Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Megjelent online 2017 május 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Absztrakt
Célok / hipotézis
Az étrendi zsírok túlhevülése emberben és rágcsálókban elhízást okoz. Az emberekkel és rágcsálókkal kapcsolatos közelmúltbeli vizsgálatok azt mutatták, hogy a zsíroktól való függőség egy közös mechanizmussal rendelkezik, amely függ az alkohollal, a nikotinnal és a kábítószerekkel, az agy jutalmazási rendszerei zavarában. Kiemelték, hogy a magas zsírtartalmú étrend (HFD) gyengíti a dopamin D2 receptor (D2R) jelátvitelt a striatumban, amely az agy jutalomrendszerének központi szabályozója, ami hedonikus túlmelegedést eredményez. Korábban arról számoltunk be, hogy a barna rizsspecifikus bioaktív komponens γ-oryzanol hipotalamikus kontroll révén csökkentette a HFD preferenciáját. Ezért azt vizsgáltuk, hogy a y-oryzanol egerekben modulálja-e az agy-jutalmazási rendszer működését.
Mód
HFD-vel táplált hím C57BL / 6J egereket orálisan kezeltünk y-ory-zanollal, és a D2R jelátvitelben résztvevő molekulák striatumszintjét értékeltük. Megvizsgáltuk a γ-ory-zanol hatását a D2R promoter DNS-metilációjára és a későbbi változásokat az étrendi zsírok preferenciáiban. Ezenkívül megvizsgáltuk a 5-aza-2-deoxycytidin, a DNS-metil-transzferázok (DNMT-k) hatásos inhibitora, az élelmiszer-preferenciákra, a D2R-jelzésre és a striatumban lévő DNMT-szintekre gyakorolt hatását. A y-oryzanol gátló hatását a DNMT aktivitására in vitro enzimatikusan értékeltük.
Eredmények
A HFD-vel táplált egerek striatumában a D2R-ek termelését a D2R promoter régiójának DNS-metilációjának növekedésével csökkentettük. A γ-oryzanol orális adagolása csökkentette a DNMT-k expresszióját és aktivitását, ezáltal helyreállította a D2R-ek szintjét a striatumban. A DNMT-k farmakológiai gátlása az 5-aza-2-deoxycytidinnel szintén javította az étrendi zsír előnyét. Ezeknek az eredményeknek megfelelően az enzim in vitro vizsgálatok azt mutatták, hogy a y-oryzanol gátolta a DNMT aktivitását.
Következtetések / értelmezés
Kimutattuk, hogy a y-oryzanol javítja a DFNUMXR promoter régiójának HFD által indukált DNS-hipermetilációját az egerek striatumában. Kísérleti paradigmánk kiemeli a γ-oryzanolt, mint ígéretes elhízás elleni anyagot, amelynek különálló tulajdonsága, hogy új epigenetikai modulátor.
Elektronikus kiegészítő anyag
A cikk online verziója (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) szakértői, de nem szerkesztett kiegészítő anyagot tartalmaz, amely az engedélyezett felhasználók rendelkezésére áll.
Bevezetés
Az elhízott személyek túlélése legalább részben megegyezik az alkohollal, nikotinnal és kábítószerrel való függőséggel kapcsolatos közös mechanizmusokkal [1]. Az étvágy hypothalamikus és hormonális szabályozása mellett az agy jutalomrendszere, különösen a dopamin receptor jelzés, szorosan kapcsolódik az addiktív vagy hedonikus táplálkozási viselkedéshez [2]. Egy korábbi, patkányokon végzett vizsgálat azt mutatta, hogy a striatális dopamin D2 receptor (D2R) lebomlása lentivírus által közvetített rövid hajtű interferáló RNS-vel gyorsan kiváltott függőséget okozó jutalmi hiányt és kényszerszerű táplálkozást keresett [3]. A csökkent D2R-sűrűség miatt a dorsalis striatum kevésbé reagál az étkezési jutalomra, mint az elhízott emberek és rágcsálók sovány kontroll csoportjai [3-5]. E fogalomnak megfelelően a TaqA. \ T ANKK1 a gén lokusz (DRD2 / ankyrin ismétlés és az 1-et tartalmazó kináz domén kódolása), amely csökkenti a striatális D2R termelést, az emberben elhízott fenotípushoz kapcsolódik [6], míg a bariatrikus műtét utáni fogyás hatásai emelkedett striatális D2R sűrűséghez kapcsolódnak [7]. Ezek az adatok erősen utalnak a striatális D2R fontosságára, mint új terápiás célpont az elhízás kezelésére. Azonban az agy jutalomrendszerére kifejlesztett gyógyszerek jelentős káros hatásokat, köztük súlyos pszichiátriai problémákat okoztak, ami a klinikákból való kilépést eredményezte [8].
