Cdk5 ֆոսֆորիլատները Dopamine D2 ընդունիչն ու անջատում են ներքեւի ազդանշանը (2013)

Կարծիքներ. Ցույց է տալիս, որ Cdk5- ը հանգեցնում է դոպամինի D2 ընկալիչների կարգավորման: Զարմանալիորեն, թարգմանչական գործոն deltafosb ներդնում է Cdk5- ի արտադրությունը:

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y եւ այլն: (2013) PLOS ONE 8 (12): e84482: doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Վերացական

Են դոպամինի D2 receptor (DRD2) առանցքային receptor, որը միջնորդում է դոպամինի հարակից ուղեղի գործառույթներ, ինչպիսիք են տրամադրություն, պարգեւատրման, եւ զգացմունքներով. Cyclin- կախված kinase 5- ը (Cdk5) հանդիսանում է պրոլինային ուղղված սարինային / տրեոնին kinase, որի գործառույթը ներառում է ուղեղի պարգեւատրման սխեմայի մեջ: Այս ուսումնասիրության, պարզվեց, որ սերին 321 նստվածք (S321) է երրորդ ներբջջային հանգույց DRD2 (D2i3) մի վեպ կարգավորիչ կայքը Cdk5: Cdk5 կախված phosphorylation Հյուրատետր S321 է D2i3 նկատվում էր vitro եւ բջիջների մշակման համակարգեր:

Մենք նաեւ նշեցինք, որ S321- ի ֆոսֆորիալացումը թույլ է տալիս DRD2- ի ագրոնիստ-խթանիչ մակերեւույթի արտանետումը եւ նվազեցված G սպիտակուցի կապը DRD2- ին: Բացի այդ, ներքեւում գտնվող cAMP ուղին ազդում էր heterologous համակարգում եւ առաջնային նեյրոնային մշակույթներից p35 նոկաուտի սաղմոններից, հավանաբար, DRD2- ի նվազեցված արգելակային ակտիվության պատճառով: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ S5- ի Cdk321- ի միջնորդավորված ֆոսֆորալումը խաթարում է DRD2 ֆունկցիան, ապահովելով դոպամինային ազդանշանների նոր կարգավորող մեխանիզմ:

գործիչներ

Մեջբերում: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y եւ այլն: (2013) Cdk5 ֆոսֆորիլատները, Dopamine D2 ընդունիչը եւ հոսում է ստորին ազդանշանները: PLOS ONE 8 (12): e84482: doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Խմբագիր: Ջեյմս Պորտեր, Հյուսիսային Դակոտա համալսարան, Ամերիկայի Միացյալ Նահանգներ

Ստացվել է ` Մայիս 20, 2013; Ընդունվել է. Նոյեմբեր 14, 2013; Published: Դեկտեմբերի 31, 2013

Հեղինակային իրավունք: © 2013 Jeong եւ այլն: Սա բաց մատչելի հոդված է, որը բաժանվում է ըստ պայմանների Creative Commons Attribution Լիցենզիա, որը թույլ է տալիս անսահմանափակ օգտագործումը, բաշխումը եւ վերարտադրությունը ցանկացած միջավայրում, եթե նախնական հեղինակը եւ աղբյուրը հաշվառվում են:

Ֆինանսավորում. Այս աշխատանքը աջակցել է Կորեայի կառավարության կողմից իրականացվող դրամաշնորհների (NRF-2012R1A2A2A01012923 եւ NRF-2012R1A4A1028200) եւ Կորեայի NRF- ի (2012K2A1A2033117) եւ Կորեայի գիտահետազոտական ​​ինստիտուտի (KBRI) կողմից իրականացվող միջազգային համագործակցության ծրագրի շրջանակներում: MSIP- ի հիմնական հետազոտական ​​ծրագիրը (2031-415): SKP- ն ստացավ 2004- ի եւ 2006 ազգային դաշինքի ստացողը `շիզոֆրենիայի եւ դեպրեսիաների հետազոտման (NARSAD) երիտասարդ հետազոտողների մրցանակաբաշխության համար: Հիմնադրամները դերակատարություն չունեն ուսումնասիրության նախագծման, տվյալների հավաքագրման եւ վերլուծության, որոշման հրատարակման կամ ձեռագրի պատրաստման վերաբերյալ:

Մրցակցող շահերը. Հեղինակները հայտարարել են, որ մրցակցային շահեր չկա:

ներածություն

Դոպամինային ազդանշանը ներգրավված է տարբեր ուղեղի գործառույթներում, ներառյալ շարժիչի համակարգման, տրամադրության վերահսկման եւ վարձատրության մեխանիզմների [1]. Դոպամինային ազդանշանների հիմնական բաղադրիչը ողնաշարավորների վրա կիրառվում է ստիատալ միջավայրի ցողունային նեյրոններ (MSNs), որոնք ընտրովիորեն արտահայտում են դոպամինային ընկալիչների ենթաբազմություն եւ ստանում են դոպամիներգիկ ներարկում, հիմնականում, վրացական tegmental տարածությունից (VTA) եւ substantia nigra (SN) [2]. Դոպամինային ընկալիչները G protein- զուգորդված ընկալիչները (GPCR) են `յոթ transmembrane տիրույթներով եւ բաղկացած երկու ենթատիպերից, D1- ի նման եւ D2- ի նման ընկալիչները, որոնք դոպամինային ազդանշանի միջնորդական փոխազդեցությունները [1]. Օրինակ, dopamine D1- ի նման ընկալիչները (D1, D5) ակտիվացնում են adenylyl cyclase- ը G- ի միջոցով:αs եւ բարձրացնել CAMP- ի միջուկային մակարդակը, սակայն dpamine D2- ի նման ընկալիչների (D2, D3, D4) արգելակում են adenylyl cyclase- ը G- ի միջոցով:αi եւ նվազեցնել CAMP- ի միջուկային մակարդակը [1], [3].

Dopamine- ի ընկալիչների շրջանում D2 ընդունիչը (DRD2) ներգրավված է բազմաթիվ խոշոր հոգեբուժական խանգարումների, այդ թվում `շիզոֆրենիայի եւ թմրամոլության պաթոֆիզիոլոգիայում [4], որ շատ antipsychotic դեղեր գոնե մասամբ թիրախ DRD2. Հայտնի է նաեւ, որ DRD2- ի գործունեությունը բարելավում է կենդանիների մոդելներում չարաշահման թմրամիջոցների վարքային հետեւանքները [5]. Հակադեպրեսանտները եւ տրամադրության կայունացուցիչի արդյունավետությունը կապված են նաեւ DRD2- ի բջջային մակերեսի արտահայտման կամ PCA- ի, ERK- ի եւ GSK3- ի միջնորդավորված ներքեւի միջուկային ազդանշանների փոփոխությունների հետ: [1], [4], [6]. Չնայած ուղեղի DRD2- ի այս կարեւոր դերերին, DRD2- ի առանձնահատկություններին համահունչություն եւ բարդություն ներկայացնող մանրամասն կարգավորող մեխանիզմները ամբողջությամբ չեն հասկացել:

Համաձայնեցված ապացույցների տողերը ցույց են տալիս, որ DRD2- ի գործունեության ճշգրիտ կարգավորմամբ ներգրավված են բազմաթիվ posttranslational փոփոխություններ: DRD2- ի լայնածավալ glycosylation հայտնաբերվեց վաղ լուսանկարչական աֆիլիտի պիտակավորման ուսումնասիրություններ [7], եւ DRD2- ի շրջանակներում disulfide պարտատոմսերի ձեւավորումը նույնպես ճանաչվել է որպես լիգանդի պարտադիր լուրջ փոփոխություն [8]. Բացի այդ, DRD2- ի ֆոսֆորման վայրերը նախապես հայտնաբերվել են vitro ռադիոիզոտոպներով փորձարկումը, տարբեր kinases- ի միջնորդավորված տարբեր կարգավորիչ ուղիների երթուղիները [9]. Իրոք, սպիտակուցային kinase C- ը (PKC) կարգավորում է DRD2- ի միջամտության միջամտության մաղձումը եւ ներդնում DRD2- ի փոխազդեցությունը cytoskeletal սպիտակուցներով [10]. Phosphorylation կողմից GPCR kinase 2 (GRK2) կարգավորում է agonist-induced reensitization patterns DRD2 [11].

