Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apr; 300 (4): R876 – R884.
Diterbitkan secara online 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Abstrak
Kami sebelumnya telah melaporkan bahwa pemberian insulin ke dalam nukleus arkuata hipotalamus menurunkan motivasi sukrosa, yang dinilai oleh tugas pemberian-sendiri, pada tikus. Karena pola aktivasi sistem saraf pusat (SSP) dalam kaitannya dengan pemberian sukrosa secara mandiri belum dievaluasi, dalam penelitian ini, kami mengukur ekspresi c-Fos sebagai indeks aktivasi neuron. Kami melatih tikus untuk menekan sukrosa, sesuai dengan jadwal rasio tetap (FR) atau rasio progresif (PR) dan memetakan ekspresi imunoreaktivitas c-Fos di CNS, dibandingkan dengan ekspresi c-Fos dalam kontrol yang ditangani. Kami mengamati ekspresi unik c-Fos dalam hipotalamus medial (arkuata, paraventrikular, retrochiasmatic, dorsomedial, dan inti ventromedial) dalam hubungannya dengan onset kinerja PR, dan ekspresi c-Fos pada hipotalamus lateral dan nukleus unggun. stria terminalis terkait dengan onset kinerja FR. Ekspresi c-Fos meningkat pada nucleus accumbens dari tikus FR dan PR. Penelitian kami menekankan pentingnya sirkuit homeostasis energi hipotalamus dan sirkuit limbik dalam kinerja tugas pemberian makanan. Mengingat peran hipotalamus medial dalam regulasi keseimbangan energi, penelitian kami menunjukkan bahwa sirkuit ini dapat berkontribusi untuk pengaturan regulasi dalam konteks homeostasis energi yang lebih besar.
sirkuit dopaminergik mesolimbik (DA), termasuk area ventral tegmental (VTA) dan proyeksi ke striatum dan situs kortikal, telah diidentifikasi sebagai memainkan peran penting dalam memotivasi atau memberi penghargaan pada aspek memotivasi dari berbagai kelas berbagai jenis penyalahgunaan obat (13, 22-24, 26, 48). Penelitian terbaru dari laboratorium kami dan orang lain menunjukkan bahwa sirkuit ini juga memainkan peran utama dalam memotivasi atau memberi penghargaan pada aspek makanan. Interaksi fungsional dan anatomis dengan sirkuit yang mengatur homeostasis energi disarankan oleh laporan modulasi hadiah makanan oleh status gizi hewan (10, 14, 16, 43). Modulasi ganjaran, termasuk ganjaran makanan, oleh status gizi atau metabolisme, sangat dipengaruhi oleh sinyal saraf dan endokrin, termasuk insulin (15), leptin (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), hormon konsentrat melanin (KIA) (45), dan orexin (5, 7): keberadaan reseptor, kemanjuran biokimia dan seluler, dan kemanjuran in vivo atau perilaku dari sinyal-sinyal ini dalam sistem saraf pusat (SSP) telah banyak ditunjukkan dalam beberapa tahun terakhir.
Sirkuit limbik yang diperluas juga telah terbukti berperan dalam memberi makan dan hadiah makanan (2, 19, 28). Namun, ada situs CNS yang berkontribusi tambahan. Khususnya, hipotalamus lateral (LH) telah lama dikenal sebagai situs mediasi perilaku makan dan stimulasi diri (4, 31). Neuron-neuron orexinergik dan pensinyalan leptin dalam LH telah diidentifikasi sebagai penting untuk pemberian makan dan hadiah makanan (5, 29, 30). Kami baru-baru ini mengamati bahwa insulin yang diberikan baik ke ventrikel otak ketiga atau ke dalam arkuata hipotalamus (ARC) dapat mengurangi pemberian sukrosa secara mandiri, tetapi pemberian insulin ke dalam VTA atau nucleus accumbens tidak berpengaruh pada paradigma imbalan khusus ini (15). Dengan demikian, tampak bahwa beberapa situs hipotalamus mungkin memainkan peran penting dalam mencari dan memperoleh makanan yang termotivasi, dan konsisten dengan ini, orang akan berhipotesis bahwa daerah hipotalamus secara substansial diaktifkan dalam kaitannya dengan administrasi makanan sendiri. Untuk mulai menguji hipotesis ini, kami telah memetakan ekspresi c-Fos dalam SSP tikus yang dilatih dalam paradigma administrasi mandiri sukrosa, setelah pelatihan rasio tetap (FR), atau setelah pelatihan rasio progresif (PR), tugas yang lebih ketat untuk menilai motivasi (20).
BAHAN DAN METODE
Subjek.
Subjek penelitian adalah tikus Albino jantan (325–425 g) dari Simonsen (Gilroy, CA). Tikus dipelihara dengan chow ad libitum. Mereka dipertahankan pada siklus terang-gelap 12: 12-jam dengan lampu menyala pada pukul 6 pagi dan dilatih dan diuji antara pukul 7 pagi dan siang, dalam kondisi postprandial dan postabsorptive. Semua prosedur yang dilakukan pada tikus mengikuti pedoman National Institutes of Health untuk perawatan hewan dan telah disetujui oleh Sub-komite Perawatan dan Penggunaan Hewan dari Komite Penelitian dan Pengembangan di VA Puget Sound Health Care System.
