Am. J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 április; 300 (4): R876 – R884.
Megjelent online 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Absztrakt
Korábban arról számoltunk be, hogy az inzulin beadása a hypothalamus íves magjába csökkenti a szacharóz motivációját, amelyet önadagolási feladat alapján értékeltek patkányokban. Mivel a központi idegrendszer (CNS) aktiváció mintázata a szacharóz önadagolásával összefüggésben nem került értékelésre, a jelen vizsgálatban a c-Fos expresszióját a neuronális aktiválás indexeként mértük. Patkányokat képeztünk szacharózra való sajtolásra, fix arányú (FR) vagy progresszív arányú (PR) ütemezés szerint, és a c-Fos immunreaktivitásának leképezett expresszióját a CNS-ben, összehasonlítva a kezelt kontrollok c-Fos expressziójával. A PR-teljesítmény megjelenésével összefüggésben a c-Fos egyedülálló expresszióját figyeltük meg a mediális hipotalamuszban (az ívelt, paraventricularis, retrochiasmatikus, dorsomedialis és ventromedialis magokban), és a c-Fos expresszióját az oldalsó hipotalamuszban és az ágymagban. a stria terminalis-nak a FR teljesítményének kezdetén. A c-Fos expressziója nőtt mind a FR, mind a PR patkányok magjában. Vizsgálataink hangsúlyozzák mind a hipotalamikus energia homeosztázis áramkörének, mind a limbikus áramkörének fontosságát az élelmiszer-jutalmazási feladat teljesítésében. Tekintettel a mediális hipotalamusz szerepére az energiaegyensúly szabályozásában, tanulmányunk arra utal, hogy ez az áramkör hozzájárulhat a jutalomszabályozáshoz az energiaháztartás nagyobb összefüggésében.
a mesolimbikus dopaminerg (DA) áramkör, beleértve a ventrális tegmentális területet (VTA) és a striatum és a kérgi helyekre vetített vetületeit, úgy határozták meg, hogy kritikus szerepet játszanak a visszaélésszerű gyógyszerek számos osztályának motiválásában vagy jutalmazásában (13, 22-24, 26, 48). Laboratóriumunk és mások által végzett legújabb kutatások azt sugallják, hogy ez az áramkör szintén fontos szerepet játszik az élelmiszerek motiváló vagy jutalmazó szempontjaiban. Az energiaháztartást szabályozó áramkörökkel való funkcionális és anatómiai interakciókat az állatok táplálkozási helyzetének az állatok tápláltsági állapotával történő modulációjának jelentései javasolják (10, 14, 16, 43). A jutalom modulálása, beleértve az élelmiszer-jutalmat, táplálkozási vagy anyagcsere-állapot mellett, erősen befolyásolja az idegi és endokrin jeleket, beleértve az inzulint is.15), leptin (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), melanin-koncentráló hormon (MCH) (45) és orexin (5, 7): a receptorok jelenléte, a biokémiai és celluláris hatékonyság, valamint ezen jelek in vivo vagy viselkedési hatékonysága a központi idegrendszerben (CNS) az elmúlt években bőségesen bizonyított.
A kiterjesztett limbikus áramkör hasonlóképpen szerepelt a táplálkozásban és az élelmiszer-jutalomban (2, 19, 28). Vannak azonban további hozzájáruló központi idegrendszeri oldalak. Nevezetesen, az oldalsó hipotalamusz (LH) már régóta ismert, hogy a táplálkozási és önstimulációs viselkedést közvetítő hely.4, 31). Az LH-ban lévő oxxergén neuronokat és leptin-jelzést fontosnak találták a táplálás és az élelmiszer-jutalom szempontjából.5, 29, 30). Nemrégiben megfigyeltük, hogy a harmadik agykamrába vagy a hypothalamus (ARC) íves magjába beadott inzulin csökkentheti a szacharóz önadagolását, de az inzulin beadása a VTA-ba vagy a nukleinsavakba nem befolyásolta ezt a specifikus jutalmi paradigmát (15). Tehát úgy tűnik, hogy több hipotalamikus hely jelentős szerepet játszhat az motivált élelmiszer-keresésben és -szerzésben, és ezzel összhangban feltételezhető, hogy a hipotalamikus régiók lényegesen aktiválódnak az élelmiszer-önadagolással összefüggésben. A hipotézis tesztelésének megkezdéséhez a c-Fos expresszióját a szacharóz-önadagolási paradigmában képzett patkányok központi idegrendszerében rögzített arányok (FR) képzés után, vagy a progresszív arányok (PR) képzés után szigorúbb feladattal végezzük. a motiváció értékelésére (20).
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
Tárgyak.
Az alanyok hím albínó patkányok voltak (325–425 g) Simonsen-től (Gilroy, Kalifornia). A patkányokat ad libitum chow-n tartottuk. 12: 12-órás világos-sötét ciklusban tartották őket, 6 órakor világítottak, és 7 óra és dél között képezték és tesztelték étkezés utáni és abszorpciós állapotban. A patkányokon végzett összes eljárás követte az Országos Egészségügyi Intézet állatgondozásra vonatkozó irányelveit, és a VA Puget Sound Health Care System kutatási és fejlesztési bizottságának állatgondozási és felhasználási albizottsága jóváhagyta.
