Az inzulin aktiválja az inzulin receptorokat (InsRs) a hipotalamuszban, hogy étkezés után jelezze a telítettséget. Azonban az elhízás növekvő előfordulása, amely krónikusan megnövekedett inzulinszintet eredményez, azt jelenti, hogy az inzulin az agyi központokban is hathat, amelyek szabályozzák a motivációt és a jutalmat. Itt közöljük, hogy az inzulin képes növelni az akciós potenciálfüggő dopamin (DA) felszabadulását a nukleáris accumbensben (NAc) és a caudate – putamen-ben egy közvetett mechanizmuson keresztül, amely striatális kolinerg interneuronokat tartalmaz, amelyek expresszálják az InsR-t. Továbbá, két különböző krónikus étrend-manipuláció patkányokban, élelmiszer-korlátozás (FR) és egy obesogén (OB) étrend, ellentétesen megváltoztatja a striatális DA felszabadulásának inzulinra való érzékenységét, fokozott válaszreakciót mutatva a FR-ben, de az OB-ben a reakcióképesség csökkenése. A viselkedési vizsgálatok azt mutatják, hogy a nemkívánatos inzulinszintek a NAc héjban szükségesek egy párosított glükóz oldat ízének megszerzéséhez. Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy a striatális inzulin jelzés fokozza a DA felszabadulását az élelmiszer-választások befolyásolására.

Megállapítottam, hogy a plazma inzulin tartós növekedése étkezés közben és után aktiválja az inzulinreceptorokat (InsRs) a hypothalamusban, ami negatív visszacsatolást biztosít az étvágyi áramköröknek, ami csökkenti a további étkezést^{1, 2, 3}. Az agyi inzulin elsősorban a hasnyálmirigy β-sejtjeiből származik, és a vér-agy gáton a plazmából az agyba aktív transzport jön létre^{4, 5, 6, 7, 8}, bár a neuronális inzulin szintézisére és felszabadulására is egyre több bizonyíték van^{1, 9}. Nevezetesen, az insR-k expressziója nem korlátozódik a hipotalamuszra, bár az extra-hipotalamikus insR-k funkciója megoldatlan marad^{1, 2, 3}. Tekintettel az elhízás és a II. Típusú cukorbetegség növekvő gyakoriságára, amelyben az inzulin keringő szintje folyamatosan emelkedik, és az agy inzulin transzportja és a receptor érzékenysége csökken^{3, 8, 10, 11}kritikus, hogy megértsük az inzulin funkcióját az agyi régiókban, amelyek szabályozzák a motivációt és a jutalmat. Különös érdeklődésre számot tartó agyi régiók közé tartozik az accumbens (NAc), amely közvetíti az élelmiszer és a gyógyszerek előnyös hatásait.^{12, 13}és a caudate – putamen (CPu), amely szerepet játszik a szokásalapú viselkedésben és a vágyban¹³. Az insR-ek ezekben a régiókban vannak kifejezve, a legnagyobb sűrűség a NAc-ben^{3, 14}; Az insR-eket a középső agyban lévő dopamin (DA) neuronok is expresszálják, beleértve a ventralis tegmentális területen (VTA) és a materiia nigra pars compacta (SNc) sejtjeit is.¹⁵. Az agy inzulin szintje arányos a plazma inzulin koncentrációjával és a test adipositással^{6, 7, 8}azzal a feltevéssel, hogy az inzulin ezekben az agyrégiókban az InsR-eken hathat az élelmiszer-jutalom befolyásolására^{3, 16, 17}.

Korábbi vizsgálatok striatális szinaptoszómákban, heterológ sejtekben, agyszeletekben és in vivo kimutatták, hogy az inzulinok inzulin aktiválása a DA transzporter (DAT) DA-felvételének növekedéséhez vezet^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Ez az eljárás magában foglalja a PI3 kináz jelátviteli útvonalát^{19, 20}és eredményezi a DAT behelyezését a plazmamembránba¹⁹. A keringő inzulinszint dinamikusan modulálja a striatális DAT-aktivitást, csökkent a DA-felvétel és a DAT felületi expressziója a cukorbetegség állati modelljeiben és az élelmiszer-korlátozás után (FR)^{20, 21}. Az inzulin-függő DAT-aktivitás növekedése kimutatta, hogy csökkenti a kiváltott extracelluláris DA-koncentrációt ([DA]_o) a VTA-ban²³, ami a DA felszabadulás és felvétel közötti egyensúly változását tükrözi. Az inzulin telített mikroinjekciója a VTA-ban a telített sűrűséggel összhangban csökkenti az élelmiszer-jutalmat^{23, 24}míg a VTA és SNc DA neuronokban az InsR-eket nem tartalmazó egerek fokozott táplálékfelvételt mutatnak, és elhízottak lettek²⁵. Bár az inzulin a VTA DA neuronok hosszú távú depresszióját idézheti elő²⁴az inzulin-expozíció a telítettségben betöltött szerephez igazodva szintén növelheti a DA-neuron tüzelési sebességét, esetleg a DA-felszabadulás és az autoreceptor által közvetített gátlás csökkentésével.²⁵. Ezért az inzulin nettó hatása a striatális DA felszabadulásra nehéz megjósolni. Valóban, az inzulin hatása a striatális DA felszabadulásra ex vivo szelet¹⁹ és az inzulin helyi mikroinjekciójának hatása a NAc-ben az élelmiszer-jutalomra²⁶ tűnik ellentmondásosnak. Ennek megoldása érdekében a NAc és a CPu intakt mikrokörnyezetében értékeltük az axon DA felszabadulását és felvételét ex vivo striatális szeletek gyors vizsgálatsal ciklikus voltammetriával (FCV), és meghatározták az inzulin-jelzés hatásait a NAc-ben a jutalom viselkedésében in vivo.

Vizsgálataink azt mutatják, hogy az inzulin elsődleges hatása a NAc-ben és a CPu-ban a DA felszabadulás fokozása, annak ellenére, hogy a DA felvétel párhuzamosan nő. A DA felszabadulás dinamikus szabályozása inzulin-függő növekedést mutat a striatális kolinerg interneuronok (ChIs) ingerlékenységében, ami fokozott DA felszabadulást eredményez nikotin acetil-kolin (ACh) receptorok (nAChR) aktiválásával. Az inzulin hatása a ChI-kre és a DA felszabadulásra az InsR-ek közvetítésével történik. Nevezetesen, az inzulin hatása a DA felszabadulásra FR patkányok szeleteiben amplifikálódik, de patkányokon egy obesogén (OB) étrendre tompított. Ezek az adatok a DA kiadás amplifikációját mutatják be ex vivo az inzulinszeletek azt jelzik, hogy az inzulin jutalomjelként szolgálhat in vivo. Valójában a párhuzamos viselkedési vizsgálatok azt mutatják, hogy az inzulin szerepe az NAc héjában az íz-preferencia kondicionálásban. Ezek az eredmények együttesen jelzik az inzulin új szerepét, mint jutalomjelet, amely befolyásolhatja az élelmiszer-választást

Az InsR-ek hatására kialakuló inzulin növeli a kiváltott striatális DA felszabadulást

Helyi kivizsgálás kezdeti vizsgálata [DA]_o FCV-vel ellenőrzik ex vivo striatális szeletek patkányokból ad libitum (AL) az élelmiszerekhez és a vízhez való hozzáférése feltárta azt a váratlan megállapítást, hogy az inzulin akut alkalmazása számos fiziológiailag releváns koncentrációban^{1, 4} megnövekedett egyimpulzusú [DA]_o (1a – c), EC-inzulinnal₅₀ 2 – 12 nM értékei (az a koncentráció, amelynél a hatás maximális volt)1b). Megnövekedett kiváltás [DA]_o különösen meglepő volt, mivel ez a maximális arány jelentős növekedésével járt együtt.V_max) a DAT által közvetített felvétel minden alrégióban (Táblázat 1), ami versengő csökkenéshez vezetne [DA]_o, amint azt korábban jeleztük^{22, 23}. Ehelyett azt találtuk, hogy [DA]_o az 20-55% -ot 30 nM inzulinnal maximálisan amplifikálták; a legnagyobb arányú hatásterület a NAc héj, amely a striatum alrégió a legnagyobb InsR kifejezéssel^{1, 14}. Az azonos körülmények között 30 nM inzulinnak kitett szeletek nem mutattak változást a striatális DA tartalomban (Kiegészítő ábra 1a), ami azt jelenti, hogy az inzulin megváltoztatja a dinamikus kibocsátás szabályozását, nem pedig egyszerűen a DA szintézisét. Különösen az inzulin hatása a kiváltásra [DA]_o ≥100 nM szuprafiziológiai koncentrációknál elveszett (1b). Ez nem az emelkedett DAT aktivitás felborulásának, mint az inzulin hatásának volt eredménye V_max ezen koncentrációkban is elveszett (Táblázat 1). Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy az intakt striatális mikrokörnyezetben az inzulin domináns hatása a kiváltotta [DA]_o a felszabadulás növelése a DA felvétel párhuzamos növekedése ellenére.

  

  

(a) Átlagos egyimpulzusú [DA]_o NAc-héjban, NAc-magban és CPu-ban az inzulin (Ins) előtt és után, az 30 nM; hibahelyek elhagyva, de lásd (b); nyilak jelzik az inger idejét. Az inzulin fokozódik, kiváltva_o héjban (55 ± 10%), mag (37 ± 5%) és CPu (20 ± 4%) alapján (***P<0.001). (b) Az inzulin hatása a koncentráció függvényében alakult ki egy fiziológiai tartományban (1 – 30 nM) héjában (n= 22-24, F_5,133= 14.471, P<0.001), mag (n= 36-76, F_5,308= 16.318, P<0.001) és CPu (n= 30-62, F_5,253= 13.763, P<0.001), de ≥ 100 nM mellett elveszett. (c) A csúcs-kiváltott reprezentatív felvételek [DA]_o az NAc-mag egyetlen helyén az idő függvényében, gyógyszeres alkalmazás hiányában (Con), az inzulin (30 nM) alkalmazása során vagy amikor inzulint alkalmaztunk egy InsR inhibitor HNMPA (5 μM) jelenlétében. (d) Átlagos csúcskifejtés [DA]_o az inzulin (30 nM) HNMPA, InsR antagonista S961 (1 μM) és PI3K inhibitor LY294002 (1 μM) hatásának megelőzésére vonatkozó adatok, de nem az IGF-1R inhibitor PPP (1 μM) által.n= 29-76; P> 0.9 versus önmagában inzulin). Mert 1a – d, n= az 3 – 6 patkányok alrégióinak száma az egyes hatóanyagok vagy inzulin koncentrációk esetében; egyirányú ANOVA, Tukey becsületes szignifikancia teszt (HSD). Lát Kiegészítő ábra 1b, c NAc shell és CPu adatokhoz.

