DeltaFosB stjórnar óbeinum Cck promoter virkni (2010)

Brain Res. 2010 Maí 6; 1329: 10 – 20.

Birt á netinu 2010 mars 11. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elizabeth Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edwards,2 Sade Spencer,2 Eric J. Nestler,3 og Colleen A. McClung2, *

Höfundarupplýsingar ► Höfundarréttur og Leyfisupplýsingar ►

Endanleg útgáfa útgáfunnar af þessari grein er aðgengileg kl Brain Res

Sjá aðrar greinar í PMC sem vitnar birt grein.

Fara til:

Abstract

Sumar af mikilvægum lífefnafræðilegum, uppbyggilegum og hegðunarlegum breytingum sem framkallaðar eru vegna langvarandi váhrifa á misnotkun lyfja virðast vera miðlar af mjög stöðugum umritunarstuðli ΔFosB. Fyrri vinna hefur sýnt að ΔFosB ofþrýstingur hjá músum í 2 vikur leiðir til aukningar á tjáningu fjölmargra gena í striatum, sem flest eru síðar stjórnað eftir 8 vikna ΔFosB tjáningu. Athyglisvert er að mikill fjöldi þessara gena var einnig stjórnað upp hjá músum sem ofgreindu umritunarstuðulinn CREB. Það var óljóst af þessari rannsókn, hvort skammtímafosb stjórnar þessum genum með CREB. Hér finnum við að 2 vikur af ofFosB ofþjáningu eykur tjáningu CREB í striatum, áhrif sem dreifast um 8 vikur. Snemma örvunin tengist aukinni CREB bindingu við ákveðna markgenaörvendur á þessu heila svæði. Furðu, eitt gen sem var grunur um CREB markmið miðað við fyrri skýrslur, kólsystokínín (Cck), var ekki stjórnað af CREB í striatum. Til að kanna nánar reglugerð um Cck í kjölfar ΔFosB ofþrýstings staðfestum við að skammtímatilraun ΔFosB eykur hvort tveggja Cck verkefnisstjóra og genatjáningu. Það eykur einnig bindingarvirkni á líklegri CREB bindissíðu (CRE) í CREB Cck verkefnisstjóri. Samt sem áður, þó að CRE-staðurinn sé nauðsynlegur fyrir eðlilega grunntjáningu Cck, það er ekki krafist fyrir ΔFosB örvun Cck. Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að þótt skammtímaframleiðsla FOSB auki tjáningu og virkni CREB hjá tilteknum genaverkefnum, er þetta ekki eini búnaðurinn sem genum er stjórnað upp við þessar aðstæður.

Leitarorð: kjarna accumbens, uppskrift, fíkn

Fara til:

INNGANGUR

Langvarandi váhrif á misnotkun lyfja veldur lífefnafræðilegum og skipulagsbreytingum á nokkrum heilasvæðum. Þessar breytingar eru taldar hafa í för með sér breytingar á genatjáningarsniðum í mesolimbíska kerfinu. Þetta kerfi er samsett úr dópamínvirkum taugafrumum sem varpa frá ventral tegmental area (VTA) í miðhjúpi yfir í miðlungs spiny taugafrumur í nucleus accumbens (NAc) (ventral striatum) auk fjölda annarra heila svæða. Breytingar á virkni tveggja umritunarþátta, cAMP svörunarþátta sem bindur prótein (CREB) og ΔFosB (Fos fjölskylduprótein), hafa verið lagðar til að miðla mörgum af lífefnafræðilegum, uppbyggilegum og hegðunarlegum breytingum sem sjást við langvarandi váhrif á misnotkun lyfja ( yfirfarið af Nestler, 2005).

CREB er alls staðar tjáður umritunarstuðull sem er aðili að CREB / ATF fjölskyldunni. CREB homodimers bindast afbrigði af CRE röð (samstaða: TGACGTCA) sem finnast í stuðlaranum í mörgum genum. Hægt er að örva fosfórun CREB (aðallega við serín 133, þó að aðrir staðir hafi verið greindir) með nokkrum merkjagöngum, þar með talið þeim sem eru aftan við dópamínviðtaka (Cole o.fl., 1995). Við fosfórýleringu við serín 133, ritar CREB samvirkjandi CREB bindingarprótein (CBP) eða skyld prótein sem leiðir til aukinnar tjáningar gena (skoðað af Johannessen o.fl., 2004). Langvarandi útsetning fyrir misnotkun ópíata eða geðrofslyfja veldur tímabundinni aukningu á virkni CREB í kjarnanum. (Barrot o.fl., 2002; Shaw-Lutchman o.fl., 2002, 2003), aðlögun sem talin er draga úr gefandi eiginleikum þessara lyfja og stuðla að neikvæðum tilfinningalegum frásögn lyfja (Nestler, 2005).

Lgríðarlegar varanlegar aðlöganir að misnotkunarlyfjum eru taldar miðla að hluta til af ΔFosB, mjög stöðugu afbrigði af FosB (Nestler o.fl., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Aðstandendur Fos gera lítið úr fjölskyldumeðlimum í Jun fjölskyldunni og mynda virkjunarprótein 1 (AP-1) flókið. AP-1 umritunarfléttur bindast afbrigði af AP-1 svörunarþáttnum (samstaða: TGACTCA) til að stjórna uppskrift (endurskoðuð af Chinenov og Kerppola, 2001). Þó bráð útsetning fyrir misnotkun lyfja leiði til skammvinnrar örvunar (klst.) Fos-fjölskyldumeðlima (sem og aukinnar virkni CREB) leiðir endurtekin váhrif til lyfja uppsöfnun mjög stöðugs ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrotti o.fl., 2008), sem tjáningin er viðvarandi í margar vikur.

Tvö-erfðabreyttar músar sem framkalla ofvirkt annaðhvort osFosB eða CREB í fullorðins striatum sýna margar af lífefnafræðilegum og hegðunarlegum svipgerðum sem sjást hjá dýrum sem hafa verið endurtekin fyrir geðörvandi lyfjum eða öðrum misnotkun lyfja. Agreining á breytingum á tjáningu gena hjá þessum erfðabreytta dýrum bent á fjölmörg gen sem voru stjórnað upp með skammtímatilvikum (2 vikum) of tjáningu á osFosB, breytingum í tengslum við samhliða lækkun lyfja umbun. Breytingarnar á tjáningu gena og hegðunarviðbrögðum við skammtíma ΔFosB voru ótrúlega svipaðar þeim sem sáust hjá dýrum sem ofreyndu CREB í 2 eða 8 vikur (McClung og Nestler, 2003). Aftur á móti minnkaði langtímaofþrýstingur (8 vikur) af osFosB tjáningu margra þessara sömu gena og leiddi til aukningar á lyfjaumlaun (Kelz et al., 1999; McClung og Nestler, 2003).

Eitt gen sem er greint í þessum rannsóknum er kólsystokínín (Cck), taugapeptíð framleitt á nokkrum heilasvæðum, þar á meðal striatum (Hokfelt o.fl., 1980). CCK getur breytt dópamínvirkri sendingu (Vaccarino, 1992), tekur þátt í umbun og styrking lyfja (Josselyn o.fl., 1996; Josselyn o.fl., 1997; Hamilton, o.fl., 2000; Beinfeld o.fl., 2002; Rotzinger o.fl., 2002), og er framkallað í striatum með langvarandi kókaíni (Ding og Mocchetti, 1992). Að auki Cck Sýnt hefur verið fram á að verkefnisstjóri svarar bæði CREB og AP-1 fléttur (Haun og Dixon, 1990; Deavall, o.fl., 2000; Hansen, 2001). Þar sem mörg genin (þ.m.t. Cck) sem sýndu aukna tjáningu í kjölfar bæði CREB og skammtímatjáningu osFosB voru þekkt eða grunur leikur á genum CREB (McClung og Nestler, 2003), vildum við ákvarða hvort skammtíma expressionFosB tjáning leiði til stjórnunar á þessum genum (með áherslu á Cck) með stjórnun CREB eða með flóknari aðferðum til að stjórna genum.

