A hipokretin (orexin) megkönnyíti a jutalmat azáltal, hogy a ventrális tegmentális területen (2014) a transzmisszió dinamorfin antireward hatásait enyhíti

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b és a William A. Carlezon, Jr.^a

Szerzői információk ► Szerzői jogi és licencinformációk ►

A hipokretin (orexin) és a dinamorfin neuromodulátorok, amelyek fontos szerepet játszanak a hatás és a motiváció szabályozásában. Az oxxin kritikus a jutalomért, és a kábítószer-keresésben is szerepet játszik, míg a dynorphin negatív hangulatot közvetít, és a depresszív állapotokhoz kapcsolódik. Ezeket az ellentétes hatásokat figyelembe véve a jelentések arról, hogy mindkét peptid ugyanabban a neuronban expresszálódik és koreláltak, ellenállóak. Itt megmutatjuk, hogy az orexin és a dynorphin ugyanazon szinaptikus vezikulákban együtt expresszálódnak, és ez a kolokalizáció mélyen befolyásolja a jutalmat, a kábítószer-bevételt és az impulzusszerű viselkedést. Az a tény, hogy az orexin elzárja a dinorfin depressziós szerű antireward hatásait, jelentősen megváltoztatja az orexin az agyban való funkcionális szerepét.

A hipokretin (orexin) és a dinamorfin neuropeptidek, amelyek ellentétes hatással vannak a motivált viselkedésre. Az oxxin az arousal és jutalomállapotokban van jelen, míg a dynorphin depresszív állapotokban van jelen. Megmutatjuk, hogy ellentétes hatásuk ellenére ezek a peptidek a hypothalamuson belül azonos szinaptikus vezikulákba vannak csomagolva. Az orexin funkció megzavarása meggátolja az oldalsó hipotalamusz (LH) stimuláció előnyös hatásait, kiküszöböli a kokain által kiváltott impulzivitást, és csökkenti a kokain önadagolását. A dinamorfin funkció egyidejű megszakítása megfordítja ezeket a viselkedési változásokat. Azt is megmutatjuk, hogy az orexin és a dynorphin ellentétes hatással van a ventrális tegmentális terület (VTA) dopamin neuronjainak ingerlékenységére, az orexin tartalmú neuronok kiemelkedő célpontjára, és hogy az intra-VTA orexin antagonizmus csökkenti a kokain önadagolását és az LH önstimulációját amelyek a dinamorfin antagonizmus által megfordultak. Eredményeink egy egyedülálló sejtfolyamatot azonosítanak, amely révén az orexin elzárhatja a korelázott dinamorfin jutalmi küszöbértékét növelő hatásait, és ezáltal engedéllyel járhat, hogy megkönnyítse a jutalmat.

Az Orexin és a Dynorphin Cotransmitterek.

Megerősítettük az orexin és a dynorphin koexpresszióját az egér laterális, perifornikai és dorsomedialis hypothalamus neuronjaiban fluoreszcens mikroszkópiával (18) (Ábra 1A). A több transzmittert expresszáló neuronok létezését más agyi áramkörökben leírták, és a szűrőmechanizmusok neurális alapját jelenthetik, amellyel a koexpresszált neurotranszmitterek felszabadulása differenciális tüzelési sebességgel történik (19). Az EM alkalmazásával azonban megállapítottuk, hogy az orexin és a dynorphin ugyanazon szinaptikus vezikulákon belül kolokalizálódik. A kopackázás többségét nem müelinizált, varikózus axonális folyamatokban figyelték meg, ahol az immunjelölést a hólyagokban vagy azok közelében találtuk. Az idegsejtek testein belül a Golgi komplexhez szignifikáns címkézést társítottak, míg a szomszédos magokban nem találtunk semmit.Ábra 1 B és a C). A dendritek mindkét peptidhez vezikulummal kapcsolatos jelölést is tartalmaztak, ami arra utal, hogy ezek az adók potenciálisan dendritikus felszabadulását eredményezik. Kis számú mikrostrukturális profil rögzítette az axon terminálokat mindkét peptid címkézésével az aszimmetrikus szinapszisok kioldási zónáján kívül található nagy (icles100 nm) vezikulákban.Ábra 1 B és a C), amely alátámasztja azt a következtetést, hogy az orexin és a dynorphin cotransmitterként funkcionál, és hogy normál körülmények között a sejtek égési frekvenciájának függvényében egymás helyett differenciálisan szabadulnak fel.

