PMCID- ը ` PMC2820240- ը
NIHMSID- ը NIHMS174679
Վերացական
Կոկինային ներածված փոփոխությունները գենի արտահայտության մեջ առաջացնում են նեյրոնային մորֆոլոգիայի եւ վարքի փոփոխություններ, որոնք կարող են հիմնվել կոկաինի կախվածության վրա: Մենք որոշեցինք կարեւոր դերակատարություն ունենալ histone 3 lysine 9 (H3K9) dimethylation- ի եւ լճին dimethyltransferase G9a- ի համար, կոկաինով պայմանավորված կառուցվածքային եւ վարքային պլաստիկության մեջ: Կրկնական կոկաինի կիրառումը կրճատվել է H3X9 dimethylation- ի գլոբալ մակարդակները միջուկային հեծանիվների մեջ: Տնրա կրճատումը հիստոնալ մեթիլացման միջոցով միջամտեց այս գլխուղեղի շրջանում G9a- ի ռեպրեսիաների միջոցով, որը կարգավորվել է կոկաինը ենթադրվող transcriptional factor ΔFosB- ի կողմից: Օգտագործելով պայմանական mutagenesis եւ վիրուսային միջնորդավորված գեների փոխանցում, մենք հայտնաբերեցինք, որ G9a իջեցումը մեծացնում է կորիզի հոդի նեյրոնների դենդրիկ ողնաշարի պլաստիկությունը եւ կոկաինի ավելացման նախապատվությունը, դրանով իսկ կարեւոր դեր է խաղում կոկաինի երկարատեւ գործողությունների ժամանակ հիստոնալ մեթիլացման համար:
ներածություն
Կրկնակի կոկաինը ենթարկվում է գենի արտահայտման համառ փոփոխությունների եւ նեյրոնային մորֆոլոգիայի փոփոխության հետեւանքով, որը ուղեղի մրցակցային սխեմաների հիմնական բաղադրիչն է (Nc):1-2). Chromatin- ի վերամշակումը կարեւոր է այս ուղեղի տարածաշրջանում անբավարար transcriptional փոփոխությունների համար, որոնք կարող են հիմք հանդիսանալ կոկաինի կախվածության (3-9): ՔԿԱԳ-ի քրոմատին կառուցվածքի կոկաինի կարգավորումը, մասնակիորեն, քրոմատինային enzymatic մեքենաների կոկաինի ներածված փոփոխությունների ուղղությամբ, հանգեցնելով histone acetylation եւ fosforilization (4, 7-9); սակայն, դեռեւս ուսումնասիրված չեն հիստոնի մետիլման վերահսկող ֆերմենտների դերը:
Վերջերս գենոմի լայնածավալ գիտնականների վերլուծությունը, օգտագործելով chromatin immunoprecipitation, միկրոավտոբուսներով (ChIP-Chip) հայտնաբերել է կրկնակի կոկաինի բուժումից հետո NAc- ի կոնկրետ գենային խթանողներին H3 լիզին 9 (H3K9) եւ 27 (H3K27) մեթիլացիայի փոփոխված ձեւերը6): Այսպիսով, մենք բազմաթիվ լիզինային մեթիլտերֆերազների (KMTs) եւ դեմետիլազների (KDMs) պրոֆիլակտիկ նյութեր ենք ստեղծել, որոնք հայտնի են H3X9 կամ H3K27 մեթիլացմանՆկար 1A). Միայն երկու ֆերմենտներ, G9a եւ GLP, ցուցադրեցին անփոխարինելի transcriptional regulation 24 ժամ կոկաինի կառավարման կրկնօրինակից հետո, երբ երկու գեների արտահայտությունը զգալիորեն նվազեցվեց. Քանի որ G9a եւ GLP հատկապես կատալիզացնում են H3K9 (H3K9me2) dimethylation- ը, կոկաինի կողմից դրանց նվազեցումը համահունչ է այս ժամանակահատվածում դիտվող euxromatic H3K9me2- ի համաշխարհային մակարդակի նվազեցմանը:Նկարը `1B): Ի տարբերություն հեթխրոմատիկ H3K27 մեթիլացման գլոբալ մակարդակները, մնացորդը մնացել է անփոփոխ `կոկայի կրկնակի ազդեցությանՆկարը S1- ը աջակցում է առցանց նյութին): Շնորհիվ դրա բարձր մակարդակի կատալիտիկ ակտիվության vitro և ի Վիվո (10), մենք սկսեցինք հետաքննել հետագայում G9a- ի ռեպրեսիաների ֆունկցիոնալ նշանակությունը հետագայում կրկնելով կոկայի կրկնակի ազդեցությունը: G9a սպիտակուցի մակարդակները, ինչպես իր mRNA մակարդակները, զգալիորեն նվազել են 24 ժամ կոկաինի կրկնօրինակումից հետո (Նկարը S2): Չնայած G9a mRNA արտահայտությունը կրճատվել է 35% -ի կողմից, իմունոհիստոքիմիական անալիզը բացահայտեց ավելի համեստ 15% իջեցումը G9a սպիտակուցի մակարդակներում, որը համապատասխանում է H21X3me9- ի դիտարկված 2% նվազումից հետո կոկաինի կրկնակի կառավարման (Նկարը `1B): G9a mRNA արտահայտությունը նույնպես նվազեցվեց այս ուղեղի տարածաշրջանում 20% -ից հետո, կոկաինի ինքնակարգավորումըՆկարը S3).
Որոշել, թե արդյոք Euchromatic H3K9me2- ի փոփոխությունները փոխկապակցված են NAc- ի գենի արտահայտման գենոմային փոփոխությունների հետ, մենք օգտագործում էինք միկրոավտոբուսային վերլուծություններ, գենետիկական արտահայտությունների պրոֆիլների ուսումնասիրման համար, որոնք առաջացրել են կոկաինի մարտահրավեր դոզան `կենդանիների հետագա կոկաինի ազդեցության պատմության հետ կամ առանց դրա (տես հավելյալ գենային ցուցակները Սեղաններ S1-S3): Կենդանիները, որոնք ստացել են կրկնակի կոկաին, ցուցադրվել են կտրուկ աճող գենային արտահայտություն 1 ժամ կոկաինը մարտահրավերից հետո `կտրուկ բուժվող կենդանիների համեմատ (Նկար 1C): Այս աճող գենային արտահայտությունը դեռեւս տեղի է ունեցել կոկաինի մարտահրավերների արձագանքում, որը տրվել է 1 շաբաթից կրկնական կոկաինի դուրսբերման ժամանակ: Նախորդ հաշվետվություններին համահունչ, գենի փոքր տոկոսը (~ 10%) ցուցադրեց անչափ տարրական ընդունված արձագանքները, որոնք հաջորդում էին կոկաինի կրկնօրինակըՆկար 1CԲ) տեսնել Աղյուսակ S1) (5): Անմիջականորեն ուսումնասիրելու G9a- ի դեգրադացիայի դերը ուժեղացված գենային արտահայտման մեջ, որը նկատվում է կրկնակի կոկաինի հետո, մկները ստացել են GFP- ի կամ G9a- ի պարունակող Herpes simplex վիրուսի (HSV) վեկտորների ներգրավված NAC ներարկումներ եւ պարզել, թե արդյոք G9a overexpression բավարար էր արգելափակել գեների արտահայտման կրկնակի կոկաինը-իջեցված ընդլայնումը: Մի շարք 12- ի պատահականորեն ընտրված գեների շարքում, որոնք արտահայտում էին արտահայտված բարձր մակարդակները հաջորդ քառակի կոկաինը, մենք նկատեցինք, որ G9a զգալիորեն նվազեցրել է այս գեների 50%Աղյուսակ S4).