Fara til:

NIÐURSTÖÐUR

Δ FB-ofþrýstingur hækkar tímabundið CREB stig

Við notuðum vestræna blotting til að kanna hvort osFosB ofþrýstingur eykur CREB próteinmagn í striatum músa. Við þessa rannsókn notuðum við bi-transgenic mýs (lína 11A) sem bera bæði NSE-tTA transgen og TetOp-osFosB transgen. Í fjarveru doxycycline sýna þessar mýs öfluga aukningu á ΔFosB tjáningu í dynorphin jákvæðum taugafrumum í striatum (Kelz et al., 1999). Þessi aðferð til að ofreyna ΔFosB hefur verið mikið skjalfest og gerir ráð fyrir svæðissértækri oftryggingu, sem er samsíða ΔFosB örvuninni sem sést hjá dýrum sem verða fyrir langvarandi kókaíni (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Við komumst að því að í 11A músum sem ofgreindu ΔFosB, var CREB próteinmagn verulega uppstýrt eftir 2 vikna tjáningu og þessi gildi fóru aftur í grunngildi eftir 8 vikna tjáningu (Mynd 1A, n = 8). Til að ákvarða hvort hægt væri að endurtaka breytingar á CREB stigum með skammtíma ΔFosB yfirtjáningu í öðru kerfi, tjáðum við ΔFosB tímabundið í PC12 frumum og komumst að því að CREB stig jukust marktækt (p <0.05) þegar borið var saman við samanburðar (Mynd 1B, n = 4). Þessar niðurstöður sýna að skammtíma ΔFosB tjáning eykur CREB próteinmagn.

Mynd 1

Mynd 1

CREB stig hækka með ΔFosB ofþjáningu. Western blot greining á lysötum frá (A) músarstrata frá 11A músum utan dox í 2 eða 8 vikur eða (B) PC12 frumur ofþjappa ΔFosB. Gögn í A eru sýnd sem prósentubreyting á off dox samanborið ...

Bæði osFosB og CREB bindast próteinum tiltekinna mark gena í striatum í kjölfar skammtímatilkynningar ΔFosB of.

Við notuðum ChIP (chromatin immunoprecipitation) greiningar á fósturvef til að ákvarða hvort osFosB eða CREB binding átti sér stað við ákveðna markgenaörvandi og ef þessi binding var aukin í kjölfar skammtíma ΔFosB ofþrýstings. Við greindum bindingu á BDNF og Cck verkefnisstjórar, þar sem bæði genin eru mjög uppstýrð í kjölfar skammtíma over FosB ofþjáningar, ofreynslu CREB eða langvarandi kókaínmeðferðar (McClung og Nestler, 2003). Við greindum einnig bindingu á CDK5 verkefnisstjóri, þar sem það er þekkt beint markmið ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb o.fl., 2001; Kumar et al., 2005). Að lokum, við mældum bindingu við pródynorfín verkefnisstjóri, þar sem fyrri rannsóknir hafa komist að því að það getur verið bundið af ΔFosB og CREB við mismunandi aðstæður (Andersson o.fl., 2001; Zachariou et al., 2006).

Flísgreining var framkvæmd á striata frá 11A músum sem ofreyndi ΔFosB í 2 vikur með því að nota mótefni sem þekkja CREB eða ΔFosB. Við venjulegar aðstæður komumst við að ΔFosB bindur sig við CDK5 og pródynorfín verkefnisstjórar, meðan engin greinanleg binding er við BDNF or Cck verkefnisstjórar (Tafla 1). Ennfremur jók overFosB ofþjöppun bindingu ΔFosB við CDK5 verkefnisstjóra, en ekki hjá pródynorfín verkefnisstjóri. Við mældum næst CREB bindingu við þessa verkefnisstjóra og komumst að því að CREB binst við CDK5, BDNF og pródynorfín verkefnisstjórar, en ekki til Cck verkefnisstjóra, í venjulegu striatum, og að ΔFosB ofþjöppun í 2 vikur eykur CREB bindingu við BDNF og pródynorfín verkefnisstjórar, en ekki CDK5 verkefnisstjóri. Samanlagt sýna þessar niðurstöður að ΔFosB og CREB geta bæði bindst ákveðnum genaforritara svo sem pródynorfín og CDK5samt sem áður er CREB-binding sérstaklega fyrir aðra verkefnisstjóra svo sem BDNF. Ennfremur leiðir overFosB ofþjöppun til aukningar á osFosB bindingu við ákveðna verkefnisstjóra, eins og búast mátti við, en einnig til CREB bindingar við ákveðna verkefnisstjóra, í samræmi við ΔFosB-miðlaða CREB örvun sem fram kom á þessum tímapunkti.

Tafla 1

Tafla 1

Binding líklegra stjórnunarpróteina við ýmsa verkefnisstjóra hjá músum sem tjá sig um ΔFosB í tvær vikur.

Fyrri vinna hefur sýnt að breytingar á genatjáningu af völdum langtíma ΔFosB ofþróunar tengjast krómatínbreytingum, einkum asetýleringu á históni H3, á sérstökum genahækkendum (Kumar et al., 2005). Til að ákvarða hvort þetta gæti haft í för með sér breytingar á tjáningu gena við skemmri tíma ΔFosB oftjáningu, mældum við bindingu á asetýleruðu históni H3 (histónbreyting tengd transkriptívirku litskiljun), eða metýleruðu históni H3 (Lys9, histónbreyting tengd transkriptíum óvirkt krómatín). Við komumst að því að of tjáning á osFosB í 2 vikur olli engum breytingum á bindingu á asetýleruðu H3 við neinn af genaörvunum sem rannsakaðir voru (Tafla 1). Við fundum verulega lækkun á bindingu metýleraðs históns H3 við pródynorfín verkefnisstjóra, en engin bindandi hjá Cck verkefnisstjóra og engin breyting á bindingu hjá CDK5 og BDNF verkefnisstjórar, sem benda til þess að þetta sé ekki almennur gangur sem ΔFosB, til skamms tíma, stjórnar genatjáningu. Við vorum hissa og áhuga á því að við fundum engan mun á ChIP prófunum okkar sem gætu skýrt aukninguna í Cck mRNA tjáningu í 11A músunum í kjölfar 2 vikna ΔFosB tjáningar og ákvað að rannsaka þennan gang frekar.

SkammtímaΔFosB eykst Cck tjáning í mörgum kerfum

Persónugerð örörvunar tvífættra 11A músa sem ofreyndu ΔFosB í striatum kom í ljós að Cck tjáningarstig hækka í kjölfar 2 vikna ofsjáningar og lækka síðan smám saman með lengri tímabilum ΔFosB tjáningar (Mynd 2A, n = 3). Við staðfestum þessi áhrif fyrir Cck með því að nota rauntíma PCR á aðskildum hópi dýra við 2 og 8 vikur og fundust niðurstöður á tveimur tímapunktum vera svipaðar örörpagreiningunni (gögn ekki sýnd).