Sukrosa administrasi diri.
Prosedur didasarkan pada metodologi yang kami publikasikan (15) dan dilakukan pada tikus yang diberi makan. Percobaan termasuk tiga fase: autoshaping untuk memulai pelatihan, pelatihan FR, dan pelatihan rasio progresif (PR) menggunakan algoritma PR dari Richardson dan Roberts (38). Algoritma PR membutuhkan 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, XNX, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX dll) tuas penekan untuk pengiriman hadiah yang berhasil dalam suatu sesi (38). Tikus dilatih untuk mengatur sendiri sukrosa 5% (hadiah 0.5 ml) yang dikirim ke wadah tetesan cairan. Kotak operan, dikendalikan oleh sistem Med Associates (Georgia, VT), memiliki dua tuas, tetapi hanya satu tuas (tuas yang aktif dan dapat ditarik) yang mengaktifkan pompa infus. Penekan pada tuas lain (tuas stasioner yang tidak aktif) juga direkam. Seperti yang telah kami amati sebelumnya, jumlah penekanan pada tuas tidak aktif sangat rendah (kurang dari penekanan / sesi 10). Solusi sukrosa dikirim ke wadah penurunan cairan untuk konsumsi oral (Med Associates, St. Albans, VT). Pelatihan awal dilakukan selama sesi 1-h di bawah jadwal penguatan berkelanjutan (FR1: setiap tuas pers diperkuat). Setiap sesi dimulai dengan penyisipan tuas aktif dan pencahayaan lampu rumah putih yang tetap menyala selama seluruh sesi. Nada 5-s (2900 Hz, 20 dB di atas latar belakang) dan cahaya (7.5 W lampu putih di atas tuas aktif) isyarat gabungan isyarat menyertai setiap pengiriman hadiah, dengan waktu 20-s dimulai dengan pengiriman sukrosa. Pelatihan FR dilakukan selama 10 hari; respon stabil dicapai pada sesi kelima. Pelatihan PR dilakukan untuk kemungkinan 3 maksimum h / hari selama 10 hari. Sesi PR berakhir setelah 30 menit dari tidak ada tuas pers yang merespons, pada saat mana lampu rumah dimatikan secara otomatis dan tuas aktif ditarik kembali; tikus-tikus dibawa keluar dari kamar-kamar dan dikembalikan ke kandang rumah mereka. "Stop time" dilaporkan dalam Tabel 2 mewakili waktu di mana sistem dimatikan; oleh karena itu, tuas pers aktif terakhir akan terjadi 30 menit sebelum waktu berhenti. Data perilaku (Tabel 2) mewakili rata - rata sesi 6-10 untuk pelatihan FR, dan sesi 1-9 untuk pelatihan PR. Tikus yang ditangani dengan kontrol diambil dari ruang perumahan dan ditempatkan di ruang operan bersih dengan lampu rumah menyala selama 60, di dalam ruang prosedur, untuk mensimulasikan pengalaman penanganan dan ruang dari tikus sukrosa yang dikelola sendiri. Mereka tidak diberi makan atau minum apa pun di dalam kotak operan, dan tidak memiliki akses ke tuas.
Pada hari terakhir, tikus ditempatkan di dalam ruang sesuai hari pelatihan dan disimpan di dalam ruang selama 90 menit, setelah itu dikeluarkan, untuk anestesi, perfusi, dan imunohistokimia selanjutnya. Tikus kontrol juga dibawa ke ruang prosedur dan disimpan dalam ruang operasi yang bersih, sesuai hari pelatihan, selama 90 menit, setelah itu dibius dan diberi wewangian. Segera setelah sesi 90 menit terakhir, tikus dibius mendalam dengan inhalasi isoflurane dan perfusi dengan NaCl 0.9% diikuti dengan larutan paraformaldehida 4% dingin. Waktu untuk anestesi dan eutanasia didasarkan pada waktu yang diketahui dari ekspresi puncak protein c-Fos pada 90-120 menit setelah kejadian. Jadi, ekspresi c-Fos akan mencerminkan aktivasi SSP pada permulaan tugas perilaku, daripada hasil dari pengalaman hewan tersebut dan menelan sukrosa. Otak dilepas dan dipasang di paraformaldehyde selama beberapa hari; Kemudian, mereka kemudian ditempatkan dalam 20% sukrosa-PBS, setelah itu ditempatkan dalam larutan sukrosa-PBS 30%. Otak dipotong pada cryostat (cryostat Leica CM 3050S) untuk imunohistokimia.
c-Fos imunohistokimia dan kuantisasi.