Որպեսզի հայտնաբերենք վերգետնյա transcriptional events- ը, որոնք հանդես են գալիս G9a- ի կրկնակի կոկաինի դրսեւորման ռեպրեսիաների միջամտության համար, մենք ուսումնասիրեցինք հնարավոր դերը ΔFosB- ի համար, որն անմիջական վաղ գենի բարձր կայուն շերտով արտադրանք է: fosB. ΔFosB կուտակվում է NAc- ում կոկաինի կրկնվող ազդեցությունից հետո, երբ այն կապված է կոկաինի բարձրացման հետ (11): ΔFosB- ն կարող է հանդես գալ որպես transcriptional activator կամ repressor, կախված թիրախ գենը (3, 5, 6, 12): Օգտագործելով bitransgenic NSE-ՏՏԱ × tetOP-ΔFosB մկները, որտեղ ΔFosB արտահայտությունը կարող է ընտրովիորեն ազդել չափահաս կենդանիների NAc եւ dorsal striatum (13), մենք ուսումնասիրեցինք ΔFosB արտահայտության ազդեցությունը NAX- ում H3K9me2- ի եւ KMT- ի կոկաինի կարգավորման վերաբերյալ: ΔFosB overexpression- ը բավարար էր H3K9me2- ի (Նկար 1D) եւ G9a արտահայտությունը (Նկարը, 1E), դրանով իսկ համադրելով կրկնակի կոկաինի հետեւանքները: Ի հակադրություն, ΔFosB- ը չի նվազեցրել այս ուղեղի շրջանում GLP- ի արտահայտությունը եւ ոչ մի ազդեցություն չի ունեցել SUV39HNNUMX- ի եւ EZH1- ի վրա, H2K3- ի եւ H9K3- ի հիմնական trimethylating enzymes- ները (համապատասխանաբար,Նկարը S4): Տվյալները հաստատելու համար օգտագործելով անկախ ΔFosB overexpression համակարգը, վայրի չափահաս չափահաս մկները ստացան GFP- ի կամ ΔFosB- ին արտահայտող Adeno- ի հետ կապված վիրուսի (AAV) երկկողմ ներարկային ներարկումներ: ΔFosB- ի վիրուսով միջնորդավորված գերբեռնումն այս ուղեղի շրջանում նվազեցրեց G9a արտահայտության մակարդակըՆկարը, 1E).
G9a- ի այսպիսի հստակ եւ կոնկրետ կարգավորումը մեզ հուշում էր, թե արդյոք փոխել G9a արտահայտությունը, մասնավորապես NAc neurons- ում, կարգավորում է կոկաինը վարքագծային արձագանքները: Wildtype մկները ստացան HSF վեկտորների ներարկումներ, որոնք արտահայտում են GFP կամ G9a եւ այնուհետեւ վերլուծվում են անօրինական կոկաինի պայմանավորված վայրի նախապատվության պարադիգմը, որն ապահովում է դեղերի պարգեւի անուղղակի չափը: NAX նեյրոնների G9a- ի վիրուսային գերբարձր հերոինքսպրեսիան հաստատվել է վարքագծային փորձարկումից հետո (Նկար 2A): G9a overexpression զգալիորեն նվազել է կոկաինի նախապատվությունը, համեմատած GFP- ին (Նկարը `2B), եւ աճել է H3K9me2 մակարդակները NAc (Նկար 2C): G9a- ի (G9aH1093K) կատալիտիկորեն մահացած մուտանտի գերբարձրացում (14) չի ազդել կոկաինի նախապատվության վրա (Նկարը `2B) եւ ոչ մի ազդեցություն չեն ունեցել այս ուղեղի շրջանում H3K9me2 մակարդակների վրա (Նկար 2C).
Հետագա ուսումնասիրել G9a- ի դերը կոկաինի վարքային ազդեցությունների մեջ եւ ավելի կոնկրետ կերպով նմանակել NAX- ի G9a- ի կրկնակի կոկաինի դրսեւորման ռեպրեսիան, մեծահասակ G9afl / fl մկներ (14) ստացել են AAV վեկտորների ներգրավված NAC ներարկումներ, որոնք արտահայտում են Cre recombinase կամ GFP որպես հսկողություն: AAV-Cre- ի NX- ում G9- ի նոկաուտը, որը հաստատվել է իմունոհիստոքսիմիական (Նկարը S5), զգալիորեն մեծացրել է կոկաինի ազդեցությունը տեղակայման փորձարկումների վրա եւ նվազեցրեց H3K9me2 մակարդակը NAc- ում (Նկարը, 2D, E): G9a- ի եւ GLP- ի, BIX01294- ի առեւտրային հասանելի դեղաբանական ինդիկատոր15-16), օգտագործվել է պարզելու, թե արդյոք ֆերմենտի արգելքը նույն կերպ ազդում է կոկաինի վարքային արձագանքների վրա: Իրոք, G9a- ի եւ GLP- ի դեղագործական արգելումը զգալիորեն ավելացել է կոկաինի նախապատվությունը եւ նվազեցնել H3K9me2- ը NAc- ում (Գծապատկեր 2F, Գ).