Mynd 2

Mynd 2

Skammtíma yfirtjáning ΔFosB eykst Cck genatjáningu. (A) Cck mRNA tjáningu í striatum í kjölfar ΔFosB ofþrýstings í 11A músum í 1, 2, 4 eða 8 vikur. Örlyfjagreining var gerð á strídískum sýnum og Cck stigum ...

Til að kanna frekar abilityFosB til að stjórna Cck tjáningu, notuðum við PC12 frumur tímabundið transfected með a Cck-luciferase fréttaritari plasmíð og annað hvort ΔFosB tjáningarplasmíð eða jafnt magn af pCDNA. Bæði tveir (n = 5-9) og þrír (n = 11-13) dagar overFosB ofþrýstings leiddu til marktækrar aukningar á Cck-luciferase tjáning. Að auki leiddi þriggja daga overFosB ofþjáning verulega meira Cck- glúkiferasa framköllun miðað við tveggja daga yfirtjáningu (Mynd 2B). Ofþrýstingur ΔFosB olli ekki tjáningu á örvandi lúsíferasa smíðum (gögn eru ekki sýnd). Undir engum meðferðarskilyrðum var fækkun í Cck-luciferasa virkni greinileg. Þessar niðurstöður sýna að skammtíma expressionFosB tjáning eykur virkni Cck verkefnisstjóra, og lætur ósvarað fyrirkomulagi þar sem langtímaframkvæmd ΔFosB kúgar Cck tjáning.

Over Yfirtjáning FosB eykur bindingu á líklegri CREB bindisíðu í Cck verkefnisstjóri

Greiningar okkar komust að því Cck tjáning eykst í kjölfar skammtímatjáningar expressionFosB, en ChIP prófanir okkar komust hins vegar að því að hvorki CREB né ΔFosB bindast Cck verkefnisstjóri. Til að ákvarða hvort einhverjar breytingar séu á próteinbindingum við Cck verkefnisstjórinn í kjölfar Δ FosB ofþrýstings, notuðum við rafmagns hreyfigetuskiptapróf (EMSA) með rannsókn sem inniheldur líklega CRE-svipaðan stað sem er til staðar innan Cck verkefnisstjóri. Með því að nota kjarnaútdrátt úr striata af 11A músum sem ofreyndu ΔFosB í 2 vikur, fundum við aukningu á bindingu við hugsanlegan CRE stað í Cck verkefnisstjóri (Mynd 3 A, C, n = 4). Athyglisvert er að 11A mýs ofþýða ΔFosB í 8 vikur sem sýna fækkun í Cck tjáning, sýndi einnig aukna bindingu á þessum stað (Mynd 3B, C, n = 4). Til samanburðar skoðuðum við bindingu við samhljóða CRE-stað hjá músum sem ofreyndi ΔFosB í 2 vikur og fundum öfluga CRE-bindingu í striatal útdrætti, en engin aukning á bindingu eftir ΔFosB örvun (Mynd 3F, n = 4). Þannig, þrátt fyrir ΔFosB-framkallaða hækkun á heildar CREB stigum sem sést á þessum tímapunkti, eru þessar niðurstöður í takt við ChIP prófanir okkar sem komast að því að aukin CREB binding hjá verkefnisaðilum í kjölfar expFosB ofþrýstings er sértæk aðeins fyrir ákveðin gen og er ekki alþjóðlegt fyrirbæri . Til að ákvarða hvort CREB er bundið við Cck verkefnisstjóri í EMSA greiningunni okkar, gerðum við supershift prófanir með CREB sértækt mótefni. Í samræmi við ChIP prófanir okkar fundum við enga bindingu CREB við a Cck rannsaka sem innihélt hugsanlegan CRE-stað í EMSA greiningum en CREB binddi og endurbætti samstöðu CRE-staðinn (Mynd 3D, E, n = 4). DNA bindandi virkni við Cck verkefnisstjóri var heldur ekki fyrir áhrifum af mótefni gegn ΔFosB (gögn ekki sýnd), við aðstæður sem sýndar voru í nokkrum fyrri rannsóknum til að hindra ΔFosB bindingu við jákvætt AP-1 vefi (Hope o.fl., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi o.fl., 1998). Við gerðum einnig ChIP prófanir á striata af 11A dýrum í kjölfar 8 vikna ΔFosB tjáningar og finnum enn engin binding á CREB eða ΔFosB við Cck verkefnisstjóri (gögn ekki sýnd). Þannig leiðir expressionFosB tjáning til aukinnar próteinbindingar við Cck verkefnisstjóri eftir bæði 2 og 8 vikna tjáningu; þó er hver þessi þættir ekki þekktir.

Mynd 3

Mynd 3

Próteinbinding við Cck verkefnisstjóri. (A, B) Rafeindafræðileg hreyfigetuskiptapróf með því að nota Cck CRE-líkur staður með striatal vefjum frá dýrum sem eru ofþjánir ΔFosB í 2 vikur (A) eða 8 vikur (B). Í (A), keppni við umfram ómerktan keppanda ...

Hugsanleg CRE síða í Cck verkefnisstjóri er ekki ábyrgur fyrir aukinni virkni verkefnisstjóra

Þar sem við fundum aukningu á próteinbindingum með því að nota brot úr Cck verkefnisstjóra, sem inniheldur hugsanlegan CRE-síðu, í framhaldi af ΔFosB ofþjáningu, vildum við ákvarða hvort þessi síða er nauðsynleg til að auka Cck tjáning í kjölfar exp FosB ofþjáningar. Til að prófa þennan möguleika transfekteruðum við PC12 frumur með a Cck-luciferasa plasmíð sem inniheldur ósnertan CRE-svipaðan stað eða einn sem inniheldur stökkbreytingu á staðnum sem myndi afnema allar milliverkanir við CREB. Athyglisvert er að stökkbreyting á CRE-líkum stað minnkaði basal Cck verkefnisstjóra um 32% (Mynd 4A, n = 9), en hafði ekki áhrif á Cck örvun hvatamanns með ΔFosB yfirtjáningu (Mynd 4B, n = 11-13). Þetta bendir til þess að þrátt fyrir að Cck verkefnisstjóri krefst ósnortinna CRE-líkra staða fyrir fulla grunnvirkni, aukin virkni verkefnisstjórans sem framkölluð er af overFosB ofþjöppun krefst ekki CRE-líku röðarinnar.

Mynd 4

Mynd 4

The Cck-lík CRE síða er ekki nauðsynleg fyrir Cck framkalla með ΔFosB. (A) Cck-luciferasa virkni var mæld 2 dögum eftir transfection við annað hvort eðlilegt Cck-lúsíferasa eða einn þar sem CRE-líkur staður var stökkbreytt. * p <0.05 (B) Cck-luciferase ...

cFos binst við Cck verkefnisstjóri

Fyrri rannsóknir hafa komist að því cFos mRNA eykst með skammtíma expressionFosB tjáningu, hins vegar, eftir langvarandi ΔFosB tjáningu, minnkar hæfni kókaínmeðferðar til að örva cFos í striatum (McClung og Nestler, 2003; Renthal o.fl., 2008). Þess vegna gæti verið mögulegt að cFos stuðli að aukningu í Cck tjáning í kjölfar skammtímatjáningar ΔFosB. Við gerðum ChIP prófanir með mótefni sérstaklega fyrir cFos og mældum cFos bindingu við Cck verkefnisstjóri með og án skammtímatjáningar ΔFosB. Þó að við komumst að því að cFos bindur sig við Cck verkefnisstjóra, þessi binding jókst ekki marktækt í kjölfar expFosB ofþrýstings (Mynd 5, n = 5). Þetta bendir til þess að þar sem cFos bindur Cck verkefnisstjóra, það gæti stuðlað að almennri reglugerð um Cck tjáningu, en líklega er það ekki þátttakandi í reglugerð um Cck verkefnisstjóri eftir ΔFosB.