 

Fig. 1.

Az oxxin és a dinamorfin a hypothalamus neuronjaiban cotranszmitterek. (A, Balra) A fénymező fotomikrográfja mutatja az orexin (vörös) és a dinamorfin (zöld) immunreaktivitást vizsgáló hipotalamusz területét. (A, Jobbra) Kétcsatornás kép egyesítése ...

A rexin blokád jutalmazási küszöbérték-emelkedő hatását a Dynorphin blokád megfordítja.

Ennek az egyedülálló jeladómodellnek a funkcionális jelentőségének feltárása céljából megvizsgáltuk, hogy az orexin és a dynorphin jelzés zavarai befolyásolhatják-e a normális és aberráns motivációt tükröző komplex viselkedéseket. A C57BL / 6 egerekben intrakraniális önstimuláció (ICSS) végrehajtására, az oldalsó hipotalamusz (LH) stimulációval megerősítve (20), az OX blokádja₁Az N- (2-metil-6-benzoxazolil) -N-1,5-naftiridin-4-il-karbamid (SB334867) R-je a fényfázis során dózisfüggő növekedést eredményezett a jutalom küszöbértékekben (Ábra 2A; egyirányú ismétlődő intézkedések ANOVA dózisra: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Az ICSS küszöbértékek növekedése a kezelés által kiváltott csökkenést tükrözi az ingerlés jutalmazó hatásában, amely depressziós jellegű jel a csökkenő jutalomérzékenységre utal (20). Ez a hatás nem a szedáció vagy más nem specifikus viselkedési zavar miatt következett be, mivel az ICSS válaszarány nem változott (Ábra 2B; egyirányú ismétlődő intézkedések ANOVA dózisra: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Fig. 2.

Az orexin blokád jutalmi küszöbértékét növelő hatását a dinamorfin blokád megfordítja. (A) Az orexin jelzés blokkolása az OX-en₁Az SB334867 R (0 – 30 mg / kg, ip) az ICSS tesztben növeli a jutalmi küszöbértékeket, ami azt mutatja, hogy csökken a jutalom. Ez a hatás ...

Az SB334867 által okozott jutalmi küszöbértékek megemelkedését megakadályozták nor-binaltorfininnal (norBNI) történő előkezeléssel [ANOVA kétutas ismétlődő mérések (a betegek közötti faktor között) × dózis SB (alanyi faktoron belüli) interakció: F_3,24 = 3.98, P <0.01], amely hosszan tartó blokádot eredményez a dinamorfin akciókban a KOR-oknál (10). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az orexin-jelzés elvesztése a coreleased Dynorphin látens antireward hatásait tárja fel. A norBNI önmagában történő beadása nem csökkentette a jutalmi küszöbértékeket. Bár ez a hatás összefügghet a norBNI és más prototípusos KOR antagonisták egyedi farmakodinamikájával (10azt is jelezheti, hogy redundanciát mutatnak az agyi jutalmak áramlását befolyásoló folyamatokban, vagy hogy az orexin tónusok fokozatos fokozódása (egyedül a korelázott dinamorfin nélkül) nem elegendő a jutalmi jel közvetítéséhez az oldalsó hipotalamuszban. Ezek a megállapítások először úgy tűnhetnek, hogy ellentmondanak azoknak, akik a sötét fázisban az SB334867-et vizsgálták az ICSS küszöbértéken.21). Ugyanakkor jelentős bizonyíték van arra, hogy az orexin funkció csökkenése következményekkel járhat, attól függően, hogy az állatokat fény vagy sötét fázisuk alatt tesztelik-e. Például az élelmiszer és a víz megőrzi az orexin KO egerekben járó előnyöket, amikor a vizsgálatot a sötét fázisban végzik, de nem a fényfázis alatt (22), az az idő, amikor minden viselkedési tesztünket elvégeztük.