Կոկաինի կրկնակի կառավարումը մեծացնում է դենդրիտիկ հոդերի խտությունը, NAc միջին ցողունային նեյրոնների վրա (17), այս նեյրոնների վրա հոսող գլուտամերեգիկ synapses- ներում ֆունկցիոնալ փոփոխությունների հետ կապված գործընթաց18-19) եւ զգայուն վարքային արձագանքները դեղին17, 20). Այսպիսով, մենք գուշակեցինք, որ NAX- ում G9a- ի գործունեության նվազեցումը կրկնակի կոկաինի կողմից կարող է միջնորդել կոկաինի կարողությունը կարգավորելու NAc նեյրոնների դենդրիկ ողնաշարի խտությունը: Օգտագործելով chromatin immunoprecipitation (ChIP) հակահայկական G9a հակամարմինը, մենք հայտնաբերեցինք մի քանի վտանգավոր G9a գենային թիրախներ, որոնցից յուրաքանչյուրը նախկինում ներգրավվել է կոկաինի միջոցով դենդրիտիկական պլաստիկության մեջ (Նկար 3A) (20-26): Մենք հայտնաբերեցինք, որ կոկաինի կրկնվող կրճատումը զգալիորեն նվազել է G9a- ի, ինչպես նաեւ H3K9me2- ի մակարդակները,Նկարը `3B): Ի հակադրություն, սուր կոկաինի վարչակազմը արագորեն հավաքեց G9a- ն այդ նույն գենային խթանման որոշներից, որոնք համապատասխանում էին G9a արտահայտությանը, որը նկատվել է NAc 1 ժամում կոկաինի սուր դոզանից հետոՆկարը S6): Չնայած G9a- ն կոնկրետ գենային խթանողներին պարտադիր պայմանավորված է արտահայտության փոփոխությունների հետ, այնուամենայնիվ մնում է անորոշ, թե արդյոք նման միջոցառումները միջնորդվում են NAX- ի փոփոխված գլոբալ մակարդակներով եւ / կամ G9a- ի տարբերություններով, ընդդեմ կրկնակի կոկաինը:
Հաշվի առնելով NX- ի բազմաթիվ պլաստիկության հետ կապված գեների վերաբերյալ G9- ի կանոնակարգումը, մենք ուղղակիորեն ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք այս քաղցկեղի բուժման արդյունքում G9a արտահայտության պահպանումը բավարար է կոկաինի ներածված dendritic ողնաշարի ձեւավորմանը: Օգտագործելով կոկաինի բուժման արձանագրությունը, նախապես ցուցադրվել է նպաստել dendritic ողնաշարի ներադրումը NAc- ում (20), մենք հետազոտեցինք ողնաշարի խտությունը կենդանիների HSV-GFP- ով կամ HSV-G9a- ով ներարկված: Նախորդ հետազոտությունների համաձայն, մենք նկատեցինք, որ կոկաինի բուժման արդյունքում NAc- ում դենդրիտային ողնաշարի խտության զգալի աճ է նկատվում, որը արգելափակվել է ամբողջությամբ G9a overexpression (Նկար 3C): Միայն G9a գերբնակեցումը բավարար չէր կոկաինի բացակայության դեպքում կրճատելու NAc dendritic ողնաշարի խտությունը: Այս տվյալները լրացնելու համար, G9afl / fl մկները ստացել են HSV-Cre- ի ներարկային NAC ներարկումներ եւ ողնաշարի խտությունը չափվել է եւ համեմատվել կոկաինի բացակայության դեպքում HSV-GFP- ով կենդանիների հետ: G9a- ի թակոցը զգալիորեն մեծացրել է ողնաշարի խտությունը, NAc- ի միջին ցողունային նեյրոնների վրա (Նկար 3C).
Հաշվի առնելով այն հանգամանքը, որ G9- ի NX- ում նվազեցված կոկաինը հետո միջնորդվում է ΔFosB- ի կողմից, ապա հաջորդում ենք, թե արդյոք այս transcription գործոնը նույնպես ներգրավված է NAc dendritic spines- ի կարգավորման մեջ. Չնայած ΔFosB- ն նախկինում չի կապվել նման dendritic plastisite- ի հետ, նրա մի քանի թիրախները, ներառյալ Cdk5- ը եւ NFKB- ի ենթաընկերությունները, (20-23), եւ ΔFosB- ի համառ արտահայտությունը NAc նեյրոնների հետ կապվում է աճող դենդրիկ ողնաշարի խտության հետ `կրկնակի կոկաինի բուժումից հետո (27): Նախ `մենք հայտնաբերեցինք, որ ΔFosB- ի ինդուկցիան կրկնակի փոխանցման մկների մեջ կոկաինի բացակայության պայմաններում է, որը նվազեցրեց G9a եւ H3K9me2 արտահայտությունը (Նկարը, 1D, E), նվազեցված G9a- ի հետ կապված բազմաթիվ պլաստիկության հետ կապված գեներին, որոնցից շատերը նույնպես ցուցադրվել են ΔFosB- ի ուղղակի թիրախները (Նկար 3D) (3, 6). Մենք ցույց տվեցինք, որ ԱԱ-ում ΔFosB- ի վիրուսային գերբնակեցումը զգալիորեն բարձրացրել է բազալիկ պայմաններում դենդրիտիկ ողնաշարի խտությունը, նման է, որ նկատվում է կոկաինի կրկնվող հաջորդականացումից հետո (Նկարը, 3E). Հակառակ դեպքում, ΔJunD- ի NAc- ում գերակշռում է, որը բացասական բացասական մուտանտային սպիտակուց է, որը հակադրվում է ΔFosB transcriptional activity- ին, արգելափակում է կրկնական կոկաինի կարողությունը բարձրացնելու համար dcdrritic ողնաշարի ձեւավորմանը NAc- ում (Նկար 3C).
Մեր դիտարկումը, որ ΔFosB կարգավորում է G9a արտահայտությունը NAc- ում, եւ որ ΔFosB- ն եւ G9a- ն կարգավորում են նույն թիրախային գեների մի մասը, հանգեցրին մեզ ուսումնասիրելու ΔFosB- ի եւ G9a- ի այլ փոխազդեցություններ: Սուր կոկաինը հետո, երբ G9a մակարդակները ավելացան, G9a- ի պարտադիր կապակցությամբ fosB գենը ավելացել է, իսկ կրկնակի կոկաինը հետո, երբ G9a արտահայտությունը ճնշվել է, G9a- ն պարտադիր է fosB գենը նվազել է (Նկար 3A): Նման կրճատվել է G9a- ի միացումը, երբ կրկնակի կոկաինը չի դիտարկվում c-fos, որտեղ G9a կապումը ավելանում է կրկնակի կոկաինի (Նկարը S7): Սա համահունչ է այն փաստի հետ, որ ի տարբերություն fosB, c-fos ճնշված է, ոչ թե առաջացած, քրոնիկական հոգնածության ազդեցության հետեւանքով (5): ΔFosB ավելցուկային արտերկրպրեսիան բիթագործական մկների մեջ բավական էր զգալիորեն նվազեցնել G9a- ի կապը ֆոսբ գեն (Նկար 3D): Բացի այդ, G9a overexpression- ը բավարար էր կրճատել ΔFosB- ի արտահայտությունը `կրկնական կոկաինի կիրառմամբԱղյուսակ S4). Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ autoregulatory ցիկլը, որի միջոցով G9a- ը ի սկզբանե սահմանափակում է ΔFosB- ի սուր կոկաինը: Այնուամենայնիվ, ΔFosB- ն կուտակում է թմրամիջոցների կրկնակի ազդեցության ենթարկվածությունը, այն դանդաղեցնում է G9a եւ դրանով իսկ ամրացնում է իր հետագա ներդիրը:
Ի վերջո, մենք ցույց տվեցինք, որ ԱԱԱ-ում լիստոնի լիթիի մետիլացիան քննադատորեն ներգրավված է նեյրոնային գենը կարգավորելու համար `ի պատասխան կոկաինը: G9a- ի եւ H3K9me2- ի ռեպրեսիաները, որոնք հաջորդում են կոկաինի կրկնօրինակը, խթանում են կոկաինի նախապատվությունը, մասնակիորեն, բազմաթիվ գեների transcriptional ակտիվացման միջոցով, որը հայտնի է դենդրիտիկ պլաստիկության անբնական ձեւերի կարգավորմամբ: Այսպիսի մեխանիզմների միջոցով կարգավորվող գենների ավելի լավ հասկացողությունը կբարելավի թմրամոլության բարդ կենսաբանական հիմքի մասին մեր գիտելիքները եւ կարող է նպաստել կախվածության խանգարումների առավել արդյունավետ բուժմանը:
Նյութեր եւ մեթոդներ
Կենդանիներ եւ բուժում
Եթե այլ բան նշված չէ, մկները տեղադրվեցին չորս հինգից մեկ վանդակի մեջ, 12 ժամ լույսի / մութ ցիկլով (լույսերը 7- ից `00 AM- ից մինչեւ 7: 00 PM), մշտական ջերմաստիճանում (23 ° C) ad libitum ջրի եւ սննդի մատչելիությունը: Բոլոր կենդանական արձանագրությունները հաստատվել են IACUC- ի կողմից `UT Southwestern Medical Center- ում եւ Սինայիի Բժշկական դպրոցում:
Համար կոկաինը փորձերի [immunohistochemitry, արեւմտյան blotting, քանակական ՊՇՌ (qPCR), microarray վերլուծություն եւ քրոմատինի immunoprecipitation (Chip)], 8- է 10 շաբաթ-ամյա արական C57BL / 6J մկները օգտագործվում էին: Կենդանիները օրական ստացել են «saline» կամ «saline» (7 բուժում saline, ip), «սուր» կոկաին (6 բուժում saline + մեկ բուժում 20 մգ / կգ կոկաին-HCl, ip) կամ կրկնակի կոկաին (7 բուժում 20 մգ / կգ կոկաինը, HCl, ip): Մկները զոհաբերվեցին 1 ժամ կամ վերջնական բուժումից հետո 24 ժամ: Միկրոավտոբուսի ուսումնասիրությունների համար կենդանիները ամեն օր բուժվում էին կամ «աղի» (15 բուժում saline, ip), «սուր» կոկաինով (14 բուժում saline + 1 բուժում 20 մգ / կգ կոկաինը HCl, ip), կրկնակի + սուր կոկաին 7 բուժում saline + 8 բուժում 20 մգ / կգ կոկաինի-HCl, IP) կամ կրկնեց դուրսբերումը. սուր »կոկաին (7 բուժում 20 մգ / կգ կոկաինի-HCl + 7 բուժում աղի + 1 մարտահրավեր բուժում 20 մգ / կգ կոկաինի-HCl, ip) եւ զոհաբերեցին 1 ժամ վերջնական բուժումից հետո: Զգայական փորձերի ընթացքում մկները միանգամից տեղադրվեցին հետ-վիրահատություն եւ վարվեցին 10 մգ / կգ կոկաին-HCl, ip, ինչպես նկարագրված է ստորեւ: Համար dendritic ողնաշարի վերլուծության եւ microarray վավերացում հաջորդող HSV-GFP եւ HSV-G9a-GFP վարակի, մկները վերաբերվում աղտաղտուկներում (5 բուժում աղի, ip) կամ կրկնեց կոկաին »(5 բուժում 20 մգ / կգ կոկաին-HCl, ip ) 3 օրվա ընթացքում, քանի որ այս ներարկման արձանագրությունը նախկինում ցուցադրվել է Herpes simplex վիրուսի (HSV) տրանսգենի արտահայտման ժամանակահատվածում միջուկի հոդակապի (NAc) նեյրոնների վրա ողնաշարի խտությունը մեծացնելու համարՀավելյալ ref S1): Դենդրիկ ողնաշարի վերլուծության համար օգտագործվող մկները վերջին բուժումից հետո զոհաբերեցին 4 ժամ:
Ներգրավելով NX նեյրոնների սահմանափակված G9a տառատեսակի տեղական հանումը, մենք օգտագործեցինք mutant mice homozygous համար floxed G9a ալելին, որոնք մանրամասն նկարագրված են այլ վայրերում (S2): Cre-induced recombination- ը արտադրում է exon 22- ը 25-ից դուրս շրջանակի ընդգրկում, որը հանգեցնում է մուտացիայի ենթարկված տառատեսակի անհեթեթային միջամտության: Մենք օգտագործել G9a ֆլեքսացված մկները, որոնք լիովին backcrossed է C57BL / 6J մկների. Մկները ստերոտաքսային կերպով ներարկվել էին ԱՀՀ-ում Adeno- ի հետ կապված վիրուսով (AAV) վեկտորներով (serotype 2), որոնք արտահայտում էին GFP կամ Cre-GFP- ը 7- ի եւ 10 շաբաթների միջեւ: Իմունխիստոկիմիական անալիզը օգտագործվել է Cre- միջնորդավորված recombination- ի արդյունավետության ստուգման համար (տես Լրացուցիչ պատկեր S5): Մենք օգտագործեցինք AAV ներարկված կենդանիներին 21 օր post-surgery- ը, քանի որ G9a ֆլեքսացված մկների վերամշակումը կայուն եւ առավելագույն էր այս ժամանակահատվածում, որը համապատասխանում է հրապարակված հաշվետվություններին (S3-S4): G9a- ը եւ ΔJunD overexpression փորձերը նույն կերպ են իրականացվել HSV- ի վիրուսային վեկտորների օգտագործմամբ կամ GFP, wildtype G9a-GFP, կատալիտիկորեն մահացած G9aH1093K-GFP կամ ΔJunD-GFP (տես S2 G9a կոնստրուկցիաների զարգացման հետ կապված մանրամասների համար): HSV- ը գերազանցող ճնշումային մկները օգտագործվել են 3 օր հետո հետվիրահատական վիրահատությունից, քանի որ գերբնակեցումը առավելագույնն էր այս ժամանակահատվածում, ինչպես դիտարկվում է իմունոհիստոքիմիայի միջոցով: HSV արտահայտության անցողիկ բնույթի եւ AAV արտահայտության զգալիորեն ավելի կայուն բնույթի շնորհիվ HSV- ի վեկտորները օգտագործվել են արագ, կարճաժամկետ տրանսգենի արտահայտման համար պահանջվող փորձերի ժամանակ, մինչդեռ AAV վեկտորը օգտագործվում է փորձերի ժամանակ, որոնք պահանջում են երկար տարիներ տրանսգենի արտահայտություն: Երկու վեկտորները ցուցադրվել են լայնածավալ նախնական ուսումնասիրություններում, ներթափանցել ուղեղի տարածքի ներսում միայն նեյրոնային բջիջների մարմինները վարակելու համար, առանց վիրուսային կամ անուղղակի նյարդերի վարակի:
BIX9 (01294 ng / μl) դեղագործական G25a / GLP inhibitor օգտագործող վարքագծային փորձարկումների համար, մկները ստերոտաքսիկորեն ներարկվում էին երկու subcutaneous mini-pumps- ի, ինչպես նաեւ երկկողմանի ուղեկցող թռչունների միջոցով, NAc- ում: Mini-pumps- ը ակտիվացվել է 12 ժամ առաջ 0.25 օր առաջ արված իմպլանտացիայի միջոցով, որը սկսում է 5 օրվա ցանկացած տրանսպորտային միջոցի (14 hydroxypropyl β-cyclodextrin) կամ թմրամիջոցների շարունակական առաքման (XNUMX μL / ժամ) ընթացքում, որի ընթացքում վարքագծային գնահատումներ են կատարվել:
ΔFosB գերբնակեցման փորձերի համար [արեւմտյան blotting, qPCR եւ ChIP], տղամարդկանց ցատկային NSE-ՏՏԱ × tetOP-ΔFosB մկները օգտագործվել են (10 շաբաթական), որտեղ բացակայում է tetracycline ածանցյալ դոկիքսիքցլինի (8 շաբաթական դոկտիքսիլլին), կենդանիները ցուցադրվում են ΔFosB- ի կայուն ստերիալալ սահմանափակ սահմանային արտահայտությունըS5): Այս մկների մեջ ΔFosB overexpression հաստատվել է qPCR- ի միջոցով: Հաստատելու համար NSE-ՏՏԱ × tetOP-ΔFosB մկները, wildtype 8- ամյա C57BL / 6J տղամարդկանց մկները sterotaxically- ներարկվել intra-NAc հետ AAV վեկտորները արտահայտող կամ GFP կամ ΔFosB-GFP. Այս դեպքում օգտագործվել են AAV վեկտորները, ապահովելու առավելագույն ΔFosB արտահայտությունը 8 շաբաթական հետբուհական վիրահատության ժամանակ, որը թույլ է տալիս ուղիղ համեմատել վիրուսային վարակված եւ կրճատված ΔFosB գերբնակեցող մկների միջեւ: Viral overexpression- ը հաստատվել է qPCR- ի օգտագործմամբ 8 շաբաթական հետբուհական վիրահատության ժամանակ (15-gauge NAc փորվածքները հայտնաբերվել են ներարկման վայրում): AAP-GFP- ը եւ AAV-ΔFosB-GFP- ը գերակշռող մկները, որոնք չեն օգտագործվել qPCR- ի համար, 14 շաբաթից սկսած 14 շաբաթից սկսվում են աղի (30 բուժում saline, ip) կամ կրկնակի կոկաինով (6 բուժում 4 մգ / կգ կոկաին-HCl, ip) վիրահատություն: Վերջնական բուժումից հետո 4 օր անց, ուղեղները ամրագրվեցին XNUMX% paraformaldehyde- ով, որը բաժանված էր vibratome վրա եւ օգտագործեց dendritic ողնաշարի վերլուծության համար:
Արեւմտյան բլոտի վերլուծություն
14-gauge NAc պատռել են 1 մմ կորոնալ հատվածներից ստացված չժանգոտվող պողպատից մկնիկի ուղեղի մատրիցով եւ sonicated է 1 M HEPES լիզի բուֆեր (1% SDS) պարունակող protease եւ phosphatase inhibitors. 10-30 μg ընդհանուր սպիտակուցի նմուշները electrophoresed է 18% SDS գել. Սպիտակուցներ տեղափոխվել են PVDF մեմբրաններ եւ incubated հետ, կամ հակա-H3K9me2 (մուկ մոնոկլոնային, 1: 500), հակահայկական β-tubulin (մուկ մոնոկլոնային, 1: 60,000), հակահայկական ընդհանուր histone H3 (նապաստակ polyclonal, 1: 5,000), հակահայկական GFP (օգտագործվում է ստուգման հավասար վիրուսային արտահայտվելու բռունցքներով հյուսվածքի) (նապաստակ polyclonal, 1: 1000), հակահայկական H3K27me3 (նապաստակ polyclonal, 1: 500) կամ հակա-actin հակամարմինները (մուկ մոնոկլոնային, 1: 60,000) գիշերում 4 ° C (բոլոր մեմբրանները արգելափակվել են 5% կաթով կամ 5% խոշոր եղջերավոր անոթային albumin): Մեմբրանները, այնուհետեւ, օքսիդացված են պերօքսիդազով մակնշված երկրորդական հակամարմիններով (1: 15,000-1- ը, 60,000- ը, կախված հիմնական հակամարմիններից) եւ խմբաքանակները արտացոլվել են SuperSignal West Dura substrate- ի միջոցով: Bands էին քանակական NIH Image J Software- ի եւ H3K9me2- ի խմբաքանակները նորմալացվել են either actin կամ β-tubulin եւ հստակ հիստոն H3- ի համար `հավասար բեռնելու համար: Կրկնվող կոկաինը որեւէ ազդեցություն չի ունեցել ակտի մակարդակների վրա (Նկարը S8) կամ ընդհանուր հիստոն 3 (Նկարը S1): Բացի այդ, HSV-G9a-GFP- ի եւ HSV-G9aHXNNM-GFP- ի վարակի ազդեցությունը NAc- ում β-tubulin- ի ընդհանուր մակարդակի վրաՆկարը S8).
Իմունխիստոկիմիա
Մկները sedated է մահացու դոզան chloral hydrate եւ perfused է 4% paraformaldehyde նախքան վերլուծվել է մեկ կամ կրկնակի իմունհամահուցակիմիա, ինչպես նախկինում նկարագրված (S6): Կարճ ասած, հետվնասվածքային ուղեղները ինկուբացված էին սենյակային ջերմաստիճանում գիշերում 30% sucrose- ում մինչեւ 35 μմ (բաժանված դենդրիտային ողնաշարի վերլուծության համար օգտագործված ուղեղները 100% sucrose- ի բացակայությամբ vibratome- ում բաժին է ընկնում 30 μմ հատվածներում): Ազատ լողացող ՆԱԿ բաժինները էին լվանում 1X PBS, արգելափակվել է (3% նորմալ էշ շիճուկ, 0.1% tritonX, 1X PBS), իսկ ավելի ուշ incubated anti-GFP (հավի polyclonal, 1: 8000) եւ / կամ հակահայկական G9a (ճագարաբուծության polyclonal , 1: 500) հակամարմինները արգելափակման լուծման մեջ: Dendritic spines- ի համար վերլուծվող բաժինները քնաբերվել են 1- ի 200- ի վրա որպես նապաստակի պոլիկլոնալ հակա-GFP հակամարմին: Անցումային քնկումից հետո, NAc բաժինները 3 անգամ 10 րոպե լվացվեց 1X PBS- ի հետ, այնուհետեւ 2X PBS- ի արգելափակման լուծույթում 3 ժամում Cy1- ի եւ / կամ Cy2 ֆլուորեսցենտային զուգորդված երկրորդական հակամարմինների ինկուբացիան: Մորիֆոլոգիական ուսումնասիրությունների համար օգտագործվող բաժինները ներկառուցված են երկրորդային հակամարմինների գիշերում սենյակային ջերմաստիճանում: Միջուկային համակեցումը կատարվել է 1X PBS- ով DAPI (1: 50,000) պարունակող բաժինների քննելու միջոցով 10 րոպե: Բաժինները կրկին լվացվեցին, որին հաջորդեց էթոնոլի ջրազրկումը եւ մոնտաժը DPX- ով: Բոլոր բաժինները նկարագրվեցին, օգտագործելով կոնֆլիկալ մանրադիտակը:
ՌՆԹ մեկուսացում եւ qPCR