Szacharóz önadagolás.
Az eljárások a közzétett módszertanunkon alapultak (15) és táplált patkányokon végeztük. A kísérlet három fázisból állt: az automatikus képalkotás képzés, FR képzés és progresszív arányok (PR) képzése Richardson és Roberts PR algoritmusával (38). A PR algoritmus 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX stb.) a gomb megnyomja a munkamenetekre jutó jutalmat (38). A patkányokat arra tanították, hogy önállóan adagolják a 5% szacharózt (0.5 ml jutalom) egy folyadékcsepp-tartályba. A Med Associates (Georgia, VT) rendszer által vezérelt operáns dobozok két karral rendelkeztek, de csak egy kar (aktív, visszahúzható kar) aktiválta az infúziós szivattyút. A másik kar (egy inaktív, álló kar) megnyomása szintén rögzítésre került. Amint azt korábban láttuk, az inaktív karon lévő prések száma nagyon alacsony volt (kevesebb, mint az 10 prések / munkamenet). A szacharózoldatot egy folyékony cseppedénybe juttattuk be orálisan (Med Associates, St. Albans, VT). A kezdeti képzést az 1-h munkamenetek során folytonos megerősítési ütemterv szerint hajtották végre (FR1: minden karnyomó prés megerősítésre került). Minden munkamenet az aktív kar behelyezésével és egy fehér házvilágítás megvilágításával kezdődött, amely a teljes munkamenet alatt maradt. Egy 5-hang (2900 Hz, 20 dB a háttér felett) és a fény (7.5 W fehér fény az aktív kar fölött) diszkrét összetett cue-val együtt jutott el minden jutalomszállítással, 20-idővel a szacharózszállítással kezdődően. FR képzésre 10 napokra került sor; stabil válaszadás érhető el az ötödik ülésen. A PR-képzés a lehető legnagyobb 3 h / napra történt 10 napokon. A PR-munkamenetek az 30 min. Aktív aktív gombnyomásra nem válaszoltak, ekkor a házfény automatikusan kikapcsolt és az aktív kar visszahúzódott; a patkányokat kivettük a kamrákból, és visszatértük a ketreceikbe. A „Stop time” (leállítási idő) jelentésben Táblázat 2 a rendszer kikapcsolásának időpontját jelenti; ezért az utolsó aktív karnyomás 30 perccel a leállási idő előtt történt volna. Viselkedési adatok (Táblázat 2) a ülések 6-10 a FR képzésére, és. \ t ülések 1-9 PR képzéshez. A kontroll-kezelt patkányokat a ház helyiségéből vettük, és egy tiszta operáns kamrába helyeztük a ház fényével, 60 percre, az eljárás helyiségében, hogy szimulálják a szacharózt beadó patkányok kezelését és szobahőmérsékletét. Nem kaptak semmit, hogy enni vagy inni, miközben az operáns dobozokban tartózkodtak, és nem rendelkeztek hozzáféréssel a karokhoz.
Az utolsó napon a patkányokat a kamrákba helyeztük az edzésnapok szerint, és 90 percig tartottuk a kamrákban, majd eltávolítottuk őket érzéstelenítés, perfúzió és későbbi immunhisztokémia céljából. A kontroll patkányokat ugyanígy bevittük az eljárási helyiségbe, és egy tiszta operáns kamrában tartottuk az edzésnapok szerint 90 percen keresztül, majd érzéstelenítettük és perfundáltuk őket. Az utolsó 90 perces munkamenetet követően a patkányokat izoflurán inhalációval mélyen altattuk, majd 0.9% NaCl-val perfúzióval, majd hideg 4% paraformaldehid oldattal perfundáltuk. Az érzéstelenítés és az eutanázia időzítése a c-Fos fehérje expressziójának csúcsának ismert időbeli lefutásán alapult 90–120 perccel az esemény után. Így a c-Fos expresszió a központi idegrendszer aktiválódását tükrözné a viselkedési feladat kezdetén, nem pedig annak eredménye, hogy az állatok megtapasztalták a feladatot és lenyelték a szacharózt. Az agyakat eltávolítottuk, majd paraformaldehidben utólag rögzítettük néhány napig; majd 20% szacharóz-PBS-be helyezték őket, majd 30% szacharóz-PBS oldatba helyezték őket. Az agyakat kriosztáton (Leica CM 3050S kriosztát) metszettük immunhisztokémiai célokra.
c-Fos immunhisztokémia és mennyiségi meghatározás.