A szisztémás SB334867 és norBNI adagolásának ICSS-re gyakorolt ​​hatásának lokalizálásához külön egércsoportot implantáltunk LH stimuláló elektródákkal és VTA vezető kanülekkel. Az SB334867 VTA-nak való mikroinfúziója jelentősen megnövelte a jutalom-küszöbértékeket, ami a jutalomérzékenység csökkenését jelzi. Bár a VTA-n belüli norBNI önmagában nem volt hatással az ICSS küszöbértékekre, az blokkolta az ezt követő SB334867 infúzió küszöbértéket növelő hatásait (Ábra 2C; egyirányú ismétlődő intézkedések ANOVA a Drug számára: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Noha a koponyán belüli gyógyszerinfúziók a szisztémás gyógyszerinjekciókhoz képest mérsékelten csökkenték a válaszreakció maximális arányát, ezek a hatások nem érték el a statisztikai szignifikanciát (Ábra 2D; egyirányú ismétlődő intézkedések ANOVA a Drug számára: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Oxxin és Dynorphin Transmission által szabályozott impulzivitás.

Az impulzivitást a jutalom-kereső viselkedés elnyomásának hiánya jellemzi, sok pszichiátriai betegség közös jellemzője a magas impulzivitás szintje (23). A visszaélés kábítószerei, beleértve a kokainot is, az impulzivitás növekedését is kiválthatják, ami feltételezhető a függőség kialakulásának ösztönzésére (24). Figyelembe véve azt a kulcsszerepet, hogy a coreleased orexin és a dynorphin az ICH tesztben az LH stimuláció előnyös hatására gyakorolt ​​érzékenységet szabályozza, feltételeztük, hogy a két neuropeptid közötti kölcsönhatások befolyásolhatják a kiindulási impulzivitást és a kokain által kiváltott hiányt. Az impulzivitást rágcsálókban számszerűsíteni lehet az 5-választás soros reakcióidő előtti idő előtti válaszainak mérésével (5-CSRTT).25) egy olyan állatmodell, amely analóg a folyamatos teljesítményvizsgálattal, amelyet az emberek figyelmének vizsgálatára alkalmaznak. Ebben a vizsgálatban a korai válaszok általában alacsonyak a normál körülmények között, és súlyosbodnak a DA transzmissziót növelő gyógyszerek (26). Az 5-CSRTT-t használtuk az orexin-dynorphin rendszer spontán és kokain által kiváltott impulzív viselkedéshez való hozzájárulásának vizsgálatára. Önmagában beadva az SB334867 tovább csökkentette a spontán korai válaszok már alacsony számát (Ábra 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Ezek a csökkentések a válasz pontosságára gyakorolt ​​hatások hiányában következtek be (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), pellet visszakeresési késleltetése (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), vagy az elvégzett stimulációs kísérletek száma (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), ami azt jelzi, hogy nem a romlott éberség vagy a motoros képességek miatt következett be. A norBNI adminisztrációja azonban megfordította az SB334867 hatásait a korai válaszadásra (Ábra 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), ami azt sugallja, hogy a nem-dinamikus transzmisszió döntő fontosságú ezen antiimpulzív hatások közvetítésében. Az önmagában vagy az SB334867-szel kombinálva a norBNI nem gyakorolt ​​hatást a válasz pontosságának mérésére (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), késés (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), vagy a befejezett ingerkísérletek száma (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Az SB334867 előkezelése megakadályozta a kokain által kiváltott idő előtti válasz kétszeres növekedését is (Ábra 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Ezek az adatok bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy az orexin neurotranszmisszió képes szabályozni az impulzív viselkedést mind a kiindulási, mind a kokainnal stimulált körülmények között, dinamorfin-érzékeny módon.

 

Fig. 3.

Az orexin és a dynorphin egyensúlyával szabályozott impulzív viselkedés. (A) Az SB334867 gyengíti a motoros impulzivitás 5-CSRTT patkány modelljének korai válaszát. A pontosság, a késleltetés mértéke az élelmiszerpellet visszanyerésére, valamint a kihagyott kísérletek száma ...

A Dynorphin mediálja az OX-ben a redukált kokain önadagolását₁R-Null egerek.