Mynd 5

Mynd 5

cFos binst við Cck verkefnisstjóri. Krómatín ónæmisrannsóknargreiningar voru gerðar með sérstöku mótefni fyrir cFos með því að nota striatal vef frá osFosB of-tjá músum annað hvort á dox eða eftir 2 vikna fjarlægingu dox. Rauntíma PCR greining var ...

Fara til:

Umræða

Þessi rannsókn staðfestir og stækkar við fyrri niðurstöður sem sýna að osFosB stjórnar tjáningu gena í striatum og við komumst að því að það gerir það með mörgum aðferðum eftir skammtímatjáningu. Við sýnum að eftir 2 vikna yfirofsýni binst ΔFosB beint við verkefnisstjórana í ákveðnum genum sem leiða til breytinga á tjáningu (þ.e. CDK5). Ennfremur eykur það CREB próteinmagn, áhrif sem sést í ræktuðum frumum jafnt sem í striatum, sem leiðir til aukinnar CREB bindingar hjá öðrum genaframleiðendum (þ.e. dynorphin og BDNF). Í fyrri rannsókn fundum við að skammtímatjáning á ΔFosB í striatum leiðir til margra sömu breytinga á genatjáningu og finnast þegar CREB er of tjáð og leiðir til svipaðra hegðunarviðbragða við mælingar á kókaínsóknum (McClung og Nestler, 2003). Þannig að núverandi niðurstaða þess að osFosB leiði til örvunar CREB, sem og bindingar CREB við ákveðna genaverkefna, hjálpar til við að skýra hvers vegna svo margar breytingar á genatjáningu voru deilt með þessum tveimur umritunarþáttum.

Örvun CREB af ΔFosB er áhugaverð þar sem sýnt hefur verið fram á að misnotkun lyfja veldur breytingum á serín 133-fosfórýleruðu CREB stigum (Mattson o.fl., 2005) og auka CRE-miðla umritun (Barrot o.fl., 2002; Shaw-Lutchman o.fl., 2002, 2003), án þess að breyta heildarmagni CREB. Hugsanlegt er að breytingar á CREB stigum geti verið tímabundnar og því auðvelt að sakna í öðrum rannsóknum. Í okkar höndum höfum við séð aukningu á kókaíni af völdum CREB mRNA í tilteknum tilraunum, en þessi áhrif eru mjög breytileg (óbirt athugun). Þar sem bæði 11A erfðabreyttu músin og PC-12 frumur sýna framkalla CREB í kjölfar skammtímatilraunar ΔFosB bendir þetta til þess að CREB sé örugglega af völdum ΔFosB (eða markmiðs fyrir ΔFosB), sem veitir enn einn farveginn til að skýra lyfjaváða breytingar á geninu tjáning.

Okkur kom á óvart að hvorki CREB né ΔFosB bindast Cck verkefnisstjóri þó Cck tjáning er greinilega stjórnað upp eftir skammtímatjáningu ΔFosB. Cck er mikið taugapeptíð sem kemur fram bæði í VTA og NAc (Hokfelt o.fl., 1980) og er líklega þátttakandi í viðbrögðum við misnotkun lyfja (Josselyn o.fl., 1996; Josselyn o.fl., 1997; Hamilton, o.fl., 2000; Beinfeld o.fl., 2002; Rotzinger o.fl., 2002). Í frumuræktarmælingum er Cck verkefnisstjóri hefur verið mikið einkenndur og sýnt að hann svarar fjölskyldu CREB og AP-1 (skoðað af Hansen, 2001). Haun og Dixon (1990) sýndi að AP-1 fléttur geta bundist við Cck CRE-lík síða vitroog það var síðar sýnt, með því að nota SK-N-MC taugakrabbameinsfrumur, að stökkbreyting á CRE-líkum vefsvæði dró úr svörun verkefnisstjóra við of tjáðri cFos / cJun (Rourke o.fl., 1999). Reyndar finnst okkur líka aukast Cck verkefnisstjóriMynd 2) og bindandi við eða við CRE-líkan þáttinn (Mynd 3) við oftilitun ΔFosB, annar AP-1 fjölskyldumeðlimur, en við finnum enga beina bindingu ΔFosB við Cck verkefnisstjóri in vivo or vitro, jafnvel eftir ofþjáningu þess.

Mikil vinna hefur sýnt CREB hlutverk í reglugerð um Cck verkefnisstjóra. The Cck CRE-lík síða er varðveitt yfir hryggdýrum (Hansen, 2001) og í sumum frumuræktarprófum bindast bæði CREB og AP-1 fléttur við þennan stað og eru nauðsynlegar fyrir Cck verkefnisstjóriHaun og Dixon, 1990; Deavall, o.fl., 2000; Hansen, 2001). Að auki nokkrir þekktir virkjar af Cck Sýnt hefur verið fram á að tjáning (þ.mt bFGF, PACAP, peptónar og afskautun) virkar með CREB (Hansen, o.fl., 1999; Deavall, o.fl., 2000; Bernard, o.fl., 2001; Gevrey, o.fl., 2002; Hansen, o.fl., 2004). Okkar Cck- Gluciferasa fréttaritari genagögn styðja mikilvægu hlutverki fyrir CRE-líkan stað við stjórnun á Cck virkni verkefnisstjóra, þar sem stökkbreyting á þessari síðu dregur úr grunnfrumum Cck verkefnisstjóra og Cck-luciferasa tjáning af völdum VP16-CREB, sem er virkilega form CREB, tapast þegar þessi staður er stökkbreyttur (óbirt athugun). Okkur kom því á óvart að CREB virðist ekki bindast Cck próteini í útdráttarstríði annað hvort við upphaf eða við skammtímatíma over FosB ofþrýsting þegar CREB gildi eru aukin. Þetta heldur því fram að stig CREB í sjálfu sér eru ekki eini þátturinn í að ákvarða magn bindingar á þessum vef og það er stutt af vinnu annarra (Cha-Molstad, o.fl., 2004). Þar sem verkefnisstjórar annarra, áður greindra CREB miða gen, svo sem BDNF og pródynorfín, bindaði CREB, við erum fullviss um að komast að því að CREB er ekki bindandi fyrir Cck verkefnisstjóri í kjarnorkuútdráttum. Ennfremur framkalla Cck-luciferasa virkni af ΔFosB var ekki háð ósnortnum CRE-líkum stað, sem bendir til þess að ΔFosB stýri ekki Cck tjáningu með því að stjórna beinni bindingu CREB við Cck verkefnisstjóri.