Az immunreaktív c-Fos-fehérje kvantitatív meghatározását az agyszakaszokban használt módszerrel használtuk.12). A teljes agy kezdeti kvalitatív képernyőjét c-Fos expresszióra végeztük. A csúszkával szerelt 12-μm teljes agyi koronális metszeteket PBS-ben (Oxoid, Hampshire, UK) mossuk 3-időkben. Ezután az 1 h-t szobahőmérsékleten blokkoltuk 5% normál kecske vagy szamár szérumot tartalmazó PBS-ben. Ezután a szekciókat PBS-ben többször mostuk, és egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on PBS-ben elkészített primer antitestoldatokban. A metszeteket PBS-ben háromszor mostuk, majd sötétben szobahőmérsékleten inkubáltuk másodlagos antitestoldatban, amelyet PBS-ben készítettünk 1 h-ra. A szekciókat ezután ismét PBS-ben mostuk, és a fedőlapot Vectashield kemény készletben (Vector Laboratories, Burlingame, CA) szerelt közegbe csúsztattuk. A szekciók digitális képeit egy Nikon Eclipse E-800 fluoreszcencia mikroszkóp segítségével szereztük be, amely egy Optiphot fényképezőgéphez van csatlakoztatva, és a Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) szoftver segítségével.
Ezt követően korlátozott számú területre összpontosítottunk, amelyek nyilvánvaló különbséget mutattak a feltételek között, a mennyiségi és a neuronális fenotípusok között. Konkrétan a nukleáris accumbens magra és a héjra (NAc) összpontosítottunk; a stria terminalis elülső és hátsó ágymagja (aBNST, pBNST); mediális hipotalamikus régiók [ventromedialis mag (VMH), dorsomedialis hypothalamus (DMH), paraventricularis nucleus (PVN), retroszkópos terület (RCh) és ARC]; oldalirányú hypothalamus (LH), beleértve a hátsó és a ventrális régiókat és a perifornikai (peF) területet; VTA; az agyi szár [a magányos alsó alsó olívaolaj, a hypoglossal (nXII) magja, a laterális retikuláris mag és a C1 / A1 adrenalin / noradrenalin magok]. Az Atlas-illesztett 12-μm-es szakaszokat kiértékeltük a c-Fos-expresszióra és a mennyiségi meghatározásra a megfelelő szakaszokban és régiókban, Paxinos és Watson atlasz alapján (34). Lásd Táblázat 1 specifikus sztereotaxikus koordinátákhoz. A vizsgálatok elsődleges célja az volt, hogy összehasonlítsuk az egyes viselkedési feladatokat a megfelelő kontrollal (PR vs. PRC; FR vs. FRC). A lehetséges viselkedés és a kontrollfeltételek közötti különbségek optimalizálása érdekében a PR és FR csoportok csúcsteljesítményeit elemeztük. Így 4 / 12 PR és 3 / 12 FR patkányokat vizsgáltunk: Ezek a patkányok aktív karnyomásszámmal (az elsődleges viselkedési végponttal) rendelkeztek, amely nagyobb volt, mint egy átlagos szórás a saját viselkedési csoportjuk átlagánál. Megvizsgáltuk a kontroll patkányok (5 PRC és 3 FRC patkányok, az FR vagy PR patkányok egyidejű jelenlétét) alcsoportját is. Egy további három patkányból álló csoportot vettünk át a FR eljárással („FRext”), hogy utánozzuk a PR eljárás hozzáadott időtartamát (azaz az összes 20 napra, mivel a PR patkányokat FR-en és PR-n keresztül vittük be) annak értékelésére, hogy A FR és a PR közötti különbségek a viselkedési feladat vagy az eljárás időtartama miatt következtek be. A FRext agyakat nem elemeztük és szisztematikusan nem szkríneltük, de a specifikus érdekelt területeket a többi négy csoporttal vizsgáltuk, hogy lehetővé tegyük az összehasonlító kvantitációt, amint azt az eredményekben kifejezetten jeleztük.
A mennyiségi meghatározáshoz (40 × nagyításnál) atlasz-illesztett régiókat választottunk ki. Az ImagePro Plus szoftvert (Media Cybernetics) használtuk a kívánt terület képének rögzítésére. Egy területet a számláláshoz határoztak meg, és megállapítottuk a pozitív sejtek számának küszöbértékét. Az azonos területet és a hátteret (küszöböt) használtuk a megfelelő kísérleti csoportok szekcióira, és a pozitív sejtek (kvantitatív) szoftverszámlálását ugyanabban a munkamenetben végeztük minden kísérleti csoportban, hogy megakadályozzuk a munkamenet-változások háttérbeállítását. Statisztikai elemzéshez csak egy patkányból vettük a számokat, ha a megfelelő vagy teljes szakaszok minden egyes területen (amint azt a 6. \ T Táblázat 1) rendelkezésre álltak; egy adott területre vonatkozó adatokat nem vettek be egy patkányból, ha a területre vonatkozóan kétoldalú képviselet hiányos volt.
Minőségi kettős jelölésű immunfluoreszcens analízis.