A függőséggel szembeni sérülékenység jelentősen megnő az impulzív egyéneknél, és a kokain által kiváltott impulzív növekedés feltételezhető, hogy hozzájárulnak a függőség kialakulásához (23, 27). Ezen túlmenően az orexin-átvitel és a dinamorfin-transzmisszió független volt a kokain és más visszaélésszerű gyógyszerek jutalmazó hatásainak szabályozásában.28-32). Feltételeztük, hogy az orexin és a dinorfin átvitel közötti kölcsönhatások közvetlenül szabályozhatják a gyógyszer bevételét. Ennek a lehetőségnek a feltárása érdekében az iv kokain önadagolását OX-t nem tartalmazó genetikailag módosított egerekben vizsgáltuk₁Rs (OX₁R^{- / -}). Ennek a genotípusnak az egereken jelentősen alacsonyabb a kokain önadagolása széles tartományban (0.1 – 1 mg / kg infúzióonként), de változatlan választ mutatnak az élelmiszer-jutalmakra ugyanazon megerősítési ütemterv szerint (33), ami arra utal, hogy a kokain-csökkentés nem másodlagos a viselkedési teljesítmény hiányához. Sőt, OX₁R^{- / -} az egerek normális kokain-önadagolási arányt mutatnak a kokainhozzáférés körülbelül három kezdeti ülésén, de aztán gyorsan mutatják a kokain-bevitel csökkenését (33). Megerősítettük ezt a fenotípust egy 0.3 mg / kg dózisban infúzióban, ami azt jelzi, hogy az OX-en keresztül történő jelátvitel történik₁Az R-ek kritikus szerepet játszanak a kokain önadagolásának kialakításában és fenntartásában [Ábra 4; kétirányú ismétlődő mérések ANOVA, genotípus (az alanyok közötti tényező között) × gyógykezelés (a tantárgyakon belül): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Ahogy az norBNI-vel végzett előkezelés helyreállította a normál ICSS-t és az impulzív viselkedést az SB334867-es egerekben, részben helyreállította a kokain önadagolását is₁R^{- / -} egerek, amelyek egy egyedülálló példát mutatnak be, amelyben a genetikai abláció által egy neurotranszmitter rendszer működésében keletkező viselkedési hiányt egy másik blokád megmenti. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az OX-ben₁R^{- / -} egerek, a dinorfin nem kívánt hatásai gyengítik a kokain jutalmazó tulajdonságait, és ezáltal csökkentik a gyógyszer önadagolását. Érdekes, hogy az OX-ben₁R^{+ / +} (kontroll) egerek, a norBNI váratlanul csökkentette a kokain önadagolását. Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy a nonorexin neuronok által kibocsátott dinamorfin, mint például az úgynevezett „közvetlen” striatonigrális közepes tüskés neuronok, ellentétes hatással van a kokain-bevitelre, és valójában megkönnyítheti a kokain jutalmazó hatásait. A kokain-jutalmakban ellentétes szerepet játszó két KOR-populáció megléte azt is megmagyarázza, hogy a norBNI csak részben változtatta meg az OX-ben kimutatott kokainfogyasztási viselkedés hiányát.₁R KO egerek. Alternatív megoldásként, a KOR antagonizmus csökkenti a kokain visszavonását (34), amelyek hozzájárulnak a kábítószer-beviteli mintákhoz (17). Függetlenül attól, hogy ezek az adatok arra utalnak, hogy a dinamorfin depresszív hatásai az intenzív orexin jelzés hiányában uralkodnak, ami csökkenti a kokain jutalmazó hatását, míg az orexin hatásai megkönnyítik a kokain jutalmazó hatását, és meghosszabbítják a kokain hatását. dinamorfin jelátvitel.

 

Fig. 4.

Csökkentett kokain önadagolás OX-ben₁Az R KO egereket helyreállítja a KOR blokád. Az orexin jelátviteli zavarás az OX-en₁E receptor genetikai deléciójával végzett R csökkenti a kokain iv önadagolását (0.3 mg / kg infúzióban). Ez a hiány részben ...

Az oxxin és a Dynorphin kiegyensúlyozott ellentétes hatást fejthet ki a VTA DA neuronok izgathatóságára.