• Teljes méretű kép (98 KB)

 

 

Mivel az inzulin inzulinszerű növekedési faktor 1 receptorokra is hatással lehet (IGF-1R), bár 100 nM-nél nagyobb koncentrációban (ref. 1), arra törekedtünk, hogy megerősítsük, hogy az inzulin fokozott hatása a kiváltott \ t_o az InsR függ. Ez a helyzet bizonyult, mivel a hatást egy intracelluláris InsR-inhibitor, a hidroxi-2-naftalenil-metil-foszfonsav (HNMPA) és egy InsR-antagonista, S961, de nem az IGF-1R-ek szelektív inhibitora, a pikropodofillin gátolta.²⁴ (PPP; 1c, d és a Kiegészítő ábra 1b, c). Ezután megvizsgáltuk a PI3 kináz bevonását, amely megindítja a DAT inzulinfüggő szabályozásáért felelős jelátviteli utat¹⁹. Az 1 μM koncentrációban a P13K inhibitor LY249002 önmagában nem volt hatással a csúcs-kiváltásra [DA]_o or V_max (n= 29 – 76 helyek (NAc mag) gyógyszerenként, P> 0.05, egyirányú varianciaanalízis (ANOVA); adatok nem láthatók), mégis megakadályozta az inzulin kiváltott hatását [DA]_o minden striatum alrégióban (1d és a Kiegészítő ábra 1b, c).

Az insRs lokalizációja DA axonokon és ChI-kön

A megfigyelt növekedés a V_max az inzulin fiziológiás szintjeihez való DA-felvétel esetében a DA axonokon lévő inRR-ek jelenlétére utal, ahogyan a korábbi striatális készítmények eredményei is^{18, 19, 20, 21, 22}. Bár kimutatták az insRs funkcionális kifejeződését a középső agyi neuronokon^{15, 23, 24, 25}, A striat DA axonokon végzett InsR expresszióról nem számoltak be. Ezt immunhisztokémiai módszerrel kezeljük. Sűrű InsR immunoreaktivitás a striatum korlátozott mennyiségi értékelésénél a DA axonokon lévõ InsR lokalizációra, amelyet egy DA-szintetizáló enzim, tirozin-hidroxiláz (TH) immunreaktivitásával azonosítottunk. Ezért egy korábban jelentett protokollt fogadtunk el²⁷, amely magában foglalja az InsR puncta számítását, amely normál kép nézetben átfedésben van a TH + profilokkal, és csak azután, hogy az InsR kép csak az 90 ° forgatásával számolt. Ha az InsR és a TH + profilok látszólagos átfedése nem specifikus, akkor az eljárásnak statisztikailag hasonló értéket kell adnia, függetlenül attól, hogy normál vagy 90 ° -nál nagyobb a fázis. Ez az elemzés azonban csökkentette az InsR puncta átfedését az 14 ± 9% TH + profiljaival.n= 42 mezők, P<0.01, páros kétfarkú t-teszt; az adatok nem jelennek meg), megerősítve az InsR jelenlétét a DA axonokon. Az intenzívebb azonban, hogy a striatum InsR-immunjelölése különféle InsR-expressziókat tárt fel a nagy sejttesteken, amelyeket striatális ChI-ként azonosítottak a kolin-acetil-transzferáz (ChAT), az ACh-szintézishez szükséges elsődleges enzim ko-immun-jelölésével. Elektrofiziológiai kritériumok alkalmazásával²⁸ a ChI-k azonosítására az előzetes teljes sejt-felvételi vizsgálatokban több neuront töltöttünk biocitinnal, majd immunhisztokémiai feldolgozás céljából; mindezek (4 / 4) immunpozitívak voltak mind az InsR, mind a ChAT esetében (2a). Az InsR és a ChAT ko-lokalizáció későbbi értékelése a NAc-ben megerősítette, hogy gyakorlatilag minden ChAT + neuron kifejezte az InsR-t (96%; n= 27 / 28 neuronok négy szakaszban két patkányból).

  

  

(a) Biocytinnel töltött ChI, majd ChAT-ra immunoltatva, és InsR (4 / 4 biocytin-töltött ChI-k); az egyesített kép a ko-lokalizációt mutatja; méretarány, 10 μm. (b-e) A striatális ChI-k válasza az inzulin (3 nM) előtt és után a depolarizáló áramimpulzusok sorozatára (200, 300, 400 és 120 pA; 30-intervallumok). (b) A Chi (felső) spike-frekvencia-adaptáció az aktuális injekció alatt az akciós potenciál (AP) -vesztés csökkenésében figyelhető meg, míg a spike az inzulinban az áramimpulzus alatt (alacsonyabb); teljes adatkészlet d. (c) Az inzulin által indukált AP szám növekedési reprezentatív időszaka a ChI in in minden aktuális lépésével b. (d) Az AP-szám összefoglalása az inzulin-expozíció előtti és az azt követő csúcshatásokon átadott áramimpulzusok közöttn= 21 párosított stimulációk, 7 neuronok, 5 patkányok)e) Az inzulin (+ Ins) hatását a kontroll körülmények között (Con; n21 párosított stimulációk, 7 neuronok, ***P<0.001, páros kétfarkú t-teszt), HNMPA (5 μM) jelenlétében (n12 párosított stimulációk, 4 neuronok, 4 patkányok, \ t P>0.05, párosított t-teszt) és PPP (1 μM) jelenlétében (n18 párosított stimulációk, 6 neuronok, 6 patkányok, **P<0.01, Wilcoxon párosított pár aláírt rangos teszt). (f) Átlagos egyimpulzusú [DA]_o NAc magban az inzulin (30 nM) előtt és után mecamilaminban (Mec; 5 μM) vagy DHβE (1 μM) normálizált 100% csúcsszabályozásra (n= 20 – 40 helyek egy szubregiononként az 3 – 4 patkányok között, P> 0.05 a kontrollhoz képest, párosítatlan t-teszt). (g) Átlagos egyimpulzusú [DA]_o a heterozigóta kontrollból (Het) és az őssejtek szeleteiből Csevegés KO egerek az inzulin előtt és után (30 nM), normalizálva 100% csúcsszabályozásra. Az inzulin fokozódik, kiváltva [DA]_o heterozigóta egerekben 190 ± 23% NAc héjban, 140 ± 8% NAc magban és 137 ± 12% CPu-ban (n= 15 – 25 helyek egy alrégióban 3 – 4 egerek genotípusonként, **P<0.01, ***P<0.001 a kontrollhoz képest párosítva t-test), de nem volt hatással a kiváltásra [DA]_o minden striatális alrégióban Csevegés KO egerek (P> 0.1).

• Teljes méretű kép (167 KB)

 

 

Az inzulin növeli a ChI ingerlékenységét

Az insRs funkcionalitásának tesztelésére a striatális ChI-k esetében vizsgáltuk az inzulin hatását a ChI ingerlékenységére teljes sejtáram-rögzítés segítségével. A ChI ingerlékenységét 3-s depolarizáló áramimpulzusok sorozata alapján határoztuk meg, amellyel előidézett egy olyan cselekvési potenciál, amely megbízhatóan tüskés frekvencia-adaptációt mutatott (2b), gyakran az áramimpulzus vége elvesztésével. Meglepő módon az inzulin (30 nM) gyengítette a tüskés frekvencia adaptációt, ami idővel fokozatosan növelte az akciós potenciál számát (2c), a maximális növekedéssel (2d, e) az 20 és az 50 min. Inzulin hiányában a kontroll ChI-k nem mutattak változást a kiváltott akciós potenciálok számában (P> 0.05, páros kétfarkú t-teszt; az adatok nem jelennek meg); az azonos időintervallumban megfigyelt kontroll neuronokkal összehasonlítva az inzulinnak kitett neuronok szignifikánsan nagyobb változást mutattak a kiváltott akciós potenciálok számában (kontroll n= 12 stimuluspárok négy neuronból, inzulin n= 21 stimuluspárok hét neuronból, F_1,25= 5.63, P<0.05, vegyes mértékű kétirányú ANOVA; adatok nem láthatók). Az inzulin hatásának növekedését az akciós potenciál számában a HNMPA megakadályozta, de az IGF-1R szelektív inhibitor PPP (2e), ami azt mutatja, hogy az inzulin által okozott megnövekedett ChI ingerlékenység az InsR közvetítette.

A kiváltott inzulin fokozása [DA]_o nAChR és ACh szükséges

Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a ChIs és az ACh hatékonyan szabályozza a striatális DA felszabadulást a DA axonokon lévő nAChR-eken keresztül^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Az intenzív inzulin expresszió ChI-en és az akut inzulin-expozícióban megfigyelt ChI-ingerlékenység javulása azt sugallta, hogy ezek az idegsejtek új célpontok lehetnek az inzulin számára, ami fokozott DA-felszabaduláshoz vezethet. Ennek teszteléséhez vizsgáltuk az inzulin hatását mecamil-amin, egy nem szelektív nAChR antagonista vagy dihidro-β-eritroidin (DHβE) jelenlétében, amely a β2 alegység-tartalmú (β2 *) nAChR-ek szelektív antagonistája, amelyek gazdagodtak DA axonok³⁵. Érintett [DA]_o ezen antagonisták jelenlétében könnyen kimutatható volt, még akkor is, ha mindkét gyógyszer csökkentette az egyimpulzus által kiváltott amplitúdót [DA]_o (például 13 – 26% -ban NAc magban), amint azt korábban jeleztük^{29, 30, 31, 32}. Az ACh és a nAChR szerepének alátámasztására az inzulin hatása a kiváltásra [DA]_o mecamil-amin vagy DHβE (2f). A striatális ACh jelátvitel inzulin-fokozott DA felszabadulásában való részvételének megerősítéséhez megvizsgáltuk az inzulin hatását ex vivo az egerekből származó striatális szeletek, amelyekben a ChAT expressziója genetikailag abba került az elülső struktúrákban (előjáték) Csevegés KO egerek), beleértve a striatumot is³². Bár ezekben az egerekben a ChI-k sértetlenek, az ACh-szintézis megszűnik, ami csökkent, de még mindig könnyen kimutatható egyimpulzusú [DA] -hoz vezet._o, amint azt korábban leírtuk³². A kontroll heterozigóta alomtársakban az inzulin (30 nM) fokozódóvá vált [DA]_o az NAc shellben és a core-ban és a CPu-ban 37 – 90% (2g), amely meghaladja a patkány striatumban észlelt amplifikációt (pl. Ábra 1). Az inzulin hatása a kiváltásra [DA]_o a striatális komplexumban nem volt jelen az előtérben Csevegés KO egerek, demonstrálva, hogy az inzulin-közvetített DA-felszabadulás fokozása striatális ACh-re van szükség, de a ChI-kből nem jön létre együtt-felszabaduló adók, például glutamát.³⁶.

Az inzulin hatása a kiváltásra [DA]_o az étrendfüggő

A plazma- és agyi-inzulin-koncentrációk arányosak a test adipositásával^{6, 7, 8}, és kompenzáló változásokhoz vezethet az agy érzékenységében az inzulinra. Ezért teszteltük azt a hipotézist, hogy az étrend befolyásolja az inzulin képességét a DA felszabadulás előmozdítására, a patkányok sztriatális szeleteit használva, amelyeket krónikus FR vagy OB étrendben tartanak, az AL kontrollokkal szemben. Amint az várható volt, a plazma inzulin szintje korrelált a testtömeggel, alacsonyabb inzulint FR-ben, mint az AL vagy OB patkányokban.3a és a Táblázat 2). A cirkuláló inzulin különbségei ellenére a csúcsérzékeny [DA]_o a NAc héjban és a magban, és a CPu lényegesen alacsonyabb volt ex vivo striatális szeletek mindkét étrendcsoportból az AL-hoz képest (3b és a Kiegészítő ábra 2 a, b), ami azt jelenti, hogy az inzulint szabályozó tényezők mellett abszolút \ t_o. A striatális DA-tartalom nem különbözött az étrendcsoportok között, ami a kibocsátási szabályozás változását jelzi, nem pedig a DA-szintézisben.Kiegészítő ábra 2c). A dinamikus szabályozás változásával összhangban a striatális DA felszabadulás inzulinra való érzékenysége jelentősen függ az étrendtől. FR patkányokban az ≤1 nM inzulin koncentráció, amely nem volt hatással az AL-ben (1b), fokozottan kiváltott [DA]_o (3c), ami az inzulin fokozott érzékenységét tükrözi az EK-val₅₀ az FR striatum (0.4 – 0.6 nM) értékei, amelyek megközelítőleg nagyságrenddel alacsonyabbak, mint az AL-ben \ t 1b és a 3c). Meglepő kontrasztban az inzulin hatása elveszett az OB striatumban; még az 30 nM inzulin, amely maximális hatással volt az AL striatumra (1b), nincs hatása az OB-ben (3c).