A kettősen jelölt immunhisztokémiai vizsgálatokhoz agyi metszeteket vettünk azoktól a patkányoktól, amelyekben a c-Fos mennyiségét meghatároztuk. Mivel nem akartuk megzavarni az állatok viselkedését, a peptid neurotranszmitterek megjelenítésének optimalizálása érdekében nem kezeltük őket kolchicinnel. Ezért az önadagolási feladattal összefüggésben aktivált neuronális fenotípusok vizualizálása korlátozott volt. Az aktivált idegsejtek fenotípusainak értékelésének megkezdéséhez azonban számos központi idegrendszeri helyen digitális képeket készítettünk (amelyeket a fenti szakaszban leírtak szerint szereztünk be) 20 ×, 40 × vagy 60 × (az ábrák szerint) nagyítással. . A glutamát-dekarboxiláz (GAD), a tirozin-hidroxiláz (TH), a CRF, az Y neuropeptid (NPY), az Agouti-val rokon peptid (AgRP) és a triptofán-hidroxiláz kettős festési eljárása összehasonlítható volt a saját, azzal a különbséggel, hogy c-Fos-Ab és a többi elsődleges antitest keverékét alkalmaztuk egy éjszakán át inkubálni 4 ° C-on; hasonlóképpen mindkét szekunder antitestet ugyanabban az oldatban tartottuk, és 1 órán át sötétben, szobahőmérsékleten inkubáltuk. A blokkolási lépés előtt 20 perces, 50% -os etanolos mosást alkalmaztunk az orexin vizsgálathoz. A primer antitestek megfelelő hígításának meghatározásához kezdeti optimalizálási vizsgálatokat végeztünk. Elsődleges antitestként nyúl anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) és egér anti-c-Fos (1: 800) volt (mindkettő a Santa Cruz Biotechnology-tól, Santa Cruz, Kalifornia); egér anti-GAD (1: 1,000 1), egér anti-tirozin-hidroxiláz (500: 1) és juh-anti-triptofán-hidroxiláz (mindegyik a Chemicontól, Temecula, CA); nyúl anti-CRF (500: 1) (Dr. Wylie Vale ajándéka, Salk Intézet, Kalifornia); nyúl anti-NPY (1,000: 1 1,000), nyúl anti-AGRP (1: 5,000 3) és kecske anti-orexin A (488: 1 500) a Phoenix Pharmaceutical cégtől (St. Joseph, MO). Másodlagos ellenanyagokként Cy1-konjugált kecske-nyúl- vagy egérgátlót (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 2,500-as kecske-egér- vagy nyúl- vagy szamárjuh-ellenes IgG-t (Molecular Probes, Eugene, OR) ; az összes másodlagos antitestet 488: 1-ra hígítottuk. A c-Fos / MCH kettős immunfestést sorozatosan vizsgáltuk; először MCH (500: 5 primer antitest, Millipore) esetében Alexa-1-kecske anti-nyúl (500: 3) szekunder antitesttel. A tárgylemezeket 20% normál kecskeszérummal blokkoltuk, és anti-c-Fos (50: XNUMX) és cyXNUMX-kecske anti-nyúlra festettük szekunder antitestként. A blokkolási lépés előtt XNUMX perces, XNUMX% -os etanolos mosást alkalmaztunk az MCH assay-hez.
Statisztikai elemzések.
A csoportadatokat a szövegben, táblázatokban és ábrákban átlag ± SE-ként mutatjuk be. A jelentőséget úgy definiáljuk, mint P ≤ 0.05. Statisztikai összehasonlításokat végzünk a kísérleti csoportok (FR vs. PR) vagy a kísérleti csoportok és a megfelelő kontrollok (PR vs. PRC; FR vs. FRC) között, nem párosított Student t-teszt. A Pearson-korrelációs együtthatókat az aktív karnyomások és a különböző agyi régiók c-Fos expressziója, valamint a különböző agyi régiók közötti c-Fos expresszió korrelációját azonos kísérleti körülmények között számítottuk a StatPlus: mac LE statisztikai elemző programmal Mac OS verzióhoz 2009-ben az AnalystSoft. Teszteltünk lineáris összefüggéseket (Pearson's) R statisztika) a különböző központi idegrendszeri régiók c-Fos expressziója között. Megvizsgáltuk a különböző aktivált CNS régiókban a c-Fos expresszió és a viselkedés közötti összefüggéseket is. Ezeknek a korrelációknak a FR és PR adatait vizsgáltuk patkányokról, amelyekre c-Fos kvantitációt végeztünk.
EREDMÉNYEK
c-Fos mennyiségi meghatározása.