Cyclin- կախված kinase 5- ը (Cdk5) հանդիսանում է պրոլինային ուղղված սարինային / threonine kinase, որն ունի արտոնյալ ակտիվություն իր հիմնական ակտիվացողների ուղեղի հատուկ արտահայտությամբ, p35 եւ p39 [12]. Cdk5- ը ներգրավված է տարբեր նեյրոնային պրոցեսներում, ներառյալ նեյրոնային միգրացիան եւ սիկոնային ուղեցույցը, եւ Cdk5 եւ p35 null մկների շերտը հայտնաբերում են կորտային շերտերում [13]. Վերջերս ցուցադրվեց, որ WAVE1- ի եւ ephexin- ի ֆոսֆորումը Cdk5- ի կողմից կարգավորում է դենդրիկ ողնաշարի morphogenesis [14]. Բացի այդ, Cdk5- ը նաեւ կարգավորում է NMDA ընդունիչի, NR2B- ի եւ NR2A- ի միջնորդավորված NMDA հոսանքների մակերեսի արտահայտման մակարդակները: [15], [16]. Հատկանշական է, որ բազում ապացույցներ ներկայացված են Cdk5- ի եւ դոպամին համակարգի միջեւ մտերիմ հարաբերություններ: Cdk5 ֆոսֆորացված թիրոսին հիդրոքսիլազը (TH), կարգավորելով կայունությունը եւ դրանով իսկ պահպանելով դոպամիներգիկ homeostasis [17]. Postynaptic neurons- ում, երբ dopamine- ի T75- ի եւ ցիկլիկ-AMP- ի կարգավորվող ֆոսֆոպրոտին-32kD (DARPP-32) ֆոսֆորիֆիկացված է Cdk5- ով, այն կարող է արգելակել PKA- ի ակտիվությունը եւ դրանով հակադրեցնել դոպամին DRD1 միջնորդավորված PKA ազդանշան [18]. Հետաքրքիր է, երբ կոկաինը, որը դոպամինային ընկալիչների անուղղակի ագոնիստ է, ողնաշարերում քրոնիկ կերպով վարվում է, cdk5- ի mRNA եւ սպիտակուցային մակարդակները ավելանում են միջին ճարպային նեյրոնների [19]. Կոլեկտիվ կերպով Cdk5- ը կարծես թե ներգրավված է թմրանյութերի ներգործության ենթարկված սինապտիկ հարմարվողականության մեջ: Այս ուսումնասիրության մեջ ցույց ենք տալիս DRD2- ի եւ Cdk5- ի ֆունկցիոնալ փոխազդեցությունը, որը հետագայում տարածում է Cdk5- ի դոպամինային ազդանշանի դերը:

Նյութեր եւ մեթոդներ

Հակամարմիններ

Anti-rabbit serums- ը բարձրացվել է DRD321- ի (D321i2) երրորդ միջուկային հանգույցի ֆոսֆո-սերիայի 2 (pS3) պարունակող պեպտիդների դեմ: Ֆոսֆո-պեպտիդ, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), օգտագործվել է պեպտիդ-կոնյուկոգեն սյունակ, հավանականության մաքրման համար (20401, PIERCE): Anti-pS321 հակամարմինը հարստացված է արտադրության հրահանգից հետո հարստացվածության մաքրման համակարգով: Մաքրված ֆոսֆո-հակածրագիրը պահպանվել է PBS- ով `0.1% նատրիումի azide եւ 0.1% ժելատին: Cdk5 / p249- ի Western blotting եւ immunocytochemistry- ի համար օգտագործվել են Anti-Mouse anti-Cdk35 հակամարմինները (sc-820) եւ հակահայկական նապաստակ anti-p5 հակամարմինները (sc-35): DRD9996-GFP- ի իմունոպրեպտիտացիայի եւ Western blotting- ի համար օգտագործվել է Anti-Mouse anti-GFP հակամարմին (sc-2): Anti-rabbit anti-FLAG հակաբիոտիկ (sc-807), anti-rabbit anti-HA հակաբորբոքիչ (sc-805), հակա-մուկ հակա-GST հակամարմին (sc-138) եւ հակահայկական մկնիկի հակա-GAPDH հակամարմին (sc- 32293) գնել են Santa Cruz Biotechnologies- ից:

Կենդանիներ

The p35 նոկաուտի մուկը բարի նվեր էր դոկտոր Katsuhiko Mikoshiba- ից Ճապոնիայում RIKEN Brain Science ինստիտուտում եւ օգտագործվում էր առաջնային նեյրոնային մշակույթի համար: Նախաձեռնող սարքը գենոտիպավորման համար 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC եւ 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT- ը նախապես նկարագրված էին: [20]. ICR մկները եւ Sprague Dawley առնետները օգտագործվել են ուղեղի լիզատի պատրաստման համար: Կենդանիների բոլոր ընթացակարգերը հաստատվել են Պոհանի Գիտության եւ տեխնոլոգիայի ինստիտուցիոնալ Կենդանիների խնամքի եւ օգտագործման կոմիտեի կողմից:

Պլազմիդ կառուցում

Մարդու DRD2- ի երկար izoform օգտագործվել է EGFP-N1 պլազմիդ վեկտորի եւ երրորդ intracellular հանգույց DRD2 (212-373 amino թթու մնացորդներ, ներառյալ 29 լրացուցիչ amino թթու մնացորդները եզակի է DRD2 երկար izoform) մի pFLAG-CMV-2 պլազմիդ վեկտոր. Մարդու Cdk5- ը տեղադրված է pCMV-HA պլազմիդ վեկտորի մեջ եւ մարդու p35- ը տեղադրվել է pcDNA 3.1 պլազմիդ վեկտորի մեջ: Մարդկային Cdk5- ը տեղադրվել է cytomegalovirus (CMV) խթանողին տակ pcNNAX- ով pcNNAX- ի միջոցով, pcDNA 35- ի վեկտորի մեջ, երկդիմավոր արտահայտություն կառուցելու համար (Cdk3.1 / p5) իմունոգիտոկիմիայի, ընդունիչի ներքինացման փորձի համար [35S] -GTP- ըγS- ի պարտադիր փորձաքննություն, ռադիոլիգանից եւ պարտադիր հավասարակշռությունը եւ cAMP ֆերմենտի իմունոֆիզը:

Արհեստական ​​պայմաններում Kinase քննություն

IP կապակցված vitro kinase- ի փորձը կատարվեց հետեւյալ կերպ. Մի ամբողջ մկնիկի ուղեղը 3 μL erythrocytes լիզի բուֆեր (ELB) (50 մմ Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 մմ EDTA, 0.1% NP-40) կողմից Dounce homogenizer- ի կողմից համակցված գլխուղեղի լիզաները . The lizates incubated է սառույցի համար 20 րոպե, sonicated եւ centrifuged է 30 × g 10 րոպե: The supernatants էին հակաբորբոքային anti-p35 հակամարմին է immünoprecipitated ստանալու համար ակտիվ Cdk5 / p35 համալիր. Cdk5 / p35 համալիրը եւ մաքրված GST ֆունտի սպիտակուցը խառնվում է ադրենոսինի 5'-triposphate, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) եւ ինկուբացված է kinase բուֆերային (30 մմ HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 մմ DTT) համար 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում [18], [21]. Մաքրված Cdk5 / p25 համալիր (14-516, Millipore) օգտագործվել է նաեւ vitro kinase անալիզ, ինչպես նկարագրված է վերը: The 2 × նմուշի բեռնման բուֆերը ավելացվել է ռեակցիայի խառնուրդին եւ խաշած է 100 ° C- ում: Նմուշները այնուհետեւ ենթարկվեցին SDS-PAGE եւ չորացրած գելը գնահատվել է autoradiography- ով:

Հեղուկ քրոմատագրությունը (LC) -Մասի սպեկտրոմետրիա (MS) / MS Analysis

The recombinant GST-D2i3 սպիտակուցը վերլուծվել է LC-MS / MS- ից հետո, IP- ի հետ կապված vitro kinase քննություն: Մենք կատարեցինք L-MS / MS տվյալների պեպտիդային նույնականացում X !! Tandem (version Dec-01-2008): Յուրաքանչյուր RAW տվյալների ֆայլը առաջին անգամ փոխակերպվեց mzXML- ին, օգտագործելով trans-proteomic խողովակաշարը (TPP, տարբերակը 4.3): Հետադարձված mzXML- ներում MS / MS- ի սկանները ենթարկվել են որոնման UniProt մկնիկի հաջորդականության տվյալների բազայի (2010_07- ի), ներառյալ GST-D2i3 հաջորդականությունը, օգտագործելով X !! Tandem: Առողջության հանդուրժողականությունը սահմանվել է 3 Da- ի նախնական իոնների եւ 2 Da- ի մասնիկների իոնների համար: Օգտագործվել է թփսիների ֆերմենտի առանձնահատկությունը: Variable փոփոխման տարբերակները օգտագործվել են cysteine ​​(57.021 Da), methionine (15.995 Da) օքսիդացում, asparagine (0.987 Da) հիդրոիզի եւ serine (79.966 Da) ֆոսֆորման համար օգտագործվել են կարբամիդոմետիլացման համար:

Իմունային խանգարումներ

ԻԼԲ-ի լիզի բուֆերում բջջային լիզատների վրա կատարվել է իմունոպրոպիտացիա: Anti-GFP- ի հակամարմինը ավելացվել է lizates եւ իննուբացված է 3 ժամվա ընթացքում 4 ° C- ում: Իմունային համալիրները մաքրվել են սպիտակուցներով `A agarose- ով: The precipitates էին inkubated SDS նմուշի բեռնման բուֆեր 30 րոպե 37 ° C, եւ ենթարկվել SDS-PAGE եւ արեւմտյան blots.