Az epigenetikai módosítások nemcsak a fejlődés és a differenciálás szempontjából kritikusak, hanem azért is, mert azok környezeti változások eredményeként keletkeznek, beleértve az étrendet és az életmódot is [9]. A DNS-metiláció egy fő epigenetikus esemény a génexpresszió stabilitására [9]. Patkányokban az anyai expozíció egy magas zsírtartalmú étrendben (HFD) generációnként megváltoztatja a DNS metilálódását az utódok központi jutalmazási rendszerében, ami a kölykök túlzott fogyasztását eredményezi [10]. A DNS-metil-transzferázok (DNMT-k) különösen fontos szerepet játszanak mind a táplálkozási viselkedés, mind a fizikai aktivitás szabályozásában [10, 11], ami arra enged következtetni, hogy a DNMT-k ígéretes terápiás célpontok lehetnek az elhízás – cukorbetegség szindróma kezelésére. Fontos, hogy bizonyos természetes élelmiszerekből származó anyagok, köztük a koffeinsav és az epigallocatechin, ismert, hogy DNMT-gátlókként hatnak [12, 13].
Nemrég kimutattuk, hogy a bioaktív, barna rizsspecifikus komponens γ-oryzanol, a ferulinsav-észter és számos fitoszterol keveréke csökkenti a táplálkozási zsír preferenciáját a hypothalamikus endoplazmatikus retikulum (ER) stressz csökkenésével [14]. Egerekben és nyulakban az orálisan beadott γ-oryzanol gyorsan felszívódott a bélből, és főként az agyba osztódott [15, 16]. Ezeket az eredményeket együttesen figyelembe véve, a központi idegrendszerre ható természetes élelmiszerekből származó termékek alternatívát jelenthetnek az elhízás csökkent táplálkozási viselkedésének biztonságos enyhítésére. Ebben az összefüggésben teszteltük azt a hipotézist, hogy a γ-oryzanol megváltoztatja a DNS-metilálási állapotot az agy jutalom rendszerében, ami az egerekben a HFD preferenciájának gyengülését eredményezi.
Mód
Állatok
A Charles River Laboratories Japan-tól (Kanagawa, Japán) nyert hét hetes C57BL / 6J hím egereket (ketrecenként 3-4) specifikus kórokozóktól mentes körülmények között, 24 ° C-on, 12 óra / 12 óra fény / sötét ciklus. Egy hetes akklimatizáció után a 8 hetes egereket súly szerint egyeztettük, és két vagy három csoportra osztottuk, hogy minden kísérleten részt vegyenek. Az egerek szabad hozzáférést kaptak élelemhez és vízhez. Valamennyi állatkísérletet a Ryukyus Egyetem állatkísérleti etikai bizottsága hagyta jóvá (5352., 5718. és 5943. sz.).
Γ-ori-zanol és 5-aza-2'-deoxicytidin adagolása
A HFD előnyösségének értékeléséhez az γ-oryazanolt (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japán) az élelmiszer-választási vizsgálat során az előzőekben leírtak szerint adagoltuk 8-hetes egereknek.14, 17]. A többi kísérlethez egy 12079% y-oryzanolt tartalmazó HFD-t (D0.4B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) pelletként állítottunk elő. Az étrend összetevőit elektronikus kiegészítő anyag (ESM) táblázat mutatja 1. 12 hetes etetés után szöveteket gyűjtöttünk a striatumból és a hipotalamuszból. Az egerek átlagos táplálékfelvételéből becsült napi y-oryzanol-bevitel körülbelül 320 μg / testtömeg-g. A y-oryzanol dózisait a korábban leírtak szerint határoztuk meg [14]. Az 5-aza-2′-dezoxicitidint (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) hetente háromszor, 0.25 héten keresztül intraperitoneálisan (12 μg / testtömeg-gát) injektáltuk [18].
Az étrendi zsír preferenciájának értékelése
A táplálkozási zsírok preferenciáinak értékeléséhez az élelmiszer-tesztek a chow és a HFD (D12450B és D12451; kutatási étrendek) közötti választást választották, mint korábban leírták [14]. Az étrend összetevőit az ESM táblázat tartalmazza 1. Röviden: az egereknek szabad hozzáférést biztosítottak a chow-hoz és a HFD-hez. A chow és a HFD bevitelét hetente mértük, és elemeztük az étkezési zsír preferenciájának változását. A HFD-preferenciát a következő képlet alapján számoltuk ki: HFD-preferencia = [(HFD-bevitel / teljes táplálék-bevitel) × 100].