Amint azt korábban láttuk, az aktív karnyomások száma szignifikánsan nagyobb volt a PR vs. FR teljesítménynél (Táblázat 2), és a szacharóz-jutalmak száma nagyobb volt a FR teljesítménye során. A PR patkányok munkamenetének hossza körülbelül 90 min (stop time - 30) volt. Táblázat 3 felsorolja a C-Fos immunreaktív sejtszámát minden olyan központi idegrendszeri régióban, ahol kvantitatív vizsgálatot végeztek. A FR és PR patkányok c-Fos expressziójának mintázatát az alábbiakban foglaljuk össze Ábra 1. A mediális hypothalamus (MHhogyaz ARC, PVN, RCh, DMH és VMH kompozíciója a patkányoknak, akik PR-karral szorították a szacharózt, de nem mutattak ki általános aktiválódást a FR-karral foglalkozó patkányokban, a szacharózhoz képest, a megfelelő kontrollokhoz képest. A PR patkányok mediális hipotalamuszán belül ez az aktiválás a PVN, ARC és VMH (Ábra 2). A FR-kar megnyomásával, de nem PR-gombnyomással, az LH-n belüli jelentős aktiválással társult (főként a perifornikus területen történő aktiváláson alapul). Mind az aktív karnyomás, mind a hipotalamusz c-Fos expressziója összehasonlítható volt a FRext és FR csoportok között (MHhogy946 ± 26 és 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 és 186 ± 10; LHhogy468 ± 79 és 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 és 173 ± 15), ami arra utal, hogy az FR és PR csoportok közötti expressziós mintázat különbsége nem a képzés / tapasztalat időtartamára, hanem az instrumentális feladat jellegére vonatkozik. A FR csoport esetében a c-Fos expresszió szignifikáns növekedése volt megfigyelhető a BNST-ben, mind az aBNST, mind a pBNST esetében. Mind a FR, mind a PR karok megnyomásával a NAc héjban a c-Fos-immun-pozitív neuronok emelkedtek; A c-Fos-számok szignifikánsan nőttek a NA-magban a FR-gombnyomást végző patkányoknál, és a PR-gombnyomással rendelkező patkányokban nem volt szignifikáns tendencia a megnövekedett c-Fos-expresszió felé. A c-Fos-ot a PR-feladattal nem növelte a VTA-ban, bár a FR-feladatnál a növekedés irányába mutató nem jelentős tendencia volt megfigyelhető. Végül a c-Fos szignifikánsan nőtt a hypoglossal (cranialis ideg XII) magjában a PR-re képzett patkányok agyszárában, de nem FR-ben.
c-Fos expressziót figyeltek meg más központi idegrendszeri régiókban, köztük az amygdala és az agykéreg (Ábra 3). Mindazonáltal mind a kontroll körülmények között, mind a PR és FR feladatokkal összefüggésben megfigyelhető volt az expresszió, ami arra utal, hogy az eljárás nem specifikus aspektusai (kezelés, mozgás az eljárásszobába) esetleg ezt az aktiválást eredményezték. Ezekben a régiókban nem végeztek mennyiségi mennyiséget. Hasonlóképpen, az nXII-n kívüli agyi ősrégiókon belüli aktiválódást figyelték meg, de mind a kontroll, mind a feladathoz kapcsolódó állapotok összefüggésében fordult elő, ami szintén szerepet játszik a nemspecifikus arousal vagy viselkedési aktiválásban.
Megvizsgáltuk a c-Fos expresszió közötti összefüggéseket a különböző központi idegrendszeri régiókban. A karnyomásos csoportok adatait egyesítve negatív korrelációt találtunk az LH és a VMH c-Fos expressziója között; így a VMH aktiválása az LH (Pearson's R, -0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Szintén szignifikáns pozitív korrelációt figyeltünk meg az LH perifériás régiójában a c-Fos expresszió és a VTA között (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), összhangban van a két régió közötti ismert monoszinaptikus kapcsolattal (lásd a Refs. 2 és a 13). Jelentős negatív korrelációt találtunk a VTA-ban a c-Fos expresszió és az NAc-shell között, függetlenül attól, hogy külön-külön teszteltük-e az FR teljesítményét (Pearson's R, -0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) vagy PR teljesítményre (Pearson's R, -0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), összhangban van a striatális régiók és a materia nigra és a VTA közötti ismert kölcsönös bemenetekkel (2, 13). Megvizsgáltuk a különböző CNS régiókban a c-Fos expresszió és a viselkedés összefüggéseit is. A karnyomásos csoportok adatait egyesítve szignifikáns pozitív korrelációt figyeltünk meg az ARC-ben lévő c-Fos és az aktív karnyomások között (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
A szacharóz bevitelével aktivált neuronok azonosítása és a szacharóz motivációja.
Az agyszárban a c-Fos-pozitív neuronok nem mutattak pozitív immunfestést TH-re, az epinefrin és a norepinefrin (és a dopamin) sebességkorlátozó enzimére; úgy tűnik, hogy ezek a katekolaminerg neuronok nem aktiválódtak a FR vagy PR feladatok által. Néhány c-Fos-pozitív neuron azonban pozitív immunfestést mutatott a triptofán-hidroxiláz esetében, ami azt jelzi, hogy a szerotonin neuronok populációja aktiválódott. Ahogy látható Ábra 4Az ARC-ben a c-Fos-pozitív sejteket AGRP-festett szálak veszik körül, és az NPY-rost / c-Fos-immunfestéshez hasonló mintázatot figyeltünk meg (nem ábrázoltuk). A PVN-ban a c-Fos-pozitív neuronok a CRF-pozitív neuronokat körülvették, de nem volt megfigyelhető kolokalizáció (az adatokat nem mutatjuk be). Ábra 5 mind az orexin, mind az MCH immunfestését mutatja az LH-ban. Orexin neuronokat találtunk mind a dLH-ban, mind a peLH-ban. Bár az MCH-pozitív neuronokat megfigyeltük a peLH-ban, lényegében nem volt kolokalizáció a c-Fos-mal az LH ezen régiójában. Azonban az orexin-pozitív neuronokban a c-Fos-kolokalizációt figyeltük meg (Ábra 6, felső), és nagyon korlátozott c-Fos kolokalizáció az MCH-val a vLH-ban (Ábra 6, alsó). Újra hangsúlyozni kell, hogy mind a lokalizáció, mind a c-Fos-val való kolokalizáció alulbecsülhető a peptid neurotranszmitterek, például a CRH esetében, mivel a patkányokat nem előkezelték kolchicinnel. Végül a magban és a magban (Ábra 7), a GAD-val, a GABA szintetikus enzimmel együttfestő c-Fos mind a FR, mind a PR patkányok esetében megfigyelhető volt. A VTA-ban a TH-nek robusztus festése volt; a c-Fos-pozitív neuronokat azonban ritkán észlelték, és nem úgy tűnt, hogy kizárólag TH-vel kolokalizálódtak.