Kami menggunakan metodologi kami yang sudah ada untuk mengukur protein c-Fos imunoreaktif di bagian otak (12). Layar kualitatif awal seluruh otak dilakukan untuk ekspresi c-Fos. Slide-mount 12-μm seluruh bagian otak koronal dicuci 3 kali dalam PBS (Oxoid, Hampshire, UK). Bagian kemudian diblokir selama 1 jam pada suhu kamar dalam PBS yang mengandung 5% kambing normal atau serum keledai. Bagian kemudian dicuci beberapa kali dalam PBS dan diinkubasi semalaman di 4 ° C dalam larutan antibodi primer yang dibuat dalam PBS. Bagian dicuci tiga kali dalam PBS dan kemudian diinkubasi dalam gelap pada suhu kamar dalam larutan antibodi sekunder dibuat di PBS selama 1 h. Bagian kemudian dicuci lagi di PBS dan dipasang dan penutup diselipkan dalam media pemasangan Vectashield hard set (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Gambar digital bagian diperoleh dengan menggunakan mikroskop fluoresensi Nikon Eclipse E-800 yang terhubung ke kamera Optiphot dan menggunakan perangkat lunak Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Selanjutnya, kami fokus pada sejumlah area yang menunjukkan perbedaan nyata antara kondisi, untuk kuantisasi, dan untuk fenotip neuron. Secara khusus, kami fokus pada nucleus accumbens core and shell (NAc); nukleus anterior dan posterior stria terminalis (aBNST, pBNST); daerah hipotalamus medial [nukleus ventromedial (VMH), hipotalamus dorsomedial (DMH), nukleus paraventrikular (PVN), daerah retrochiasmatic (RCh), dan ARC]; lateral hipotalamus (LH), termasuk daerah punggung dan perut dan daerah perifornical (PEF); VTA; batang otak [inferior zaitun, nukleus hipoglosus (nXII) dari saluran soliter, nukleus reticular lateral, dan C1 / A1 inti adrenalin / noradrenalin]. Bagian 12-μm yang cocok dengan Atlas dievaluasi untuk ekspresi dan kuantisasi c-Fos pada bagian dan wilayah yang cocok, berdasarkan atlas Paxinos dan Watson (34). Tolong lihat Tabel 1 untuk koordinat stereotoksik tertentu. Fokus utama dari tes ini adalah untuk membandingkan setiap tugas perilaku dengan kontrol masing-masing (PR vs PRC; FR vs FRC). Untuk mengoptimalkan kemungkinan perbedaan berdasarkan pada perilaku vs kondisi kontrol, kinerja puncak dari kelompok PR dan FR dipilih untuk analisis. Dengan demikian, tikus 4 / 12 PR dan 3 / 12 FR dianalisis: Tikus ini memiliki nomor pers tuas aktif (titik akhir perilaku primer) yang lebih besar dari satu standar deviasi di atas rata-rata untuk masing-masing kelompok perilaku mereka. Subkohort dari tikus kontrol (5 PRC dan 3 FRC, hadir di ruang prosedur bersamaan dengan tikus FR atau PR) juga dianalisis. Kelompok tambahan tiga tikus diambil melalui prosedur FR ("FRext") untuk meniru durasi prosedur PR yang ditambahkan (yaitu, untuk total hari 20, karena tikus PR diambil melalui FR dan kemudian PR) untuk mengevaluasi apakah perbedaan antara FR dan PR adalah karena tugas perilaku atau durasi prosedur. Otak FRext tidak dianalisis dan disaring secara sistematis, tetapi wilayah minat tertentu diuji dengan empat kelompok lain, untuk memungkinkan kuantisasi komparatif, seperti ditunjukkan secara khusus dalam hasil.
Untuk kuantitasi (pada pembesaran 40 ×), daerah yang cocok dengan atlas dipilih. Perangkat lunak ImagePro Plus (Media Cybernetics) digunakan untuk mengambil gambar dari area yang diinginkan. Area ditentukan untuk penghitungan, dan ambang batas untuk jumlah sel positif ditetapkan. Area dan latar belakang yang identik (ambang batas) digunakan untuk bagian dari masing-masing kelompok eksperimen, dan penghitungan perangkat lunak sel positif (kuantisasi) dilakukan pada sesi yang sama untuk semua kelompok eksperimen, untuk mencegah perubahan antar sesi dalam pengaturan latar belakang. Untuk analisis statistik, penghitungan diambil dari tikus individu hanya jika bagian yang sesuai atau lengkap melalui masing-masing daerah (sebagaimana didefinisikan dalam Tabel 1) tersedia; data untuk area tertentu tidak diambil dari tikus jika ada perwakilan bilateral yang tidak lengkap untuk area itu.
Analisis imunofluoresensi berlabel ganda kualitatif.