Biszulfit szekvenálás DNS-metiláláshoz
A DNS-t DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokió, Japán) alkalmazásával tisztítottuk. A DNS-oldatot frissen elkészített 3 mol / l NaOH-val összekevertük, 37 ° C-on 15 percig inkubáltuk, és 5.3 mol / l karbamidhoz, 1.7 mol / l nátrium-biszulfithoz és 4.9 mmol / l hidrokinonhoz adtuk. Az oldatot 15 cikluson át denaturáljuk 95 ° C-on 30 másodpercig, és inkubáljuk 50 ° C-on 15 percig.19]. A biszulfit-kezelt DNS-t MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) alkalmazásával tisztítottuk és PCR-rel amplifikáltuk KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR készlet (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) és a D2R promoter régió CpG helyén lévő primerek alkalmazásával. . A primer szekvenciák az alábbiak voltak: elülső láncindító, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; fordított primer, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Ezután az adapter szekvenciákat adtuk hozzá és tisztítottuk az Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) alkalmazásával. A mintákat ezután összegyűjtöttük és egy GS Junior-ra (Roche Diagnostics, Tokyo, Japán) töltöttük a gyártói protokoll szerinti szekvenáláshoz. A metilezési szintet a metilezett citozinok százalékában fejeztük ki az összes citozin maradékban.
DNMT aktivitási vizsgálat
A DNMT enzimatikus aktivitási vizsgálatot egy EpiQuik DNS metiltranszferáz aktivitás / gátlási vizsgálati készlet (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) és EPIgeneous Methyltransferase Assay kit (Cisbio Japan, Chiba, Japán) alkalmazásával végeztük a gyártó protokollja szerint.
Az egyes vegyületek gátló hatásának a DNS-metilációra gyakorolt hatásának felmérése céljából S-adenozil-20-homociszteint (SAH) mindegyik vegyület jelenlétében mértünk (XNUMX μmol / l a szűrővizsgálatokhoz), S-adenozil-metionin (SAM; 10 μmol / l) és DNMT-szubsztrát (4 ng / μl) 37 ° C-on 90 percig. A Michaelis – Menten kinetika értékeléséhez a DNMT1-et (20 μmol / l) inkubáltuk y-oryzanollal, SAM-mal (5 μmol / l) és a poli dI-dC jelzett koncentrációjával 37 ° C-on 90 percig. A DNMT3a-t (100 μmol / l) és a DNMT3b-t (100 μmol / l) inkubáltuk y-oryzanollal, SAM-mal (5 μmol / l) és a poli dG · dC jelzett koncentrációjával 37 ° C-on 120 percig. A vizsgálatokat négy példányban hajtottuk végre. A kivont fehérjét (0.75 mg / ml) SAM-mal (5 μmol / l), poli dI-dC-vel (5 μg / ml) és poli dG · dC-vel (5 μg / ml) inkubáltuk 40 ° C-on 120 percig, és Megmértük a SAH képződést.
Ösztrogénnel kapcsolatos receptor-y aktivitási vizsgálat
A y-oryzanol potenciális antagonista aktivitását az ösztrogénnel kapcsolatos receptor-y (ERRγ) iránt az emberi ösztrogénnel kapcsolatos receptor gamma-riporter vizsgálati rendszer (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) alkalmazásával értékeltük a gyártó protokollja szerint. Röviden, az aktív ERRy-t konstitutívan expresszáló, nem emberi emlős riporter sejteket 24 órán át három ismétlésben az egyes vegyületek jelzett koncentrációinak tettük ki.
Western blotolás
Ezt a fent leírtak szerint hajtottuk végre [20] antitestekkel D2R (1: 500, nyúl), dopamin transzporter (DAT; 1: 500, nyúl), tirozin-hidroxiláz (TH; 1: 1000, nyúl) (AB5084P, AB1591P és AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), a jelátalakító és a 3α (STAT3α; 1: 1000, nyúl), DNMT1 (1: 1000, nyúl), DNMT3a (1: 1000, nyúl) (8768, 5032 és 3598); Cell Signaling Technology, Tokió, Japán), DNMT3b (1 μg / ml, nyúl), ERRγ (1: 1000, nyúl) és β-aktin (1: 10,000 16049, egér) (ab128930, ab6276 és abXNUMX; Abcam, Cambridge, MA, USA).