VITA
A jelenlegi vizsgálatban a közvetlen korai gén, a c-Fos, expresszióját használtuk, hogy megvizsgáljuk a szacharóz önszabályozó kar megnyomásával járó akut CNS aktiváció mintázatát, akár viszonylag igénytelen feladatként (FR) vagy fokozatosan kihívást jelentő feladat, amelyet úgy gondolnak, hogy tükrözzék a jutalom motivált keresését, mint például a szacharóz, és erősen bevonják a limbikus áramkört (22, 24, 49) (PR). A két feladat között a hypothalamikus aktiválási mintázatok különböztek, a FR-feladatban az LH / limbikus aktiváció és a PR-feladatban a mediális hipotalamusz / limbikus aktiváció volt (lásd: Ábra 1). Ennek számos oka van. Először is, ezek a paradigmák „térképezhetnek”, mint kvalitatívan eltérő tapasztalatok a központi idegrendszerben. A FR teljesítményében képzett patkányok egyszerű, magas jutalmú tevékenységet várnak. Egy jutalmazó étel előrelátása erősen befolyásolja a FR-patkányokban megfigyelt c-Fos-mintát. Az aktiválási minta nyilvánvaló minőségi különbsége azt sugallja, hogy a második lehetőség - hogy a PR állatoknak több tapasztalata van a feladattal - kevésbé valószínű, és ezt alátámasztotta a c-Fos mérése a patkányok hypothalamusában, amelyek 20 FR szekciókat kaptak. , amely a FR csoporthoz hasonló aktivitást mutatott, nem a PR csoportot. Mindkét lehetőséget tesztelhetjük a FR-képzés nehézségeinek szisztematikus növelésével és a központi idegrendszer aktiválásában bekövetkezett változások értékelésével, amely esetben az aktiválási minta kvalitatív változása várható. Míg azonban a képzési tapasztalatok száma nem számít a központi idegrendszer aktiválási mintájára, a szacharóz-jutalmak átlagos száma: a PR-feladat egyszerűen megtanulható „kevésbé jutalmazó” élményként, és ez funkcionálisan kapcsolódik a az LH aktiváció hiánya. Így a CNS aktiválási mintája a munkamenet elején egy interoceptív állapotot tükrözhet, mint például a feltételes hely paradigma: a limbikus áramkörben az aktiválás erőssége kötődik a tanuláshoz és a motivációhoz. Megfigyeltük a c-Fos expresszió variabilitását az FRC állatok mediális hipotalamuszában. Különösen a PVN-n belül ez a variabilitás lehet az FR-patkányok aktiválásának maszkolása, amelyeknél a c-Fos-féle növekedés és a FRC-patkányok iránya megfigyelhető volt.Táblázat 3). Azonban az általános mediális hipotalamikus aktiválás nem különbözött a FR és az FRC állatok között.
Meg kell jegyeznünk, hogy bár célunk az volt, hogy azonosítsuk a központi idegrendszeri helyeket, amelyek hozzájárulnak a viselkedés kialakulásához, az időbeli felbontás valamilyen megfontolás. Amint az alábbiakban tárgyaltuk, mostanra felismertük, hogy a műszeres vagy operáns viselkedések különböző alkotórészeit a neuronok különböző populációinak aktiválása közvetíti (13, 23, 33, 49). Nem tudjuk teljesen kizárni, hogy a nagyon közvetlen bar-press vagy a jutalmak nyalásából adódó aktiválás valamilyen mértékben hozzájárult az általunk megfigyelt aktiválási mintákhoz. Eredményeink alapjául szolgálnak az egyes központi idegrendszeri helyszínek szerepének további vizsgálatára az önigazgatás feladat különböző aspektusaiban vagy összetevőiben, valamint az ilyen vizsgálatokhoz, más közvetlen korai gének méréséhez különböző „on” és „off” időintervallumokkal (36) nagyon hasznos lesz.