Bagian otak diambil dari tikus di mana c-Fos dihitung, untuk imunohistokimia berlabel ganda. Karena kami tidak ingin mengganggu kinerja perilaku hewan, mereka tidak diberikan kolkisin sebelumnya untuk mengoptimalkan visualisasi neurotransmiter peptida. Oleh karena itu, visualisasi fenotipe neuronal yang diaktifkan dalam hubungannya dengan tugas administrasi sendiri dibatasi. Namun, untuk memulai penilaian fenotipe neuron teraktivasi di sejumlah lokasi SSP, gambar digital (diperoleh seperti dijelaskan pada bagian di atas) diambil pada pembesaran 20x, 40x, atau 60x (seperti yang ditunjukkan dalam legenda gambar) . Prosedur pewarnaan ganda untuk glutamat dekarboksilase (GAD), tirosin hidroksilase (TH), CRF, neuropeptida Y (NPY), peptida terkait Agouti (AgRP), dan triptofan hidroksilase sebanding dengan pengujian imunoreaktivitas c-Fos pada sendiri, kecuali bahwa campuran c-Fos-Ab dan salah satu antibodi primer lainnya digunakan untuk inkubasi semalam pada suhu 4 ° C; demikian pula, kedua antibodi sekunder berada dalam larutan yang sama dan diinkubasi selama 1 jam dalam gelap pada suhu kamar. Pencucian etanol 20% selama 50 menit sebelum langkah pemblokiran digunakan untuk uji orexin. Pengujian pengoptimalan awal dilakukan untuk menentukan pengenceran yang sesuai dari antibodi primer. Antibodi primer yang digunakan adalah anti-c-Fos kelinci (1: 500) (sc-52) dan anti-c-Fos (1: 800) tikus (keduanya dari Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); tikus anti-GAD (1: 1,000), tikus anti-tirosin hidroksilase (1: 500), dan domba anti-triptofan hidroksilase (semua dari Chemicon, Temecula, CA); kelinci anti-CRF (1: 500) (hadiah dari Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA); kelinci anti-NPY (1: 1,000), kelinci anti-AGRP (1: 1,000), dan kambing anti-orexin A (1: 5,000) semuanya dari Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Antibodi sekunder yang digunakan adalah anti-kelinci atau anti-tikus kambing terkonjugasi Cy3 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Anti-tikus Alexa Fluor 488 kambing atau IgG anti-kelinci atau keledai anti-domba (Molecular Probes, Eugene, OR) ; semua antibodi sekunder diencerkan pada 1: 500. c-Fos / MCH dual immunostaining diuji secara serial; pertama, untuk MCH (1: 2,500 antibodi primer, Millipore) dengan antibodi sekunder Alexa-488-goat anti-rabbit (1: 500). Slide diblok ulang dengan 5% serum kambing normal dan diwarnai untuk anti-c-Fos (1: 500) dan cy3-goat anti-rabbit sebagai antibodi sekunder. Pencucian etanol 20% selama 50 menit sebelum langkah pemblokiran digunakan untuk uji KIA.
Analisis statistik.
Data kelompok disajikan sebagai sarana ± SE dalam teks, tabel, dan gambar. Signifikansi didefinisikan sebagai P ≤ 0.05. Perbandingan statistik dibuat antara kelompok eksperimen (FR vs. PR) atau antara kelompok eksperimen dan kontrol yang sesuai (PR vs. PRC; FR vs. FRC) menggunakan Student's yang tidak berpasangan. t-uji. Koefisien korelasi Pearson antara penekanan tuas aktif dan ekspresi c-Fos di daerah otak yang berbeda, serta korelasi ekspresi c-Fos antara berbagai daerah otak di bawah kondisi eksperimental yang identik, dihitung menggunakan program analisis statistik StatPlus: mac LE untuk versi Mac OS 2009 oleh AnalystSoft. Kami menguji korelasi linier (Pearson's R statistik) antara ekspresi c-Fos di berbagai wilayah CNS. Kami juga memeriksa korelasi antara ekspresi c-Fos di berbagai daerah CNS yang diaktifkan dan perilaku. Data FR dan PR dari tikus, yang dilakukan kuantitasi c-Fos, digunakan untuk korelasi ini.
HASIL
kuantisasi c-Fos.
Seperti yang telah kami amati sebelumnya, jumlah penekan tuas aktif secara signifikan lebih besar untuk kinerja PR vs FR (Tabel 2), dan jumlah hadiah sukrosa lebih besar selama kinerja FR. Panjang sesi untuk tikus PR adalah sekitar 90 mnt (waktu berhenti - 30). Tabel 3 daftar c-Fos jumlah sel imunoreaktif di semua wilayah CNS di mana kuantisasi dilakukan. Pola ekspresi c-Fos untuk tikus FR dan PR dirangkum dalam Ara. 1. Ada aktivasi signifikan dari hipotalamus medial (MHanak kecil, gabungan ARC, PVN, RCh, DMH, dan VMH) dari tikus yang terlibat dalam tuas PR menekan sukrosa, tetapi tidak ada aktivasi keseluruhan pada tikus yang terlibat dalam tuas FR yang menekan sukrosa, dibandingkan dengan masing-masing kontrol. Dalam hipotalamus medial tikus PR, aktivasi ini terjadi pada PVN, ARC, dan VMH (Ara. 2). Penekan tuas FR, tetapi tidak menekan tuas PR, dikaitkan dengan aktivasi signifikan dalam LH (terutama didasarkan pada aktivasi dalam area perifornical). Kedua penekan tuas aktif dan ekspresi c-Fos hipotalamus sebanding antara kelompok FRext dan FR (MHanak kecil, 946 ± 26 dan 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 dan 186 ± 10; LHanak kecil, 468 ± 79 dan 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 dan 173 ± 15, masing-masing), menunjukkan bahwa perbedaan dalam pola ekspresi antara kelompok FR dan PR terkait tidak dengan durasi pelatihan / pengalaman tetapi dengan sifat tugas instrumental. Untuk kelompok FR, ada peningkatan yang signifikan dalam ekspresi c-Fos di BNST, diamati pada aBNST dan pBNST. Kedua menekan tuas FR dan PR dikaitkan dengan peningkatan neuron c-Fos-imunopositif di cangkang NAc; Jumlah c-Fos secara signifikan meningkat pada inti NAc dari tikus yang terlibat dalam menekan tuas FR, dengan tren yang tidak signifikan terhadap peningkatan ekspresi c-Fos pada tikus yang terlibat dalam penekanan tuas PR. c-Fos tidak meningkat dalam VTA dengan tugas PR, meskipun tren tidak signifikan terhadap peningkatan diamati dengan tugas FR. Akhirnya, c-Fos secara signifikan meningkat pada nukleus hypoglossal (saraf kranial XII) di batang otak tikus yang dilatih untuk PR, tetapi tidak untuk FR.