Az agyi struktúrák, amelyek a hypothalamic orexin és a dynorphin neuronokból származó bemeneteket kapják, potenciálisan mindkét peptidnek vannak kitéve, és így az ellenálló hatásuk van a neuronális ingerlékenységre (35, 36). Az, hogy az egyik peptid hatásai mennyire érvényesülnek a másikkal szemben, valószínűleg számos tényezőtől függ, beleértve az egyes peptidek relatív abundanciáját, az extracelluláris térben való élettartamot és a receptorok expresszióját a cél neuronok különböző populációiban, valamint az interakciók között. a receptorok és intracelluláris jelátviteli mechanizmusaik a posztszinaptikus sejtekben. Az impulzivitást és a kokain jutalmat legalább részben a DA neuronok szabályozzák a VTA-ban (26), a hypothalamic orexin tartalmú sejtek kiemelkedő célpontja (37). Továbbá az orexin infúziója a VTA-ba fokozza a kábítószer-keresést (6). Az egyes peptidek VTA neuronok aktivitására gyakorolt ​​relatív hozzájárulásának felméréséhez elektrofiziológiai felvételeket végeztünk DA-sejtekből C57BL / 6 egér agyi szeletekben, amelyek orexin és dynorphin hatásának vannak kitéve egyedileg vagy együtt. Amint az várható volt, külön-külön alkalmazva az orexin egyenletesen ingerlő volt, míg a dinamorfin csak gátló hatást fejtett ki (Ábra 5 A és a B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). A rögzített DA neuronok populációjában a leginkább mindkét peptid telítő koncentrációjára reagált, bár egy kis kisebbség szelektíven reagált csak az orexinre vagy a dinamorfinra (Ábra 5B). Figyelemre méltó, hogy mindkét peptidet alkalmazzuk a kettős reagálású neuronokra (n = 10), nem volt nettó hatásaÁbra 5A), ami azt sugallja, hogy az egyes peptidek telített koncentrációjú ellentétes hatásai a corelease hatására hatékonyan kiiktatják egymást. A 10 neuron közül négynél az orexin jelenléte ellenére előnyös gátlás mutatkozott a dynorphinnál, míg az egyik sejtet az orexin előnyösen izgatta (> 1.5-szeres változás) a dynorphin jelenléte ellenéreÁbra 5 A és a C). Összességében, bár több sejt reagált az orexinre, mint a dynorphin, mindkét peptidre reagáló sejtek nem mutattak nettó változást az égési sebességben, amikor orexint és dinamorfint alkalmaztak, ami arra utal, hogy az egyes peptidek ellentétes hatásai kiegyensúlyozottak voltak a VTA DA-ban. tanulmányozott neuronok.

 

Fig. 5.

Az oxxin és a dinamorfin kiegyensúlyozott, de ellentétes hatást gyakorol a VTA DA neuronokra. (A, Bal) Az egymáshoz illesztett orexin és dinamorfin nem eredményez nettó változást a VTA DA neuronok tüzelési sebességében (n = 10). Egyedül alkalmazva a dinamorfin gátló volt és az orexin ingerlő volt. ...

Az orexin és a dynorphinre érzékeny VTA DA neuronok közötti lehetséges orexin – dynorfin kölcsönhatások további tisztázása érdekében megpróbáltuk alternatív módon megnövelni a fürdő által alkalmazott dinamorfin gátló hatását az SB334867 kezeléssel (S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01), vagy a fürdőben alkalmazott orexin gerjesztő hatásának fokozására norBNI-kezeléssel (S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). Mindkét kísérletben OX₁Az R és KOR blokád nem eredményezte ezeket a hatásokat, ami arra utal, hogy az SB334867 és a norBNI nem gyakorol hatást nemspecifikus hatásokon keresztül. Ennél is fontosabb, hogy ezek az adatok arra utalnak, hogy az egyes peptidek in vitro tónusa nem elegendő ahhoz, hogy kis molekulájú antagonisták, például az SB334867 és a norBNI alkalmazásával befolyásolják. Ez a megállapítás összhangban van a korábbi munkával, ami arra utal, hogy a nagy, peptidtartalmú vezikulák exocitózisa jellemzően csak nagy tartós tüzelési frekvenciáknál fordul elő, amelyek általában nem szerepelnek a szeletkészítményekben (38).

