Abstract
Breyting á geðörvandi völdum geðhvarfa á dópamínóviðtaka taugafrumum í nucleus accumbens (NAcc) hefur verið tilgáta sem aðlagandi taugafrumvarp sem tengist langvarandi ávanabindandi hegðun. NAcc er að mestu leyti samsett úr tveimur aðskildum undirhópum meðalstórra, spiny taugafrumna sem tjá mikið magn af dópamíni D1 eða D2 viðtökum. Í þessari rannsókn greindum við þéttleika hryggdýra eftir langvarandi kókaínmeðferð í aðgreindum D1 eða D2 viðtaka sem innihalda meðalstór spiny taugafrumur í NAcc. Þessar rannsóknir notuðu erfðabreyttar mýs sem tjáðu EGFP undir stjórn annaðhvort D1 eða D2 viðtakablöndu (Drd1-EGFP eða Drd2-EGFP). Eftir 28 daga kókaínmeðferð og 2 daga fráhvarf jókst þéttleiki hryggs í bæði Drd1-EGFP- og Drd2-EGFP jákvæðum taugafrumum. Hins vegar var aukning á þéttleika hryggs aðeins viðhaldið í Drd1-EGFP-jákvæðum taugafrumum 30 dögum eftir að lyf var hætt. Athygli vekur að aukin expressionFosB tjáning kom einnig fram í Drd1-EGFP- og Drd2-EGFP-jákvæðum taugafrumum eftir 2 daga afturköllun lyfja en aðeins í Drd1-EGFP jákvæðum taugafrumum eftir 30 daga afturköllun lyfsins. Þessar niðurstöður benda til þess að aukinn þéttleiki hryggs sem sést hefur eftir langvarandi kókaínmeðferð sé aðeins stöðugur í taugafrumum sem innihalda D1 viðtaka og að expressionFosB tjáning tengist myndun og / eða viðhald tindarhryggja í D1 sem og taugafrumum sem innihalda D2 viðtaka. í NAcc.
Mesólimbísk dópamínvirka leiðin samanstendur af taugafrumum á ventral tegmental svæðinu sem leggst undir kjarna accumbens (NAcc), lyktarhnýði, forstilltu heilaberki og amygdala (1), en dópamínvirkar taugafrumur í nigrostriatal í substantia nigra (pars compacta) veita stigvaxandi vörpun til ryggisstrífs (2). Geðörvandi lyf hækka synaptískan styrk dópamíns í NAcc: kókaíni, með því að hindra upptöku dópamíns úr klofinu og amfetamín, með því að stuðla að losun dópamíns frá taugastöðvum (3-5). Endurtekin, stöðvuð gjöf geðörvandi lyfja leiðir til aukinna hegðunarviðbragða (næmni) á bráðum örvandi áhrifum þessara lyfja (6-8). Flestar vísbendingar benda til þess að aðlögunarbreytingar á vöðva tegmental svæði – NAcc dópamínvirka kerfinu séu meginatriði í breytingum á reynsluháðri plastleika sem liggur til grundvallar hegðun af völdum lyfja.
Auk dópamíns er glútamat nauðsynlegt til að þróa hegðun næmni sem svar við geðörvandi lyfjum (9, 10). Miðlungs stór spiny taugafrumur (MSNs) í ventral striatum fá örvandi glutamatergic framskot frá forstilltu heilaberki sem myndast á höfði tindarhrygg. MSN eru einnig aðalmarkmið dópamínvirkra axóna sem myndast á hryggjarhálsum (1, 11, 12). Þess vegna eru tindarhryggir í MSN táknar frumuhólfið þar sem dópamínvirk og glutamatergic sending er upphaflega samþætt.