GST Pull-down Assay

10 μg մաքրված GST եւ GST-D2i3 ինկուբացիան 1.5 ժամի համար 4 ° C- ի համար: 30 μL glutathione (GSH) -conjugated Sepharose 4B beads (17-0756-01, GE Healthcare), որը հավասարակշռված է լիզի բուֆերային եւ ավելացվել է լրացուցիչ 1 ժամի համար: Beads հավաքվել են ցենտրիֆուգավորում է 2,000 ×g եւ լվացվեց 4 անգամ լիզի բուֆեր [22], [23]. Precipitations- ը վերլուծվել է Western blotting- ով, օգտագործելով anti-Cdk5- ը եւ anti-p35 հակամարմինները:

Իմունոթիտոկիմիա

Լյարդի վրա մշակված HEK 293 բջիջները եւ շերտավոր նեյրոնները մեկ անգամ լվացվեն ֆոսֆատ բուֆերացված աղիով (PBS) եւ ամրացվում է ցուրտ 4% paraformaldehyde / PBS համար 30 րոպե: Առաջնային հակամարմինը զսպեց արգելափակման լուծույթում (2% ձիաբջիջ եւ 1% Triton X-100 PBS- ում): Ալեքսաֆտոր-647- համակցված հակա-մկնիկ հակամարմինները (A20990, Invitrogen) եւ Ալեքսաֆտոր-568- համակցված հակաբնածին հակաբորբոդը (A11011, Invitrogen) օգտագործվել են որպես երկրորդական հակամարմիններ: Hoechst- ը օգտագործվել է կորիզի գունավորման համար: Պատկերները ստացան գաղտնի մանրադիտակով (Olympus, FluoView-1000):

Receptor ներքինացման փորձաքննություն

24 հ transfection- ից հետո, բջիջները 1 μM quinpirole- ով (Q102, Sigma) 30 րոպեով եւ 90 րոպեով 37 ° C- ով վարվել է: Բջիջները կրկին կասեցվել են 2 մլ սառը PBS եւ յուրաքանչյուր ռեակցիայի համար օգտագործվել է 200 μL ալկոհոլ: Դիակի բուժումը կատարվել է սենյակային ջերմաստիճանում `3 ժամվա ընթացքում` հետեւյալ կոնցենտրացիաներով. 3 nM [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, Sigma): Հիդրոֆոբիկ [3H] -spiperone օգտագործվել է ընդհանուր արտահայտված ընկալիչների պիտակավորման եւ hydrophilic sulpiride օգտագործվել փոխարինելու membranous reseptor-bound [3H] -spiperone ազդանշանները: Մեմբրանի հետ կապված ռեցեպտորների ազդանշաններ են հաշվարկվել `ընդհանուր արտահայտված ընկալիչի արժեքներից ներծծվող վերգետնյա արժեքների վերացում: Բջիջները ֆիլտրացված էին GF / B (Millipore) ֆիլտրի վրա եւ լվացքի բուֆերով (3 մմ Tris-HCl (pH 50), 7.4 մմ NaCl) լվացվեց 100 անգամ: Զտիչները չորացրած էին, իսկ մնացորդային ռադիոակտիվությունը չափվել է հեղուկ սինթիլատորի հաշվիչի միջոցով [24].

Բջջային մեմբրանի պատրաստում

Քաղցրավենիքից հետո 100 մմ մշակման ճաշատեսակների մեջ հաստատված բջիջները լվանում էին սառնարանային PBS- ով եւ բերում 1 մմ HME բուֆեր (25 մմ HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 մմ EDTA): Homogenized lysates- ները կենտրոնացված էին 500 գ-ով 15 րոպեով, իսկ սուպերմատները հետագայում 36,000- ի միջոցով centrifuged 30 րոպե: HME բուֆերում կրկին կասեցված կարկուտները փորձարկվել են:

[35S] -GTP- ըγS պարտադիր փորձաքննություն

Բջջային մեմբրանի ֆրակցիաները նախնական ինուբակացված էին 1 μM քինպիրոլով (Q102, Sigma) փորձարկման բուֆերներում (25 մմ HEPES (pH 7.5), 1.5 մմ MgCl2, 100 մմ NaCl, 1 մմ EDTA եւ 0.01 մմ ՀՆԱ) 10 րոպե: [35S] -GTP- ըγS (NET-030H, PerkinElmer) ավելացվել է 3 nM- ի վերջնական կոնցենտրացիան 30 μL եւ հետագայում ինկուբացված 90 րոպե: 170 μL սառցե սառը բուֆեր (10 մմ Tris-HCl (pH 8.0), 100 մմ NaCl, 10 մմ MgCl2, եւ 0.1 մմ GTP) ավելացվել է արձագանքը դադարեցնելու համար: Մեմբրանները ֆիլտրացված են GF / B ֆիլտրում (Millipore) եւ լվացքի բուֆերով (3 մմ Tris-HCl (pH 50), 7.4 մմ NaCl) լվացվում է 100 անգամ: Զտիչներ են չորացրած եւ ռադիոակտիվությունը չափվել է սվինգի հաշվիչի միջոցով [25], [26].

Radioligand պարտադիր փորձաքննություն

Պատրաստված բջջային թաղանթներն ինկուբացված են 0.01 nM [3(565 մմ HEPES (pH 102), 30 մմ MgCl (HNUMX, Sigma), 25- ի համար, HNSPX- ի (NET-7.5, PerkinElmer) եւ քինփիրոլի (Q1.5, Sigma)2, 100 մմ NaCl, 1 մմ EDTA): Մեմբրանները ֆիլտրացված են GF / B ֆիլտրում (Millipore) եւ լվացքի բուֆերով (3 մմ Tris-HCl (pH 50), 7.4 մմ NaCl) լվացվում է 100 անգամ: Ռեակցիան դադարեցվել է GF / C ֆիլտրերի միջոցով արագ փչացման միջոցով: Մնացորդային ռադիոակտիվությունը չափվել է հեղուկ սինթիլացիայի հաշվիչի միջոցով [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Վերականգնված HEK 293 բջիջները նախապես վարվել են 10 μM rolipram (R6520, Sigma) 1- ի հետ եւ այնուհետեւ վարվել 0.1 μM forskolin (F6886, Sigma) եւ քնփիրոլի (Q102, Sigma) կոնցենտրացիաների աճը 30 րոպե: Նախնական մշակված ստիատալ նեյրոնները 10 μM rolipram- ով 1 ժամով բուժվել են, իսկ 1 μM դոպամինը `1 ժամ [22]. Բջջային lizates պատրաստվել են 0.1 M HCl եւ cAMP մակարդակները հայտնաբերվել cAMP ֆերմենտի immunoassay kit (Sapphire Bioscience), հետեւելով արտադրողի հանձնարարությամբ:

Առաջնային մշակված ստիատալ նեյրոն

Striatal տարածքը մեկուսացված էր մկնիկի սաղմնային ուղեղից (E15): Դիսեկցիոն հյուսվածքները հայտնաբերվել են 11095% trypsin (T0.25-4549, Sigma) եւ 100% DNase I 0.1 րոպեում 6 ° C- ի պարունակությամբ նվազագույն էական լրատվամիջոցներում (MEM) (37, Invitrogen): Բջիջները վերամշակվել են պլաստմասսայե մեդիայի մեջ (MEM 0.01 M HEPES (pH 7.4) եւ 10% (vol / vol) ձիու շիճուկով (16050-122, GIBCO): Նեյրոնները մշակվել են 7 օրվա ընթացքում vitro (DIV 7) MEM- ով B27 հավելվածով (17504-044, Invitrogen) մինչեւ cAMP ֆերմենտային իմունոինիզացիաներ կիրառելու համար:

Արդյունքներ

Cdk5 ֆոսֆորիլատները Serine 321- ը DRD2- ի երրորդ միջուկային հանգույցում vitro

Որպեսզի հայտնաբերենք վեպի Cdk5 նյութերը, մենք կատարել ենք համակարգային որոնում (S / T) PX (K / H / R) որպես Cdk5 ճանաչման կոնսենսուսի հաջորդականություն [30] եւ հայտնաբերել DRD2- ը որպես թեկնածուի ենթաշերտ: Կոնսենսուսի հաջորդականությունը, ներառյալ սառնարանային 321- ը, գտնվում է DRD2- ի (D2i3) երրորդ միջուկային հանգույցում, որտեղ կիրառվել են տարբեր կարգավորիչ մեխանիզմներ [3], [10], [11]. Հաջորդականությունը էվոլյուցիոնորեն պահպանում է DRD2- ում էքստրեմալ կենդանիների մեջ, որը ենթադրում է մնացորդի ֆունկցիոնալ նշանակություն (Նկար 1A).

thumbnail

Նկար 1: Cdk5 ֆոսֆորիլատները սերիայի 321- ը DRD2- ի երրորդ միջուկային հանգույցում in vitro.