A különböző agyterületek c-Fos-expressziójában talált korrelációk alátámasztják a hipotalamikus és primer limbikus régiók ismert funkcionális kapcsolódását ehhez a konkrét jutalmi feladathoz, például az LH és a VMH, valamint az LH és a VTA perifornikai régiója között. (lásd a Refs. 2 és a 13). Megvizsgáltuk a különböző aktivált régiókban a c-Fos expresszió és a viselkedés közötti összefüggéseket is. Az ARC-ben lévő c-Fos és az aktív karnyomók közötti korreláció illeszkedik az ARC-aktivitás jól meghatározott szerepéhez az élelmiszer-bevitelben (1); korábbi megfigyelésünk szerint, hogy az inzulin injekció kifejezetten az ARC-re csökkentette a szacharóz önadagolását (15); előzetes jelentésekkel az ARC és az endorfinerg neuronok kritikus szerepéről a kokain önadagolásának megszerzésében és teljesítésében (40-42); és az ARC-től a NAc-hez azonosított előrejelzésekkel (17). Tehát az ARC valószínűleg kulcsszerepet játszik a motivált viselkedésben, hogy sokféle jutalmazó ingert keressen és szerezzen, beleértve, de nem kizárólag, az ételt. Végül a PR és a VMH szignifikáns aktiválódását figyeltük meg a PR szacharóz-kereséssel. Ez összhangban áll ezen mediális hypothalamikus magok jól jellemzett szerepeivel az élelmiszer-bevitel szabályozásában, az ARC-vel való közvetlen szinaptikus kapcsolatokban és a limbikus áramkörrel azonosított kapcsolatokban (1, 27, 37).
Szignifikáns negatív korrelációt találtunk a VTA-ban a c-Fos expresszió és a NAc-shell között, függetlenül attól, hogy FR-t vagy PR-t teszteltek. Némileg meglepő volt, hogy a PR vagy FR szacharóz önadagolásával összefüggésben nem figyeltek meg erősebb VTA aktivációt (szemben a megfelelő kontrollokkal). Talán ez a megállapítás tükrözi mérésünk időzítését, amely a feladat kezdetén aktív CNS-helyekre összpontosít, amelyekre ezek az állatok jól képzettek voltak. Ez összhangban állna Schultz észrevételeivel és tézisével (44), hogy a dopamin neuronális aktiválása a váratlan ingerek vagy jutalmak jelzőjeként szolgál, és ez az aktiválás a képzéssel együtt csökken. Azonban a striatális dopamin felszabadulása a szacharóz-bevétel során képzett állatokban nagyon pontos és időbeli diszkrét eseményként jelentkezik (39). Így lehetséges, hogy az általunk megfigyelt trendek nagyobb tanulmányi csoporttal (azaz több statisztikai erővel) jelentősen jelentősek lennének. Mind a FR, mind a PR szacharóz bevételével összefüggésben megfigyeltük az NAc aktiválódását. A NAc neuronok aktiválását és gátlását jelentették az instrumentális jutalmi teljesítmény összefüggésében, és az aktiválás / aktivitás mintázata a képzés és a környezet függvénye, és a viselkedés különböző összetevőihez kapcsolódik (pl. Orientáció, megközelítés, bevitel).6, 33, 50). Amint azt a fentiekben tárgyaltuk, a c-Fos mérése nem rögzíti az ilyen specifikus aktivitást. Carlezon azt javasolta, hogy a „jutalom” túlnyomórészt a NAc neuronok, azaz a közepes tüskés neuronok aktivitásának csökkenéséhez kapcsolódik.3). Ez nem felel meg a megfigyeléseinknek - lényegesen javult a NAc c-Fos a GAD-val kolokalizált kezelőszervekkel és c-Fos-pozitív neuronokkal, összhangban a közepes tüskés neuronok (GABAergic) aktiválásával, de nem vizsgáltuk kifejezetten az NAc neuronális gátlását ”. Az NAc aktiválása és gátlása mind instrumentális feladatok során, mind anatómiai, mind időbeli specifitással fordulhat elő. E tanulmány szempontjából arra a következtetésre juthatunk, hogy a NAc részt vesz a műszeres szacharóz-bevétel kialakulásában, az NAc mag pedig hozzájárul a motoros aktiváláshoz, és az NAc-héj hozzájárul a feladat motoros és motivációs aspektusaihoz.
A BNST mindkét fő régiójának (anterior és posterior) aktiválását is megfigyeltük FR patkányokban. A BNST a limbikus áramkör egy része, amely modulálja a neuroendokrin válaszokat az ismétlődő inger tapasztalatokra (8, 9), és nagyobb értelemben az ismétlődő ingerek tanulásával kapcsolatos. Jóllehet szerepe az ismételt stressz-élményekkel kapcsolatban a legszélesebb körben ismert, megállapításaink a BNST szélesebb szerepére utalnak: A BNST módosíthatja a visszatérő pozitív, valamint a negatív vagy stresszes ingerekre adott központi idegrendszeri válaszokat. Mivel ezt az aktiválást a FR kezdetén megfigyeltük, de nem a PR, a teljesítmény, a BNST toborzása a FR képzéssel kapcsolatos megnövekedett szacharóz jutalmakhoz köthető. A CRF neuronok közvetlen aktiválásának megfigyelése azt sugallja, hogy a szacharózra adott instrumentális válasz nem jelentős stresszor; a c-Fos expresszió más PVN neuronokban azonban összhangban van a stressz áramkör modulációjával (46). Valójában Ulrich-Lai és munkatársai arról számoltak be, hogy egy másik étrend / táplálkozási paradigmával a szacharóz bevitel modulálja a PVN funkciót (47). Végül megfigyeltük a hypoglossal ideg magjának aktiválódását a PR, de nem FR teljesítményével. Ennek jelentőségét csak a spekulációra lehet rámutatni; az egyik lehetőség az, hogy a szacharóz ízének relevanciája a patkányokban megnőhet, ha kevesebb szacharóz jut.