Dópamín verkar á tvær helstu undirflokka viðtakanna, D1 undirflokksins (D1 og D5 undirtegundir) og D2 undirflokksins (D2, D3 og D4 undirtegundir) (13). Í ristli á baki hafa líffræðilegar rannsóknir sýnt fram á að MS-streymaörvandi innihaldsefni innihalda mikið magn af D1 viðtökum (ásamt efni P og dynorphin), en ristilþrepandi MSN-lyf tjá aðallega D2 viðtaka (ásamt enkephalin) (14-17). Spár frá NAcc eru flóknari en í riddarastriki, þar sem skelin og kjarnahlutar NAcc eru að því marki að aðskildum undirsvæðum ventral pallidum og að miðlæga tegmental svæði og substantia nigra (18). Þrátt fyrir að D2 viðtökur og enkephalin séu mjög tjáðar í spám á ventral pallidum, eru D1 viðtökur og efni P að finna jafnt dreift í spám til ventral pallidum og ventral tegmental area (19). Rannsóknir á örvum og mótlyfjum, sem eru sértækir fyrir D1 eða D2 viðtaka, sýndu að bæði D1 og D2 viðtökur eru nauðsynlegar vegna geðörvandi háða hegðunarbreytinga (20-25). Hlutverk þessara viðtaka virðist þó vera mismunandi. Til dæmis, örvun D1 viðtaka dregur úr kókaíni sem er leitað af völdum inndælingar með kókaíngræðslu og kókaínstengdum umhverfismerkjum en örvun D2 viðtaka auðveldar endurupptöku af kókaíni (26-28).
Hegðunarafbrigðin tengd geðveikri fíkn eru afar langlífi. Þess vegna hefur verið töluverður áhugi á að bera kennsl á langvarandi breytingar af völdum lyfja á sameinda- og byggingarstigi í taugakerfi sem stjórnað er af dópamíni og glútamati (29-32). Sérstaklega hefur komið í ljós að langtímaáhrif á kókaíni eða amfetamíni fjölga fjöldagreindarpunktum og hrygg MSN í NAcc (33-35). Sýnt hefur verið fram á að þessar skipulagsbreytingar eru í allt að ≈1 – 3.5 mánuðum eftir síðustu váhrif á lyfinu (30, 35) og hefur verið ráðlagt að liggja til grundvallar langvarandi breytingum á synaptískri plastleika í tengslum við útsetningu fyrir geðörvandi áhrifum.
Markmið þessarar rannsóknar var að skoða byggingarbreytingar af völdum kókaíns af völdum tindarhryggja í undirflokkum uppsöfnuðra MSN sem tjá annað hvort D1 eða D2 viðtaka. Í þessum rannsóknum höfum við notað erfðabreyttar músar úr bakteríum litning (BAC) sem tjá EGFP undir stjórn annaðhvort D1 (Drd1-EGFP) eða D2 (Drd2-EGFP) dópamín viðtakaörvunar (36). Niðurstöðurnar benda til þess að þrátt fyrir að aukinn þéttleiki hryggs gerist upphaflega í MSN sem innihalda D1 viðtakann og MSN sem innihalda D2 viðtakann, er breytta hryggþéttleiki aðeins stöðugur í taugafrumum sem innihalda D1 viðtakann. Ennfremur finnum við svipaðar breytingar á tjáningu umritunarstuðilsins osFB, sem bendir til þess að osFosB geti átt þátt í myndun og / eða viðhaldi á tindarhryggum í D1 sem og D2 viðtaka sem innihalda viðtaka í NAcc.
Niðurstöður
Greining á MSN í Drd1-EGFP og Drd2-EGFP BAC erfðabreyttum músum.
Vörpunarmynstur MSN frá baklægum og ventral striatum í Drd1-EGFP eða Drd2-EGFP BAC erfðabreyttum músum hefur verið einkennist með greiningu á GFP tjáningu (36). Mismunur tjáningar á GFP í MSNs í ristli á baki samsvarar almennt þeim innræna D1 eða D2 viðtaka, hvort um sig (36). Við greindum frekar mismunadjáningu GFP í NAcc í Drd1-EGFP eða Drd2-EGFP músum (Fig. 1a og b). Þó að N58% taugafrumna í NAcc hafi tjáð GFP í Drd1-EGFP músum (Fig. 1a), N48% taugafrumna í NAcc tjáðu GFP í Drd-2-EGFP músum (Fig. 1b). MSN tákna 90 – 95% allra taugafrumna í NAcc (12, 37). D1 viðtakar eru einungis tjáðir í MSN og D2 viðtakar eru tjáðir í MSN og kólínvirka interneurons, sem tákna 1 – 3% af stíga taugafrumum (37). Að teknu tilliti til þessara þátta benda niðurstöðurnar til þess að minim10 – 15% MSN í NAcc séu að lágmarki líkleg til að tjá bæði D1 og D2 viðtaka.
Greining á ósæðarhrygg í Drd1-EGFP og Drd2-EGFP músum.