Kvantitatív valós idejű PCR
A gén expresszióját a korábban leírtak szerint vizsgáltuk [14]. mRNS szinteket normalizáltuk Rn18s (18S rRNS). A kvantitatív valós idejű PCR-elemzésekhez használt primerkészleteket az ESM táblázat foglalja össze 2.
Statisztikai analízis
Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Egyirányú ANOVA-t és ismételt mértékű ANOVA-t, majd többszörös összehasonlító teszteket (Bonferroni – Dunn módszer) alkalmaztunk. Diákok t A két csoport közötti különbségek elemzésére tesztet alkalmaztunk. A különbségeket szignifikánsnak tekintették p <0.05.
Eredmények
A DNMT-k 5-aza-dC-vel történő farmakológiai gátlása csökkentette az étrendi zsír előnyét egerekben
A HFD-vel táplált egerekben a D2R promoter régiójában a DNS-metiláció sztriatumban szignifikánsan nőtt, mint a chow diétával táplált egerek. (Fig.1a) .1a). Másrészről a D2R promoter régiójában a hypothalamikus DNS-metiláció nyilvánvalóan magasabb volt, mint a striatumban a chow diéta alatt.p <0.01) (ábra. (Fig.1a, 1a, f) és a HFD nem változtatta meg (1. ábra). (Fig.1f) .1f). A HFD-vel táplált egerekben a D2R promoter régiójában a megnövekedett DNS-metiláció a striatumban 5-aza-dC-vel, egy erős DNMT-gátlóval kezeltük. (Fig.1a) .1a). Ezzel szemben a hypothalamusban a D2R promoter régiójában a DNS-metiláció nem változott szignifikánsan az 5-aza-dC-vel történő kezeléssel. (Fig.1f) .1f). A HFD-vel 20 hétig táplált 12 hetes hím egerek sztriatumában a D2R mRNS és fehérje szintje szignifikánsan csökkent (XNUMX. ábra). (Fig.1b, 1b, k, l). Ezzel ellentétben a dopamin D1 receptorok szintjei (D1R-ek, amelyeket kódol Drd1), amelyek az adenilil-ciklázon és a cAMP-közvetített intracelluláris jelátvitelen a D2R-ekkel ellentétes módon működnek, változatlanok voltak (1. ábra). (Fig.1c) .1c). Továbbá, a D2R jelátvitelhez kapcsolódó más molekulák szintjeiben, például az mRNS és / vagy fehérje szintjén a TH és a DAT nem változott (1. ábra). (Fig.1d, 1d, e, k, m). Másrészt a hipotalamuszban, köztük a D2R-ben nem észleltek nyilvánvaló változásokat. (Fig.1g-m) .1g-m). Nevezetesen, a hypothalamusban a D2R és TH fehérje szintjei sokkal alacsonyabbak voltak, mint a striatumban. (Fig.1l, 1l, m)ami a dopamin receptor jelátvitel relatív fontosságát tükrözi az agy jutalomrendszerben, mint a hipotalamusz.
Annak megvizsgálására, hogy a D2R promoter régiójában a DNS-metiláció megváltoztatja-e az étrend-zsír előnyét, elemeztük az 5-aza-dC-vel kezelt egerek táplálkozási viselkedését. Ahogy az várható volt, az 5-aza-dC szignifikánsan megnövelte az mRNS-t és a fehérje szinteket a D2R-nek a HFD-vel táplált egerek striatumában. (Fig.1b, 1b, k, l). Másrészről nem volt hatása a Drd1, Th és a Slc6a3 (kódolja a DAT-t) a striatumban vagy a szinteken Drd2, Drd1, Th és a Slc6a3 a hypothalamusban. (Fig.1c-e, 1c – e, g – m). Míg a hordozóval kezelt egerek előnyben részesítették a HFD-t, a HFD előnye szignifikánsan csökkent az 5-aza-dC-vel kezelt egerekben (a hordozóval kezelt egerek 88% -a). (Fig.1n) .1n). Következésképpen az 5-aza-dC-vel történő kezelés csökkentette a testtömeg növekedését (1. ábra). (Fig.11o).
γ-oryzanol csökkenti a DNMT szintjét a HFD-vel táplált egerek striatumában
Ahogy korábban bejelentettük [14] az γ-oryzanol orális beadása a hím egereknek szondával szignifikánsan csökkentette a HFD előnyét (93% a hordozóval kezelt egerek értékeihez). (Fig.2a), 2a) a testtömeg-növekedés látszólagos csillapítását eredményezi (1. ábra). (Fig.2b) .2b). Ezért tanulmányoztuk a γ-oryzanol potenciális hatását a D2R-ek epigenetikus modulációjára a striatumban.