  

  

(a) A plazma inzulin koncentrációja pozitívan korrelál a testtömeggel az etetőcsoportok között (R= 0.76). (b) Átlagos egyimpulzusú [DA]_o a NAc magjában (lásd Kiegészítő ábra 2a, b a NAc héj és a CPu esetében alacsonyabb volt az FR-ben (38 ± 4%) és az OB (25 ± 4%) \ tn= 50 – 60 helyek az 5 – 6 patkányoknál étrendcsoportonként, F_2,156= 23.337, egyirányú ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB kontra FR (P<0.08). (c) A kiváltott érzékenység [DA]_o az inzulinra fokozódott a FR-ben, de elvesztette az \ tn= 21 – 49 helyek szubregiononként egy 2 – 4 patkányonként étrendcsoportonként, egyirányú ANOVA, Tukey HSD), nagyobb érzékenységgel FR-ben az AL-patkányok között minden alrégióban (P<0.001 minden régióra; kétirányú ANOVA; Processzor: F_{(conc × étrend; 3,286)}= 10.253; mag: F_{(conc × étrend; 3,353)}= 6.166; héj: F_{(conc × étrend; 3,195)}= 10.735).

• Teljes méretű kép (124 KB)

 

 

Ezek az adatok fordított kapcsolatot mutatnak a striatális InsR érzékenység és a test adiposity között. Alternatív megoldásként azonban ezek az étrend-függő különbségek a megváltozott nAChR érzékenységet tükrözhetik. Ezért minden egyes diétás csoportban meghatároztuk a NAc magban a nikotinra adott koncentráció-választ. A nikotin nAChR deszenzitizálódást okoz, amelyet a [DA] arányának összehasonlításával számszerűsíthetünk._o az öt impulzus rövid vonata által kiváltott 100 Hz-nél az egyimpulzus által kiváltott [DA]_o (5 p: 1 p arány) a nAChR aktiváció / deszenzitizáció indexeként^{30, 31}. Ezzel a megközelítéssel nem találtunk különbséget a nAChR érzékenységű étrendcsoportok között az NAc magban (Kiegészítő ábra 3a – c). Továbbá a kontroll 5 p: 1 p arány nem különbözött az NAc magban lévő étrendcsoportokban (Kiegészítő ábra 3d) vagy CPu (nem illusztrált), ami azt jelenti, hogy az étrend nem változtatja meg a nAChR-függő DA-kibocsátási szabályozást. Így úgy tűnik, hogy a striatális InsR-érzékenység fokozódik a FR-ben az AL-patkányokkal szemben, de az OB-patkányokban hiányzik, az inzulin fiziológiás koncentrációiban a striatális DA-felszabadulás szabályozásának elvesztésével.

Az NAc shell inzulin modulálja a kondicionált íz preferenciát

A táplálkozási preferenciákat mind a pre-, mind a poszt-inferitív tényezők okozzák; az egyes mechanizmusok nem teljesen megoldottak, de a jelenlegi bizonyítékok mindkét esetben a NAc DA jelzését jelzik^{37, 38}. Tekintettel arra, hogy a plazma és a cerebrospinális folyadék (CSF) inzulin szintje gyorsan emelkedik a perifériás glükózszint emelkedése után⁶és az inzulin növekedése a striatumban kimutatható a plazma inzulin emelésének 5 min⁷logikus, ha feltételezzük, hogy a perifériás inzulin felszabadulás étkezés közben fokozhatja a NAc DA felszabadulását, és hozzájárulhat az inzulin utáni jutalmazási mechanizmusokhoz. Egy korábban leírt íz-preferencia protokollt adaptáltunk³⁷ szacharin-édesített glükóz oldatokkal patkányokban, hogy megvizsgáljuk azt a hipotézist, hogy az endogén inzulin hatásának blokkolása egy inzulin antitest helyi alkalmazásával a NAc-ben csökkentené a párosított íz előnyét. Az InsAb hatásosságát az inzulin hatásának blokkolásában egy, az AUC-vel végzett vizsgálat során vizsgálták in vitro a DA felvételének vizsgálata striatális szinaptoszómákba. Az inzulin (30 nM) szignifikánsan megnövekedett V_max a NAc vagy a CPu szinaptoszómáiban (Kiegészítő ábra 4), összhangban van a miénkkel V_max a striatális szeletekből származó adatok (Táblázat 1) és korábbi tanulmányokkal^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Inzulin hiányában sem az InsAb, sem a kontroll antitest immunglobulin G (IgG) nem változtatott V_max DA-felvétel a kontrollhoz képest. IgG jelenlétében az inzulin még mindig jelentős növekedést okozott V_max; azonban az inzulin hatása V_max az InsAb jelenlétében elveszett (Kiegészítő ábra 4).

A szöveti károsodás minimalizálása és a szöveti célpont érzékenységének megőrzése érdekében két alanycsoportot vizsgáltunk, amelyekben a NAc mikroinjekciót mock mikroinjekciós eljárással váltogattuk, nem pedig egyetlen egyedcsoportot alkalmaztunk, és egy ízesített oldatot párosítottunk az InsAb-vel és egy másikval. jármű. Következésképpen az egy palackos kondicionálás során a kísérleti csoport két ízesítéssel párosított InsAb mikroinjekciókat kapott, és váltakozó üléseken a másik ízrel párosított mock mikroinjekciókat (4a, balra). A kontrollcsoport kapott mock mikroinjekciókat váltakozva foszfát-pufferolt sóoldat (PBS) vagy IgG mikroinjekcióival. Mindkét ízesített oldat glükózt tartalmazott a kondicionálás során. A kontroll mikroinjektált csoportban nem vártunk különbséget az ízek között, míg az InsAb-mikroinjektált csoportban a preferencia várhatóan az ál-mikroinjekció párosított íze felé változik.

  

  

(a) Egy-palackos kondicionálást ábrázoló ábra (balra) és a két palackos vizsgálat (jobbra). (b) Egy palackos kondicionálás során fogyasztott mennyiség (ml). Jelentős kölcsönhatás volt az infúzió-kondicionáló szekció és a mikroinjekciós kezelés között.n= 19 – 20 patkányok csoportonként, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 vegyes ANOVA, ismételt intézkedésekkel az infúziós kondicionáló munkamenetben). Az InsAb mikroinjekció jelentősen csökkentette a fogyasztást a kontrollhoz képest a harmadik során (t(40) = 3.026, **P<0.01) és negyedik (t(40) = 3.052, **P<0.01, védett egyfarkú t-tesztek). Az ál-injekciók egyik csoportban sem befolyásolták a fogyasztást.F_3,111= 1.110, 2 × 4 vegyes ANOVA, ismételt mérésekkel az ál-kondicionálás során). (c) A két palack íz-preferencia teszt során elfogyasztott mennyiség. Jelentős kölcsönhatás volt az íz és a mikroinjekciós kezelés között a kondicionálás során (F_1,37= 5.36, P<0.05, kétirányú kevert ANOVA, ismételt ízesítési mérésekkel). Az InsAb csoport lényegesen kevesebbet fogyasztott az InsAb párosított ízből, mint az ál-páros íz (t(18) = 2.82, ** P<0.01, védett egyfarkú t-teszt); a kontrollcsoport nem mutatott ízesítést (t(19) = 0.803, P> 0.05, védett t-teszt). Összehasonlítva a csoportokat, az InsAb patkányok szignifikánsan kevesebbet fogyasztottak az infúzióval párosított \ tt(40) = 1.96, *P<0.05) és lényegesen több az ál-páros íz (t(40) = 1.77, *P<0.05, védett egyfarkú t-teszt), mint a kontrollok.

• Teljes méretű kép (161 KB)

 

 

Az egy palackos kondicionálás során az InsAb mikroinjekció a harmadik és negyedik infúzió során jelentősen csökkentette a fogyasztást a járműhöz képest.4b). Ezzel ellentétben mindkét csoport ugyanolyan mennyiségű oldatot fogyasztott mind a négy ál-befecskendező ülésen (F_3,111= 0.127, P>0.05, vegyes kétirányú ANOVA) (4b). Összesen nyolc kondicionáló munkamenet után az íz-preferenciát két-palackos tesztben értékeltük, amelyben a patkányok egyszerre kaptak hozzáférést mindkét ízesített oldathoz.4a). A statisztikai analízis az íz és a kondicionálás során kapott mikroinjekciós kezelés között jelentős kölcsönhatást tárt fel.4c). Az InsAb-csoport lényegesen kevesebbet fogyasztott az InsAb-párosításhoz képest, mint a mock-páros ízű (4c), míg a járműcsoport nem mutatott ízesítést (4c), ami azt jelenti, hogy az ép inzulin jelzés a édes kalóriaoldat kiválasztásához hozzájárult. A hordozóval összehasonlítva az InsAb-mikroinjektált patkányok szignifikánsan kevesebbet fogyasztottak az infúzió-párosított ízből és szignifikánsan nagyobb mértékben az injekció-párosított ízből (4c). IgG mikroinjekciója (t(9) = 0.792. P>0.05, védett t-teszt) vagy PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, védett t-testek) nem befolyásolták az aroma-preferenciát (az adatokat nem ábrázolták), azzal a lehetőséggel, hogy az InsAb mikroinjekció nemspecifikus hatása csökkentette a fogyasztás vagy az íz preferenciáját. Azt is meg kell jegyezni, hogy az InsAb csoport előnye a tesztben nem előnyben részesíti a kevésbé újszerű aromát, mivel nem volt kölcsönhatás a munkamenet és a munkamenet típus között (az aktuális infúzió és az infúzió között) az InsAb csoportban (F_3,54= 1.584, P> 0.05, kétirányú ANOVA). Vagyis az InsAb csoport nem fogyasztott többet az ál-infúzióval párosított ízből, mint az InsAb infúzióval párosított íz; a kezelési csoportok közötti különbségek csak az infúziós kondicionáló munkamenetek során jelentkeztek. Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy az NAc inzulin szerepet játszik a glikémiás terhelést jelző íz preferencia megerősítésében.

Itt közöljük, hogy az inzulin amplifikálja a striatális DA felszabadulást nAChR-függő módon, azáltal, hogy modulálja a ChI ingerlékenységét az InsR-ek segítségével. Eredményeink arra utalnak, hogy az inzulin jutalomjelként szolgálhat a fáradtság jelzésében betöltött szerepe mellett. Nevezetesen, az inzulin hatása a DA felszabadulásra táplálkozással módosul, és az FR után szignifikánsan megnövekedett az inzulinérzékenység, de az inzulin-fokozott szabályozás teljes elvesztése egy OB étrendre. Ezek a változások az InsR érzékenység változásait tükrözik, amelyek fordítottan kapcsolódnak a keringő inzulinszintekhez, mivel a plazma inzulin szintje diétától függ, de a nAChR érzékenység nem volt. Végül, az állatok viselkedésében végzett íz-preferencia-vizsgálatok azt sugallják, hogy az NAc-héjban az inzulin-jelzés befolyásolja az élelmiszer-preferenciát, amely nemcsak az inzulint az élelmiszerrel kapcsolatos tanulásban, hanem a jutalom jeleként is megerősíti szerepét.