A szacharóz-keresést és a szacharóz-bevételt multimodális tapasztalatnak kell tekinteni, amely időben dinamikus, mivel a lenyelés a szacharóz kalóriatartalmához kapcsolódó perifériás jeleket, valamint a szokásos elterjedést és az alliesthesiát (25). Miközben kutatásunk a perifériás endokrin jelek, azaz az inzulin és a leptin befolyásolására összpontosított, az élelmiszer-jutalom modulálására, hatásaikat közvetlenül közvetíthetik a rövid vagy hosszú távú szerepet játszó adók és neuropeptidek. táplálék vagy élelmiszer-jutalom (lásd a Ref. 14). A jelenlegi tanulmány némi betekintést nyújt ehhez; megfigyeltük az MCH-t vagy az orexint, az orexigen két neuropeptidet expresszáló neuronok aktiválódását. Ezek az eredmények valójában alábecsülhetik az MCH vagy az orexin szerepét az élelmiszer-jutalomban, mivel az immunocitokémia nem kolhicinnel kezelt patkányokban kétségkívül korlátozta mindkét neuropeptid megjelenítését. Az aktivált orexin neuronok azonosítása az LH-ban összességében összhangban van az orexin neuronok táplálkozásban, táplálékjuttatásban és általánosabb stimulus jutalomban való részvételével végzett számos tanulmánykal (pl. 5, 7, 29). A peFLH orexin neuronok aktiválódását figyeltük meg. Aston-Jones és munkatársai (5) az LH-orexin-neuronok különböző populációinak szerepét szétválasztották a jutalom viselkedésében, és rákényszerítették a peFLH orexin-neuronokat, szemben a jutalommal. Eredményeink tehát az LH orexin szerepét sugallják az izgalomban, és talán az aktív karra vagy a szacharóz-bevitelre vonatkozó iránymutatások felé.
A jövőbeni megfontolás méltó a szacharóz egyedisége vagy általánosíthatósága, mint jutalmazó ösztönző. A korai központi idegrendszeri aktiváció mintázatának itt az élelmiszerre specifikus, mint ösztönző, vagy más, jutalmazó ingerekre vonatkozó általános meghatározás továbbra is meghatározásra vár. Amint azt a fentiekben említettük, különösen a FR feladatban, számos szacharóz jutalom lenyelése várhatóan metabolikus következményekkel járna, a hormon felszabadulás modulálásával (például kolecisztokinin, ghrelin, inzulin) és a perifériás és a központi idegrendszeri idegaktiválás változásaiban. Ezeknek a változásoknak nem várható közvetlen szerepük a mért korai központi idegrendszeri aktiválási mintákban, de szerepet játszhatnak a szacharóz jutalom megtanulásában a képzés során. A neuropeptidek, mint például az orexin, szintén kritikusan érintettek.
Vizsgálatunk szerint tudásunk szerint a szacharóz önadagolásának kezdetén a specifikus mediális hypothalamikus magok aktiválódásának első bizonyítéka, beleértve a homeosztázisban és a stresszreakcióban szerepet játszó PVN-t, valamint az energia homeosztázis szempontjából kritikus ARC-t, tápanyagérzékelés és az élelmiszer-bevitel szabályozása. Fontos, hogy megfigyeltük a mediális hypothalamus és a NAc aktiválódását a PR-megjelenéssel összefüggésben, ami arra utal, hogy mind a homeosztatikus, mind a limbikus helyek szerepet játszanak a szacharóz önadagolásában. Kiegészítő limbikus áramköröket lehet felvenni egy későbbi időpontban a feladatban.
Kilátások és jelentőség
Míg történelmileg a motivációs és jutalmazási magatartások tanulmányozása a leginkább a központi idegrendszer limbikus áramkörét vonja maga után, rengeteg bizonyíték gyűlt össze, amely hangsúlyozza a limbikus és az energia homeosztázis áramkörének kritikus funkcionális kölcsönhatását. A jelenlegi tanulmány most azt sugallja, hogy a szacharóz motivált munkájában specifikus mediális hypothalamikus magok várhatóak. Ebből a tanulmányból extrapolálva a jövőbeni tanulmányok értékelhetik, hogy szükséges-e a mediális hipotalamusz szerepe, és hogy aktiválódása-e az egyéb jutalmak, például a visszaélés drogjai motivált kereséséhez. Ezen túlmenően a vizsgálat eredményei indokolják a motivált viselkedések változásának tanulmányozását a megváltozott mediális hipotalamusz fiziológiával, például az elhízással összefüggésben.
TÁMOGATÁSOK
Ezt a kutatást a DK40963 Nemzeti Egészségügyi Intézetek támogatták. Dr. Dianne Figlewicz Lattemann vezető kutatói kutató, biomedicinális laboratóriumi kutatási program, Puget Sound Egészségügyi Rendszer Tanszék, Seattle, Washington. Dr. Sipolsot a Lett Tudományos Tanács támogatta 04.1116.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönjük dr. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius és JE Blevins tanácsot és hasznos megbeszéléseket tartottak.
REFERENCIÁK
;