GFP tjáning í Drd1-EGFP og Drd2-EGFP músunum var gagnleg til að lita taugafrumum. Samt sem áður var GFP merkið í dendrites og tindarhryggjum of veikt til að leyfa greiningu þeirra eftir ónæmislyktun með and-GFP mótefnum. Sölumeðferð með blöðru á flúrljómandi litum hefur nýlega verið notuð til að merkja taugafrumum á fljótlegan og skilvirkan hátt (38). Hægt er að merkja heila taugafrumur með þessari tækni og aðferðin virðist vera sambærileg við Golgi – Cox litun. Til að greina dendritic formgerð taugafrumna í NAcc voru fastar uppsöfnuðar sneiðar merktar með fitusæknum flúrljómslitunarefni 1,1′-díótadecýl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) með því að nota genapistil. Dæmi um DiI-lituð MSN er sýnt í Fig. 1c. Við þær aðstæður sem notaðar voru sáum við almennt merktar taugafrumur án þess að skarast dendrites frá öðrum merktum taugafrumum. Við stærri stækkun mætti sjá ítarlega útfærslu á botnlanga, þ.mt tindarhrygg (Fig. 1d).
Við notuðum síðan blöndu af DiI merkingu og ónæmisheilbrigðafræði fyrir GFP í annað hvort Drd1-EGFP eða Drd2-EGFP erfðabreyttum músum, sem var gert mögulegt með því að nota lítinn styrk þvottaefni fyrir permeabilization vefja (sjá aðferðir). Með vandlegum samanburði á DiI blettinum og GFP tjáningu í frumum líkamans MSN, gætum við greint DiI- og GFP-jákvæða eða DiI-jákvæða og GFP-neikvæða taugafrumur í Drd1-EGFP (Fig. 2a) eða Drd2-EGFP (Fig. 2b) mýs. Fyrir eftirfarandi rannsóknir, greindum við útfellingarrannsóknir í dendritic í aðeins DiI- og GFP-jákvæðum taugafrumum frá Drd1-EGFP eða Drd2-EGFP músum.
Langvinn kókaínmeðferð hefur í för með sér aukna þéttleika hryggs í MSN sem er gefinn upp í teppum og tjáir annað hvort Drd1-EGFP eða Drd2-EGFP.
Drd1-EGFP eða Drd2-EGFP músum var sprautað ítrekað með kókaíni (30 mg / kg) eða saltvatni í fjórar vikur í röð (sjá aðferðir). Tveimur dögum (2WD) eða 30 dagar (30WD) eftir síðustu lyfjameðferð voru gáfur unnar fyrir DiI merkingu og ónæmisheilbrigðafræði eins og lýst er hér að ofan. Í fyrri rannsókn var greint frá því að langvarandi meðferð með amfetamíni jók þéttleika hryggs á distal en ekki proximal dendrites MSNs í NAcc (35). Við takmörkuðum því greiningu okkar við fjarlægar dendrites (þ.e. þær sem eru með annarri eða þriðju röð útibúa), þar með talið flugstöðvasvæði. Þegar greind var með 2WD, reyndist hryggþéttleiki aukast í Drd1-EGFP-jákvæðum MSN (128% saltvatnshóps) (Fig. 3a og c) og í minna mæli í Drd2-EGFP-jákvæðum taugafrumum (115% saltvatnshóps) (Fig. 3 b og d). Eftir 30WD hélst aukinn þéttleiki hryggs í Drd1-EGFP-jákvæðum taugafrumum (118% saltvatnsstjórnunar) (Fig. 3 a og c) en ekki í Drd2-EGFP-jákvæðum taugafrumum (Fig. 3 b og d).
Formgerð dendritískra hryggja er breytileg hvað varðar lengd þeirra og breidd hrygghausa. Við flokkuðum þess vegna útlæga útfellingu í fjóra hryggstegunda (þrjóskur, sveppir, þunnir og þráðberar) við 2WD úr kókaíni (gögn eru ekki sýnd). Þéttleiki sveppategundar (119.7 ± 4.0%, P <0.01) og þunnar hryggir (120.0 ± 3.4%, P <0.01) var aukið með kókaínmeðferð í Drd1-EGFP jákvæðum MSN, en þéttleiki stubbar (182.4 ± 21.6%, P <0.05) og sveppahryggir (122.5 ± 5.0%, P <0.01) var aukið í Drd2-EGFP jákvæðum MSN. Engin marktæk aukning var á þéttum hryggjum í Drd1-EGFP jákvæðum taugafrumum eða þunnum hryggjum í Drd2-EGFP jákvæðum taugafrumum.