Annak ellenőrzésére, hogy a norBNI nem befolyásolta-e a viselkedést az „off-target” műveletekkel közvetlenül az OX-en₁Rs, ezt követően megvizsgáltuk az antagonista hatásait az OX-re₁R jelzés. Konkrétan egy fluorometrikus képalkotó lemezolvasó (FLIPR) vizsgálatot alkalmaztunk, hogy meghatározzuk a fürdőben alkalmazott orexin A, SB334867 vagy norBNI azon képességét, hogy intracelluláris kalcium tranzienseket indukáljanak a humán OX-t expresszáló tenyésztett CHO-sejtekben.₁Rs. Bár az orexin A az intracelluláris kalcium (EC₅₀ = 0.01 μM) és az SB334867 dózisfüggően enyhítette ezt a hatást (EC₅₀ = 0.035 μM), a norBNI nem eredményezett semmilyen hatást sem az alapvonalra, sem az orexin A által kiváltott intracelluláris kalcium növekedésére. Ez arra utal, hogy a norBNI hatása a VTA DA neuronális fiziológiára kizárólag a javasolt KOR jelátviteli mechanizmusokon keresztül történik, és a hatóanyagnak nincs közvetlen hatása az OX-en.₁R (39) (S3 A-C).

Orexin – Dynorphin kölcsönhatások a VTA szabályozó kokain önigazgatásában.

Elektrofiziológiai vizsgálataink azt mutatják, hogy az orexin és a dynorphin közötti dinamikus kölcsönhatások szabályozzák a VTA DA aktivitást, és hogy a VTA neuronok valószínűleg kulcsfontosságú szubsztrátként szolgálnak az orexin-dynorfin rendszer hatásainak motivált viselkedésére. A hipotézis közvetlenül teszteléséhez megvizsgáltuk az SB334867 intravénás intravénás infúziójának hatását iv. Kokain önadagolásra patkányokban. A VTA intra-VTA-infúzióval összehasonlítva a VTA SB334867-ben a kokainbevitel jelentős csökkenését okozza, amelyet a norBNI blokkolt.Ábra 6; egyirányú ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), ami azt sugallja, hogy ezen az agyterületen belüli, egymással szemben nem álló dinamorfin-hatások gyengítik a kokain jutalmat. Ezek az eredmények látszólag eltérnek azoktól, amelyek bebizonyították az intra VTA SB334867 hiányát a kokain önadagolásában alacsony erőkifejtésű, fix arányú 1 (FR1) erősítési ütemtervekben (40). Számos jelentés azonban kimutatta, hogy a feladat megnövekedése esetén az SB334867 hatékonyabb a kábítószer-fogyasztás csökkentésében (2, 33). Mivel ebben a kísérletben a patkányok nagyobb erőfeszítést hajtottak végre FR5 ütemezéssel, a jelen eredmények összhangban vannak az irodalommal. Ezek az adatok közvetlen bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy az orexin és a dynorphin ellentétes jellege a VTA DA neuronális fiziológiában jelentős hatást gyakorolhat a jutalom-vezérelt viselkedésre.

 

Fig. 6.

A VTA-ban az ortoxin-dinamorf kölcsönhatások közvetítik a kábítószer-bevételt. A kokain önadagolását a VTA SB334867 intravénásan csökkenti (3 μg / oldal), míg ezt a hatást megfordítják a norBNI-vel (10 mg / kg, ip) végzett előkezeléssel.n = 9). ***P < ...

Animals.

Az EM kísérletekben használt felnőtt hím C57BL / 6J egereket (8 wk; Jackson Laboratory) csoportosítottuk (három-öt ketrecenként); az ICSS-hez használt műtéteket a műtétet követően egyedileg helyeztük el. Felnőtt hím (350 g) Sprague – Dawley patkányokat (Charles River Laboratories) alkalmaztak az 5-CSRTT és a kokain önadagolási kísérleteiben, és négy csoportba sorolták. Az elektrofiziológiai kísérletekhez használt felnőtt hím C57BL / 6J egereket (postnatalis 19 – 21) csoportosítottuk (három-öt ketrecenként). Az OX1^{- / -} egerek és az OX1^{+ / +} Az önadagolási vizsgálatokhoz használt almattársak (6 wk) a Jackson Laboratory-tól szereztek be, és több mint hét generáción át a C57BL / 6 egerekbe kerültek. Ezeket az egereket csoportosítottuk (két ketrecenként). Valamennyi állatot hőmérséklet-szabályozott körülmények között tartottunk 12-h fény / sötét cikluson, és a viselkedési teszteket 4 – 5 h-ben végeztük a fényciklusban; az élelmiszer és a víz ad libitum adható, hacsak másként nem jelezzük. Az eljárásokat a Nemzeti Egészségügyi Intézetekkel összhangban hajtották végre Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához (50) és a McLean Kórház intézményi állat-egészségügyi és használati bizottságai, a British Columbia Egyetem és a Scripps Florida jóváhagyta.