Vanhæfni okkar til að greina CREB í samskiptum við Cck verkefnisstjóri er studdur af Renthal o.fl. (2009), sem notaði ChIP-flís nálgun til að skoða alþjóðlegar breytingar á fosfórýleruðu CREB (pCREB) og ΔFosB bindingu í striatum eftir langvarandi útsetningu fyrir kókaíni. Í þessum tilraunum voru DNA-próteinfléttur ónæmisfrömmuð með ΔFosB eða pCREB mótefnum og útfellda DNA, eftir merkingu, var blandað saman í örveru örvandi. Þótt mörg einkenni CREB-markgena áður hafi verið greind með þessari nálgun (t.d. BDNF, prodynorphin), Cck var ekki greind. Að auki hefur verið sýnt fram á að binding CREB við samstöðu CRE-stað er mjög mismunandi milli ræktaðra frumulína (Cha-Molstad, o.fl., 2004). Allar fyrri rannsóknir sem fundu CREB milliverkanir við Cck verkefnisstjóri var framkvæmdur í frumuræktun (ekki heila sem EMSA og ChIP sýni okkar voru fengin úr) og notuð hlaupaskiptapróf til að rannsaka prótein-DNA samspil. Þó að EMSA geti metið möguleika þáttar til að binda DNA röð, veita ChIP prófanir nýjar skoðanir á þessum milliverkunum in vivo. Ennfremur, mikið af gögnum sem sýna annað hvort framkalla Cck verkefnisstjóra eða CREB bindandi við Cck próteinn var fenginn úr frumum sem höfðu verið örvaðar af þáttum eins og peptónum (Bernard o.fl., 2001), afskautun (Hansen, o.fl., 2004), eða margs konar virkjara í innanfrumu merkjasiglingum þ.mt cAMP og ERK (Hansen o.fl., 1999). Í tilraunum okkar, eina „áreitið“ sem notað var, var of tjáning ΔFosB, sem dugar til að örva Cck tjáning. Samanlagt bendir þetta til þess að geta CREB til að binda (og mögulega stjórna) Cck verkefnisstjóri er mjög háð frumutegundinni og virkjun tiltekinna merkjaslóða. Að auki, the Cck CRE-líkur kynningarefni (að minnsta kosti í ódregnum PC12 frumum og í músastratum) er ekki beint skotmark hvorki CREB né ΔFosB. Athyglisvert er að reglugerðin um FosB tjáning með CREB er einnig sértæk fyrir frumugerð og tegund örvunar. Rannsókn Andersson et al. komist að því að innspýting á CREB antisense fákirni í músastratum hindraði að hluta til örvun FosB eftir gjöf kókaíns (Andersson o.fl., 2001). Hins vegar fundu þeir einnig að geta L-Dopa til að örva FosB tjáning í 6-OHDA-skemmdum striatum var ekki fyrir áhrifum af nærveru CREB antisense fákirna.

Þar sem CREB og osFosB virðast óbeint stjórna Cck verkefnisstjóra og breytingar á krómatín uppbyggingu hafa verið staðfestar sem svar við margvíslegu áreiti sem örvar ΔFosB (Tsankova o.fl., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal o.fl., 2008), ræddum við að ΔFosB gæti óbeint breytt mótunarvirkni með því að breyta krómatín uppbyggingu. Hins vegar hjá músum sem ofþjáðu ΔFosB í 2 vikur, var engin breyting á históni H3 asetýleringu við Cck verkefnisstjóri (Tafla 1). Þetta er studd af ChIP-flís gögnum Renthal o.fl. (2009), sem tilkynnti enga breytingu á asetýleruðu H3 bindingu við Cck kynningarefni í músum sem verða fyrir langvarandi kókaíni. Þar sem Cck próteinn er virkur í striatum, ekki var búist við eða kom fram nein bæling á metýleruðu históni H3 bindingu. Athyglisvert er að við sáum heldur enga breytingu vegna ΔFosB ofþrýstings í asetýleruðu H3 bindingu við BDNF verkefnisstjóri (sem sýndi aukna CREB bindingu) eða á CDK5 og pródynorfín verkefnisstjórar (sem sýndu aukna ΔFosB bindingu). Þar sem fjöldi breytinga á históni er til staðar í tengslum við breytingar á virkni verkefnisstjóra (skoðað af Rando og Chang, 2009), líklega eru aðrar breytingar á litningi sem tengja við örvun þessara gena. Einhver breyting á krómatíni, þó að hún sé oft spá fyrir um stig virkjunarinnar, gæti ekki breyst við virkjun tiltekins gens. Í framtíðarvinnu væri fróðlegt að skoða aðrar hugsanlegar breytingar á krómatín uppbyggingu umhverfis Cck verkefnisstjóri í kjölfar overFosB ofþrýstings. Athyglisvert er að langvarandi kókaín (líklegt um Sýnt hefur verið fram á að örvun á FB myndar tjáningu sirtuin 1 og 2, históna deacetylases í flokki III sem virðast breyta taugalífeðlisfræði, ERK merki og hegðunarviðbrögð við kókaíni (Renthal o.fl., 2009). Innleiðsla á histón deacetylasa myndi hafa getu til að stjórna samtímis tjáningu mikils fjölda gena um alheimsbreytingar á uppbyggingu chromatin.

Einn mögulegur frambjóðandi sem tekur þátt í Cck reglugerð í kjölfar overFosB ofþrýstings var AP-1 fjölskyldumeðlimur cFos. Tjáning á cFos er stjórnað af CREB (Sheng o.fl., 1990; Impey o.fl., 2004), og ofvöxtur cFos (samhljóða oftjáningu bindiefnisins cJun) eykst Cck verkefnisstjóriRourke o.fl., 1999). Þess vegna gæti aukið gildi CREB vegna skammtímatilrauna ΔFosB aukið gildi cFos og leitt til aukinnar bindingar við Cck CRE-lík síða. cfos mRNA er framkallað hjá músum eftir tveggja vikna of ressionFosB ofþjáningu (McClung og Nestler, 2003) og fækkaði hjá músum sem voru útsettar fyrir langvarandi kókaíni eða langtímaframkvæmd ΔFosB (Renthal o.fl., 2008). Hér finnum við að cFos binst beint við Cck promotor í striatal vefjum, ΔFosB ofþjáning eykur ekki marktækt bindingu. Þetta bendir til þess að þó að cFos gæti verið um að ræða reglur Cck tjáningu almennt, er breyting á bindingu cFos eingöngu ekki líkleg til þess að ΔFosB stjórnar Cck tjáning. Hins vegar er mögulegt að osFosB geti valdið hvorki breytingum á cFos eftir þýðingu (td breytt fosfórýlering) eða örvað tjáningu bindiefni (eins og cJun) eða samvirkjandi prótein. Þar sem ósnortinn CRE-líkur staður (sem áður hefur verið sýnt fram á að er bindandi staður fyrir AP-1 fléttur, sjá þó Haun og Dixon, 1990) er ekki krafist aukins Cck verkefnisstjóra sem sést með ΔFosB ofþjáningu (eins og metið var í genatilraunum fréttaritara okkar), er það ástæðan fyrir því að aðrir transverkandi þættir eru einnig stjórnaðir af ΔFosB.

The Cck prótein brot sem notað er í luciferase fréttaritara genatilraunum okkar inniheldur varðveittan Sp1 bindissíðu og E-kassa (skoðað af Hansen, 2002). Sérstaklega hefur verið sýnt fram á að raðir af e-kassa binda fjölda umritunarþátta (skoðað af Forrest og McNamara, 2004). Með því að nota PC12 frumur höfum við séð að stökkbreyting E-kassans minnkar Cck verkefnisstjóra en breytir ekki svörum verkefnisstjórans við ΔFosB (gögn eru ekki sýnd). Athyglisvert er að a Cck-luciferase fréttaritari sem inniheldur stökkbreytingar bæði á CRE-staðnum og í E-kassanum hefur enga greinanleg basalvirkni og svarar ekki toFosB ofþjáningu (óbirt athugun). Annar mögulegur sáttasemjari ΔFosB aðgerða á Cck verkefnisstjóri eru ATF, þar sem vitað er að vissar tegundir eru framkallaðar í striatum með langvarandi geðörvandi útsetningu (Green et al., 2008). Hins vegar höfum við ekki fundið neinar vísbendingar um ΔFosB örvun þessara ATFs (gögn eru ekki sýnd) og ekki er búist við að ATFs myndi bindast stökkbreyttum CRE-líkum stað á Cck verkefnisstjóri.