Net [DA]_o tükrözi a DA felszabadulás és a DA felvétel közötti egyensúlyt a DAT-en keresztül. Korábbi bizonyítékok arról, hogy az inzulin szabályozhatja a DAT aktivitását^{18, 19, 20, 21, 22, 23} azt jósolta, hogy az inzulin növekedése nettó csökkenést okozhat [DA]_o fokozott DA-felvételen keresztül. Megállapítottuk azonban, hogy a striatumban az inzulin hatása ennél bonyolultabb. Bár az inzulin expozíció növekedett V_max a DAT esetében az inzulin elsődleges hatása a DA felszabadulásra volt jellemző, nem pedig a DA felvételre, a kiváltott növekedés következetes növekedésével [DA]_o az inzulin koncentráció fiziológiás tartományán belül a NAc héjban és a magban és a CPu-ban. Bár a kiváltott növekedés [DA]_o az 100 nM szuprafiziológiai koncentrációjánál visszaállt a kontroll szintekre, V_max változatlan maradt a kontrolltól, és magyarázatként kiküszöbölte a DAT-re gyakorolt ​​domináns hatást. Ehelyett a felvételre gyakorolt ​​hatás elvesztése, valamint a felszabadulás is az inRR-ek deszenzitizálását vagy a downstream jelátviteli útvonalak nagy inzulinkoncentrációval történő szabályozását jelenti. Valójában az inzulinok a perifériás szövetekben az inzulin-kötődés után gyors endocitózist és lebomlást szenvednek¹, az ún. bizonyítékokkal a neuronális InsR érzékenység csökkenését követően rövid ideig tartó magas inzulin- vagy magas kalóriatartalmú étrend-expozíció után^{10, 11, 39}.

Az inzulin domináns hatása az itt bemutatott striatális DA felszabadulás fokozására ellentétben áll a két másik közelmúltbeli eredményével ex vivo szelet tanulmányok. Az elsőben az inzulin a [³H] DA striatális szeletekből, bár megnövekedett [³H] DA túlfolyást észleltünk, amikor a DAT-t gátolták²². Tekintettel arra, hogy megjelent [³A H] DA-nak el kell kerülnie a DAT által közvetített felvételt a szuperfúziós oldatban kimutatható szövetben, ez a protokoll különösen érzékeny a DAT szabályozásra. Eredményeink azt mutatják, hogy az inzulin fokozza a DA felszabadulását a ChI-k és a nAChR aktiválása mellett, a DAT-közvetített felvétel fokozásán túl, megmagyarázza az inzulin-fokozott látszólagos paradox növekedést [³H] DA túlcsordulás, amikor a DAT-re gyakorolt ​​versengő hatások blokkolódtak²². A második vizsgálatban a VTA-ban a szomatodendritikus DA-felszabadulás közvetlen kimutatására használt FCV-t alkalmazták, de az inzulin túlnyomó hatását is megállapította a DA-felvételre, ami a csökkent csökkenést tükrözi [DA]._o (Ref. 23). Számos tényező közötti különbség a helyi mikrocirkulációtól a szomatodendritikus és az axonális DA felszabadító mechanizmusokig⁴⁰, hozzájárulhatna e regionális különbséghez. Amint azt az alábbiakban tárgyaljuk, azonban az inzulin regionálisan függő szerepe valószínűleg komplementer, nem pedig ellentmondásos.

Korábban feltételezték, hogy a DA jelzés inzulinfüggő szabályozásának bármilyen szerepe közvetett a DA neuronok közvetlen inaktiválásával. Itt azt mutatjuk be, hogy az insR-ek kifejeződnek a striatális ChI-kön is, és hogy az inzulin modulálja a ChI ingerlékenységét a striatális DA-felszabadulás amplifikálására, ami kulcsfontosságú szerepet játszhat az inzulin táplálkozásra gyakorolt ​​hatásában. A Striatal ChI-k a thalamus intralamináris magjainak neuronjaiból nyúlványokat kapnak, amelyek a szenzoros ingerekre reagálva robbanó tüzeléssel rendelkeznek, és segítenek a figyelem, a megerősítés és az asszociatív tanulás irányításában fontos ChI-kben fellépő törésszünet-tapintási minták irányításában⁴¹. Ezért az inzulin hatása a striatális ChI-k inRR-jére fokozhatja az érzékszervi táplálkozási jelek hatását a thalamicus tüzelésre adott striatális válaszra, hozzájárulva a bevitt étkezés jutalomértékének fokozott észleléséhez. A Chiat aktiválás által a striatális DA felszabadulásának közvetlen előmozdítása arra a következtetésre vezetett, hogy a ChI-ket stimuláló tényezők kiváltságos szerepet játszanak a DA kiadás kiváltóinak.³³. Adataink az első bizonyítékot szolgáltatják ehhez, az inzulin-fokozott ChI ingerlékenység és az ACh jelátvitel dinamikusan növeli a DA kiadást.

A fokozott DA-felszabadulás inzulin jelenlétében szintén az ACh-jelátvitel fokozódását jelenti olyan mértékben, amely nAChR deszenzitizálódást vagy muszkarin ACh-receptor (mAChR) aktiválódást okoz, amelyek mindegyike elnyomhatja az egyimpulzus-kiváltotta [DA]_o (refs 29, 30, 31, 42). Tehát az itt bemutatott mechanizmusok különböznek a mAChR-ek ACh-aktiválódásától, amely az elkeseredéssel és a telítettséggel társult.⁴³.

Egyimpulzusú [DA]_o alacsonyabb volt mind FR, mind OB patkányokban, mint az AL patkányokban; bár ezek az eredmények összhangban vannak a korábbi jelentésekkel^{44, 45, 46}Tanulmányainkban a két étrendcsoport három striatum alrégiójának első szisztematikus összehasonlítását végeztem egy állandó időkereten belül. A táplálékfüggő változások mechanizmusai a DA-felszabadulásban nem tisztázódtak, és nem tartoznak a jelen tanulmányok körébe. Tekintettel azonban arra, hogy a plazma inzulinszintjét az FR és az OB étrend ellentétesen megváltoztatja, nem valószínű, hogy csökkent a kiváltott szint [DA]_o mindkét csoportban az étrend-függő inzulinszint következménye.

Másrészről az étrenddel szembeni érzékenység változásai és a táplálékfüggő plazma inzulinszintek adják a legvalószínűbb magyarázatot az inzulinra adott fokozott érzékenységre a FR-ben és az inzulinra adott válaszok elvesztésében. Nem volt bizonyíték az alternatív magyarázatra a megváltozott nAChR érzékenységre sem FR, sem OB patkányokban az AL ellen. Bár eredményeink az elsők között jelzik a fokozott striatális InsR érzékenységet FR-vel¹⁸a testsúlycsökkenés a CSF csökkent inzulinszintjével járhat⁷, amely hozzájárulna a DA felszabadulásának fokozott érzékenységéhez az inzulinra FR-ben. Ezzel ellentétben az OB-patkányokban az inzulin-érzékenység csökkenése összhangban van az agyi InsR-érzékenység csökkenésével kapcsolatos korábbi bizonyítékokkal, amelyeket súlygyarapodás vagy OB-étrend okoz.^{3, 10, 11}.

termékeink ex vivo a szeletadatok alátámasztják azt a hipotézist, hogy az inzulin jutalomra és telítettségre utalhat. Ezt a hipotézist teszteltük az endogén inzulin kétoldalú InsAb mikroinjekció hatásának blokkolásával az NAc-héjban az íz-preferencia-kondicionálás során. A jutalomban betöltött szerepnek megfelelően az inzulin hatásának gátlása csökkentette a párosított glükóz tartalmú oldat ízének előnyét, szemben az ép inzulin jelzéssel kapcsolatos ízekkel. Az inzulin blokkolása az NAc-héjban szintén csökkentette a párosított oldat fogyasztását egy palackos kondicionálás során, míg az ál-vagy kontroll mikroinjekciók nem befolyásolták a fogyasztást. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az NAc-héjban lévő inzulin szerepet játszik az élelmiszer-preferenciában. Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy az ízesítés megszerzéséhez az intenzív DA jelzés az NAc-ben szükséges^{37, 38}, megerősítve a NAc DA szerepét a tápoldatok megerősítő hatásainak közvetítésében. Ebben a fényben az ép inzulin rendelkezésre állással párosított glükózoldat előnyben részesíti az inzulin elsődleges hatását a DAT-közvetített DA-felvételen a NAc-héjban, mivel ez várhatóan csökken [DA]_o és ezáltal csökkentik a kontroll párosított íz fogyasztását. Eredményeink összhangban vannak az előző tanulmányi eredményekkel is, amelyekben az inzulin mikroinjekciója a NAc-héjban megnövelte az állatok szájon át szacharóz-adagolásának idejét, a szacharóz-fogyasztás határvonalának növekedésével²⁶, ami ellentétes a megnövekedett DA felvétel várható következményeivel. Összességében ezek a viselkedési adatok összhangban vannak az inzulin előrejelzett hatásával a striatális ChI-kre és a fokozott DA felszabadulásra. Ezek az eredmények azonban nem zárják ki a striatális mikrocircuit más elemei bevonását a megfigyelt viselkedésekbe, széles körben elterjedt InsR kifejezést kapva a striatumban.^{1, 14}.

Az itt bemutatott tanulmányok az első bizonyítékot szolgáltatják arra, hogy az inzulin szerepet játszik az étkezés kalóriaértékének, és ezáltal a jutalmazó hatások közlésében, ami jelentős hatással van az inzulin hatására mind az alsúlyban, mind az elhízott betegekben. Számos tanulmány azt jelzi, hogy az étel utóhatás hatásai, függetlenül attól, hogy az íztranszdukciós útvonalak érintetlenek-e⁴⁷, növelje a NAc DA felszabadulását és a viselkedés pozitív megerősítését^{37, 47}. Így a posztabszorpciós inzulin-válasz kódolhatja az étkezés glikémiás hozamát, és hozzájárulhat a fogyasztást lehetővé tevő élelmiszer-preferenciák és viselkedés erősítéséhez. Azonban a keringő inzulinszintek és a központi InsR érzékenység extrém változásai szerepet játszhatnak az abnormális és adaptív viselkedésben is. Például a hypoinsulinaemia és az insR-érzékenység kompenzáló felfelé állítása FR-személyeknél befolyásolhatja a behatolást.⁴⁸. Ezzel szemben a II. Típusú cukorbetegség vagy az elhízás központi inzulinérzékenysége, amely itt az OB patkányokban tükröződik, hozzájárulhat a lenyelés utáni jutalom érzetének csökkenéséhez, a magas glikémiás indexű élelmiszerek bevitelének kompenzálásához.^{49, 50}. Ezért a striatális inzulinérzékenység növelése vagy csökkenése hozzájárulhat a kóros evéshez, ami a táplálkozás és / vagy az elhízás mértékét eredményezi.