Ekspresi c-Fos diamati di daerah CNS lainnya, termasuk amigdala dan korteks serebral (Ara. 3). Namun, ekspresi diamati pada kedua kondisi kontrol serta dalam hubungan dengan tugas PR dan FR, menunjukkan bahwa aspek spesifik dari prosedur (penanganan, perpindahan ke ruang prosedur) mungkin mengakibatkan aktivasi ini. Kuantitas di wilayah ini tidak dilakukan. Demikian pula, aktivasi dalam daerah batang otak selain nXII diamati, tetapi terjadi dalam hubungan dengan kedua kondisi kontrol dan yang berhubungan dengan tugas, juga menunjukkan peran dalam gairah atau aktivasi perilaku yang tidak spesifik.
Kami menguji korelasi antara ekspresi c-Fos di wilayah SSP yang berbeda. Menggabungkan data dari grup pengungkit, kami menemukan korelasi negatif antara ekspresi c-Fos di LH dan VMH; dengan demikian, aktivasi VMH dikaitkan dengan penurunan keseluruhan aktivasi LH (Pearson's R, −0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Juga, kami mengamati korelasi positif yang signifikan antara ekspresi c-Fos di wilayah perifornical dari LH dan VTA (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), konsisten dengan konektivitas monosinaptik yang diketahui antara kedua wilayah ini (lihat diskusi dalam Referensi. 2 dan 13). Kami menemukan korelasi negatif yang signifikan antara ekspresi c-Fos di VTA vs NAc-shell, baik diuji secara terpisah untuk kinerja FR (Pearson's R, −0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) atau untuk kinerja PR (Pearson's R, −0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), konsisten dengan input timbal balik yang diketahui antara daerah striatal ke substantia nigra dan VTA (2, 13). Kami juga menguji korelasi antara ekspresi c-Fos di berbagai wilayah SSP, dan perilaku. Menggabungkan data dari kelompok penekan tuas, kami mengamati korelasi positif yang signifikan antara c-Fos di ARC, dan pengepres tuas aktif (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Identifikasi neuron diaktifkan dengan asupan sukrosa dan motivasi untuk sukrosa.
Di batang otak, neuron c-Fos-positif tidak menunjukkan imunostaining positif untuk TH, enzim pembatas laju untuk epinefrin dan norepinefrin (dan dopamin); dengan demikian, neuron katekolaminergik ini tampaknya tidak diaktifkan oleh tugas FR atau PR. Namun, beberapa neuron c-Fos-positif menunjukkan immunostaining positif untuk triptofan hidroksilase, menunjukkan bahwa populasi neuron serotonin diaktifkan. Seperti yang ditunjukkan pada Ara. 4, di ARC, badan sel c-Fos-positif dikelilingi oleh serat bernoda AGRP, dan pola yang sama untuk immunostaining serat NP / serat / c-Fos diamati (tidak ditampilkan). Dalam PVN, neuron c-Fos-positif muncul mengelilingi neuron positif-CRF, tetapi tidak ada colocalization diamati (data tidak ditampilkan). Ara. 5 menunjukkan immunostaining untuk orexin dan KIA di LH. Neuron orexin ditemukan pada dLH dan peLH. Meskipun kami mengamati neuron MCH-positif di PELH, pada dasarnya tidak ada colocalization dengan c-Fos di wilayah LH tersebut. Namun, kami mengamati colocalization c-Fos di neuron orexin-positif dalam PELH (Ara. 6, puncak), dan kolokisasi c-Fos yang sangat terbatas dengan KIA dalam vLH (Ara. 6, dasar). Harus ditekankan kembali bahwa baik lokalisasi, dan colocalization dengan c-Fos, dapat diremehkan untuk neurotransmitter peptida seperti CRH, karena tikus tidak diobati dengan colchicine. Akhirnya, di dalam nukleus accumbens core dan shell (Ara. 7), c-Fos coimmunostaining dengan GAD, enzim sintetis untuk neurotransmitter GABA, diamati, untuk tikus FR dan PR. Ada pewarnaan yang kuat untuk TH dalam VTA; Namun, neuron c-Fos-positif jarang diamati dan tampaknya tidak secara eksklusif melakukan kolokasi dengan TH.