Einn varnaratriði þessarar rannsóknar er að við notum bi-erfðabreytt kerfi til að ofreyna ΔFosB og því verður maður að vera íhaldssamur við að draga hliðstæður á milli þessa hugmyndafræði og gjafar á langvarandi kókaíni. Hins vegar gefa 11A erfðabreyttu mýs sér einstakt tækifæri til að skoða sérstök áhrif effectsFosB í striatum þar sem ofþjöppun er takmörkuð við þetta heilasvæði (Chen et al., 1998), meðan gjöf kókaíns framkallar breytingar á fjölmörgum öðrum svæðum í heila sem síðan geta haft óbeint áhrif á striatum. Ennfremur hafa nokkrar rannsóknir skjalfest svipaðar atferlis- og sameinda svipgerðir í 11A músunum í samanburði við dýr sem ekki eru í erfðabreytingum sem fengu meðferð með langvinnu kókaíni (Kelz et al., 1999; McClung og Nestler, 2003; Renthal o.fl., 2009). Að auki, Bibb o.fl. (2001) greint frá svipuðum stigum streatal Cdk5 mRNA og örvun próteina í þessum sama 11A stofni samanborið við kókaínmeðhöndlað, ekki erfðabreytt ruslfreyjur, svo og svipaðar breytingar á CDK5 markmiðunum, p35 og DARPP-32.

Að lokum, við komumst að því að skammtíma expressionFosB tjáning leiðir til örvunar gena í striatum með mörgum aðferðum. Þetta felur í sér beina próteinbindingu, örvun á CREB próteini og virkni, litningi á litningi, auk ferla sem enn hefur ekki verið ákvarðaður.

Fara til:

Reynslustarfsemi

Dýr

Karlkyns tveggja transgenísk 11A dýr (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) voru notuð í þessari rannsókn og einkennast af Kelz et al., 1999. Til að ofreyna ΔFosB voru mýs fjarlægðar úr doxycycline milli 3 og 6 vikna aldurs, meðan stjórn músum var haldið á doxycycline. Allar mýs voru hópaðar og hýstar á 12: 12 ljós / dökkri hringrás, ljós logað klukkan 7 og ljós slökkt klukkan 7 pm, með Ad Lib aðgangur að mat og vatni. Allar músartilraunir voru í samræmi við samskiptareglur sem samþykktar voru af dýraverndarnefnd og háskólanum í Texas Southwestern Medical Center í Dallas.

Fréttaritari og tjáningarplasmíð

Villutegundin (WT) Cck promoter-luciferase fréttaritari var gerður með því að setja um það bil 200 bp PCR brot í pGL3-luc vektorinn (Promega). Þetta brot var fengið úr erfðafræðilegu DNA úr músum (grunnar: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' andstreymis, og 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' downstream) og upphaflega sett í pGEM-T Easy vektor (Promega, #A1360). Stuðlinum brotið var síðan klónað í Kpn1 / Xho1 takmörkun ensímstaðanna á pGL3-luc.

Til að búa til CRE punkt stökkbreytingu í Cck hvatamaður, stökkbreytandi grunnur sem beint er að áður tilkynntum CRE-svipuðum stað (skilningsgrunnur: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense grunnur: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') var notaður við framleiðslu á mutagen með notkun . Þetta breytir tilkynntu CRE-svipuðu svæði (ACTGCGTCAGC) í ACTGAGCTCC. Allar plasmíð fréttamanna voru staðfestar með DNA raðgreiningu. ΔFosB tjáningarplasmíðið inniheldur ΔFosB röð í fullri lengd sem er sett inn í margfelda einræktunarstað pCDNA 3.1 og hefur verið lýst áður (Ulery and Nestler, 2007).

Frumurækt og DNA transfection

Rottnaheilafrumukrabbameini (PC12) frumum var haldið í Dulbecco breyttu Eagle-miðli F-12, bætt við 10% hestserum, 5% fósturs nautgripasermi og 1% penicillin / streptomycin við 37 ° C og 5% CO2. Frumur voru smitaðar með rafdrætti með því að nota BTX 360 rafdráttarvél (350V, 0 ohm og 850 μF) í 800 μL fosfatbuffað saltvatn Dulbecco í 4 mm bili kúvettum með 10 μg af fréttaritara og 5 μg af tjáningargerðinni. Tómt vektor plasmíð (pCDNA) var notað til að staðla heildarmagn DNA. Eftir smitun voru frumurnar ræktaðar á 35 mm kollagenhúðuðum diskum í tilgreindan tíma.

Lúsiferasa próf

Tveimur eða þremur dögum eftir smitun voru frumur þvegnar þrisvar sinnum í Dulbecco fosfatbuffuðu saltvatni, ljósaðar (með því að nota 3 mM glýsýlglýsín, 25 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), safnað og hreinsað með skilvindu. 30 μL af lysati var sameinuð með 140 μL lúsíferasa prófunarstuðpúði (25 mM glýsýlglýsín, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kalíumfosfat, 1 mM kóensím A, pH 7.8). Luminescence virkni var mæld með því að nota FLx-800 flúrljómun lesara eftir sjálfvirka inndælingu af 40 μL 1 mM lúsiferíni í hverri holu. Lúsíferasa virkni var normaliseruð að heildar próteininnihaldi eins og það var ákvarðað með BioRad próteingreiningu.

Rafskautafræðileg hreyfigetuskipting

Kjarnakjarni úr tvíhliða sneiðum af striatum úr tvífættum 11A músum (sem haldið var við eða utan doxýcýklín í 2 eða 8 vikur) (McClung og Nestler, 2003) voru undirbúin skv Huang og Walters (1996). 32P-merktir tvístrengdir fákirni rannsakar voru framleiddir með Promega Gel Shift Assay kerfisferlinu (#E3300) og rannsakaðir voru hreinsaðir með Roche Quick Spin Column. Samstaða CRE og AP-1 rannsaka raðir voru frá Promega (#E328A og E320B, hvort um sig) og Cck CRE raðir voru (Cck-CRE skilningur: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Bindandi viðbrögð og rafskaut voru framkvæmd með því að nota breytingar á Promega Gel Shift Assay kerfisaðferðinni (#E3300). 50,000 CPM af merktum rannsaka var sameinuð 10 μg kyrningakjarni útdráttar. Kalt samkeppnis-DNA eða mótefnum var bætt við áður en geislamerktu rannsakarnir voru kynntir. Við ofurhlífartilraunir var 2 μg af CREB mótefni (Upstate Biotechnology # 06-083) notað. Viðbrögð voru rafgreind á 4% pólýakrýlamíð geli, þurrkuð og útsett fyrir filmu (með því að styrkja skjái í 1 klukkustund til 2 daga).