Երկկողմանի 14 չափիչ NAc հարվածները համասեռացվել են Տրիզոլում և մշակվել ըստ արտադրողի ցուցումների: RNA- ն մաքրվել է RNAesy Micro սյուններով և սպեկտրոսկոպիան հաստատել է, որ RNA 260/280 և 260/230 չափաբաժինները> 1.8 են: RNA- ն այնուհետև փոխադարձ կերպով արտագրվեց `օգտագործելով Bio-Rad iScript Kit: cDNA- ն քվարկավորվել է qPCR- ի միջոցով `օգտագործելով SYBR Green- ը: Յուրաքանչյուր ռեակցիա կատարվեց կրկնօրինակ կամ կրկնակի և վերլուծվեց ΔΔCt մեթոդի համաձայն, ինչպես նախկինում նկարագրված էր `օգտագործելով գլիցերալդեհիդ-3-ֆոսֆատ դեհիդրոգենազը (GAPDH) որպես նորմալացման հսկողություն (S7): Տեսնել լրացուցիչ աղյուսակ S5 mRNA- ի primer sequences- ի համար:
ԴՆԹ-ի միկրոավտոբուս վերլուծություն
3 միկրոավտոբուսների ընդհանուր քանակի միկրոավտոբուսային ուսումնասիրության համար օգտագործվել են չորս խմբեր (12 անկախ խմբի կենսաբանական կրկնօրինակներ): Կոկաինի վերջին ներարկումից հետո, 1 ժամ անց, կենդանիները արագորեն ապամոնտաժվել են, եւ ուղեղները հանվել եւ տեղադրվել են սառույցով: NAc- ի բաժանումը կատարվել է 15- ի կախիչի օգնությամբ եւ արագ սառեցվել է չոր սառույցում, մինչեւ RNA արդյունահանված: Երկակի զարկերակները չորս կենդանիներից հավաքվել էին մեկ կրկնօրինակով, 12 մկնիկը մեկ խմբի համար: RNA մեկուսացումը, միկրոավտոբուսի մշակումը եւ տվյալների վերլուծությունը կատարվել են նախկինում նկարագրված (S8) Համառոտ, RNA- ն մեկուսացվեց և մաքրվեց, ինչպես նկարագրված է վերևում, և ստուգվեց որակի համար `օգտագործելով Agilent's Bioanalyzer- ը: Illumina MouseWG-6 v2.0 զանգվածների հակառակ վերծանումը, ուժեղացումը, պիտակավորումը և հիբրիդացումը կատարվել են UT Southwestern- ի միկրոսխեմանի միջուկի կողմից ստանդարտ ընթացակարգերի միջոցով: Beadstudio ծրագրակազմի միջոցով հում տվյալների հանումն ու քանակի նորմալացումը կատարվում էին: Նորմալացված տվյալները վերլուծվել են GeneSpring ծրագրակազմի միջոցով և գենելիստները ստեղծվել են 1.3 անգամ փոփոխության կտրվածքի նշանակության չափանիշների զուգորդմամբ `p <0.05 p- արժեքի ոչ խիստ կտրվածքով:
Մենք մի քանի պատճառներով պահպանում ենք այդ տվյալների նկատմամբ վստահության մեծ աստիճան: Նախ, բոլոր կենդանիները միեւնույն ժամանակ, նույն պայմաններում, վարվել էին, բուժվում եւ սպանվում: Ինչպես նաեւ, բոլոր RNA- ն եւ զանգվածի վերամշակումը կատարվել են միեւնույն ժամանակ: Երկրորդը, մենք կատարեցինք եռօրյայի զանգվածներ եւ միավորված բազմակի կենդանիներ մեկ զանգվածի ընտրանքով, դրանով իսկ նվազագույնի հասցնելով անհատական փոփոխականության եւ վիճակագրական ուժերի ավելացման տարբերություններըS9): Երրորդ, մեր ուսումնասիրության համար օգտագործվող տվյալների վերլուծության չափորոշիչները խորհուրդ են տրվում MicroArray Quality Control ծրագրի կողմից, քանի որ այդ չափանիշները վավերացված են, միջերկրածնային վերարտադրողականության բարձր մակարդակի եւ միջերկրածային եւ վերարտադրողական վերարտադրելիության ապահովման համար (S10-S11).
Վիրուսային վեկտորների կառուցում
Վիրուսային վեկտորի ներդիրի չափի սահմանափակումների շնորհիվ, կամ wildtype G9a (G9a) կամ կատալիտիկորեն մեռած G9a (G9aH1093K) համար կոդավորման հաջորդականությունները ենթասլոնացված են pcnumx + HSV պլազմիդի բիսիստրոնային պարունակության մեջ, որը արտահայտում է GFP մարդու անմիջական վաղ ցիտոմեգալովիրուսի խթանողին (CMV) (G1005a տեղադրման չափը ~ 9 քբ է, որը գերազանցում է AAV-3.96 վեկտորների համար առավելագույն ներդիրի չափը): The IE2 / 4 խթանողին ներառում է G5a արտահայտությունը: Fragments էին subcloned մեջ bicistronic p9 + HSV պլազմիդ միջոցով բութ վերջնական ligations հետ Klenow բուժվել PmeI եւ EcoRI digested G1005a (pcDNA9) եւ CIP վերաբերվում p3.1 + հետեւելով EcoRI մարսողություն. HSV-ΔJunD-GFP- ի արտադրության համար EcoRI սահմանափակումների վայրերի կողմից ΔJunD- ի կոդավորման հաջորդականությունը ստեղծվել է PCR- ի կողմից, օգտագործելով EcoRI կայքի պարունակող primer oligonucleotides: Այնուհետեւ PCR արտադրանքը կապվեց p1005 + վեկտորի EcoRI կայքում: Կրեդի recombinase- ի տեղային արտահայտությունը NAc նեյրոնների մոտ ձեռք է բերվել վիրուսային միջնորդավորված գենետիկայով, օգտագործելով AAV վեկտորը, ինչպես նկարագրված է (S12): GFP- ը կամ GFP- ից Cre- ի N-տերմինալ միաձուլումը subcloned է մի rekombinant AAV-2 վեկտոր պարունակող CMV խթանողին հետ splice դոնոր ընդունիչ հաջորդականությամբ եւ polyadenylation ազդանշան. Բոլոր վեկտորի տեղադրությունները հաստատվել են dideoxy- sequencing- ի կողմից: Վիրուսային վեկտորները պատրաստվել են եռակի փոխարկման, օգնականի անվճար մեթոդով, ինչպես նախկինում նկարագրված (S13): Մաքրված վիրուսը պահվել է -80 ° C- ում: Վիրուսային որակը գնահատվել է HEK293 բջիջներում գնահատված վարակիչ տիտրերով: AAV-ΔFosB-GFP վիրուսները նույնպես պատրաստված էին: HSV-Cre- ի համար Cre- ի արտահայտությունը պայմանավորված էր IRES- ի խթանողին, ի տարբերություն IE4 / 5- ի խթանողին, որպեսզի նվազագույնի հասցնի Կրեմի արտահայտությունը եւ կանխի նեյրոնային թունավորությունը (տես S14 վիրուսային շինարարության համար): Բոլոր դեպքերում էլ վիրուսային արտերկրպրեսիան վավերացվել է vitro և in vivo qPCR- ի միջոցով, եւ վիրուսները եղել են իմունոգոստոկիմիմիական կերպով `վիրահատությունից հետո ցուցադրվող NAc- ի սահմանափակ արտահայտությունը:
Ստերոտաքսիկ վիրաբուժություն