PEMBAHASAN
Dalam penelitian ini, kami menggunakan ekspresi gen awal langsung, c-Fos, untuk mengevaluasi pola aktivasi SSP akut yang terkait dengan timbulnya aktivitas menekan tuas swa-administrasi sukrosa, baik sebagai tugas yang relatif tidak menuntut (FR) atau tugas yang secara progresif lebih menantang dianggap mencerminkan pencarian hadiah yang termotivasi, seperti sukrosa, dan sangat melibatkan sirkuit limbik (22, 24, 49) (PR). Pola aktivasi hipotalamus berbeda antara dua tugas, dengan aktivasi LH / limbik mendominasi dalam tugas FR dan aktivasi medial hipotalamus / aktivasi limbik yang mendominasi dalam tugas PR (lihat Ara. 1). Ada beberapa kemungkinan alasan untuk ini. Pertama, paradigma ini mungkin "memetakan" sebagai pengalaman yang berbeda secara kualitatif di SSP. Tikus yang terlatih dalam kinerja FR akan mengharapkan aktivitas yang mudah dan memberi imbalan tinggi. Antisipasi makanan yang berharga harus sangat memengaruhi pola c-Fos yang diamati pada tikus FR. Perbedaan kualitatif yang tampak dalam pola aktivasi menunjukkan bahwa kemungkinan kedua - bahwa hewan-hewan PR hanya memiliki lebih banyak pengalaman dengan tugas-kurang kemungkinan, dan ini didukung oleh pengukuran kami C-Fos dalam hipotalamus tikus yang menerima sesi 20 FR , yang menunjukkan aktivitas yang mirip dengan kelompok FR, bukan kelompok PR. Kedua kemungkinan ini dapat diuji dengan secara sistematis meningkatkan kesulitan pelatihan FR dan mengevaluasi perubahan dalam aktivasi SSP, dalam hal ini, seseorang akan memprediksi perubahan kualitatif dalam pola aktivasi. Namun, sementara jumlah pengalaman pelatihan mungkin tidak menjelaskan pola aktivasi SSP, jumlah rata-rata imbalan sukrosa dalam sesi mungkin: tugas PR mungkin dipelajari sebagai pengalaman "kurang bermanfaat", dan ini mungkin secara fungsional terkait dengan kurangnya aktivasi LH. Dengan demikian, pola aktivasi SSP pada awal sesi mungkin mencerminkan keadaan interoseptif, seperti paradigma tempat terkondisi: kekuatan aktivasi dalam sirkuit limbik terkait dengan pembelajaran dan motivasi. Kami memang mengamati variabilitas ekspresi c-Fos dalam hipotalamus medial hewan FRC. Khususnya dalam PVN, variabilitas ini mungkin menutupi aktivasi pada tikus FR, di mana tren peningkatan c-Fos vs tikus FRC diamati (Tabel 3). Namun, aktivasi hipotalamus medial keseluruhan tidak berbeda antara hewan FR dan FRC.
Perlu dicatat bahwa meskipun tujuan kami adalah untuk mengidentifikasi situs CNS yang berkontribusi pada timbulnya perilaku, resolusi sementara agak menjadi pertimbangan. Seperti dibahas di bawah, sekarang dihargai bahwa subkomponen yang berbeda dari perilaku instrumental atau operan dimediasi oleh aktivasi populasi neuron yang berbeda (13, 23, 33, 49). Kami tidak dapat sepenuhnya mengesampingkan bahwa aktivasi karena penekanan bar yang sangat cepat atau menjilat hadiah mungkin telah sedikit berkontribusi pada pola aktivasi yang kami amati. Temuan kami memberikan dasar untuk investigasi lebih lanjut ke peran situs CNS spesifik dalam berbagai aspek atau komponen tugas administrasi diri, dan untuk studi tersebut, pengukuran gen awal langsung lainnya dengan berbagai rentang waktu "on" dan "off" (berbeda).36) akan sangat berguna.
Korelasi yang kami temukan dalam ekspresi c-Fos antara daerah otak yang berbeda mendukung konektivitas fungsional yang diketahui dari daerah hipotalamus dan limbik primer untuk tugas hadiah khusus ini, seperti antara LH dan VMH, dan antara wilayah periferal LH dan VTA (lihat diskusi dalam Referensi. 2 dan 13). Kami juga memeriksa korelasi antara ekspresi c-Fos di berbagai daerah yang diaktifkan, dan perilaku. Korelasi antara c-Fos dalam ARC dan penekan tuas aktif sesuai dengan peran aktivitas ARC yang didefinisikan dengan baik dalam asupan makanan (1); dengan pengamatan kami sebelumnya bahwa injeksi insulin secara spesifik ke dalam ARC menurunkan pemberian sukrosa secara mandiri (15); dengan laporan sebelumnya tentang peran kritis ARC, dan neuron endorphinergiknya, dalam perolehan dan kinerja pemberian kokain secara mandiri (40-42); dan dengan proyeksi yang diidentifikasi dari ARC ke NAc (17). Dengan demikian, ARC kemungkinan memainkan peran kunci dalam perilaku yang termotivasi untuk mencari dan mendapatkan banyak jenis rangsangan yang bermanfaat, termasuk, tetapi tidak terbatas pada, makanan. Akhirnya, kami mengamati aktivasi signifikan dari PVN dan VMH dengan timbulnya pencarian sukrosa PR. Ini konsisten dengan peran yang ditandai dengan baik dari nuklei hipotalamus medial ini dalam pengaturan asupan makanan, konektivitas sinaptik langsung dengan ARC, dan hubungan yang diidentifikasi dengan sirkuit limbik (1, 27, 37).