Az emlősökben három fő DNMT-t találunk: DNMT1, 3a és 3b. A DNMT1 funkció a DNS-metiláció fenntartására szolgál, míg a DNMT3a és az 3b szerepet játszik a de novo DNS-metiláció elősegítésében [21]. Annak érdekében, hogy a y-oryzanol potenciális hatását vizsgáljuk a DNMT-kre in vivo, értékeljük a DNMT szintjét a HFD-vel táplált egerekben. Bár a HFD önmagában nem volt hatással a striatumban vagy a hypothalamusban lévő DNMT mRNS- és fehérjeszintjeire, a γ-oryzanollal történő kiegészítés szignifikánsan csökkentette a DNRT szintjét a striatumban, de nem a hypothalamusban. (Fig.2c-e, 2c – e, g – i, k – n). Ezek az adatok felvetik annak a lehetőségét, hogy a y-oryzanol striatum-specifikus módon szabályozhatja a DNMT-szinteket. Hasonló módon, az 5-aza-dC szignifikánsan csökkentette a DNMT3a és az 3b mRNS szintjét a striatumban (ESM. 1hirdetés).
Egy korábbi vizsgálat alapján, amely kimutatta, hogy a DNMT1 mRNS-szintjét legalább részben az ERRy nukleáris receptor szabályozta [22], megvizsgáltuk a γ-oryzanol potenciális hatását az ERRy aktivitásra. Nem humán emlőssejtekben, amelyek az ERRy-t konstitutívan expresszálják, az 4-hidroxi-tamoxifen, az ERRy erős fordított agonista, jelentősen csökkent az ERRy aktivitást. Figyelemre méltó, hogy a γ-oryzanol részben csökkentette az ERRγ aktivitást (a veleszületett érték körülbelül 40% -os csökkenése). (Fig.3a) .3a). Fontos, hogy az ERRy erősen kifejeződött a striatumban, de nem a hypothalamusban. (Fig.3b-d) .3b-d). A striatum helyzetével ellentétben a y-oryzanol csak a hipotalamuszban szignifikánsan növelte a DNMT1 fehérje szintjét (1. ábra). (Fig.2k, 2k, l). Ezeket az eredményeket legalább részben a magyarázat, hogy a STAT3α, a DNMT1 szint pozitív szabályozója [23], a hipotalamuszban bőségesen expresszálódott, de nem a striatumban. (Fig.33például).
A y-oryzanol hatásának további vizsgálatára a DNMT-k aktivitására in vivo a SAH, a DNS-metiláció mellékterméke és a DNMT-k hatásos inhibitora képződését a HFD-vel táplált y-oryanol-kezelt egerekben értékeltük. A HFD-vel táplált és chow-táplált egerek között sem a striatumban, sem a hypothalamusban nem volt szignifikáns változás a SAH-képződésben. (Fig.2f, 2f, j). Jól látható, hogy a y-oryzanol szignifikánsan csökkentette a SAH-képződést a striatumban. (Fig.2f) 2f) de nem a hipotalamuszban. (Fig.2j), 2j) azt sugallva, hogy a y-oryzanol szuppresszum-specifikus módon elnyomhatja a DNMT aktivitását a HFD-vel táplált egerekben.
Az γ-oryzanol gátló tulajdonságainak enzimatikus elemzése a DNMT-kre in vitro
Ezt követően értékeltük a γ-oryzanol hatását a DNMT aktivitására in vitro. Meghatároztuk a γ-oryazanol, a ferulinsav, az 5-aza-dC, a haloperidol (egy reprezentatív D2R antagonista), a quinpirol (egy reprezentatív D2R agonista) és a SAH elleni DNMT elleni gátló hatását. Pozitív kontrollként a SAH dózisfüggő módon erősen csillapította a DNMT aktivitását (1. ábra). (Fig.4a-f) .4a-f). Ahogy az várható volt, a haloperidol és a kinpirol nem mutatott hatást a DNMT-k aktivitására (ESM. 2). Jól látható, hogy a y-oryzanol jelentősen gátolta a DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) és 3b (maximális gátlás 57%) (ábra. (Fig.4d-f) .4d-f). Ezzel szemben a ferulinsav, a γ-oryzanol metabolitja, gátló aktivitása sokkal alacsonyabb volt, mint a γ-oryzanolé. (Fig.44d-f).