Ónæmisblota

Fyrir PC12 frumur voru 35 mm plötur af transfected frumum þvegnar í ísköldum Dulbecco fosfatbuffuðum saltvatni og lysöt voru útbúin í ísköldum RIPA lysis biðminni (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 1 % Triton X-100, 0.1% natríumdodecýlsúlfat) sem innihalda próteasahemla. Eftir sonication, clearing og Bradford próteinpróf voru lysates að öllu leyti afmynduð og 50 μg af hverju sýni var rafdráttur á 10% SDS polyacrylamide gelum. Prótein voru flutt í PVDF himnu, læst í 1 klukkustund í 3% fitulausri þurrmjólk í Tris-jöfnu saltvatni sem innihélt 0.1% Tween-20 (TBS-T mjólk) og rannsökuð á einni nóttu við 4 ° C með frum mótefnum (CREB- Upstate líftækni # 06-083, notuð við 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, notuð við 1: 80,000) þynnt í TBS-T mjólk. Eftir margþvott í TBS-T voru blotar rannsakaðir í eina klukkustund við stofuhita með því að nota basískan fosfatasa samtengt aukamótefni (Sigma) þynnt 1: 5,000 í TBS-T mjólk. Eftir margþvott í Tris-jöfnu saltvatni var litaviðbragðið framkvæmt samkvæmt leiðbeiningum BioRad (# 170-6432). Himnur voru þurrkaðar yfir nótt, skannaðar á flatskanna og þéttnimæling gerð með ImageJ (sjá hér að neðan).

Að því er varðar útdrátt úr stríði voru Western blot-prófanir framkvæmdar eins og áður hefur verið birt (Hope et al., 1994). Vefja var fjarlægð af höfðingja músum, sett á ís og skipt á heila fylki í þykkt 1 mm. Vefstungur voru síðan teknar og frystar við -80 ° C þar til þær voru notaðar. Vefur var hljóðbeinaður á ís í breyttu þvottaefni sem byggir á biðminni sem innihélt bæði fosfatasa og próteasahemla (Roche, Sigma). Eftir hljóðvistun voru sýni aflituð í sjóðandi vatni og skilvindt við 15,000xg í 15 mínútur; supernatant var síðan safnað og unnið; magn próteinstyrkja var síðan magnbundið með Bradford prófun (Bio-Rad). Sýnin voru keyrð á 10% akrýlamíð / bisakrýlamíð hlaupi, flutt í PVDF himnu, lokað í 5% mjólk og ræktað með aðal mótefnum (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Í kjölfarið voru sjónir sýndir með því að nota eiturefnakerfi (Pierce). Öll sýni voru eðlileg í GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Hefðbundnum ferlum var keyrt til að tryggja að við séum innan línulega greiningar.

Densitometry greining

Fyrir PC12 ónæmisblöðrur var þéttleiki greining gerð með því að nota ImageJ með kvörðunarstöng. Meðal bakgrunnsmerki var dregið frá hverri mælingu og hlutfall CREB og GAPDH merkis var reiknað fyrir hvert sýni. Fyrir ónæmisblöðrur á fæðingu og EMSA greiningu var Scion Image 1.62c notað við frádrátt bakgrunns.

Ónæmisútskilningur krómatíns (ChIP)

Flísarannsóknir voru gerðar samkvæmt aðferðum Tsankova o.fl. (2004) og Kumar et al. (2005). Stuttlega voru tvíhliða striatal sýni frá 11A músum sem haldið var utan eða á doxýcýklíni þvertengd með 1% formaldehýði og þvertenging var slökkt með glýsíni (lokastyrkur 0.125 M). Þessi sýni voru úr heilum sneiðum sem teknar voru á stigi kjarnans með því að barkinn var fjarlægður. Krómatín var klippt í um það bil 0.2 til 1 kb brot með hljóðmeðferð, hreinsað með Protein G perlum (Thermo Scientific # 22852) og inntakssýni fryst við -80 ° C. Milli 60 og 100 μg af litskiljun var notað við hverja úrkomu. Notað var 5-10 μg af hverju frummótefni (CREB: Upstate Líftækni # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Líftækni # SC-48x, asetýlerað H3: Upstate Líftækni # 06-599, metýlerað H3 (LYS9): Cell Signal Signal Technology, cFos: Santa Cruz líftækni # SC-7202x). Mótefnamyndunarfléttur voru ónæmisútfellingar með próteini G auk perlum samkvæmt leiðbeiningum framleiðandans (Thermo Scientific # 22852). Í kjölfar öfugrar þvertengingar á aðföngum og botnfelldum sýnum var hvert sýni háð magn PCR (qPCR). Notkun allra þessara mótefna við flís hefur verið fullgilt (Tsankova o.fl., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal o.fl., 2009).

Stig próteinbindingar við hverja genaörvandi sem var áhugaverð var ákvarðað með því að mæla magn tengds DNA með qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Inntak eða heildar DNA (ónæmisfrelsi) og ónæmisútfellt DNA voru magnaðir í þríriti í viðurvist SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Ct gildi úr hverju sýni voru fengin með því að nota Sequence Detector 1.1 hugbúnaðinn. Hlutfallsleg magngreining á DNA sniðmát var framkvæmd með því að nota ΔΔCt aðferðina (Tsankova o.fl., 2004). Grunnar notaðir: BDNF kynningarefni 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 verkefnisstjóri: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck kynningarstjóri: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin promotor: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

tölfræðigreining

Öll gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalskekkja meðaltalsins. Tölfræðilegur munur var ákvarðaður með tveggja hala t-prófinu (p <0.05). Þegar margfaldur samanburður var gerður var p-gildi stillt með Bonferroni leiðréttingu.

Fara til:

Þakkir

Við viljum þakka Will Renthal og Arvind Kumar fyrir gagnlegar umræður. Við viljum einnig þakka NIDA fyrir fjármögnun þessara tilrauna.

Fara til:

Neðanmálsgreinar

Fyrirvari útgefanda: Þetta er PDF skjal af óskráðri handriti sem hefur verið samþykkt til birtingar. Sem þjónustu við viðskiptavini okkar erum við að veita þessa snemma útgáfu handritsins. Handritið verður undirritað afrita, gerð og endurskoðun sönnunargagna áður en hún er gefin út í endanlegri bönnuð formi. Vinsamlegast athugaðu að á framleiðsluferlinu má finna villur sem gætu haft áhrif á efnið og öll lögboðin frávik sem gilda um dagbókina eiga við.