Összességében megállapítottuk, hogy az inzulin új szerepe van a jutalom jeleként. Egy ilyen szerep ellentétben áll az ismert funkcióval, mint a telítettségi jel, beleértve a legújabb megállapításokat, hogy a VTA-ba mikroinjektált inzulin csökkentheti a hedonikus táplálkozást és a táplálék jutalommal kapcsolatos jelzések előnyét.^{23, 24}. Ez felveti azt a kérdést, hogy hogyan lehet összeegyeztetni az inzulin látszólag ellentétes szerepét ezekben a DA-függő funkciókban. A válasz lehet, hogy ezek a hatások egymást kiegészítik, nem ellentmondásosak. A jelenlegi eredmények azt mutatják, hogy a striatumban lévő inzulin közli a bevitt étkezés jutalomértékét. A jelzőtelítettség kettős szerepe egyszerűen lehetővé teszi, hogy az inzulin szolgáljon az étkezés befejezésének fontos céljához, miközben egyidejűleg megemlíti a táplálkozási és ily módon jutalmazó tulajdonságait, ezáltal megerősítve a belélegzés viselkedését.

Állatkezelés

Az állati eljárások összhangban voltak az NIH irányelvekkel, és az NYU Orvostudományi Iskola Állatgondozási és Használati Bizottsága jóváhagyta. Valamennyi állat 12 h fényen volt: sötét ciklusban, az 06-ről világít: 00 és 18: 00; ex vivo az 08: 00 és az 12: 00 között szeleteket állítottunk elő. Az AL patkányok és egerek mechanikai vizsgálatait végeztük ex vivo a párokban elhelyezett állatok szeleteit, míg a patkányokat egyedül az összes diétás csoport összehasonlításában és viselkedési vizsgálatokban tartották.

Patkány diéta

Felnőtt hím Sprague – Dawley patkányok (Taconic) 8 – 10 hetesek voltak az 21 – 30 napig tartó étrend-kezelés megkezdésekor. A patkányokat félig véletlenszerűen osztottuk a táplálkozási csoportokhoz: az alanyokat kezdeti súly szerint rangsoroltuk, majd a patkányok minden egymást követő trióját véletlenszerűen osztottuk el az étrendcsoportok között. Az AL patkányok szabadon jutottak a patkányfűhöz ugyanazon időszakban, mint a párosított patkányok a FR vagy OB étrendeken. Minden patkány szabadon jutott a vízhez. Élelmiszer-korlátozást hajtottak végre, mint korábban⁵¹; Röviden, a patkányok naponta 40 – 50% -ot kaptak az AL-bevitelből, amíg a testtömeg nem csökken 20% -kal, majd ezt követően a táplálékot titráltuk a súly fenntartása érdekében. Az OB patkányok szabadon jutottak a patkány-csokoládéhoz és a csokoládéhoz⁵².

Homloklebeny Csevegés knockout egerek

Egerek feltételes úszó alléljával Csevegés (Csevegés^Flox) a Nkx2.1^Cre transzgénikus vonal, hogy olyan egereket állítsunk elő, amelyekben az ACh-szintézis ablációja csak előfegyületre korlátozódik³². A nem mutáns transzgenikus alomtársak kontrollok voltak; Cre genotípusai⁺;Csevegés^{Flox / +} és Cre^-;Csevegés^{Flox / Flox} „heterozigótáknak” nevezik. A szeletekre használt felnőtt hím egerek voltak ad libitum hozzáférés a chowhoz és a vízhez.

Ex vivo szeletelőkészítés és fiziológiai megoldások

A patkányokat vagy az egereket mélyen elaltattuk 50 mg-mal^-1 pentobarbitál (intraperitoneális (ip)) és dekapitált. A voltammetria esetében a koronális előtérszeleteket (300 – 400-μm vastagság) Leica VT1200S rezgő penge mikrotomán (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) vágtuk jéghideg HEPES-pufferelt mesterséges CSF-ben (aCSF), amely (mM-ban): NaCl (120); nátrium-hidrogén₃ (20); glükóz (10); HEPES sav (6.7); KCl (5); HEPES nátrium-só (3.3); kalcium₂ (2); és MgSO₄ (2), 95% O-val kiegyensúlyozott₂/ 5% CO₂. Ezután az oldatban a kísérleteket megelőzően szobahőmérsékleten szobahőmérsékleten tartottuk^{30, 32, 53}. Az elektrofiziológiára az anesztetizálás után a patkányokat transzkardiálisan perfundáltuk jéghideg oldattal, amely (mM): szacharóz (225); KCl (2.5); kalcium₂ (0.5); magnézium₂ (7); nátrium-hidrogén₃ (28); hidrid₂PO₄ (1.25); glükóz (7); aszkorbát (1); és piruvát (3), és 95% O-val kiegyensúlyozott₂/ 5% CO₂. A szeleteket ebbe az oldatba vágtuk, majd egy módosított aCSF-ben (mM-ben) nátrium-kloridot (125) tartalmazó helyreállító kamrába helyeztük; KCl (2.5); hidrid₂PO₄ (1.25); nátrium-hidrogén₃ (25); magnézium₂(1); kalcium₂ (2); glükóz (25); aszkorbát (1); piruvát (3); és mio-inozit (4), 95% O-val kiegyensúlyozott₂/ 5% CO₂; ez az oldat kezdetben 34 ° C-on volt, majd hagyjuk fokozatosan szobahőmérsékletre hűlni⁵⁴. Az összes voltammetriás és fiziológiai kísérletet egy merülő felvevő kamrában végeztük 32 ° C-on, amelyet az 1.5 ml perc alatt szuperfundáltunk.^-1 aCSF-sel (mM-ben): NaCl (124); KCl (3.7); nátrium-hidrogén₃ (26); kalcium₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); glükóz (10) és szarvasmarha szérum albumin (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml).^-1) kiegyenlített 95% O-val₂/ 5% CO₂; a szeleteket ebben a környezetben 30 percig a kísérletezés előtt egyensúlyba hoztuk.

Gyors beolvasási ciklikus voltammetria

A kiváltott DA felszabadulási vizsgálatokat FCV alkalmazásával végeztük az agyszeletekben^{32, 53} hím patkányokból vagy Csevegés előrehaladott egerek és heterozigóta kontrollok (5 – 8 hét). Tanulmányok Csevegés a kiütéses egereket vakon vakolták, de a patkányok étrendcsoportjai nyilvánvaló fenotípusokat tartalmaztak, amelyek kizárták a vakokat. Voltammetriás méréseket végeztünk Millar Voltammeterrel (külön kérésre Dr. Julian Millerhez, a St. Bartholomew-i és a londoni Royal University of Medicine és Fogorvosi Iskolához). Egy hagyományos háromszög hullámformát alkalmaztunk az FCV-nél, a −0.7 és + 1.3 V szkennelési tartománya (az Ag / AgCl-val szemben), az 800 V s szkennelési sebessége^-1és az 100 ms mintavételi intervalluma^{30, 32, 53}. Az adatokat a Clampex 1200 szoftverrel (Molecular Devices) vezérelt DigiData 7.0B A / D kártyával szereztük meg. A DA felszabadulást koncentrikus stimuláló elektród alkalmazásával hoztuk létre; az inger impulzus amplitúdója 0.4 – 0.6 mA és az időtartam 100 μs volt^{30, 32, 53}. A NAc magban és a CPu-ban helyi egyimpulzus stimulációt alkalmaztunk; azonban egy rövid, nagyfrekvenciás impulzus-vonatot (öt impulzus 100 Hz-nél) használtak a kiváltott erősítéshez [DA]_o a NAc héjban. Mindkét stimulus paradigma DA felszabadulást vált ki, amely akciós potenciál és Ca²⁺ attól függ, hogy az egyidejűleg felszabaduló glutamát és a GABA nem befolyásolja^{42, 55}és megkönnyíti az egyidejűleg kiadott ACh^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. A kiváltott szám számszerűsítése [DA]_oaz elektródákat ismert DA koncentrációkkal kalibráltuk 32 ° C-on minden egyes kísérlet után az aCSF-ben, és minden egyes gyógyszer jelenlétében egy adott kísérlet során⁵³.

Voltammetria kísérletek az inzulin hatásának felmérésére [DA]_o két protokoll alkalmazásával nyertük. Az inzulin (Sigma, I5523) hatásának időbeli lefolyását meghatározó kezdeti kísérleteket a kiváltott megfigyeléssel végeztük [DA]_o minden 5 min egy helyen. Inzulint alkalmaztunk a következetes kiváltás után [DA]_o kapott (jellemzően 4 – 5 mérések); az inzulin hatása az 50 – 60 min. után maximális volt, majd kiváltották [DA]_o ezen a szinten maradt a kísérlet időtartama alatt (jellemzően 90 min. teljes inzulin expozíció; 1c). Ezt követően az inzulin hatását a kiváltott felvétel alapján értékelték [DA]_o az 4 – 5 diszkrét helyeken szeletekben (+ 1.5 mm a bregmától) mindhárom striatum alrégióban kontroll körülmények között (aCSF vagy aCSF plusz gyógyszer), majd ismét a maximális inzulinhatás idején (mintavétel 60 – 80 perc alatt), majd ezeket a mintákat átlagoltuk minden egyes alrégióban. Az inzulin hatása a szeletkészítés után idővel csökkent; az idő minimalizálása ex vivo és az állati felhasználás optimalizálása céljából, tipikusan egy adott állatból két szeletet teszteltünk a felvételi kamrában egyidejűleg. Az inzulin hatásának kiküszöbölésére használt gyógyszereket 15-et alkalmaztuk az inzulin előtt az aCSF felületi bevonásával, beleértve a HNMPA triszacetoxi-metil-észtert (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), pikropodofillotoxin (PPP; Tocris), mekamilamin (Tocris) és DHβE (Tocris). Az eredményekben leírtak szerint a nikotin ACh receptorok változott érzékenységét vizsgálták az étrend-csoportok között a csúcs [DA] arányának összehasonlításával_o 5 p (100 Hz) által kiváltott 1 p kiváltotta (5 p: 1 p arány)^{30, 31} a NAc magban 0 – 500 nM nikotin (Sigma) jelenlétében.

A V _max a kiváltott [DA]_o tranziensek striatális szeletekben

Az inzulin által kiváltott DAT-mediált DA-felvételek változásainak értékeléséhez a kiváltott [DA] fázis kezdeti része_o a Michaelis – Menten egyenlethez a görbéket kivontuk V_max (maximális felvételi sebesség állandó)⁵⁶. K_m (amely fordítottan kapcsolódik a DAT affinitásához a DA-hoz) 0.2 μM-en rögzítették, és ismert, hogy hasonló a striatális alrégiókban⁵⁷ és az inzulin nem érinti (lásd Kiegészítő ábra 4 felirat).