Továbbá megvizsgáltuk a γ-oryzanol gátló tulajdonságait a DNMT-kre. A SAH képződését úgy határoztuk meg, hogy az γ-oryzanol DNMT-re gyakorolt gátló aktivitását in vitro vizsgáljuk. A DNMT által közvetített DNS-metiláció során a SAH-képződés adatai Michaelis – Menten kinetika telített mintáját jelzik mind a y-oryzanol jelenlétére, mind a hiányára (1. ábra). (Fig.4g-i) .4GI). A DNMT1 által közvetített DNS-metilációban az Eadie – Hofstee elemzés kimutatta, hogy a γ-oryzanol nem mutatott hatást a \ t V max SAH-képződés (vivőanyag, 597 pmol / perc; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / perc; y-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / perc), míg a γ-oryzanol láthatóan megnövelte a K m (vivőanyag, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (ábra. (Fig.4j) .4j). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a y-oryzanol legalább részben versenyképes módon gátolja a DNMT1-et. Másrészt, a DNMT3a- és 3b-közvetített DNS-metiláció esetében a y-oryzanol csökkentette a \ t V max a SAH képződése (DNMT3a: vivőanyag, 85.3 pmol / perc; γ-orizanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / perc; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / perc; DNMT3b: jármű, 42.3 pmol / perc; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) és hasonlóan a K m ehhez a reakcióhoz (DNMT3a: vivőanyag, 0.0086 μg / ml; γ-orizanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: hordozó, 0.0122 μg / ml; oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (ábra. (Fig.4k, 4k, l). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a y-oryzanol gátolja a DNMT3a-t és az 3b-t legalább részben nem versenyképes módon.
A y-oryzanol növeli a D2R szintjét a HFD-vel táplált egerek striatumában
Ezt követően teszteltük annak a lehetőségét, hogy a y-oryzanol növeli a striatális D2R-tartalmat a DNMT-k gátlásával. HFD-vel táplált egerekben a γ-oryzanol orális adagolása szignifikánsan csökkentette a striatális DNS-metilációt a D2R-ek promóterrégiójában. (Fig.5a), 5a), míg a hipotalamuszban ez nem történt meg. (Fig.5f) .5f). Ezeknek a megállapításoknak megfelelően a D2R mRNS és fehérje szintjeit kölcsönösen növeltük (1. ábra). (Fig.5b, 5b, g, k, l). Hasonló az 5-aza-dC-vel történő kezelésre vonatkozó adatokhoz (1. ábra). (Fig.1), 1), nem volt nyilvánvaló hatás az RNS és a fehérje szintjeire Drd1, Th és a Slc6a3 (DAT) a striatumban, és nincs hatása a Drd1, Th és a Slc6a3 a hypothalamusban. (Fig.5c-e, 5c – e, h – k, m).
Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a D2R és a DNMT1 szintjét ER-stressz és gyulladás szabályozza legalább részben az NF-κB-n keresztül [17, 24, 25]. Ezért megvizsgáltuk az ER stresszhez és gyulladáshoz kapcsolódó gének szintjét. Amint azt korábban kimutatták [26], a HFD megnövelte a TNF-α-t kódoló gének expresszióját (TNF-), monocita kemoattraktáns fehérje –1 (MCP-1) (Ccl2), C / EBP homológ fehérje (Szelet), ER-lokalizált DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) és az X-box kötőfehérje 1 spliced formáját (Xbp1s) a hipotalamuszban, de nem a striatumban. (Fig.6) .6). Nevezetesen, a HFD-nek a-oryzanollal történő kiegészítése jelentősen csökkentette a Ccl2, Szelet, Dnajb9 és a Xbp1s kizárólag a hypothalamusban, de nem a striatumban. (Fig.66).
Megbeszélés
A jelen vizsgálatban a fő megállapítás az, hogy a y-oryzanol hatásos DNMT-gátló hatású az egerek striatumában, és ezáltal legalább részben gátolja a HFD preferenciáját a striatális D2R epigenetikus modulációján keresztül. A HFD-vel táplált egerek striatumában a D2R szintje szignifikánsan csökkent, míg a D1R, TH és DAT értékei nem változtak meg (1. ábra). (Fig.1b-e, 1b – e, k – m). Ezek az adatok összhangban vannak azzal a meggyőződéssel, hogy a striatális D2R diszregulációja kulcsfontosságú szerepet játszik az élelmiszer-jutalom észlelésében, amikor a HFD-t használják, ami az elhízott állatokban a HFD túlzott fogyasztását eredményezi [3]. A jelen vizsgálatban a HFD-vel táplált egerek 5-aza-dC-vel történő kezelése szignifikánsan megnövelte a striatális D2R szintjét. (Fig.1b, 1b, k, l) a D2R promoter régiójában a DNS-metilációs szint csökkenésével (lásd a 4. ábrát). (Fig.1a), 1a), és ezáltal csökkentette az étrendi zsír preferenciáját (1. ábra). (Fig.1n) .1n). Ez a megállapítás támogatja a striatális D2R-ek kritikus szerepét az élelmiszer-jutalom észlelésében, amikor HFD-n van.