Kami menemukan korelasi negatif yang signifikan antara ekspresi c-Fos dalam VTA vs NAc-shell, apakah diuji untuk FR atau kinerja PR. Agak mengejutkan bahwa aktivasi VTA yang lebih kuat tidak diamati dalam hubungan dengan pemberian PR atau FR sukrosa sendiri (vs kontrol masing-masing). Mungkin temuan ini mencerminkan waktu pengukuran kami, dengan fokus pada situs CNS potensial yang aktif pada permulaan tugas, di mana hewan-hewan ini dilatih dengan baik. Ini akan konsisten dengan pengamatan dan tesis Schultz (44), bahwa aktivasi neuron dopamin berfungsi sebagai penanda rangsangan atau penghargaan yang tidak terduga, dan aktivasi ini menurun sehubungan dengan pelatihan. Namun, pelepasan dopamin striatal selama pengambilan sukrosa pada hewan terlatih telah terbukti terjadi sebagai peristiwa diskrit yang sangat tepat dan sementara (39). Dengan demikian, ada kemungkinan bahwa tren yang kami amati akan sangat signifikan dengan kelompok studi yang lebih besar (yaitu, lebih banyak kekuatan statistik). Kami mengamati aktivasi NAc terkait dengan onset pengambilan FR dan sukrosa PR. Baik aktivasi dan penghambatan neuron NAc telah dilaporkan dalam kaitannya dengan kinerja hadiah instrumental, dan pola aktivasi / aktivitas tergantung pada pelatihan dan lingkungan, dan dikaitkan dengan komponen perilaku yang berbeda (misalnya, orientasi, pendekatan, asupan) (6, 33, 50). Seperti dibahas di atas, pengukuran c-Fos tidak akan menangkap aktivitas spesifik tersebut. Carlezon telah mengusulkan bahwa "hadiah" sebagian besar terkait dengan penurunan aktivitas neuron NAc, yaitu neuron berduri menengah (3). Ini tidak konsisten dengan pengamatan kami — NAc c-Fos yang secara substansial lebih baik dibandingkan dengan kontrol kontrol dan neuron c-Fos-positif yang dilokalisasi dengan GAD, konsisten dengan aktivasi neuron berduri sedang (GABAergik) —tapi kami belum secara khusus menilai penghambatan “neuron” neuron NAc. ” Aktivasi dan inhibisi NAc keduanya dapat terjadi selama tugas instrumental, dengan spesifisitas anatomi dan temporal. Dari perspektif penelitian ini, orang dapat menyimpulkan bahwa NAc terlibat dalam permulaan pengambilan sukrosa instrumental, dengan inti NAc berkontribusi pada aktivasi motorik dan shell NAc berkontribusi pada aspek motorik dan motivasi dari tugas tersebut.
Kami juga mengamati aktivasi kedua daerah utama BNST (anterior dan posterior) pada tikus FR. BNST adalah bagian dari sirkuit limbik yang memodulasi respons neuroendokrin untuk pengalaman stimulus berulang (8, 9), dan dalam arti yang lebih besar, dikaitkan dengan pembelajaran tentang rangsangan berulang. Meskipun perannya telah dijelaskan paling komprehensif dalam kaitannya dengan pengalaman stresor yang berulang, temuan kami menunjukkan peran yang lebih luas untuk BNST: BNST dapat memodulasi respons SSP untuk rangsangan positif, serta rangsangan negatif atau stres yang berulang. Karena kami mengamati aktivasi ini pada awal FR, tetapi tidak pada PR, kinerja, rekrutmen BNST dapat dikaitkan dengan peningkatan imbalan sukrosa dari pelatihan FR. Pengamatan kami tentang tidak ada aktivasi langsung neuron CRF menunjukkan bahwa respon instrumental untuk sukrosa bukanlah pemicu utama; Namun, ekspresi c-Fos dalam neuron PVN lainnya konsisten dengan modulasi sirkuit stres (46). Faktanya, Ulrich-Lai dan rekannya melaporkan bahwa, dengan menggunakan pola makan / pola makan yang berbeda, asupan sukrosa memodulasi fungsi PVN (47). Akhirnya, kami mengamati aktivasi nukleus dari saraf hipoglosus dalam hubungan dengan PR tetapi tidak pada kinerja FR. Signifikansi ini hanya dapat berspekulasi; satu kemungkinan adalah bahwa relevansi rasa sukrosa dapat meningkat pada tikus yang menelan lebih sedikit imbalan sukrosa.