Կետամինի տակ (100 մգ / կգ) / քիլլազի (10 մգ / կգ) անեսթեզիա, մկները տեղադրվեցին փոքր կենդանիների ստերեոտաքսիկ գործիքի մեջ, եւ գանգի մակերեսը հայտնաբերվեց: Երեսուներկու չափիչ ներարկիչի ասեղներ օգտագործվել են 0.5 μl վիրուսի երկակի քանակությամբ վիրուսի մեջ ներգրավելով 10 ° անկյան տակ (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) 0.1 μl / րոպե արագությամբ: HSV ներարկում ստացող կենդանիներին թույլատրվել է վերականգնել 2 օր վիրահատությունից հետո, իսկ AAV վեկտորների ընդունման համար օգտագործվող մկները թույլատրվել են վերականգնել մինչեւ 20 օր առաջ օդորակման ենթարկելու համար: Այս ժամանակները համապատասխանում են երկու վեկտորների համար առավելագույն վիրուսային միջամտության տրանսգենի արտահայտման ժամանակահատվածներին: BIX01294 infusions- ի համար, երկու մինի-պոմպերի յուրաքանչյուրը դրսեւորվում էին մկնիկի հետեւի վրա: Cannulae տեղաբաշխումներն իրականացվել են NAc- ի վերեւից երկու փոքր կռունկ անցքերի եւ bregma- ից (AP + 1.5, ML + 1.0, DV-5.4) թռչունների առաքմամբ: Մկներին թույլատրվել է վերականգնել 4- ից մինչեւ 5 օր վիրահատությունից հետո, նախքան ստորեւ նկարագրված կոկաինը տեղադրելու կարգը:
Պայմանավորված տեղադրության նախապատվություն
Տեղի հաստատման ընթացակարգը կատարվել է նախկինում նկարագրված, հետեւյալ փոփոխություններով (S7) Կարճ ասած, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP կամ HSV-GFP ներ-NAc ներարկումներից 1093 օր անց մկները տեղադրվեցին կոնդիցիոներների պալատներում, որոնք բաղկացած են երեք տարբեր միջավայրերից: Հետազոտությունից բացառվել են մկները, որոնք զգալի նախապատվություն են տվել երկու օդափոխիչ պալատներից որևէ մեկին (բոլոր կենդանիների <10% -ը): Այնուհետև կոնդիցիոներների խմբերը հավասարակշռվեցին ՝ հարմարվելու համար խցիկների ցանկացած կողմնակալություն, որը կարող է դեռ գոյություն ունենալ: Հաջորդ օրերին կենդանիներին ներարկում էին աղաջրով և ցերեկը պահում մեկ խցիկում 30 րոպե, իսկ հետո ներարկում կոկաին (10 մգ / կգ, IP) և 30 րոպե պահում մյուս խցիկին երեկոյան 2 օրվա ընթացքում (երկու աղի լուծույթ և կոկաինի երկու զույգ): Թեստի օրը մկներին առանց բուժման 20 րոպե հետ դրեցին ապարատ և փորձարկեցին, թե որ կողմն են նախընտրում: Կոկաինի շարժիչային արձագանքները գնահատվել են կոկային զուգակցված պալատներում ճառագայթների ընդմիջումների միջոցով `թմրամիջոցների բուժման արդյունավետությունն ապահովելու համար: AAV և BIX01294 CPP փորձերի համար օգտագործվել է մի փոքր փոփոխված արձանագրություն: Կենդանիներին նորից ներարկում էին աղի կամ կոկաին (10 մգ / կգ, տ.մ.) և պահում էին հատուկ պալատներ 30 րոպեանոց նստաշրջանների ընթացքում, բայց փոխարենը դրանք պայմանավորում էին օրական մեկ անգամ 4 օրվա ընթացքում, որին հաջորդում էր թեստը 5-րդ օրը (կենդանիները պայմանավորվում էին երեկոյան և կոնդիցիոներների բուժումը փոխարինվեց): Բոլոր խմբերի համար գնահատվել է ելակետային շարժումը `ի պատասխան աղակալման, ապահովելու համար, որ շարժումը չի ազդել վիրուսային կամ ինհիբիտորների բուժմամբ:
Ներառված ներարկային կոկաինի ինքնակառավարումը
Ստացված փորձի սկզբում քնքուշ 230-250 գ արական ողնուղեղ Long-Evans առնետները: Նրանք տեղադրվեցին խոնավության եւ ջերմաստիճանի վերահսկվող միջավայրում `12 ժամվա լույսի / մութ ցիկլով (լույսերը, 9- ում` 00): ad libitum հասանելիություն սննդի եւ ջրի համար: Rats- ը թույլատրվեց հարմարվել իրենց նոր միջավայրում եւ ամեն օր վարվեց 1 շաբաթ առաջ, փորձարկման մեկնարկից առաջ: Բոլոր ընթացակարգերը իրականացվել են «Լաբորատոր կենդանիների խնամքի եւ օգտագործման առողջության ուղեցույցի ազգային ինստիտուտի» համաձայն եւ հաստատվել է Սինայիի կենդանիների խնամքի եւ օգտագործման կոմիտեի կողմից: Ինքնասպասարկման սարքավորումները տեղադրվեցին ինֆրակարմիր ճառագայթներով `չափելու շարժիչի վարքագիծը: Ինքնակարգավորումը կատարվել է ինչպես նախկինում նկարագրված (S15-S16) իզոֆլորանի (2.4–2.7%) անզգայացման տակ աջ կաթնային երակներում տեղադրված կաթետերներով: Կաթետերները լվացվեցին 0.1 մլ աղային լուծույթով, որը պարունակում էր 10 U հեպարին և ամպիցիլին (50 մգ / կգ): Վիրահատությունից մեկ շաբաթ ապաքինվելուց հետո ինքնակառավարման ուսուցումը սկսվեց լույսի / մութ շրջանի մութ փուլում: Կենդանիներին թույլատրվում էր օրական 3-ժամյա հասանելիություն ունենալ կոկաինին (0.75 մգ / կգ / ինֆուզիոն) ֆիքսված հարաբերակցությամբ -1 (FR1) ուժեղացման ժամանակացույցի համաձայն, որտեղ 1 ակտիվ լծակային մամուլը հանգեցրեց թմրանյութի մեկ ինֆուզիոն: Առնետները կայունացրեցին կոկաինի ընդունումը 6 օր հետո (15 օր անընդմեջ <3% պատասխանի տատանում, առնվազն 75% -ը պատասխանելով ուժեղացված լծակին): Ինքնակառավարման վերջին նստաշրջանից 24 ժամ անց առնետներն արագ գլխատվեցին, ուղեղն արագորեն հանվեց և վերամշակվեց ՌՆԹ-ի մեկուսացման և qPCR- ի համար:
Chromatin- ի իմունոպրոպիտացիա (CHIP)
Թարմ NAc փափուկսները ձեւավորվել են խաչաձեւ կապակցությամբ եւ պատրաստված CHIP- ով, ինչպես նախկինում նկարագրված էր (S17-S18) փոքր փոփոխություններով: Կարճ ասած, 4 14-gauge NAc հարվածները հավաքվել էին մեկ կենդանու (5 կենդանիների համար մեկ նմուշով), որոնք խառնվում էին 1% formaldehyde- ի հետ, եւ սառեցվելով 2 M glycine- ով, մինչեւ 80 ° C- ում: 1 օր առաջ նմուշների sonication, ոչխար հակահայկական rabbit / մուկ (կախված տեղումների հակադրման) IgG մագնիսական beads պատրաստվել են ինկուբացիոն համապատասխան մագնիսական beads կամ հակահայկական G9a (նապաստակ polyclonal ChIP դասարանի) կամ հակահայկական H3K9me2 (մկնիկի Monoclonal ChIP դասարանի) հակատիտոնները գիշերում են 4 ° C- ում, անընդհատ ռոտացիայի տակ, բլոկային լուծույթում: Հյուսվածքների ուլիկացման եւ քրոմատինային կտրումը