(A) Amino acid sequence հավասարեցում, որը ցույց է տալիս DRD2- ի պահպանված շրջանները տարբեր տեսակների (ստվերածված): Պոտենցիալ Cdk5 ֆոսֆորման կայքը նշվում է աստղանիշով: (B) IP- հետ կապված vitro kinase- ի փորձարկումը recombinant GST-D2i3 եւ GST-D2i3 mutant սպիտակուցներով: Cdk5 / p35 համալիրը, որը հարստացված էր մկնիկի ուղեղի քաղվածքի միջոցով, հակադիֆիկացիայի միջոցով օգտագործվել է kinase- ի ռեակցիաներում: Ֆոսֆորացված սպիտակուցների ավտորինոգրամը ցուցադրվում է նույն գելից Coomassie փայլուն կապույտ գունանյութով: Arrowhead- ը ցույց է տալիս GST-D35i2s- ին պատկանող ռադիոակտիվ ազդանշանը եւ բաց սլաքը ցույց է տալիս ռադիոակտիվ ազդանշանները p3- ից: (C) D35i2- ի ֆոսֆորացված պեպտիդային բեկորների MS / MS սպեկտրը: Theoretical fragmentation patterns ցուցադրվում են ստորեւ սպեկտրում: Բոլոր մասնիկների իոնների մեջ հայտնաբերված y- եւ բ-իոնները նշված են սպեկտրում: The y6 եւ y7 իոնները հստակորեն մատնանշում են սինին 321 ֆոսֆորիալացումը: (D) Արհեստական ​​պայմաններում kinase- ի վերլուծությունը մաքրված Cdk5 / GST-p25 համալիրով, օգտագործելով GST-D2i3 եւ GST-D2i3 mutant սպիտակուցները: Ֆոսֆորացված սպիտակուցները ցուցադրվել են autoradiograph- ում, ինչպես նաեւ Coomassie- ի փայլուն կապույտ գունանյութերով: Arrowhead- ը ցույց է տալիս ռադիոակտիվ ազդանշանի համապատասխան GST-D2i3 եւ բաց սլաքը ցույց է տալիս GST-p25- ից ռադիոակտիվ ազդանշանները:

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

D5i2- ի ֆոսֆորիլացման համար Cdk3- ի կարողությունը գնահատելու համար մենք կատարեցինք IP-linked vitro kinase- ի փորձարկումները, օգտագործելով ակտիվ Cdk5 / p35 համալիր, որը մկնիկի ուղեղի լիզաթով հարստացված է p35- ի իմունոպրուիպիտացիայով, մաքրված recombinant GST-D2i3 (ամինաթթուների մնացորդները 212-373) սպիտակուցներով `որպես substrates: Մենք դիտարկեցինք ֆոսֆորիալացման ազդանշանները մաքրված GST-D2i3 եւ GST-D2i3 S297A սպիտակուցներով, բայց ազդանշանը զգալիորեն նվազեցվեց `օգտագործելով GST-D2i3 S321A (Նկարը `1B): Որպեսզի ստուգեք սերիայի 321- ի ֆոսֆորիալացումը GST-D2i3- ում, մենք կատարեցինք IP- ն կապված նմուշների LC-MS / MS վերլուծություն vitro kinase- ի փորձարկումները օգտագործելով LTQ XL- ի զանգվածային սպեկտրոմետրերով: Պարբերաբար վերականգնվել են ֆոսֆո-սերիայի 321 պեպտիդների զանգվածին համապատասխանող ֆոսֆո-պեպտիդները (Նկար 1C): Հաշվի առնելով, որ LC-MS / MS վերլուծության ընթացքում տվյալների կախված ձեռքբերումը ձգտում է հայտնաբերել առատ սպիտակուցներ նմուշում [31], այս տվյալները ցույց են տալիս, որ serine 321 մնացորդը D5i2 տարածաշրջանում Cdk3- ի գերիշխող ֆոսֆորման վայրն է: Որպեսզի ապացուցի, որ սեռի 321- ի ուղղակի ֆոսֆորումը GST-D2i3- ի կողմից Cdk5- ով է, vitro օգտագործվել է մաքրված Cdk5 / GST-p25 համալիրով մաքրված recombinant GST-D2i3 սպիտակուցներով քնազի անալիզը: Մենք հայտնաբերել ենք զգալի ֆոսֆորման ազդանշան GST-D2i3- ում, որը բացակայում է GST-D2i3 S321A- ում (Նկար 1D): Հաշվի առնելով միասին, այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ D2i3 S321 մնացորդը Cdk5 միջնորդավորված ֆոսֆորման համար նախապատվության թիրախ է:

Cdk5 ֆոսֆորիլատները Serine 321- ը, DRD2- ի բջիջների երրորդ միջուկային հանգույցում

Սերիայի 321- ի ֆոսֆորիալը հայտնաբերելու համար մենք բարձրացրել ենք ֆոսֆո-սերիայի 321 (pS321) համար հատուկ հակամարմիններ: IP- ն կապված նմուշներ vitro kinase- ի վերլուծությունը վերլուծվել է արեւմտյան blotting- ով, օգտագործելով հակա-pS321 հակամարմինը: Blots ցույց տվեցին հստակ խումբ, kinase ռեակցիայի մեջ, որը կախված է GST-D2i3 (Նկար 2A): Հաստատություններում DRD321- ով սինթետիկ 2- ի սինթեզի 5- ի պոտենցիալ ֆոսֆորիալը Cdk293- ի կողմից բջիջներում, anti-GFP- ի իմունոպրեսիպիտիտները HEK 2 բջիջները հայտնաբերող DRD2-GFP եւ DRD321 S5A-GFP- ն HA-Cdk35- ի եւ p321- ի հետ կամ առանց HA-Cdk2- ի եւ p2- ի վերլուծության են ենթարկվել Western blotting- ի միջոցով, anti-GFP- ի եւ հակա-pS321 հակամարմիններ: ԴՆԹ-նմմմ-ի GFP- ի ավելցուկային glycosylation հետեւանքով առաջացած DRD2-GFP- ի առկայության հետեւանքով հակա-GFP- ի հակամարմինները բնութագրող ազդանշանային ազդանշաններ են, եւ հակա-pS5 հակամարմինները հայտնաբերել են նման DRD35 ազդանշանները միայն CdkXNUMX / pXNUMX co արտահայտությամբՆկարը `2B) [7]. Հետագա ստուգելու համար սերիական 321- ի ֆոսֆորիալացումը Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) եւ D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) մուտանտային ձեւը: HEK 2 բջիջներում HA-Cdk3- ի եւ p2- ի հետ արտահայտված FLAG-D3i321- ը եւ FLAG-D5i35 S293A- ը վերլուծվել են SDS- գել շարժունակության հերթափոխի փորձով: FLAG-D5i2- ի համար զգալի Cdk3- կախված շարժունակության հերթափոխություն է նկատվում, բայց ոչ FLAG-D2i3 S321A (Նկար 2C): Մենք նաեւ գնահատեցինք DRD2- ի ֆոսֆորացված մակարդակը Ser321- ում, agonist stimulation- ով: HEK 293 բջիջները հայտնաբերել են DRD2-GFP եւ Cdk5 / p35 համալիրները խթանվել քինպիրոլով, իսկ բջջային lizates- ից հակա-GFP- ի իմունոպրեսիպիտացիաները վերլուծվել են Արեւմտյան Blotting- ով, օգտագործելով հակա-GFP եւ հակա-pS321 հակամարմիններ: Մենք հայտնաբերեցինք, որ SerxNUMX- ում DRD5- ի Cdk2- ի միջնորդավորված ֆոսֆորումը չի ազդել agonist stimulation- ի վրա, որը տարբերվում է GRK- ի եւ PKC միջնորդավորված ֆոսֆորումներից (Նկար 2D) [32], [33]. Միասին, այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ Cdk5- ը կարող է ֆոսֆորացնել բջջային միջավայրում DRD321- ի սարինային 2 մնացորդը:

thumbnail

Նկար 2: Cdk5- ի ֆոսֆորիլատները սինթետիկ 321- ի մեջ DRD2- ի երրորդ միջուկային հանգույցում բջիջներում:

Cdk5-ի միջուկային 321 ֆոսֆորալը վերլուծվել է հակա-pS321 հակամարմինների օգտագործմամբ: (A) IP- ն կապված նմուշներ vitro GST-D2i3 սպիտակուցները օգտագործելով kinase- ի փորձարկումը վերլուծվել է Western blotting (WB) կողմից նշված հակամարմիններով: Arrowheads- ը նշում է GST-D2i3s: (B) DRD2-GFP- ը եւ DRD2 S321A-GFP- ը արտահայտվել են HA-Cdk5- ի եւ p35- ի HEK 293 բջիջներում: Anti-GFP- ի իմունոպրեսիպիտատները վերլուծվել են Western blotting- ով, օգտագործելով anti-GFP եւ հակա-pS321 հակամարմիններ: Կտրուկը ցույց է տալիս DRD2 ազդանշանները եւ բաց թրաշը ցույց է տալիս հակա-GFP- ի իմունոպրեսիպիտատներից անհատական ​​ազդանշաններ: '% input'- ը IP ռեակցիայի համար ընդհանուր լիզատի% ծավալն է: Ցածր էնդոգեն Cdk5 ազդանշանները նշված են աստղանիշներով: (C) Գելի շարժունակության փոփոխման փորձ. HEK 293 բջիջները, որոնք նշված են որպես նշված, վերլուծվել են Western blotting- ով: (D) Վերականգնված HEK 293 բջիջները բուժվել են քինպիրոլով եւ հակա-GFP- ի իմունոպրեսիպիտատները վերլուծվել են Արեւմտյան Blotting- ով հակա-GFP- ով եւ հակա-pS321 հակամարմիններով: Բաց սլաքը ցույց է տալիս հակա-GFP- ի իմունոպրեսիպիտատներից անհատական ​​ազդանշաններ:

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 համալիրը եւ DRD2- ը ֆիզիկապես կապված են

Մենք ուսումնասիրեցինք Cdk5 / p35 համալիրի եւ DRD2- ի միջեւ հնարավոր ֆիզիկական փոխազդեցությունը, քանի որ շատ Cdk5 նյութեր հայտնի են ֆիզիկապես կապված Cdk5 / p35 համալիրի հետ [23], [34], [35]. Նախ, կատարվեց GST- ի քաշի նվազեցման փորձը: Մաքրված recombinant GST-D2i3 սպիտակուցը քրոնիկ ուղեղի լիզատով ինկուբացված է եւ արեւմտյան blotting- ի համար վերլուծվում են GST- ի քայքայված աղակալները: Ինչպես երեւում է Նկար 3A, endogenous Cdk5- ը եւ p35- ը հայտնաբերվել են քայքայված ցնցումների մեջ, նշելով DRD2- ի եւ Cdk5 / p35 համալիրի ֆիզիկական փոխազդեցությունըՆկար 3A): Ավելին, HA-Cdk5- ը եւ p35- ը հայտնաբերվել են HEK 293- ի բջջային lizates- ից, որոնք արտահայտում են DRD2-GFP- ի եւ Cdk5 / p35- ի հակա-GFP իմունոպրեսիպիտատներումՆկարը `3B): Բացի դրանից, մենք կատարեցինք իմունոկտոկիմիական անալիզներ եւ նկատեցինք, որ DRD2-GFP, HA-Cdk5 եւ p35 ցույց են տալիս զգալի համանախանման ազդանշանները HEK 293 բջիջների մեմբրանի տարածքումՆկար 3C, վերին վահանակներ): Մենք նաեւ հետազոտեցինք DRD2- ի եւ Cdk5 / p35- ի համաժամեցումը նեյրոնային համատեքստում: DRD2-GFP- ը նաեւ հետեւողականորեն ցույց տվեց էգոնեզու Cdk5- ի եւ p35- ի կողմից մշակված striatal նեյրոնների (DIV7) զգալի համանախագահող տեղայնացումը, հետագա աջակցությունը DRD2- ի եւ Cdk5 / p35- ի միջեւՆկար 3C, ներքեւի վահանակներ): Արդյունքները ցույց են տալիս, որ DRD2- ը եւ Cdk5 / p35- ը կարող են ստեղծել բարդ եւ, հետեւաբար, աջակցել այն հասկացությանը, որ DRD2- ը Cdk5- ի ֆիզիոլոգիական ենթածրագիրն է:

thumbnail

Նկար 3: Cdk5 / p35- ը կարող է ստեղծել DRD2 համակարգ:

(A) GST- ի քաշի վերլուծությունը, օգտագործելով մաքրված recombinant GST-D2i3 սպիտակուցը, առնետի ուղեղի քաղվածքով: GST- ի քաշի ցածր ճնշումները ենթարկվեցին արեւմտյան բլոտի վերլուծություններին: «Bead» - ը ցույց է տալիս, առանց GST- ի սպիտակուցների քայքայված նստվածք: (B) DRD2- ի եւ Cdk5 / p35 համալիրի իմունոպրոպիտացիա: Պաշտպանված բջիջներից ստացված հակա-GFP- ի IP- ն լիզացիաներից ենթարկվել են արեւմտյան բլոտի վերլուծությունների: Կտրուկը ցույց է տալիս DRD2 ազդանշանները եւ բաց թրաշը ցույց է տալիս հակա-GFP- ի իմունոպրեսիպիտատներից անհատական ​​ազդանշաններ: Իրավունքում նույնպես ցուցադրվում է մուտքագրման համար չափազանցված բլոտ: (C) DRD2- ի եւ Cdk5 / p35- ի իմունոթիտոկիմիական անալիզները: HEK 293 բջիջները DRD2-GFP- ի եւ Cdk5 / p35- ը հայտնաբերել են հակա-Cdk5 եւ հակա-p35 հակատոկիաներով (Վերին վահանակներ): DRD2-GFP- ն արտահայտվել է միայնակ մշակված նյարդային նեյրոնների մեջ եւ հակված է Cdk5- ով եւ հակա-p35 հակամարմիններով (Ստորին վահանակներ): Hoechst- ը օգտագործվել է կորիզի գունավորման համար: Սանդղակը բարը 5 μմ է: Բոլոր պատկերները ստացվել են կոնֆլիկալ մանրադիտակի միջոցով (Olympus, FluoView-1000):

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

DRD5- ի Cdk2- ի միջնորդավորված ֆոսֆլյուլինգը վերցնողների գործունեությունը

Պարզվել է, որ ֆոսֆորիալը մոդուլացնում է GPCR- ների քննադատական ​​հատկությունները, ինչպիսիք են G սպիտակուցը կապելը, ընկալիչի ներդաշնակեցումը, intracellular lokalization- ը եւ մոդուլյատորի սպիտակուցների հետ կապը: [9], [11], [24]. Agonist- ի հետ ընկած ընկալիչի ներքինացումն ազդանշանային փոխանցման կարեւորագույն կարգավորիչ գործընթաց է: Մենք ուսումնասիրեցինք DRD5- ի ներդիրացման Cdk2 միջնորդավորված մոդուլյացիան: HEK 293 բջիջները DRD2-GFP եւ DRD2 S321A-GFP- ը արտահայտող Cdk5 / p35- ով կամ առանց CX1 / p2- ին հայտնաբերվել են XNUMX μM quinpirole- ով, դրդել agonist-stimulated DRDXNUMX ներդիրացմանըՆկար 4A): [3H] -spiperone ազդանշանները DRD2-GFP արտազատող բջիջները զգալիորեն նվազել են 30 րոպե քինպիրոլի բուժման ժամանակ եւ վերականգնվել 90 րոպեում: Հետաքրքիր է,3H] -spiperone ազդանշանները DRD2-GFP եւ Cdk5 / p35 արտահայտող բջիջները նույնպես կրճատվել են 30 րոպե քնինփիրոլում, բայց ոչ վերականգնվել է 90 րոպեումՆկար 4A, երկրորդ բաժին): Մյուս կողմից, [3H] -spiperone ազդանշանները DRD2 S321A-GFP արտազատող բջիջները կրճատվել են 30 րոպեում եւ վերականգնվել են 90 րոպեում `անկախ Cdk5 / p35- ի հետ համակցված արտահայտությունից: Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ներքինացված DRD2- ը վերածվում է պլազմայի մեմբրանի երկարատեւ ագրոնիստ խթանման հետ [11]: TՀԴ-ն երեւում է, որ DRD5- ի Cdk2- ի միջնորդավորված ֆոսֆորալումը ներգրավված է վերազինման գործընթացի մեջ, որը կախված է ածխածնային DRD2 ներդաշնակեցուց հետո:

thumbnail

Նկար 4: Cdk5- ի միջնորդավորված ֆոսֆորումը հարստացնում է DRD2 մակերեւույթի արտահայտությունը եւ ներքեւի ազդանշանը:

(A) DRD2 մակերեսի արտահայտությունը, որը չափվում է [3H] -spiperone պարտադիր փորձ: Վերականգնված HEK293 բջիջները խթանվել են 1 μM քինպրիրոլով նշված ժամանակի ընթացքում եւ բերքատվության արդյունքում, որին հաջորդում է 3 nM [3H] -spiperone բուժում 3 ժամվա ընթացքում: Ռադիոակտիվությունը չափվեց և մակերեսային ազդանշանները հաշվարկվեցին: Սխալի գծերը ներկայացնում են միջին ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; միակողմանի ANOVA Dunnett post-test թեստով. Համեմատեք բոլոր սյուններն ընդդեմ կառավարման սյունակի): (Բ) [35S] -GTP- ըγՍ պարտադիր փորձաքննություն: Բջջային թաղանթները պատրաստված էին որպես նախանշված բջիջներից: Մեմբրանի նախապատրաստական ​​աշխատանքները ներառվել են 1 μM քինպիրոլով, այնուհետեւ `3 nM [35S] -GTP- ըγS 90 րոպե: Սխալի գծերը ներկայացնում են միջին ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Միակողմանի ANOVA Bonferroni հետընտրական թեստով. Համեմատեք սյունակների բոլոր զույգերը): (C) Քվինպիրոլի մրցակից [3H] -spiperone պարտադիր փորձ: Փոխակերպվող բջիջներից մեմբրանի պատրաստուկները քննել են 0.01 nM- ով [3H] - սպիպերոն և քվինպիրոլի աճող կոնցենտրացիաներ 30 րոպեի ընթացքում: Ոչ գծային ռեգրեսիան ստացվել է GraphPad- ի կողմից: Սխալի գծերը նշում են միջին ± SE (n = 3): (D) cAMP ֆերմենտային իմունային վերլուծություն փոխներարկված HEK 293 բջիջներում: Տրանսֆեկցիոն բջիջները նախապես մշակվել են 10 մկմ ռոլիպրամով 1 ժամվա ընթացքում, և հետագայում 0.1 րոպե բուժվել են 30 մկմ ֆորսկոլինով և քվինպիրոլի աճող կոնցենտրացիաներով: Ոչ գծային ռեգրեսիան ստացվել է GraphPad- ի կողմից: Սխալի գծերը ներկայացնում են միջին ± SE (n = 4; ** p <0.01; երկպոչ t- թեստեր): (E) Մշակված շնչողական նեյրոններ վայրի տեսակներից եւ p35 նոկաուտի սաղմերի (DIV 7) բուժվել են 10 μM rolipram 1- ի համար, հետեւելով 1 μM դոպամին `1 ժամ: Սխալ սալիկները ներկայացնում են միջին ± SE (n = 4; **p<0.01; երկպոչ t- թեստեր):

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Մենք հետագայում գնահատեցինք Agonist-stimulated G սպիտակուցի զուգակցման պոտենցիալ փոփոխությունը DRD2- ին, կապված Cdk5 միջնորդավորված ֆոսֆորման օգտագործմամբ [35S] -GTP- ըγՍ պարտադիր փորձաքննություն [25], [26]. DRD2-GFP եւ DRD2 S321A-GFP- ն, առանց Cdk5 / p35- ի կամ առանց HEK 293 բջիջներում: Մեմբրանները պատրաստվել եւ խթանել են 1 μM քինպրիրոլով եւ թույլատրվել [35S] -GTP- ըγS- ի ներգրավումը: DRD2-GFP եւ Cdk5 / p35 բջջային թաղանթները զգալիորեն նվազել են [35S] -GTP- ըγS պարտադիր համեմատ մյուս բոլոր բջջային թաղանթների (Նկարը `4B): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ Cdk5- ի միջնորդավորված ֆոսֆորումը նվազեցնում է Agonist-stimulated G սպիտակուցի պարտադրումը DRD2- ում:

Բացի այդ, քինփիրոլ-մրցակցող [3H] -spiperone- ի պարտադիր փորձերը կատարվել են Cdk2 միջնորդավորված ֆոսֆորմանով DRD5- ում ագրոնիստ-առկայության ցանկացած փոփոխության հետաքննություն իրականացնելու համար: Մրցակցային պարտադիր [3H] -spiperone քնփիրոլի ավելացող կոնցենտրացիաների բուժման ժամանակ չափվել է մագնեզիումի պատրաստման համար: Կինպիրոլի եւ [3H] -spiperone- ը DRD2-GFP- ում եւ DRD2 S321A-GFP- ում կազմել է նույն տրամաբանությունը:i արժեքները (-9.789 համար DRD2-GFP; -9.691 համար DRD2 S321A-GFP), նշելով, որ DRD2- ի լիգանի մոտավորությունը չի զգալիորեն ազդում Cdk5- ի միջնորդավորված ֆոսֆորալացման վրա, DRD2- ումՆկար 4C).

Cdk5- ի միջնորդավորված ֆոսֆորլացիան Down- կարգավորում է DRD2-cAMP ազդանշանային ուղին

Հետագայում մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք DRD2- ի Cdk5- ի փոփոխությունը ազդում է ներքեւի ազդանշանային ուղիների վրա: Մենք վերահսկել ենք DRD2- ի միջամտության կանխարգելումը forskolin-stimulated cAMP արտադրության միջոցով adenylyl cyclase է DRD2-GFP եւ DRD2 S321A-GFP արտահայտելով բջիջների enzyme immunoassay. DRD2- ի հայտնաբերող բջիջները ցույց են տվել, որ կինը կախված է կինոգրոլին `ի պատասխան դոզայի կախվածությունից: Հատկանշական է, որ Cdk5 / p35- ի համադրումը զգալիորեն նվազեցրել է cAMP ձեւավորման առավելագույն արգելքը (Նկար 4D, ձախ վահանակը): Մյուս կողմից, DRD2 S321A-GFP- ի արտազատման բջիջներում, cAMP- ի ձեւավորումը արդյունավետորեն արգելված է ի պատասխան քինեփիրոլի բուժման Cdk5 / p35 (Նկար 4D, աջ վահանակ): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ DRD5- ի Cdk2- ի միջնորդավորված ֆոսֆորալումը դանդաղեցնում է DRD2- ի կանխարգելիչ գործունեությունը ներքեւում գտնվող cAMP ազդանշանային ուղու վրա: Ավելի ֆիզիոլոգիական առումով պայմաններում հաստատված երեւույթները հետագայում հաստատելու համար մենք օգտագործում էինք առաջնային մշակված նեյրոններ nXockout embryos- ից պակաս, որը պակաս է p35- ում, կարեւոր Cdk5 ակտիվացնող: Նախնական մշակված նյարդային նեյրոնները բուժվում էին 1 μM դոպամինով եւ վերլուծվում է cAMP ֆերմենտի իմունային հետազոտության միջոցով: P35 նոկաուտի մկների նեյրոնները ցուցադրեցին նվազեցված cAMP մակարդակները վայրի տեսակ նեյրոնների համեմատ, երբ խթանվում է դոպամինով (Նկարը, 4E): ՏAKEN- ի հետ միասին, եզրակացրեցինք, որ DRD5- ի Cdk2 միջնորդավորված ֆոսֆորալումը DRD2- ի կողմից կիրառվող cAMP- ի ճանապարհի արգելման ազդանշանի նվազում է:

Քննարկում

Մենք հայտնաբերեցինք DRD2- ը `որպես Cdk5- ի նորաստեղծ ենթածրագիր: Ֆոսֆորիումը հայտնաբերում է DRD2- ի մակերեւույթի արտահայտությունը նվազեցնելով DRD2- ի ճակատագրի վրա, որն ընկալում է ընկալիչի ներքինացում, դրանով նվազեցնելով DRD2 G- ըi- կափարիչը եւ ներքեւի մասում cAMP ճանապարհը: Քանի որ S321- ի ֆոսֆորիալման մնացորդը գոյություն ունի ինչպես DRD2- ի, այնպես էլ կարճ isoforms- ներում, սույն ուսումնասիրության մեջ առաջարկվող մեխանիզմը կարող է լինել ընդհանուր DRD2 միջնորդավորված ազդանշանային կարգավորման կարգը.