Immunhisztokémia és mikroszkópia.

Az orexin A vagy prodynorphin fluoreszcenciáját és ezüst-fokozott arany-jelölését az előzőekben ismertetett eljárások szerint hajtottuk végre alternatív egér agyszakaszokon.51), és a szabványos EM protokollok alapján dolgozták fel. Az immunjelölt szövetek nem átfedő régióit ezután véletlenszerűen választottuk ki és fényképeztük a részecskék mennyiségi meghatározására ImageJ szoftverrel (National Health Institute of Health) (SI anyagok és módszerek, immunhisztokémia és mikroszkópia).

Elektrofiziológiai.

A patch pipettákat (3 – 5 MΩ) 143 mM kálium-glükonát, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (7.2 pH-val) és 270-280 mM mOsmol-mal töltjük. Az adatokat 20 kHz-en szereztük meg és 2 kHz-en szűrtük a pClamp 10.0 szoftverrel (Molecular Devices). A teljes sejtkonfiguráció megszerzése után a sejteket feszültség-szorítással rögzítettük -70 mV-ra, és egy sor feszültségfokozatot (250 ms -tól -60 mV-ig 130-mV lépésekben) alkalmaztunk a hiperpolarizáció kimutatására (I_h) áramok. I_h a feszültséglépés alkalmazásakor az ∼30 ms és az 248 ms közötti áram változásaként határoztuk meg. A VTA DA neuronok belső aktivitását áram-szorító módban mértük. A kísérletek akkor kezdődtek, amikor stabil alapvonalú égési sebességet értek el; A szubsztrátokat ezután 5 percre felvittük, majd mesterséges cerebrospinális folyadékkal kiöblítettük. Az adatok elemzéséhez minden 3-min szegmens utolsó 5 percét használtuk. A Dynorph A-t (1-17; 200 nM) és az orexin A-t (100 nM) az amerikai peptidből nyertük és desztillált vízben oldottuk. Ezek a koncentrációk korábban kimutatták, hogy telítő hatást gyakorolnak a VTA sejtaktivitásra (5, 52). A tiorphánt (1 μM) és a Bestatin-t (10 μM) a Sigma-Aldrich-től, desztillált vízben oldottuk, és az A-vel együtt (SI anyagok és módszerek, elektrofiziológia).

FLIPR vizsgálat.

OX₁Az R-aktivitást az intracelluláris kalcium-szintek FLIPR-vizsgálattal történő mérésével határoztuk meg.53) (SI anyagok és módszerek, fluorometrikus képalkotó lemezolvasó vizsgálat).

ICS-ek.

Az egereket monopoláris stimuláló elektródákkal vagy kanülekkel (PlasticsOne) implantáltuk ketamin / xilazin (80 és 10 mg / kg, illetve ip; Sigma) alatt, sztereotaktikusan irányítva az LH-hoz (18) és / vagy ellentétes VTA [a bregma: anteroposterior (AP), -3.2 mm; mediolaterális (ML), −0.5 mm; dorsoventral (DV), −4.7 mm a dura-tól]. 7-d helyreállítási periódus után az egereket úgy képezték, hogy válaszoljanak az agyi stimulációra, amint azt korábban leírtuk (18). A legalacsonyabb frekvenciát, amely támogatta a válaszolást (küszöbértéket), a legkisebb négyzetek legjobban illeszkedő elemzésével számítottuk ki. Amikor az egerek teljesítették az ICSS küszöbök stabilitási kritériumait (± 10% 5 egymást követő napokon), a gyógyszeres kezelések hatásait mértük. SB334867-ot (Scripps Florida) vagy DMSO-vivőanyagot adtunk alternatív napokon Hamilton fecskendővel (0.1 ml / kg ip), és a küszöbértékeket azonnal meghatároztuk 15-min tesztfolyamatokban. A norBNI-t (10 mg / kg ip; Sigma) sóoldatban (10 ml / kg) adtuk be 48 h előtt az ICSS vizsgálat megkezdése előtt.