Teljes cellás felvétel

Agyszeleteket 29-ról 35-napos hím patkányokra állítottuk elő; a felvétel feltételei megegyeztek a DA felszabadulási vizsgálatokban használtakkal. A teljes cellás áramköri felvételek hagyományos módszereket alkalmaztak⁵⁴. A Striatal ChI-ket Olympus BX51WI mikroszkóppal (Olympus America, Center Valley, PA) ábrázoltuk infravörös differenciál-interferencia kontraszt optikával és egy x 40 vízzel merülő céllal. A pipetta oldata (mM): K-glükonát (129); KCl (11); HEPES (10); magnézium₂ (2); EGTA (1); na₂-ATP (2); na₃-GTP (0.3); és a pH-t 7.2 – 7.3 értékre állítottuk KOH-val. A ChAT immunreaktivitás szempontjából értékelendő rögzített neuronok esetében az 0.3% biocitint a pipetta oldatába helyeztük, és az idegsejteket rövid ideig (~ 5 min) rögzítettük az intracelluláris tartalom hígításának minimalizálása érdekében. A pipetta ellenállása ~ 3 – 5 MΩ volt. A felvételeket egy Axopatch 200B erősítővel (Molecular Devices, Sunnyvale CA) és az 2 kHz-en szűrt aluláteresztéssel végeztük. A ChI-ket megállapított elektrofiziológiai kritériumok alapján azonosítottuk²⁸; leginkább tónusilag aktívak voltak, de a javítások után a aktivitás változott. Azonban az aktuális injekcióra való reagálás általában erős és következetes volt, ezért az inzulin ChI gerjesztő hatásának vizsgálatára használták (lásd az eredményeket). Az INR-k és az IGF-1R-eknek ebben a válaszban betöltött szerepét vizsgáló kísérletekben legalább HNMPA vagy PPP-t alkalmaztunk legalább 20 percig, mielőtt ChI-t tapasztaltunk. Az inzulin maximális hatását jellemzően ~ 16 min. Expozíció után figyelték meg, bár egyes sejtekben a növekedés nem volt maximális, amíg 50 min vagy hosszabb volt. Továbbá a hat PPP-ben rögzített neuron közül négyben az inzulin a spike szám kezdeti csökkenését okozza, mielőtt visszanyerte és meghaladná a kezdő tüske számát. Következésképpen minden kísérletben az inzulin hatását számszerűsítettük a tüskés számra gyakorolt ​​maximális hatás összehasonlításával az inzulin alkalmazás előtt közvetlenül kiváltott tüskék számával. A csúcshatás eléréséhez szükséges idő nyilvánvaló különbsége számos tényezőt tükrözhet, beleértve a szeletben lévő rögzített cella mélységét is. A kiváltott akciós potenciálokat inzulin nélkül is rögzítettük ChI-kben összehasonlítható időpontokban.

Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia

A patkány striatális szeletek DA-tartalmát (400-μm vastagság) nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával határoztuk meg elektrokémiai kimutatással⁵⁸. A szeletpárokat 30 percig 32 ° C-on aCSF-ben ekvilibráltuk, majd egy szeletet egy páronként további 60 percig inkubáltunk 32 ° C-on aCSF-ben, míg a másikat aCSF-ben 10 vagy 30 nM inzulinnal inkubáltuk. A diétás csoportok összehasonlítása során az 30 – 60 min. Inkubálás után az aCSF-felesleget óvatosan eltávolítottuk a szeletekből, a pelyhes szövetből készült mintát (7 – 10 mg) lemértünk, szárazjégen fagyasztottuk, majd tároltuk -80 ° C-on tároltuk. Az elemzés napján a mintákat jéghideg, eluens, ultrahanggal argonnal dezoxidáltuk⁵⁸, mikroszentrifugában centrifugáljuk 2 percig, és a felülúszót közvetlenül a HPLC oszlopra (BAS, West Lafayette, IN) injektáljuk; az érzékelő egy üveges szénelektróda volt, amely az 0.7 V-nál az Ag / AgCl-hoz képest van beállítva.

Immunohisztokémia

Immunhisztokémiai jelölés esetén a patkányokat nátrium-pentobarbitállal (50 mg kg) érzéstelenítettük^-1ip), majd transzkardiálisan perfundáltuk PBS-sel (154 mM NaCl 10 mM foszfátpufferben, pH 7.2), majd 4% paraformaldehidet ebben a PBS-ben; az agyokat eltávolították és a koronális metszeteket (20 μm) szokásos módon vágtuk és feldolgoztuk^{27, 59}. Az immunfluoreszcens képeket egy Nikon PM 800 konfokális mikroszkóp segítségével kaptuk meg, amely egy Spot szoftver által vezérelt digitális fényképezőgéppel (Diagnostic Instruments Inc.) és egy x 100 objektummal (numerikus apertúra = 1.4) vagy egy Zeiss LSM 510 konfokális mikroszkóppal, x × NUMX használatával készült. objektív (numerikus apertúra = 63). A lézerek Argon (1.2 nm), He / Ne (488 nm) és He / Ne (543 nm) voltak. Minden egyes lézerhez megfelelő szűrőket választottunk ki a konfokális mikroszkóp szoftver segítségével. A lyukméret a használt céltól és a szekcióvastagságtól függően változott z-stack generáció; a szoftver által jelzett optimális pinhole értéket választottuk (általában 30 μm). A digitális fájlokat dekonvolúciós szoftverrel (AutoQuant Imaging) elemezték, a végső képeket az Adobe Photoshop 7.0 segítségével dolgozták fel. Minden képet a fényerő és a kontraszt alapján állítottak be; az ilyen kiigazításokat a kép minden részére egységesen végeztük. A striatális DA axonokat két TH ellenanyaggal azonosítottuk: poliklonális AB152 nyúl anti-TH (1: 800) és monoklonális MAB318 egér anti-TH (1: 500) (mindkettő Chemicon-tól). Három InsR antitestet használtunk: sc-57342 és sc-09 (1: 100; Santa Cruz) és PP5 (ajándék a Pfizer-től). Mindegyikük sajátosságait korábban bemutatták^{60, 61}és a jelen vizsgálatokban megerősítettük, hogy a megfelelő blokkoló peptid jelenlétében az sc-57342 vagy a PP5 antitestekkel nem volt immunjelölés. A ChAT antitest AB144 (1: 200; Millipore) volt, és a biotin vektor (1: 200). A másodlagos antitestek a szamár anti-nyúl Alexa 488 (Invitrogen) vagy a szamár anti-nyúl Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), a szamár anti-kecske Cy3 (Jackson) és a szamár anti-egér Cy5 (Jackson).

Az InsR-ek TH + axonokban történő együttes lokalizációjának értékeléséhez a korábban leírt módszereket használtuk az ATP-érzékeny K-pórusképző alegység Kir6.2 jelenlétének azonosítására.⁺ csatornák DA axonokban²⁷. Az InsR-eket reprezentáló Puncta-t a beállított képek között osztották meg, ami azt jelzi, hogy a TH immunoreaktivitás szuperponálás bizonyos fokig véletlenszerűen előfordulhat. A feltételezés teszteléséhez az InsR / TH szuperpozíciókat számítottuk 42 független mezőkben három NAc immunjelölt szekcióból két patkányból. Az InsR digitális fájljait ezután 90 ° -kal elforgattuk az óramutató járásával megegyező irányban, és a számlákat ismételtük; a forgatás csökkentette a legtöbb mezőben TH-vel lokalizált InsR puncta számát (lásd az eredményeket). A szuperimozíciók számának csökkenése forgatással²⁷ jelezte az InsR puncta arányát a DA axonokkal társított minden striatum mezőben.

Vér glükóz és inzulin ELISA

A törzsvért a szeletek vizsgálatához a leépítés időpontjában gyűjtöttük össze. A vércukorszintet egy standard vércukorszint-monitorral határoztuk meg azonnal. Az inzulin esetében további vért gyűjtöttünk össze EDTA-tartalmú csövekben, és 1,500-en centrifugáltukg 15 min; a felülúszót (plazmát) összegyűjtöttük és –80 ° C-on tároltuk ALPCO patkány inzulin ELISA-készlettel történő feldolgozásig.

Kannula elhelyezés és szövettani ellenőrzés

Negyven egy felnőtt, hím Sprague – Dawley patkányt (Taconic és Charles River), amelyek kezdetben 350 – 425 g súlyát mérték, ketaminnal (100 mg kg) érzéstelenítettük.^-1, ip) és xilazin (10 mg kg^-1, ip) és sztereotaxikusan beültetve két krónikusan befogadó vezető kanülbe (26 mérőeszköz), amelyek kétoldalúan helyezkednek el 2.0 mm-es dorzálisan az infúziós helyekhez az NAc mediális héjában⁶² (1.6 mm a bregma előtt; 2.1 mm oldalirányban a sagittális varratokhoz, az 8 ° szögek a középvonal felé, 5.8 mm ventrális a koponya felületéhez). A patkányokat banamint kaptuk (2.0 mg kg^-1, szubkután) sebészeti beavatkozás utáni fájdalomcsillapító hatásként az anesztézia és az azt követő reggeli után. Egy héttel a műtét után patkányokat helyeztünk FR-be (a fentiekben leírtuk), és a műtét utáni helyreállítási súlyuk 80% -án tartottuk a vizsgálat hátralévő részében. A Cannula elhelyezését a viselkedési teszt befejezése után szövettanilag meghatározzuk. Minden patkányt CO-val leöltünk₂Az agyat eltávolítottuk és 10% pufferolt formalinban rögzítettük 48 órán át. A fagyasztott koronaszelvényeket (40 μm vastagságú) egy Reichert-Jung kriosztátra vágtuk, zselatinnal bevont üveglemezekre szerelve felolvasztottuk, és krezilibolyával festettük. Egy adott patkány adatait csak akkor használták fel, ha mindkét kanül a mediális NAc-héjon belül volt⁶² (beleértve a héj / mag vagy a héj / szaglás tubercle határát) (Kiegészítő ábra 5); ezen kritériumok alapján két patkányt kizártunk a végső elemzésből.

Íz-preferencia kondicionálás előtti expozíció

A patkányok egy éjszakán át (otthoni ketrecben) és hat 30-min-per napos ülést tartottak (tesztkamrákban) 0.2% nátrium-szacharin (Sigma) vízben 48-h időközzel a szekciók között. A patkányok ezután két 5-min-per napos 0.2% nátrium-szacharin-expozíciót kaptak 0.05% cukrozatlan szőlőből vagy cseresznye Kool-támogatásban (Kraft Foods) vízben. Az első Kool-Aid expozíció előtti ülésen a patkányok fele cseresznye ízű oldatot kapott, a másik fele szőlő ízű oldatot kapott. Az ízeket a második Kool-Aid előzetes expozíciós munkamenetben megfordították annak érdekében, hogy minden patkányt minden ízből vettünk. A bevételt az összes expozíció előtti ülésen mértük. A vizsgálati kamrák tiszta műanyag ketrecek voltak friss ágyneművel. Valamennyi expozíció előtti ülésen a patkányok a kamra mindkét oldalán ugyanazzal a megoldással rendelkeztek. Az éjszakai előtti expozíciós munkamenet kivételével az összes munkamenet viselkedési eljárási helyiségben történt, 30-min szokásos idővel, bármilyen edzés vagy tesztelés előtt.