DRD2- ը միջին ցողունային նեյրոնների մեջ ոչ միայն համարվում է որպես հիմնական dopamine receptor subtype, այլեւ ճանաչվել է շրջակա միջավայրի խթանիչների առկայության առկայության փոփոխությունների հանդեպ նրա զգայունության համար: Խիստ ուսումնասիրված են Ագոնիստական ​​ներգործության անդենսիզացման եւ DRD2 վերազինման գործընթացները [11], [24]. Մասնավորապես, մի ​​շարք ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ քրոնիկ հոգոստիմուլյար ազդեցության ազդեցությունները, ինչպիսիք են կոկաինը եւ ամֆետամինը, որոնք բարձրացնում են ստատիկային սինապսայում դոպամինի արտազատվող մակարդակը, ուղեկցվում են DRD2- ի դինամիկ փոփոխություններով: [36]. Իրոք, քրոնիկ կոկաինը օգտագործողները գիտակցում են, որ DRR2 մակարդակը կրճատվել է ստրիատալ տարածքի մեջ եւ DRD2- ի հասանելիությունը միջուկի ականջակալներում (NAcc) ցույց է տալիս, որ բացասական հարաբերակցությունը մկների եւ պրիմատների թմրամիջոցների որոնման եւ ամրապնդման վարքագծի հետ [37]-[39]. Այս բացահայտումները ցույց են տալիս, որ DRD2- ի ֆունկցիոնալությունը շատ զգայուն է ադապտիվ կամ փոխհատուցման կարգավորումին `ի պատասխան տարբեր խթանների, այդ թվում, քրոնիկ թմրանյութերի ազդեցության: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ S321 մնացորդը DRD2- ի երրորդ միջուկային հանգույցում կարող է ֆոսֆորացված լինել Cdk5- ով, ինչը հանգեցնում է DRD2- ի inhibitory ազդեցության cAMP ուղու վրա: Այս փոխազդեցությունը առաջարկում է նոր կարգավորիչ մեխանիզմ, կապված Cdk5- ի հետ, դոպամինոպրեսիվ նեյրոններում, որոնք կարող են կապված լինել DRD2- ի մակերեսի առկայության դինամիկ բնույթի հետ:

Պետք է նշել, որ Cdk5- ը հայտնի է որպես նեյրոնային միջավայրի հարմարվողական փոփոխությունների միջամտության հիմնական բաղադրիչ: Օրինակ, լիմբիկ միացման նեյրոնների մեջ դենդրիտիկ ողնաշարի կառուցվածքային եւ ֆունկցիոնալ փոփոխությունները հանդիսանում են կրկնվող հոգոսթվական ազդեցության հետեւանքներից մեկը: [40]. Այս փոփոխությունները ուղեկցվում են զանազան մոլեկուլային փոփոխություններով, ներառյալ cAMP արձագանքի տարրերի պարտադիր սպիտակուցը (CREB) եւ ΔFosB- ի ներածումը, transcription factors- ն, որոնք ցուցաբերում են կայուն կարգավորում, ի պատասխան քրոնիկ կոկաինի վարման [41], [42]. Կարեւորն այն է, որ Cdk5- ը ΔFosB- ի թիրախ է [19], եւ Dendritic ողնաշարի դինամիկայի մեջ ներգրավված շատ կարեւոր բաղադրիչներ, ինչպիսիք են PSD-95, p21- ակտիվացված kinase (PAK), β-catenin եւ spinophilin, հաղորդում են որպես Cdk5 նյութեր [43]-[46]. Cdk5- ի գործունեության գենետիկական կամ դեղագործական մանիպուլյացիաները հետեւողականորեն առաջացնում են dendritic ողնաշարի մորֆոլոգիայի փոփոխությունները եւ կոկաինը վարքագծային արձագանքները, որոնք կարեւոր դեր են խաղում Cdk5- ի համար մեսոլիբիական դոպամինային սխեմաների մոլեկուլային եւ մորֆոլոգիական փոփոխությունների մեջ [47], [48]. Մեր արդյունքները, որոնք ցույց են տալիս, որ DRD2- ը Cdk5- ի նոր թիրախ է, լրացուցիչ պատկերացում է տալիս դոպամինային համակարգի փոփոխական փոփոխությունների մասին `քրոնիկական թմրադեղերի ազդեցության հետեւանքով, Cdk5- ի հետագա ΔFosB միջնորդավորված վերակարգավորման պատճառով կարող է հանգեցնել DRD2- ի ֆոսֆիլման ավելացմանը: . Ավելին, DRD2- ը հայտնի է ազդել բազմաթիվ բջջային պրոցեսների վրա, ներառյալ cAMP- ի եւ MAP kinase- ի ուղիների եւ վերգետնյա transcriptional events- ի կարգավորումը [42], [49]. Այսպիսով, այս հետազոտության արդյունքները կարող են ոչ միայն պատկերացնել DRD2- ի Cdk5- ի ուղղակի կարգավորումը, այլեւ դոպամինային համակարգում նորարարական պատկերացում կազմել քրոնիկ թմրանյութերի ազդեցության վերաբերյալ:

Հեղինակային ներդրումները

Հանգեցրեց եւ նախագծեց փորձերը `JJ YUP DH SKP: Կատարել փորձեր `JJ YUP DKK YK: Վերլուծել տվյալները `JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP: Մասնակցել ռեագենտներ / նյութեր / վերլուծական գործիքներ `YHS: Գրված թղթի վրա. JJ SKP:

Սայլակ

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Դոպամինային ընկալիչները `կառուցվածքից մինչեւ գործառույթ: Physiol Rev 78- ը `189-225:
  2. 2. Իմաստուն ՀՀ (2002) Ուղեղի վարձատրության սխեման. Neuron 36- ը `229-240: doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Դիտել հոդվածը
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Դիտել հոդվածը
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Դիտել հոդվածը
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Դիտել հոդվածը
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Դիտել հոդվածը
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Դիտել հոդվածը
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Դիտել հոդվածը
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Դիտել հոդվածը
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Դիտել հոդվածը
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Դիտել հոդվածը
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Դիտել հոդվածը
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Դիտել հոդվածը
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Դիտել հոդվածը
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Դիտել հոդվածը
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Դիտել հոդվածը
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Դիտել հոդվածը
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Դիտել հոդվածը
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Դիտել հոդվածը
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Դիտել հոդվածը
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Դիտել հոդվածը
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Դիտել հոդվածը
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Դիտել հոդվածը
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Դիտել հոդվածը
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Դիտել հոդվածը
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Դիտել հոդվածը
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Դիտել հոդվածը
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Դիտել հոդվածը
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Դիտել հոդվածը
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Դիտել հոդվածը
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Դիտել հոդվածը
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Դիտել հոդվածը
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Դիտել հոդվածը
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Դիտել հոդվածը
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Դիտել հոդվածը
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Դիտել հոդվածը
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Դիտել հոդվածը
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Դիտել հոդվածը
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Դիտել հոդվածը
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Դիտել հոդվածը
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Դիտել հոդվածը
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Դիտել հոդվածը
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Դիտել հոդվածը
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Դիտել հոդվածը
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Դիտել հոդվածը
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Դիտել հոդվածը
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Դիտել հոդվածը
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Դիտել հոդվածը
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Dopamine ընդունիչի ազդանշան: X- ն ընդունում է 24- ը: 165-205: doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B եւ այլն: (2008) Շիզոֆրենիայի պաթոֆիզիոլոգիայում դսպամինային D2 ընդունիչի ազդանշանային բաղադրիչների հնարավոր ներգրավումը: Int J Neuropsychopharmacol 11- ը `197-205: doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Նեգուս ՍՍ, Մելլո Ն.Կ., Patel S, Bristow L, եւ այլն: (2002) Դոֆամինի D2- ի նման ընկալիչների դերը կոկաինի ինքնակառավարման մեջ. Ուսումնասիրություններ D2 ընդունիչի մուտանտի մկների եւ novel D2 ընկալիչների հակաթույնների հետ: J Neurosci 22- ը `2977-2988:
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA եւ այլն: (2012) Valproate- ն փոխում է դոպամինային ազդանշանը, Par-4 սպիտակուցի արտահայտման ներդիրով: PLOS One 7- ը `e45618: doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) D2 դոպամինային ընդունիչի երկար եւ կարճ isoforms համար դիֆերենցիալ glycosylation եւ intracellular թրաֆիքինգ: J Biol Chem 270- ը `29819-29824: doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Հատուկ [3H] raclopride կապող neostriatal dopamine D2 ընկալիչների: Disulfide եւ sulfhydryl խմբերի դերը: Neurochem Res 17- ը `749-759: doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. NG GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR եւ այլն: (1994) Sf2 բջիջներում մարդու D9L դոպամինային ընկալիչի ֆոսֆլորացում եւ palmitolation: J Neurochem 63- ը `1589-1595: doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Դոպամին D (2) ռենտգենյան ազդանշանների մոդինացում, ակտին կապող սպիտակուցներով (ABP-280): Մոլ Pharmacol 57- ը `446-452:
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H եւ այլն: (2010) Agonist- ի դրսեւորած endocytosis եւ ընկալիչ ֆոսֆորում միջամտել dopamin D (2) ընկալիչների resensitization. Mol Endocrinol 24- ը `574-586: doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 է ցինկային կախված kinase 5- ի նյարդային հատուկ կարգավորող ստորաբաժանում: Բնություն 371- ը `419-423: doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) CDK5- ի տասնամյակ: Nat Rev Mol Cell Բիոլոգի 2- ը `749-759: doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Ֆու ԱԿ, Ip NY (2007) Cyclin- կախված kinase 5- ը կապում է դենտրիտային ողնաշարի զարգացման ժամանակահատվածի հետկտրուկային ակտիվացմանը: Cell Adh Migr 1- ը `110-112: doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Cdk5 ակտիվացումն առաջացնում է hippocampal CA1 բջջային մահվան ուղղակիորեն ֆոսֆորացված NMDA ընկալիչների կողմից: Nat Neurosci 6- ը `1039-1047: doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5- ը կարգավորում է tyrosine 1472 NR2B- ի ֆոսֆորման եւ NMDA ընկալիչների մակերեսային արտահայտությունը: J Neurosci 28- ը `415-424: doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Cyclin- կախված kinase 5 ֆոսֆորլատները serin 31- ի թիրոսինային հիդրոքսիլազի եւ կարգավորում է կայունությունը: J Biol Chem 279- ը `54487-54493: doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, եւ այլն: (1999) DARPP-32- ի ֆոսֆորլյացիա Cdk5- ի կողմից կարգավորում է նեյրոնների դոպամինային ազդանշանները: Բնություն 402- ը `669-671:
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A եւ այլն: (2001) Քրոնիկ ազդեցության ազդեցությունը կոկաինի վրա կարգավորվում է Cdk5 նեյրոնային սպիտակուցով: Բնություն 410- ը `376-380:
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, եւ այլն: (2001) Հեքինային կախված kinase 5 / p35- ի եւ Reelin / Dab1- ի սիներգիստիկ ներդրումները զարգացող մկնիկի ուղեղի կորտիկային նեյրոնների տեղադրման համար: Քրեական դատավարություն ԱՄՆ-ի 98- ում `2764-2769: doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Cyclin- կախված kinase 5 ֆոսֆորում է նեյրոնների մեջ postsynaptic խտության սպիտակուցի PSD-95- ի N-տերմինալ տիրույթը: J Neurosci 24- ը `865-876: doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Պարկ SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke- ի պատգամավոր, Affar el B, եւ այլն: (2005) Par-4 հղումները դոպամինային ազդանշանների եւ դեպրեսիայի: Բջջային 122- ը `275-287: doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, եւ այլն: (2000) NUDEL- ն նոր Cdk5 նյութ է, որը համագործակցում է LIS1- ի եւ cytoplasmic dynein- ի հետ: Neuron 28- ը `697-711: doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Քիմ Քամին, Վալենզանո Կ.Ջ., Ռոբինսոն Ս.Ռ., Յաո Վ.Դ., Բարաք Լ.Ս. եւ այլն: (2001) dpamine D2- ի եւ D3- ի ընկալիչների տարբերակիչ կարգավորում `G սպիտակուցի զուգակցված ընկալիչ ընկալիչի քինազների եւ բետա-կալինների կողմից: J Biol Chem 276- ը `37409-37414: doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) A1 adenosine- ի եւ D2 դոպամինային ընկալիչների դիֆերենցիալ անջատումը Suramin եւ Didemethylated Suramin (NF037) կողմից: Մոլ Pharmacol 53- ը `808-818:
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, եւ այլն: (2000) Calmodulin- ի ամրացումը D2-dopamine- ի ընկալիչին նվազեցնում է ընկալիչի ազդանշանը `G- ի սպիտակուցի ակտիվացման անջատիչը: J Biol Chem 275- ը `32672-32680: doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. Ցանկ SJ, Seeman P (1981) [3H] spiperone- ի դոպամինի եւ serotonin reseptor բաղադրիչների որոշումը, որոնք կապում են առնետի ուղեղի շրջաններին: Քրեական դատավարություն ԱՄՆ-ի 78- ում `2620-2624: doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) Agonist գործողությունը D2 (երկար) dopamine reseptors: ligand պարտադիր եւ ֆունկցիոնալ փորձարկումներ: Br J Pharmacol 124- ը `978-984: doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Dopamine Dopamine- ը տեղադրում է [2003H] domperidone Dopamine D3 ընդունիչի բարձր տեղակայված վայրերից, բայց ոչ [2H] raclopride կամ [3H] spiperone է izotonic միջավայրում. Արդյունքները մարդու պոզիտրոնային արտանետումների տոմոգրաֆիայի համար: Synapse 3- ը `49-209: doi: 215 / syn.10.1002
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0. Բջջային ազդանշանի փոխազդեցության պրոտեոմետր լայն կանխատեսումներ, օգտագործելով կարճ հաջորդականության մոտիվներ: Nucleic Acids Res 31- ը `3635-3641: doi: 10.1093 / նար / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Պատահական նմուշառման մոդելը եւ հրացանային պրոտոմիկաների հարաբերական սպիտակուցների առատության գնահատումը: 76- ի անալոգային քիմիա: 4193-4201: doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Dopamine D1999 ընկալիչների կախվածությունը կախված է G-proteins-coupled reseptor kinases 2- ի կամ 2- ի համադրությունից: Eur J Biochem 5- ը `260-112: doi: 119 / j.10.1046-1432.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Protein kinase C- ն միջնորդում է D2- ի դոֆամինային ընդունիչի ֆոսֆորիլացիան, desensitization- ը եւ թրաֆիքինգը: J Biol Chem 279- ը `49533-49541: doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, եւ այլն: (2011) Cdk5- ի միջամտել էնդոֆիլինի B1- ի ֆոսֆորալացումը պարտադիր է autospagy- ի համար Parkinson- ի հիվանդության մոդելներում: Nat Cell Biol 13- ը `568-579: doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, եւ այլն: (2001) p35 / cdk5- ը կապում եւ ֆոսֆորիլացնում է beta-catenin եւ կարգավորում է beta-catenin / presenilin-1 փոխազդեցությունը: Eur J Neurosci 13- ը `241-247: doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Կոկաինի ամրապնդման հատկությունների դոպամին հիպոթեզը: Թրենդներ Neurosci 14: 299-302: doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, եւ այլն: (1990) Քրոնիկ կոկաինի չարաշահման ազդեցությունները postsynaptic dopamine reseptors- ում: Am J Psychiatry 147- ը `719-724:
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE եւ այլն: (2007) Nucleus accumbens D2 / 3 ընդունիչները կանխատեսում են ուղեղի խթանման եւ կոկաինի ամրացման մասին: Գիտություն 315- ը `1267-1270: doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL եւ այլն: (2006) Կապիկների քրոնիկ կոկաինի ինքնակառավարման ժամանակ DPAM- ի D2 ընդունիչների PET պատկերումը: Nat Neurosci 9- ը `1050-1056: doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Ռոբինսոն TE, Kolb B (1997) Ամպետամինի հետ նախորդ փորձի արդյունքում առաջացած կառուցվածքային փոփոխություններ, որոնք առաջացնում են միջուկի accumbens եւ prefrontal cortex նեյրոններ: J Neurosci 17- ը `8491-8497:
  182. 41. Ռոբինսոն TE, Kolb B (1999) Ամպետամինի կամ կոկաինի հետ կրկնակի բուժումից հետո ճարպաթթուների եւ prefrontal կորտերի մեջ դենդրիտների եւ դենդրիտիկ հոդերի մորֆոլոգիայի փոփոխություններ: Eur J Neurosci 11- ը `1598-1604: doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) CREB եւ DeltaFosB- ի կողմից գենային արտահայտման եւ կոկաինի պարգեւի կարգավորումը: Nat Neurosci 6- ը `1208-1215: doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA եւ այլն: (2000) Spinophilin- ը կարգավորում է դենդրիտիկ ողնաշարի ձեւավորումը եւ գործառույթը: Քրեական դատավարություն ԱՄՆ-ի 97- ում `9287-9292: doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Կոստիկային նեյրոնների վաղ զարգացման ընթացքում կայուն ողնաշարի պրեկուրսորների հետ կապված postsynaptic խտության-95 կլաստերի մոդուլային փոխադրում: J Neurosci 21- ը `9325-9333:
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarisation- ն առաջացնում է beta-Catenin- ը նեյրոնային հոդերի մեջ `խթանելով փոփոխությունների եւ կառուցվածքների փոփոխությունները: Neuron 35- ը `91-105: doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, եւ այլն: (2004) Փոխակերպված կորտիկային սինապտիկ morphology եւ խանգարված հիշողությունը համախմբում է նախաբջջանի հատուկ գերիշխող բացասական PAK transgenic mice. Neuron 42- ը `773-787: doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, եւ այլն: (2007) Cdk5- ը մոդուլացնում է կոկաինը, պտուղը եւ ստիատիկական նեյրոնային հուզմունքը: J Neurosci 27- ը `12967-12976: doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW եւ այլն: (2008) Cdk5- ի ստերիալալ դեզոդուլյացիան փոխում է կոկային, շարժիչի եւ դենդրիտիկական մորֆոլոգիայի շարժիչային արձագանքները: Քրեական դատավարություն ԱՄՆ-ի 105- ում `18561-18566: doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K- ը, Storm DR- ը (1999) Նոր կապեր ստեղծելով `նեյրոնային պլաստիկության մեջ ERK / MAP kinase ազդանշանների դերը: Neuron 23- ը `11-14: doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3