Az 5-CSRTT.

A patkányok táplálékra korlátozottak voltak (a szabad táplálék tömegének 85% -áig), és számítógéppel vezérelt, szellőztetett, hangcsillapító szekrényekben (Med Associates) és 5-CSRTT eljárásokban végzett, számítógéppel vezérelt operációs kamrákban képzettek.25). SB334867-ot (DMSO-ban, 0.1 ml / kg-ban) és / vagy kokainban (sóoldatban, 1 ml / kg; Sigma) ip-injekcióval adtunk be 10 perccel a vizsgálat előtt, mint más kísérletekben, és a norBNI-t legalább 48 h-ig adtuk be a kezelés előtt. a vizsgálat kezdete (SI anyagok és módszerek, A 5-Választás soros reakcióidő feladata).

IV Kokain önigazgatás.

A patkányokat és az egereket izoflurán (1-3% térfogat / térfogat) oxigéngőz keverékkel érzéstelenítettük, és sebészeti úton készítettük a szilasztikus (VWR Scientific) katéterekkel a jugularis vénában a megállapított eljárások szerint (54). A patkányokban a katéter beültetését követően azonnal kétoldali rozsdamentes acél vezető kanült (23 szelvény, 17 mm hosszú) ültettek be a VTA-ba (bregmából: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, −7.5 mm a durától ). Az SB334867 vagy norBNI vizsgálatot 60 perces napi munkamenetek során a stabil kokainbevitel elérése után végeztük (20 egymást követő napon a válaszreakció <3% variáció; SI anyagok és módszerek, IV kokain önigazgatás).

Statisztika.

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Az ICSS kísérletekhez kétirányú ismétlődő ANOVA mérést alkalmaztunk az SB334867-kezelt és norBNI + SB334867-kezeléssel kezelt állapotok összehasonlítására. Az egyirányú ismétlődő méréseket ANOVA-val Newman – Keuls post hoc tesztekkel alkalmaztuk az eszközök összehasonlítására az SB334867 és a norBNI + SB334867 feltételek között. Az 5CSRTT minden kísérletében az eszközök összehasonlítására egyirányú ismétlődő méréseket is végeztünk ANOVA és Newman – Keuls tesztekkel. Kétirányú ismétlődő méréseket alkalmaztunk az ANOVA-val a kezelt csoportok közötti összehasonlításra a kokain önadagolási kísérleteiben OX-sel₁R KO egerek. Az egyirányú ismétlődő méréseket ANOVA és Newman – Keuls tesztek segítségével hasonlítottuk össze az orexin és a dynorphin átlagos válaszai VTA DA neuronokkal. Az egyirányú ismétlődő méréseket ANOVA és Newman – Keuls teszteket is alkalmazták a kokain bevitelének összehasonlítására az SB334867 és a norBNI-vel kezelt patkányokban. A különbségeket jelentősnek tekintették, ha P <0.05.

Köszönjük Dr. Garrett Fitzmaurice-nak a kézirat és a Miranda S. Gallo és a Melissa Chen számára nyújtott hasznos információkért az adatgyűjtéshez nyújtott segítséget. Ezt a munkát az F32-DA026250 és a K99-DA031767 (a JWM-hez), az F32-DA024932 és a K99-DA031222 (JAH-hoz), az R01-DA023915 (a PJK-hoz) és az R01-MH063266 (a WAC-hoz) és az RXNUMX-MHXNUMX támogatta. ) és a Természettudományi és Mérnöki Kutatási Tanács felfedezési támogatását (az SLB-nek).

Összeférhetetlenségi nyilatkozat: A WAC rendelkezik egy szabadalommal (US 6,528,518; Assignee: McLean Kórház) kappa-opioid antagonisták depressziós rendellenességek kezelésére történő alkalmazásával kapcsolatban. Az összes többi szerző nem hirdet versenytárs pénzügyi érdekeket.

Ez a cikk egy PNAS közvetlen benyújtása.

Lásd a megjegyzést az oldalon 5765.

Ez a cikk online információkat tartalmaz www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.