Pencarian sukrosa dan pengambilan sukrosa harus dianggap sebagai pengalaman multimodality, dinamis dalam waktu, karena konsumsi akan menghasilkan sinyal perifer terkait dengan konten kalori sukrosa, serta habituasi dan alliesthesia dalam sesi (25). Sementara penelitian kami telah berfokus pada pengaruh sinyal endokrin perifer, yaitu, insulin dan leptin, untuk memodulasi hadiah makanan, efeknya mungkin, pada gilirannya, langsung dimediasi secara terpusat oleh pemancar dan neuropeptida yang berperan dalam jangka pendek atau jangka panjang pemberian makan atau hadiah makanan (lihat diskusi dalam Pustaka. 14). Studi saat ini memberikan beberapa wawasan tentang ini; kami mengamati beberapa aktivasi neuron yang mengekspresikan MCH atau orexin, dua neuropeptida yang bersifat orexigenic. Temuan ini, pada kenyataannya, meremehkan peran KIA atau orexin dalam hadiah makanan, karena imunositokimia pada tikus yang diobati dengan non-colchicine tidak diragukan lagi membatasi visualisasi kedua neuropeptida ini. Identifikasi neuron orexin teraktivasi dalam LH konsisten secara keseluruhan dengan banyak penelitian yang melibatkan neuron orexin dalam pemberian makan, hadiah makanan, dan hadiah stimulus yang lebih umum (misalnya, 5, 7, 29). Kami mengamati aktivasi neuron orexin peFLH. Aston-Jones dan rekannya (5) telah membedah peran populasi yang berbeda dari neuron LH orexin dalam perilaku hadiah dan telah terlibat neuron orFLIN peFLH dalam gairah, sebagai lawan dari hadiah per se. Temuan kami, dengan demikian, menunjukkan peran LH orexin dalam gairah, dan mungkin orientasi terhadap tuas aktif atau isyarat untuk pengambilan sukrosa.
Layak untuk dipertimbangkan di masa depan adalah keunikan atau generalisasi sukrosa sebagai stimulus yang bermanfaat. Apakah pola aktivasi SSP dini yang kami laporkan di sini khusus untuk makanan sebagai stimulus, atau digeneralisasikan ke rangsangan bermanfaat lainnya, masih harus ditentukan. Seperti disinggung di atas, khususnya dalam tugas FR, konsumsi sejumlah hadiah sukrosa akan diharapkan memiliki konsekuensi metabolik, dengan modulasi pelepasan hormon (misalnya, cholecystokinin, ghrelin, insulin) dan perubahan aktivasi saraf perifer dan SSP. Perubahan ini tidak diharapkan untuk memainkan peran langsung dalam pola aktivasi SSP awal yang kami ukur tetapi dapat memainkan peran dalam pembelajaran tentang hadiah sukrosa selama pelatihan. Sekali lagi, neuropeptida seperti orexin mungkin terlibat secara kritis.
Studi kami mewakili, sepengetahuan kami, demonstrasi pertama aktivasi nukleus hipotalamus medial spesifik pada awal pemberian sukrosa sendiri, termasuk PVN, yang terlibat dalam homeostasis dan responsifitas terhadap stres, dan ARC, yang sangat penting untuk homeostasis energi, penginderaan nutrisi, dan pengaturan asupan makanan. Yang penting, kami mengamati aktivasi hipotalamus medial dan NAc, dalam kaitannya dengan onset PR, menunjukkan bahwa homeostatik dan beberapa situs limbik berperan dalam inisiasi pemberian sukrosa secara mandiri. Situs sirkuit limbik tambahan dapat direkrut pada titik waktu berikutnya dalam tugas.
Perspektif dan Signifikansi
Sedangkan, secara historis, studi tentang perilaku motivasi dan penghargaan akan paling kuat berimplikasi sirkuit limbik SSP, sejumlah besar bukti telah bertambah yang menekankan interaksi fungsional kritis antara sirkuit homeostasis limbik dan energi. Studi saat ini menunjukkan kemungkinan pentingnya inti hipotalamus medial spesifik dalam kerja termotivasi untuk sukrosa. Ekstrapolasi dari studi ini, studi masa depan dapat mengevaluasi apakah peran hipotalamus medial diperlukan atau tidak dan apakah pengaktifannya berimplikasi dalam pencarian termotivasi dari hadiah lain seperti obat pelecehan. Selain itu, temuan penelitian ini memberikan alasan untuk mempelajari perubahan perilaku termotivasi dalam keadaan bersamaan dengan perubahan fisiologis hipotalamus medial, seperti pada obesitas.
HIBAH
Penelitian ini didukung oleh National Institutes of Health Grant DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann adalah Ilmuwan Karir Riset Senior, Program Penelitian Laboratorium Biomedis, Departemen Urusan Veteran Sistem Perawatan Kesehatan Puget Sound, Seattle, Washington. Sipols didukung oleh Dewan Hibah Sains Latvia 04.1116.
PENGUNGKAPAN
Tidak ada konflik kepentingan, finansial atau lainnya, yang dinyatakan oleh penulis.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami berterima kasih kepada Drs. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius, dan JE Blevins untuk saran dan diskusi bermanfaat.
REFERENSI
;