իրականացվել են ինչպես նախկինում նկարագրված (S17): Sonication- ից հետո, քրոմատինի հավասար կոնցենտրացիաները տեղափոխվել են նոր խողովակներ եւ վերջնական արտադրանքի «5%» -ը պահպանվել է որպես «մուտքային» վերահսկում: Համակցված բշտիկների / հակամարմինների խառնուրդների մանրակրկիտ լվացումից եւ վերամշակումից հետո յուրաքանչյուր քրոմատին նմուշին ավելացվել է հակատոմային / բշտիկային խառնուրդների հավասար ծավալներ (~ 7.5 μg հակաբորբոք / նմուշ) եւ իննուբացված է 16 ժամով `4 ° C- ի կայուն ռոտացիայի ներքո: Նմուշները հետագայում լվացվեցին եւ հակառակ կողմն անցան 65 ° C- ում մեկ օր առաջ ԴՆԹ-ի մաքրման համար, օգտագործելով PCR մաքրման հավաքածու: ԴՆԹ-ի մաքրումից հետո նմուշները ենթարկվեցին qPCR եւ նորմալացան իրենց համապատասխան «մուտքային» ստուգումները, ինչպես նախկինում նկարագրված (S17): Սովորական մկնիկի IgG- ի իմունոֆրիտիպիտացիաները, օգտագործելով մկնիկի պոլիկլոնալ հակա-ԻգԳ հակամարմինները, իրականացվել են նաեւ ազդանշանային ուժեղացման համապատասխան հարստացման համար: Ադենին ֆոսֆորիբոսիլտրանսֆերազիան (APRT) օգտագործվել է որպես բացասական հսկողություն կոկաինի եւ ΔFosB overexpression փորձերի համար: Տեսնել Լրացուցիչ աղյուսակ S5 խթանող primer sequences- ի համար:
Դենդրիկ ողնաշարի վերլուծություն
Նեյրոնային մորֆոլոգիայի կարգավորման մեջ G9a- ի դերը ներգրավվածության մեջ, մենք օգտագործեցինք նախկինում նկարագրված հետեւյալ փոփոխությունները (S1): HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (բոլոր վիրուսները C57Bl / 6J մկների մեջ օգտագործվել են) կամ HSV-Cre-GFP ներարկումից երեք օր անց (օգտագործվում է G9afl / fl մկները), երբ վիրուսային արտահայտությունը առավելագույնս էր, մկները սթրես են առաջանում, ուղեղները cryoprotected եւ հետագայում բաժանվում են 100 μm- ում vibratome- ում: Այնուհետեւ բաժինները immunostained են, օգտագործելով GFP դեմ հակամարմին, ինչպես նկարագրված է (տես Immunohistochemistry): G9a- ի արտահոսքի եւ նոկաուտի ազդեցությունը ողնաշարի թվերի վրա, ինչպես նաեւ ΔJunD overexpression- ի ազդեցությունը գնահատելու համար մենք չափեցինք մոտավորապես 1-2 նեյրիտների վրա նեյրոնների համար մոտավորապես 299-32 նեյրիտների վրա, որը հավասար է առնվազն XNUMX μմ միջնակարգ dendrites- ի GFP-Expressing NAc միջավայրից ցողունային նեյրոններ (MSNs): Հաշվի առնելով, որ MSN- ն morphologically տարբերվում է այլ նեյրոնային բնակչությունից NAc, ինչպես նաեւ նախորդ հաշվետվությունները, նշելով, որ HSV- ը, առաջին հերթին, վարակվում է DARPP-XNUMX- ին, այս ուղեղի շրջանում նեյրոններ արտահայտելովS19), մենք վստահ ենք, որ MSN- ները բացառապես գնահատվել են այս ուսումնասիրություններում: Յուրաքանչյուր կենդանու համար մենք ուսումնասիրեցինք 6-8 նեյրոնների յուրաքանչյուր խմբի 3-4 կենդանիների մեջ (7 խմբեր), որից հետո յուրաքանչյուր կենդանու համար միջին արժեք ստացվեց վիճակագրական վերլուծության համար: ΔFosB- ի գերբնակեցման ազդեցությունները քննելու համար փորձարկված փորձարկումները, որոնք առաջացել են NAc- ի ողնաշարի խտության վրա, նույն կերպ են իրականացվել վերը նշվածով, բացառությամբ, AAV վեկտորները օգտագործվել են GFP կամ ΔFosB-GFP- ի երկար ժամանակով արտահայտելու համար (8 շաբաթ): Բոլոր HSV պատկերները գողացվել են մի կոնֆոկալ մանրադիտակի միջոցով, 100X նավթային ընկղմման օբյեկտով (AAV պատկերները գրավել են 63X- ի նավթային ընկղմման նպատակներով): Պատկերները ձեռք են բերվել 1 կամայական միավորի վրա հիմնված փորագրիչով եւ 1024 × 1024 շրջանակի չափով: Dendritic- ի երկարությունը չափվել է NIH Image J- ի օգտագործմամբ եւ ողնաշարի համարները հիմնական փորձարարի կողմից դիտվել էին որպես կույր, քանի որ սլայդները կոդավորված էին նախքան փորձարարական սկանավորումը: Հաշվարկվել է 10 μm dendrite- ի մեկ օղակի միջին թիվը:
Վիճակագրական վերլուծություն
Մեկ եւ երկուսով ANOVA- ները կատարվել են, պայմանավորված տեղանքի նախապատվության եւ դենդրիտային ողնաշարի վերլուծության նշանակությունը որոշելու համար `երկուից ավելի խմբերի համար: Ուսանողների թեստերը օգտագործվել են այլ համեմատությունների համար, ներառյալ qPCR, արեւմտյան blotting, dendritic ողնաշարի անալիզ, համեմատելով HSV-GFP HSV-Cre- ին G9a- ումfl / fl մկների, միկրոսխեմաների վերլուծություններ (տե՛ս վերևում) և քրոմատինի իմունային նստվածքների փորձեր: ΔFosB- ի գերարտահայտումից հետո ողնաշարի դենդրիտային խտության ANOVA- ի երկկողմանի վերլուծության արդյունքում օգտագործվել են պլանավորված ուսանողների t- թեստեր `թմրամիջոցների բուժման և վիրուսի նշանակալի հիմնական ազդեցությունների հաստատմամբ: Նիշերի լեգենդներում ներառված բոլոր արժեքները ներկայացնում են միջին ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001): Մանրամասն վիճակագրական վերլուծություններ Անտառը. 1-3 հիմնական տեքստում տրված են `մանրամասն վիճակագրական տվյալներ, ներառյալ վիճակագրությունը:
Հղումներ
Ես հավաստում եմ, որ ձեռագրերի մեջ ընդգրկված նյութերից ոչ մեկը իրավունք չունի Histoxethyltransferase G9a- ի կարեւորագույն դերը կոկաինի հարուցված պլաստիկության մեջ նախկինում հրապարակվել են կամ քննվում են այլ վայրերում, այդ թվում `Ինտերնետում:
Կենդանիների օգտագործման հետ կապված բոլոր աշխատանքները իրականացվել են ինստիտուցիոնալ եւ IACUC ուղեցույցների համաձայն `ինչպես Տեխասի հարավային բժշկական կենտրոնի համալսարանում, այնպես էլ Սինայի բժշկական դպրոց:
Հղումներ եւ գրառումներ
;