In vitro vizsgálataink azt mutatták, hogy a γ-oryzanol DNMT-vel szembeni gátló hatása nyilvánvalóan erősebb, mint a metabolit ferulinsavé. (Fig.4d-f), 4d – f), ami arra utal, hogy a γ-oryzanol teljes szerkezete fontos a DNMT-kre kifejtett gátló hatására. A HFD-vel táplált egerekben tanulmányaink arra utalnak, hogy az orális beadás után a y-oryzanol teljes szerkezeteként éri el az agyat és csökkenti a DNMT-k szintjét és aktivitását a striatumban, következésképpen a DNS-metiláció csökkenése a promoter régiójában D2R a striatumban. In vitro vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a γ-oryzanol részleges antagonistaként hat az ERRy ellen, amely elsősorban a DNMT1 termelés pozitív szabályozójaként szolgál [22], és ezáltal csökkentette a DNMT1 aktivitását (1. ábra). (Fig.3a) .3a). Figyelemre méltó, hogy az ERRy erősen expresszálódott a striatumban, de az egerekben nem a hypothalamusban. (Fig.3b) .3b). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a y-oryzanol potenciálisan csökkenti a DNMT1 mRNS-szintjét, legalábbis részben az ERRy gátlásával. A striatummal ellentétben a y-oryzanol nem mutatott hatást a D2R szintjére a HFD-vel táplált egerekből származó hypothalamusban. (Fig.5g, 5g, k, l).
Másrészt kimutattuk, hogy a γ-oryzanol szignifikánsan megnövelte a DNMT1 szintjét a hipotalamuszban, de nem a striatumban. (Fig.2k, 2k, l). Kimutatták, hogy a STAT3 növeli a DNMT1 tartalmát malignus T-limfóma sejtekben [23]. Észrevettük, hogy korábban kimutattuk, hogy a y-oryzanol jelentősen megnövelte a leptin által indukált STAT3 foszforilációt a HFD-vel táplált egerekből [14]. Azt is meg kell jegyezni, hogy a STAT3α lényegében expresszálódott a hypothalamusban, de nem az egerek striatumában (1. ábra). (Fig.3e-g) .3például). Ezek az adatok arra késztetnek, hogy spekuláljuk, hogy a γ-oryzanol DNMT1 szintjére gyakorolt látszólagos különbség a hipotalamusz és a striatum között legalább részben a STAT3α és az ERRγ régióspecifikus tartalmának tulajdonítható az egerekben ( Ábra. (Fig.3b-g) .3b-g). Együttesen úgy tűnik, hogy az egerek ERRy és STAT3a expressziója viszonylag ritka a striatum és a hypothalamus között. Eredményeink alapján tehát ésszerű, hogy feltételezzük, hogy a striatumban, ahol az ERRy termelés bőséges, a y-oryzanol előnyösen csökkenti a DNMT1 mRNS szintjét és enzimaktivitását az ERRγ negatív szabályozójaként. Ezzel szemben a hypothalamusban, ahol a STAT3α termelés dominál, a y-oryzanol előnyösen növelheti a DNMT1 szintjét.
Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a striatális D2R jelátvitel HFD-dys által kiváltott csillapítása szabályozza a táplálkozási viselkedést [3], ami arra utal, hogy a striatális DNMT-k gátlásának potenciális jelentősége van az elhízás kezelésében. Másrészről, egy korábbi vizsgálat kimutatta, hogy a specifikus hypothalamikus magokban expresszált melanocortin receptor 4 gén DNS-metilációjának állapota módosíthatja az elhízás transzgenerációs formáit az agouti életképes sárga egerekben [27]. Bár további vizsgálatokra van szükség a mögöttes mechanizmusok tisztázásához, ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy a szöveti, gén- és szekvencia-specifikus DNS-metiláció fontos szerepet játszik a HFD által indukált elhízás patofiziológiájában.