Egy palackos kondicionálás

Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy az InsAb ventromedialis hypothalamusba történő mikroinjekciója gátolhatja az inzulin hatását a táplálkozási viselkedésre és a glukagon szekrécióra.^{63, 64}. Ezzel a módszerrel értékeltük az inzulin lehetséges szerepét az élelmiszer-választás megerősítésében. A patkányokat félig véletlenszerűen osztottuk, az átlagos expozíció előtti beviteli mennyiség alapján két csoportba, kontroll vagy kísérleti (InsAb). A kontrollcsoportban a patkányok vivőanyagot (PBS; 137 mM NaCl és 2.7 mM KCl 10 mM foszfátpufferben) vagy IgG-t (Abcam ab81032; 0.5 μg μl^-1 PBS-ben, mint beérkezett) mikroinjekció NAc-héjban, mielőtt a két ízesített oldat egyikét elfogyasztja, és egy mock mikroinjekciót, mielőtt elfogyasztaná a másik ízesített oldatot. A kísérleti csoportban a patkányok NAA héj mikroinjekcióját kapták az InsAb-től (Abcam ab46707; 0.5 μl 1 μg μl^-1 a kapott PBS-ben, mielőtt egy ízesített oldatnak kitettük, és előzetesen kitettük a mikroinjekciót. Két, a folyadék-mikroinjekció és a mock mikroinjekció között váltakozó alanyokat alkalmaztunk úgy, hogy a mikroinjekciók teljes száma négyre korlátozódjon, ezáltal minimálisra csökkentve a lehetséges szövetkárosodást és az érzékenységvesztést a mikroinjekciós helyen.⁶⁵. A folyékony mikroinjekcióhoz a kontrolloldatot vagy az InsAb-t két 30 cm hosszúságú PE-50 csőbe helyeztük, amely az egyik végén 5 μl Hamilton fecskendővel van feltöltve, amelyet desztillált vízzel töltöttünk, és a másik végén az 31 mm-es befecskendező kanület. a beültetett vezetőkön túl. Az 2.0 μl infúziós térfogatokat 0.5 s-n keresztül szállítottuk 90 μl s sebességgel.^-1; a befecskendező készüléket 60-ekre helyeztük, hogy időt biztosítson a diffúzióra, majd a befecskendező szelepet helyettesítettük a styletre.

A patkányokat közvetlenül a mikroinjekció vagy az ál-mikroinjekció befejezését követő 2 min. A kondicionáló oldatok 0.2% nátrium-szacharint, 0.05% cukrozatlan szőlőt vagy cseresznye Kool-Aid-t és 0.8% glükózt tartalmaztak. A megoldáshoz való hozzáférés az 30 min. A párosított íz és a kamra oldala az ivóvízeléréssel félig véletlenszerűen lett hozzárendelve és ellensúlyozva minden csoportban. A mikroinjekciók közötti intervallum legalább 72 h volt, az infúzió és az ál-szekciók között váltakozva összesen nyolc kondicionáló ülésen.

Két palack preferencia teszt

Az utolsó kondicionálást követő 48 órával a patkányokat tesztkamrákba helyeztük, amelyek egyidejűleg hozzáfértek mindkét kondicionáló ízhez; az oldatok 0.2% nátrium-szacharint tartalmaznak 0.05% szőlőben vagy cseresznye Kool-Aid-ben, glükóz nélkül. A tesztelés 2 napokon történt (60 min naponta). A zúzó-páros vagy infúziós páros oldatot tartalmazó ivócső helyzete váltakozva van annak biztosítása érdekében, hogy minden patkányt megvizsgáljanak minden egyes oldat fogyasztására a ketrec mindkét oldalán. Az egyes ízesített oldatok bevitelét a két tesztnapra átlagoltuk a preferencia meghatározásához.

[³H] DA felvétel a striatális szinaptoszómákban az InsAb hatékonyságának értékelésére

Striatusi szinaptoszómák^{21, 66} AL patkányokból (hím, 350-400 g) készítettük, NAc-vel (héj és mag) és CPu-val szétválasztottuk és külön-külön készítettük. Az egyes régiókból származó szövetet 15 térfogatban homogenizáltuk egy jéghideg 0.32 M szacharóz oldatban, üveghomogenizátorban, motoros Teflon zúzóval; öblítés és centrifugálás után a végső pelletet jéghideg 0.32 M szacharózban szuszpendáljuk^{21, 66}. A [³H] DA felvételi vizsgálat⁶⁶az 180 μl felvételi puffer teljes térfogatában a szinaptoszóma-alikvotokat 15 percig 30 ° C-on rázógépben inkubáltuk 30 nM inzulin, hordozó (PBS) vagy InsAb (végső hígítás 1: 500) jelenlétében vagy hiányában , IgG-ben (végső hígítás 1: 500) vagy járműben. A felvételi puffer (mM-ben): NaCl (122); na₂MSZH₄ (3); hidrid₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glükóz (10), CaCl₂ (1); nialamid (0.01); tropolon (0.1); és aszkorbinsav (0.001), pH 7.4. [[³A H] DA-t úgy indítottuk el, hogy az egyes szinaptoszómális szuszpenziók 20 μl-ét gyorsan adagoltuk az 96-lyukú lemezekre különböző koncentrációjú DA (0.003 – 1.0 μM) és [³H] DA (5 nM); 5 min után egy lemezrázóban 25 ° C-on, a felvételt hideg, gyors vákuumszűréssel végeztük⁶⁶. A mérőhelyenként számított értékeket pmol-ra alakítottuk, majd korrigáltuk a teljes fehérje / perc értékre. Az összes vizsgálatot háromszorosan végeztük, és legalább négyszer megismételtük; V_max és a K_m a Biosoft Kell Radlig szoftverrel (Cambridge, UK) számítottuk ki.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlagban ± sem; a jelentőséget párosított vagy páratlan diák segítségével értékeltük t-teszteket vagy ANOVA-t, hacsak másként nem jelezzük. A voltammetriás adatokhoz n a rögzítési helyek száma, tekintettel arra, hogy a helyszíntől a helyszínig terjedő variabilitás nagyobb, mint egy állat alatti régióban, mint az állatközi vagy szeletek közötti variabilitás^{30, 32, 55, 56}; az állatszámot minden egyes adatkészletnél feljegyezzük. Az EK₅₀ az inzulin és a nikotin csúcs-kiváltott hatására [DA]_o a Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) alkalmazásával számítottuk ki. Az elektrofiziológiai adatok esetében a statisztikai szignifikanciát párosítottuk t-tesztek vagy Wilcoxon teszt Prism 6.0-ben, vagy vegyes kétirányú ANOVA a SAS 9.3-ban (SAS Institute Inc., Cary, NC). Az inzulin részvételének az íz-preferencia-kondicionálásban történő értékeléséhez két teljes vizsgálatot végeztünk olyan protokollokkal, amelyek azonosak voltak az alkalmazott járműkezelés kivételével. Az első vizsgálatban az 10 patkányok PBS-t és 9-t kaptak az InsAB infúzióval. A második vizsgálatban az 10 patkányok IgG-t és 10-t kaptak InsAb infúzióval. Az infúziós kondicionálás során nem volt szignifikáns különbség a két járműcsoport (PBS vagy IgG) között.F₁₉= 0.619, vegyes kétirányú ANOVA) az ismételt mérésekkel az infúziós kondicionálás során) vagy a vizsgálat során (F₁₉= 0.012, kétirányú kevert ANOVA az ismételt mérésekkel az aromában). Következésképpen a két kísérletet elemzés céljából kombináltuk. Ehhez az elemzéshez 2 × 4 vegyes ANOVA-t (ismételt mérésekkel az infúziós kondicionálás napján) használtunk a mikroinjekciós kezelés hatásainak meghatározására a kondicionálás során, majd ezt követően védett t-testek (egy farkú, hogy meghatározzuk, melyik kondicionálási munkamenetekben a mikroinjekciós kezelés csökkentette a beviteli mennyiséget). Ugyanez az elemzés befejeződött az ál-kondicionálással. A kondicionáló kezelés hatásának meghatározására egy két palackos íz-preferencia teszt során az adatokat vegyes kétirányú ANOVA-val (ismételt mérésekkel ízesítéssel) elemeztük, majd ezt követően védett t-tesztek (egy farok, hogy teszteljék a feltételezést, hogy az InsAb csökkentené a preferenciát).