Flokkunarskilmálar:

Hluti: #1 Frumu- og sameindalíffræði taugakerfa

Fara til:

Meðmæli

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP svörunarþátt bindandi prótein er krafist fyrir dópamínháð genatjáningu í ósnortnu en ekki dópamínmenguðu striatum. J Neurosci. 2001; 21: 9930 – 43. [PubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB virkni í kjarna accumbens skeljar stjórnar hliðun hegðunarviðbragða við tilfinningalegum áreiti. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435 – 40. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Kókaínmeðferð eykur utanfrumukolecystokinin (CCK) í skel kjarna accumbens á vakandi, frjálslega hreyfanlegum rottum, áhrif sem eru aukin hjá rottum sem eru næmir fyrir kókaíni. J Neurochem. 2002; 81: 1021 – 7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones örva umritun kólecystokiníngena í þörmum með hringlaga adenósín mónófosfat svörunarþáttar. Innkirtlafræði. 2001; 142: 721 – 9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Áhrif langvarandi útsetningar fyrir kókaíni eru stjórnað af taugafrumum Cdk5. Náttúran. 2001; 410: 376 – 80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Frumugerðarsértæk binding umritunarstuðils CREB við cAMP-svörunarþáttinn. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572 – 7. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Reglugerð á delta FosB og FosB-líkum próteinum með rafleiðsluflogum og kókaínmeðferðum. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880 – 9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Meðfædd dýr með örvandi, markvissa genatjáningu í heila. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Innleiðing sýklínháðs kínasa 5 í hippocampus með langvinnum flogaflogum: hlutverk ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965 – 71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Náin kynni af mörgum gerðum: Fos-júní samspil sem miðla sértækni umritunar eftirlits. Ókógen. 2001; 20: 2438 – 52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Aðlögun taugafrumna að amfetamíni og dópamíni: sameindarvirkni pródynorfín genareglugerðar í rottuþráðum. Neuron. 1995; 14: 813 – 23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. Stjórnun á umritun CCK gena með PACAP í STC-1 frumum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000; 279: G605 – 12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Dópamínvirka stjórnun á innihaldi kólecystokiníns mRNA í rottustrimli. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77 – 83. [PubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id fjölskylda umritunarþátta og myndun á æðum. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014 – 20. [PubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Samþörf á hringlaga AMP- og kalsíumháðum próteinkínösum til að aðgerða virkjun kólecystokiníngena með próteinsýru vatnsrofi. J Biol Chem. 2002; 277: 22407 – 13. [PubMed]
  16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Innleiðing virkjunar umritunarþátta (ATFs) ATF2, ATF3 og ATF4 í kjarnaumbúðum og stjórnun þeirra á tilfinningalegum hegðun. J Neurosci. 2008; 28: 2025 – 32. [PubMed]
  17. Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Yfirstreymi dópamíns og kólsystokíníns í rottum kjarna samanstendur af svörun við bráðum lyfjagjöf. Synapse. 2000; 38: 238 – 42. [PubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mítógen virkjað próteinkínasi og prótein kínasi A boðleiðir örva umritun kólecystókiníns með virkjun hringlaga adenósíns 3 ′, 5′-einfosfat svörunar frumubindandi próteins. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen FC. Reglugerð um umritun taugafrumu kólecystokinín gena. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61 – 7. [PubMed]
  20. Hansen TV. Kólecystokinin umritun gena: stýrisefni, uppskriftarþættir og merkjaslóðir. Peptíð. 2001; 22: 1201 – 11. [PubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl og forskólín stýra samverkandi upp samvirkni kólecystokiníngena með hnitvirkingu CREB og samvirkja CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15 – 23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. Upplýsingahækkandi sem er nauðsynlegur til tjáningar á rottu kólecystokinín geninu inniheldur röð eins og -296 þátturinn í c-fos geninu úr mönnum. J Biol Chem. 1990; 265: 15455 – 63. [PubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Nauðsynlegt hlutverk fosB gensins í sameinda-, frumu- og atferlisaðgerðum langvinnra rafflekkafloga. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952 – 62. [PubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Vísbendingar um sambúð dópamíns og CCK í mesó-útlimum taugafrumum. Náttúran. 1980; 285: 476 – 8. [PubMed]
  25. Vona að BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Meðferð við langvarandi rafseglingaflog (ECS) leiðir til tjáningar á langvarandi AP-1 fléttu í heila með breyttri samsetningu og einkennum. J Neurosci. 1994; 14: 4318 – 28. [PubMed]
  26. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Innleiðing langvarandi AP-1 fléttu sem samanstendur af breyttum Fos-líkum próteinum í heila með langvarandi kókaíni og öðrum langvinnum meðferðum. Neuron. 1994; 13: 1235 – 44. [PubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. Dópamínvirka stjórnun á DNA-bindingarvirkni AP-1 umritunarstuðils í rottustrimli. Taugavísindi. 1996; 75: 757 – 75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Skilgreining CREB reglugerðarinnar: genamengd greining á eftirlitsstuðlum eftirlitssvæða. Hólf. 2004; 119: 1041 – 54. [PubMed]
  29. Johannessen M, þingmaður Delghandi, Moens U. Hvað kveikir á CREB? Frummerki. 2004; 16: 1211 – 27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. Andstæð áhrif CCK (A) og CCK (B) mótlyfja á þróun skilyrt virkni hjá rottum. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505 – 512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Sönnunargögn fyrir þátttöku CCK (A) viðtaka við öflun skilyrt virkni framleidd með kókaíni í rottum. Brain Res. 1997; 763: 93 – 102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Sjálf DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Tjáning á umritunarþáttinum deltaFosB í heilanum stýrir næmi fyrir kókaíni. Náttúran. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
  33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Endurgerð á krómatíni er lykillinn sem liggur til grundvallar plasti af völdum kókaíns í striatum. Neuron. 2005; 48: 303 – 14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Kókaín völdum CREB fosfórýlering í kjarna samanstendur af kókaínnæmum rottum er gert kleift með aukinni virkjun utanfrumu merkjatengdra kinasa, en ekki próteinkínasa A. J Neurochem. 2005; 95: 1481 – 94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. Reglugerð um genatjáningu og kókaínlaun hjá CREB og DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: sameindaskipti fyrir langtímaaðlögun í heilanum. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: Sameindarmiðill langtíma tauga- og atferlisplastleika. Brain Res. 1999; 835: 10 – 17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Er sameiginlegt sameindaferli fyrir fíkn? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Yfirfærsluferli fíknar: hlutverk DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 55. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Greinilegt mynstur DeltaFosB örvunar í heila með misnotkun lyfja. Synapse. 2008; 62: 358 – 69. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Erfðamengi útsýni yfir krómatín uppbyggingu. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245 – 71. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB miðlar ofnæmisaðgerðar á c-fos geninu eftir langvarandi útsetningu fyrir amfetamíni. J Neurosci. 2008; 28: 7344 – 9. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  43. Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Genamengd greining á litningi á litningi með kókaíni leiðir í ljós hlutverk sirtuins. Neuron. 2009; 62: 335 – 48. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Kólecystokinin mótun á virkni mesólimbísks dópamíns: stjórnun hvata til hegðunar. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404 – 13. [PubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Neikvætt samvirkni milli samsettra E-kassa og cAMP / TPA svörunarþátta í kólecystokinin genavörvananum. FEBS Lett. 1999; 448: 15 – 8. [PubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Svæðisbundin og frumukortlagning umritunar með CRE-miðlun við fráhvarf morfíns með naltrexóni. J Neurosci. 2002; 22: 3663 – 3672. [PubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Reglugerð um CRE-miðla umritun í músarheila með amfetamíni. Synapse. 2003; 48: 10 – 7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Geðhvarfafloðun og kalsíum örva umritun c-fos með fosfórýleringu umritunarstuðils CREB. Neuron. 1990; 4: 571 – 82. [PubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Breytingar á históni á genaörvandi svæðum í hippocampus hjá rottum eftir bráða og langvinna flogaköst. J Neurosci. 2004; 24: 5603 – 10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. Reglugerð um DeltaFosB umritunarvirkni með Ser27 fosfórýleringu. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 30. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dópamín-CCK samspil við umbun fyrir geðörvandi áhrif og skyld hegðun. Neurosci Biobehav séra 1992; 18: 207 – 14. [PubMed]
  52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy þingmaður, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Nauðsynlegt hlutverk fyrir os FosB í kjarnanum sem samanstendur af í morfínvirkni. Náttúra tauga. 2006; 9: 205 – 11. [PubMed]