Nemrég beszámoltunk arról, hogy a HFD növelte a D2R szintjét az egerek hasnyálmirigy-szigetein [17, 24]. Valószínű, hogy az ilyen növekedést legalább részben az ER-stressz és az NF-KB-n keresztüli gyulladás közvetíti, mivel a D2R promoter régiójában több NF-kB-re érzékeny elem van [17, 24]. Egy újabb tanulmány kimutatta, hogy a TNF-a és az IL-1β növeli a DNMT1 szintjét és aktivitását a zsírszövetben a HFD-vel táplált egerekből [25]. Fontos, hogy a jelen tanulmány kimutatta, hogy a HFD indukálta ER stressz és gyulladás a hipotalamuszban, de nem a striatumban. (Fig.6) .6). Kísérleti paradigmánkban a szövet-, régió- és helyspecifikus DNS-metiláció és demetiláció mélyreható mechanizmusai további vizsgálatot várnak.
Az előző jelentésünkkel együtt, amely azt mutatja, hogy a y-oryzanol enyhíti a HFD preferenciáját az ER stressz hipotalamikus szabályozásával egerekben [14], a y-oryzanol szintén egyedülálló tulajdonsága, hogy a táplálkozási magatartás mind hedonikus, mind metabolikus diszregulációját javítja. Mivel bizonyos antiobesity gyógyszerekről ismert, hogy kritikus mellékhatásokat okoznak [8] az agyi jutalmak rendszerében természetes táplálkozáson alapuló megközelítés várhatóan az elhízás - a cukorbetegség szindróma kezelésére biztonságosan [16]. Ebben a paradigmában a γ-oryzanol ígéretes antiobesity jelölt, amelynek sajátos tulajdonsága, hogy epigenetikus modulátor.
Köszönetnyilvánítás
Hálásak vagyunk S. Okamoto-nak (Ryukyus Egyetem, Japán) a kézirat felülvizsgálatáért. Köszönjük M. Hirata-nak, H. Kaneshirónak, I. Asato-nak és C. Noguchinak (Ryukyus Egyetem, Japán) titkársági segítségét.
Rövidítések
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-dezoxicitidin |
| D1R | Dopamin D1 receptor |
| D2R | Dopamin D2 receptor |
| DAT | Dopamin transzporter |
| DNMT | DNS-metil-transzferáz |
| ER | Endoplazmatikus retikulum |
| ERR | Ösztrogénnel kapcsolatos receptor |
| HFD | Nagy zsírtartalmú étrend |
| SAH | S-Adenosyl-L-homocisztein |
| SAM | S-Adenozil-metionin |
| STAT3α | 3α transzkripció jelátalakítója és aktivátora |
| TH | Tirozin-hidroxiláz |
Megjegyzések
Az adatok rendelkezésre állása
Az aktuális tanulmány során generált és / vagy elemzett adatállományok ésszerű kérések alapján elérhetők a megfelelő szerzőtől.
Finanszírozás
Ezt a munkát részben támogatta a Japán Tudományos Támogatási Társaság (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 és 24591338), a Tudományos, Technológiai és Innovációs Tanács, a Minisztériumközi Stratégiai Innovációs Támogatási Program. (SIP) „A következő generációs mezőgazdaság, erdőgazdálkodás és halászat létrehozására szolgáló technológiák”, a Lotte Alapítvány, a Japán Alkalmazott Enzimológia Alapítvány, az Új Energia- és Ipari Technológiai Fejlesztési Szervezet (NEDO), az Élettudományi Hálózat létrehozásának projektje ) (Okinawa prefektúra, Japán) és az Okinawa prefektúra orvostechnikai csoportosításának promóciós projektje, Japán, valamint az Okinawa prefektúra támogatása a fejlett gyógyászat előmozdítására (Okinawa prefektúra, Japán).
Érdekesség kettőssége
A szerzők kijelentik, hogy a kézirathoz nincs kettős érdeklődés.
Hozzájárulási nyilatkozat
A kutatást a CK és a HM tervezte. A CK és a TK elvégezte a kísérleteket és elemezte az adatokat. TK, CS-O, CT, MT, MM és KA hozzájárult az adatok értelmezéséhez. CK és HM írta a kéziratot. Minden szerző hozzájárult az adatok értelmezéséhez. Valamennyi szerző csatlakozott a kézirat felülvizsgálatához, és jóváhagyta a végleges változatát. A HM garantálja ezt a munkát, teljes körű hozzáférést biztosít az összes adathoz, és teljes felelősséget vállal az adatok integritásáért és az adatelemzés pontosságáért.
Lábjegyzetek
Elektronikus kiegészítő anyag
A cikk online verziója (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) szakértői, de nem szerkesztett kiegészítő anyagot tartalmaz, amely az engedélyezett felhasználók rendelkezésére áll.
Referenciák
;