2 / D3 receptor kötődés a visszanyerés után
az anorexia nervosa-ból pozitron emissziós tomográfiával és
[11c] rakloprid. Biol Psychiatry. 2005;58: 908-912. [PubMed]
37. Neville
MJ, Johnstone EC, Walton RT. A. \ T
ANKK1: egy új kináz gén, amely szorosan kapcsolódik a kromoszóma sávhoz a DRD2-hez
11q23.1. Hum Mutat. 2004;23: 540-545. [PubMed]
38. Mastronardi CA, Yu WH, Srivastava VK, Dees WL, McCann SM. A lipopoliszacharidok által kiváltott leptin felszabadulását idegi úton szabályozzuk. Proc Natl Acad Sci USA A. 2001;98: 14720-14725. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
39. Yin
HH, Knowlton BJ, Balleine BW. A dorsolaterális striatum inaktiválása
növeli az érzékenységet az akció kimenetelében bekövetkező változásokra
hangszeres kondicionálás. Behav Brain Res. 2006;166: 189-196. [PubMed]
40. Klein TA és munkatársai. Genetikailag meghatározott különbségek a hibákból való tanulásban. Science. 2007;318: 1642-1645. [PubMed]
41. Teegarden SL, Bale TL. Az étkezési preferencia csökkenése növeli az érzelmi képességeket és az étrend-visszaesés kockázatát. Biol Psychiatry. 2007;61: 1021-1029. [PubMed]
42. Volkow
ND et al. Alacsony dopamin striatális D2 receptorok kapcsolódnak
prefrontális metabolizmus az elhízott betegekben: lehetséges járulékos tényezők. Neuroimage. 2008;42: 1537-1543. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
43. Clarke HF, Dalley JW, Crofts HS, Robbins TW, Roberts AC. Kognitív rugalmatlanság a prefrontalis szerotonin kimerülése után. Science. 2004;304: 878-880. [PubMed]
44. zab
NM, Rada P, Hoebel BG. Bizonyíték a cukorbetegségről: viselkedési és
az időszakos, túlzott cukorbevitel neurokémiai hatásai. Neurosci Biobehav Rev. 2008;32: 20-39. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
45. Volkow ND, O'Brien CP. A DSM-V problémái: ha az elhízás az agyi rendellenesség? J J Pszichiátria. 2007;164: 708-710. [PubMed]
46. ​​Cottone P és munkatársai. A CRF rendszer toborzása a kényszeres étkezés sötét oldalát közvetíti. Proc Natl Acad Sci USA A. 2009;106: 20016-20020. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
47. Pellegrino LJ, Pellegrino AS, Cushman AJ. A patkány agy sztereotaxikus atlaszja. New York: Plenum Press; 1979.
48. David C, Fishburn CS, Monsma FJ, Jr, Sibley DR, Fuchs S. D2 dopamin receptorok szintézise és feldolgozása. Biokémia. 1993;32: 8179-8183. [PubMed]

Levelezés:

· Paul J Kenny ([e-mail védett])