A cikk idézése: Stouffer, MA et al. Az inzulin fokozza a striatális dopamin felszabadulást a kolinerg interneuronok aktiválásával és ezáltal jutalmat jelez. Nat. Com. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Inzulin receptorok és inzulinhatás az agyban: áttekintés és klinikai következmények. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 855–872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Cikk
   • Kontextus megjelenítése
2. Gerozissis, K. Brain inzulin, energia és glükóz homeosztázis; gének, környezet és metabolikus patológiák. Eur. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Cikk
6. Kontextus megjelenítése
7. CAS
8. PubMed
9. Cikk
10. Kontextus megjelenítése
11. CAS
12. PubMed
13. Cikk
14. Kontextus megjelenítése
15. CAS
16. PubMed
17. Cikk
18. Kontextus megjelenítése
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Cikk
23. Kontextus megjelenítése
24. ISI
25. PubMed
26. Cikk
27. Kontextus megjelenítése
28. CAS
29. PubMed
30. Cikk
31. Kontextus megjelenítése
32. Kontextus megjelenítése
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Cikk
37. Kontextus megjelenítése
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Cikk
42. Kontextus megjelenítése
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Kontextus megjelenítése
47. ISI
48. PubMed
49. Cikk
50. Kontextus megjelenítése
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Cikk
55. Kontextus megjelenítése
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Cikk
60. Kontextus megjelenítése
61. Kontextus megjelenítése
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Cikk
66. Kontextus megjelenítése
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Cikk
71. Kontextus megjelenítése
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Cikk
76. Kontextus megjelenítése
77. PubMed
78. Cikk
79. Kontextus megjelenítése
80. Kontextus megjelenítése
81. CAS
82. PubMed
83. Cikk
84. Kontextus megjelenítése
85. ISI
86. PubMed
87. Cikk
88. Kontextus megjelenítése
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Cikk
93. Kontextus megjelenítése
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Cikk
98. Kontextus megjelenítése
99. CAS
100. PubMed
101. Cikk
102. Kontextus megjelenítése
103. Kontextus megjelenítése
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Cikk
108. Kontextus megjelenítése
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Cikk
113. Kontextus megjelenítése
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Cikk
118. Kontextus megjelenítése
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Cikk
123. Kontextus megjelenítése
124. PubMed
125. Cikk
126. Kontextus megjelenítése
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Cikk
131. Kontextus megjelenítése
132. CAS
133. PubMed
134. Cikk
135. Kontextus megjelenítése
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Cikk
140. Kontextus megjelenítése
141. CAS
142. PubMed
143. Cikk
144. Kontextus megjelenítése
145. ISI
146. PubMed
147. Cikk
148. Kontextus megjelenítése
149. Kontextus megjelenítése
150. Kontextus megjelenítése
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Cikk
155. Kontextus megjelenítése
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Cikk
160. Kontextus megjelenítése
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Cikk
165. Kontextus megjelenítése
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Cikk
170. Kontextus megjelenítése
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Kontextus megjelenítése
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Cikk
179. Kontextus megjelenítése
180. PubMed
181. Cikk
182. Kontextus megjelenítése
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Cikk
187. Kontextus megjelenítése
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Cikk
192. Kontextus megjelenítése
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Cikk
197. Kontextus megjelenítése
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Cikk
202. Kontextus megjelenítése
203. Kontextus megjelenítése
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Kontextus megjelenítése
208. Kontextus megjelenítése
209. Kontextus megjelenítése
210. Kontextus megjelenítése
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Cikk
215. Kontextus megjelenítése
216. CAS
217. PubMed
218. Cikk
219. Kontextus megjelenítése
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Kontextus megjelenítése
224. Kontextus megjelenítése
225. CAS
226. PubMed
227. Cikk
228. Kontextus megjelenítése
229. ISI
230. PubMed
231. Cikk
232. Kontextus megjelenítése
233. Kontextus megjelenítése
234. ISI
235. PubMed
236. Cikk
237. Kontextus megjelenítése
238. Kontextus megjelenítése
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Cikk
243. Kontextus megjelenítése
244. Kontextus megjelenítése
245. Vogt, MC & Bruning, JC CNS inzulinjelzés az energia homeosztázis és a glükóz anyagcsere szabályozásában - az embriótól az öregségig. Trendek Endocrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. és Brownstein, M. Az inzulin azonosítása patkány agyban. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 5737-5741 (1978).
247. King, GL & Johnson, S. Az inzulin receptor által közvetített transzportja az endothelsejteken. Science 227, 1583–1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Inzulinválaszok és glükózszint a plazmában és a cerebrospinalis folyadékban patkány koplalás és újratáplálás közben. Physiol. Viselkedés 44, 205–208 (1988).
249. Banks, WA és Kastin, AJ A vér-agy gát differenciális permeabilitása két hasnyálmirigy-peptidhez: inzulinhoz és amilinhez. Peptides 19, 883–889 (1998).
250. Bankok, WA Az agyi inzulin forrása. Eur. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
251. Nemoto, T. et al. Új betekintés az inzulinszintézisre és annak szekréciójára patkány hippocampusban és agykéregben: amyloid-β1-42 által indukált proinsulin szint csökkentése glikogén szintáz kináz-3β segítségével. Cell Signal. 26, 253 – 259 (2014).
252. De Souza, CT et al. A zsírban gazdag étrend fogyasztása aktiválja a gyulladásgátló választ és inzulinrezisztenciát vált ki a hypothalamusban. Endokrinológia 146, 4192 – 4199 (2005).
253. Anthony, K. et al. Az inzulin által kiváltott válaszok enyhítése az agyi hálózatokban, amelyek az étvágyat és az inzulinrezisztencia jutalmát szabályozzák: a metabolikus szindrómában a táplálékbevitel csökkent kontrolljának agyi alapja? Diabetes 55, 2986 – 2992 (2006).
254. Kelley, AE és Berridge, KC A természetes előnyök idegtudománya: relevancia a függőséget okozó gyógyszerek szempontjából. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
255. Koob, GF & Volkow, ND Neurocircuitry of Addiction. Neuropsychopharmacology 35, 217–238 (2010).
256. Werther, GA et al. Az inzulin receptorok lokalizációja és jellemzése patkány agyban és agyalapi mirigyben in vitro autoradiográfia és számítógépes denzitometria. Endokrinológia 121, 1562 – 1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Az inzulin és a leptin receptorainak expressziója a patkány ventrális tegmentális területén / substantia nigra (VTA / SN). Brain Res. 964, 107–115 (2003).
258. Daws, LC et al. Inzulin jelzés és függőség. Neurofarmakológia 61, 1123 – 1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Energetikai szabályozási jelek és élelmiszer-jutalom. Pharmacol. Biochem. Viselkedés 97, 15–24 (2010).
260. Patterson, TA et al. Az élelmiszerhiány csökkenti a patkány dopamin transzporter mRNS-ét és aktivitását. Neuroendokrinológia 68, 11 – 20 (1998).
261. Carvelli, L. et al. A dopamin felvétel PI 3-kináz szabályozása. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
262. Williams, JM et al. A hipoinsulinemia szabályozza az amfetamin által indukált dopamin fordított transzportját. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Krónikus táplálék-korlátozás és dopamin-transzporter funkció patkány striatumban. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN et al. Az inzulin modulálja a kokainérzékeny monoamin transzporter funkciót és az impulzív viselkedést. J. Neurosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL A ventrális tegmentális területen lévő inzulin csökkenti a hedonikus táplálkozást és a visszafogás fokozásával elnyomja a dopamin koncentrációt. Eur. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
266. Labouebe, G. et al. Az inzulin endokannabinoidokon keresztül indukálja a ventrális tegmentalis dopamin neuronok hosszú távú depresszióját. Nat. Neurosci. 16, 300 – 308 (2013).
267. Konner, AC et al. Az inzulin-jelzés szerepe a katekolaminerg neuronokban az energia homeosztázis szabályozásában. Cell Metab. 13, 720 – 728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Az inzulin különböző központi idegrendszeri helyeken hat az akut szacharózbevitel és a szacharóz önadagolásának csökkentésére patkányokban. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R388 – R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME A striatális dopamin felszabadulás másodlagos szabályozása pre-szinaptikus K_ATP csatornákat. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP A neostriatalis interneuronok funkcionális sokfélesége és specifitása. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 685–692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Az endogén nikotin-kolinerg aktivitás szabályozza a dopamin felszabadulását a striatumban. Nat. Neurosci. 4, 1224–1229 (2001).
272. Rice, ME és Cragg, SJ. A nikotin felerősíti a jutalomhoz kapcsolódó dopamin jeleket a striatumban. Nat. Neurosci. 7, 583–584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. A dopamin felszabadulásának gyakoriságától függő modulációja nikotinnal. Nat. Neurosci. 7, 581–582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP A striatális dopamin felszabadulás és a feltáró motoros viselkedés szabályozása az előagy és az agytörzsi kolinerg bemenetekkel. Nat. Commun. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. et al. A striatális dopamin felszabadulást a kolinerg interneuronok szinkron aktivitása váltja ki. Neuron 75, 58 – 64 (2012).
276. Cachope, R. et al. A kolinerg interneuronok szelektív aktiválása fokozza a faszikus dopamin felszabadulást: a jutalom feldolgozásának beállítása. Cell Rep. 2, 1 – 9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. A nikotin-acetilkolin-receptor béta2 alegység immunreaktivitásának preszinaptikus lokalizációja patkány nigrostriatalis dopaminerg neuronokban. J. Comp. Neurol. 439, 235–247 (2001).
278. Higley, MJ et al. A kolinerg interneuronok a gyors VGluT3-függő glutamaterg transzmissziót közvetítik a striatumban. PLOS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. A dopamin D1-szerű receptorok aktiválása a nucleus accumbensben kritikus fontosságú a tápanyagokkal kondicionált íz-preferenciák megszerzésében, de nem expressziójában patkányokban. Eur. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamine és megtanulta az étkezési preferenciákat. Physiol. Viselkedés 104, 64–68 (2011).
281. Mayer, CM és Belsham, DD A központi inzulinjelzést az inzulinreceptor-1 szubsztrát-151 szerin foszforilációja, a proteazomális lebomlás és a lizoszomális inzulinreceptor degradációja révén hosszú távú inzulin expozíció gyengíti. Endocrinology 75, 84–2010 (XNUMX).
282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Dopamin felszabadulás a bazális ganglionokban. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. & Kimura, M. Thalamic hozzájárulások a bazális ganglionokhoz kapcsolódó viselkedésváltáshoz és megerősítéshez. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
284. Threlfell, S. et al. A striatális muszkarin receptorok elősegítik a dopamin transzmisszió aktivitásának függését a receptorok altípusai között a kolinerg interneuronokon a ventrális versus dorsalis striatumban. J. Neurosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Accumbens dopamin-acetilkolin egyensúlya a megközelítésben és az elkerülésben. Curr. Opin. Pharmacol. 7, 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG A fogyás korlátozott étkezése szelektíven csökkenti az extracelluláris dopamint a nucleus accumbens-ben, és megváltoztatja az amfetaminra, a morfinra és az ételbevitelre adott dopamin választ. J. Neurosci. 15, 6640–6650 (1995).
287. Geiger, BM et al. A mezolimbikus dopamin neurotranszmisszió hiányosságai patkány táplálék elhízásában. Neurológiai tudomány 159, 1193 – 1199 (2009).
288. Morris, JK et al. Az inzulinrezisztencia csökkenti a nigrostriatális dopamin funkciót. Exp. Neurol. 231, 171 – 180 (2011).
289. De Araujo, IE et al. Élelmiszer-jutalom ízérzékelő jelzés nélkül. Neuron 57, 930 – 941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Az elhízás és a tompított sztriatális táplálékra adott reakciót a TaqIA A1 allélja moderálja. Science 322, 449–452 (2008).
291. Wang, GJ et al. Agyi dopamin és elhízás. Lancet 357, 354 – 357 (2001).
292. Johnson, PM és Kenny, PJ Dopamine D2 receptorok elhízott patkányok függőség-szerű jutalomzavarában és kényszeres étkezésében. Nat. Neurosci. 13, 635–641 (2010).
293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. A közvetlen dopaminreceptor-agonisták jutalmazó és mozgásszervi aktiváló hatásait krónikus táplálékkorlátozás fokozza patkányokban. Pszichofarmakológia (Berl.) 154, 420–428 (2001).
294. Levin, BE és Keesey, RE Különböző testtömeg-alapértékek védelme étrend okozta elhízott és rezisztens patkányokban. Am. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Az axonális és szomatodendritikus dopamin felszabadulás monitorozása az agyszeletek gyors szkennelésének ciklikus voltammetriájával. Módszerek Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME A substantia nigra pars reticulata GABAerg neuronaktivitás szabályozása H₂O₂ flufenaminsav-érzékeny csatornákon és K_ATP csatornákat. Elülső. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME A szomatodendrites dopamin felszabadulás korlátozott szabályozása feszültségérzékeny Ca-val²⁺ az axonális dopamin felszabadulás erős szabályozásával ellentétes csatornák. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
298. Li, X. et al. A fokozott striatális dopaminátvitel és a motor teljesítménye az LRRK2 túlzott expresszióval egerekben megszűnik a családon belüli Parkinson-kór mutációja G2019S. J. Neurosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA A kibocsátás és felvétel paramétereinek meghatározása az elektromosan kiváltott dopamin-dinamikából valós idejű voltammetriával mérve. J. Neurosci. Methods 112, 119–133 (2001).
300. Chen, BT, Avshalumov, MV és Rice, ME H₂O₂ a szinaptikus dopamin felszabadulás új, endogén modulátora. J. Neurophysiol. 85, 2468 – 2476 (2001).
301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME A nigrális dopaminerg neuronok szomatodendritikus rekeszéből dopamin felszabadulásában szerepet játszó fehérjék immunocitokémiai azonosítása. Neuroscience 164, 488–496 (2009).
302. Sugimoto, K. et al. Inzulinreceptor patkány perifériás idegében: annak helye és alternatív módon splicált izoformák. Diabetes Metab. Res. 16, 354 – 363 (2000).
303. Sanchez-Alavez, M. et al. Az inzulin hipertermiát okoz a melegérzékeny neuronok közvetlen gátlásával. Diabetes 59, 43 – 50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. A patkányagy sztereotaxiás koordinátákban 6. edn Academic (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Fokozott táplálkozás az inzulin antitestek kétoldali injekciójára a VMH-ban. Physiol Behav. 19, 309–313 (1977).
306. Paranjape, SA et al. Az inzulin hatása a ventromedialis hypothalamusban a hasnyálmirigy glükagon szekréciójára in vivo. Diabetes 59, 1521 – 1527 (2010).
307. Wise, RA és Hoffman, DC A gyógyszerjutalom mechanizmusainak lokalizálása koponyaűri injekciókkal. Synapse 10, 247–263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK és Reith, MEA Interakció a 4- (2-benzhidriloxi-etil) -1- (4-fluorbenzil) -piperidin és az aszpartát 68 hidroxi-piperidin-analógja között az emberi dopamin transzporter. Eur. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Letöltés hivatkozások

Ezeket a tanulmányokat az NIH DA033811 (MER, KDC és MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) és NARSAD Independent Investigator Award (KDC) támogatásával támogatta. Az S961 nagylelkű ajándék volt Dr. Lauge Schaffer, a Novo Nordisk. A PP5 antitest nagylelkű ajándék volt a Pfizer-től. Köszönjük Dr. Charles Nicholsonnak, az NYU Orvostudományi Iskolának a szoftverek kivonását V_max értékek az FCV adatokból.