Langvinn kókaín framkallar ΔFosB tjáningu í Drd1-EGFP- eða Drd2-EGFP-Jákvæð MSN í NAcc.
ΔFosB er meðlimur í Fos fjölskyldunni umritunarþátta. Bráð gjöf kókaíns örvar hröð og tímabundna örvun nokkurra Fos ísóforma í NAcc, en endurtekin útsetning fyrir kókaíni eykur stig FOSB. Ennfremur, aukning á osFosB tjáningu er viðvarandi í NAcc vikum til mánuðum eftir að hætt var við váhrif á lyfjum og hefur verið lagt til að taka þátt í langvarandi stjórnun á tjáningu gena, jafnvel eftir að hætt var við notkun lyfsins (29, 39, 40).
Til að kanna örvun ΔFosB í NAcc frá Drd1-EGFP eða Drd2-EGFP músum eftir kókaínmeðferð, greindum við FosB og GFP tjáningu með tvöföldum merkingum (Fig. 4 og Tafla 1) Anti-FosB mótefnið þekkir allar gerðir af FosB, en við gerum ráð fyrir að aukna ónæmisgeymið tákni ΔFosB (sjá aðferðir til frekari umræðu). Hjá saltmeðhöndluðum músum, 16% Drd1-EGFP-jákvæðra taugafrumna og 15% Drd2-EGFP-jákvæðra taugafrumna lýstu FosB ónæmisvirkni með tiltölulega veikum styrkleika (Fig. 4 a og b og Tafla 1). Endurtekin kókaínmeðferð fylgt eftir með 2WD leiddi til verulegrar aukningar á fjölda Drd1-EGFP-jákvæðra taugafrumna sem sameinuðu ΔFosB (55% GFP-jákvæðra taugafrumna) (Fig. 4c og Tafla 1). Minni en samt veruleg aukning á osFosB tjáningu fannst í Drd2-EGFP-jákvæðum taugafrumum (25% GFP-jákvæðra taugafrumna) (Fig. 4d og Tafla 1). Eins og með breytingar á þéttleika hryggs var aukinni tjáningu ΔFosB haldið í Drd1-EGFP-jákvæðum taugafrumum (46% GFP-jákvæðra taugafrumna) en ekki í Drd2-EGFP-jákvæðum taugafrumum (15% af GFP-jákvæðum taugafrumum) eftir 30WD (Fig. 4 e og f og Tafla 1). Athugaðu að aukin expressionFosB tjáning sást í Fig. 4f er til staðar í Drd2-EGFP-neikvæðum taugafrumum.
Discussion
Talið er að langvarandi aðlögun við dópamínvirka taugaboðefni liggi undir ávanabindandi hegðun í tengslum við geðörvandi lyf. Einkum hefur verið gert ráð fyrir aukningu á geðrofsaldri af völdum geðhvarfa MSN í NAcc til að tengjast endurskipulagningu samstillingar tenginga (30). NAcc samanstendur að mestu af tveimur aðskildum undirflokkum MSN sem tjá mikið magn annað hvort D1 eða D2 dópamínviðtaka. Í þessari rannsókn höfum við greint þéttleika hryggs í aðgreindum D1 eða D2 viðtakendum sem innihalda viðtaka í NAcc eftir langvarandi kókaínmeðferð. Niðurstöðurnar sem fengust sýna að þrátt fyrir að aukinn hryggþéttleiki komi upphaflega fram í MSN sem innihalda D1 viðtakann og MSN sem innihalda D2 viðtakann, þá er breytilegur hryggþéttleiki aðeins stöðugur í taugafrumum sem innihalda D1 viðtakann. Ennfremur finnum við svipað mynstur breytinga á tjáningu umritunarstuðilsins osFB í D1 og D2 viðtaka sem innihalda MSN.
Þessar rannsóknir notuðu BAC erfðabreyttar mýs sem tjá GFP í sértækum undirflokkum MSNs undir stjórn annaðhvort D1 eða D2 viðtakablöndu. Þar að auki þróuðum við tvöfalda merkingaraðferð sem sameinaði ónæmisheilbrigðafræði fyrir GFP og ballistic merkingu taugafrumna með DiI. Fyrri rannsóknir hafa notað Golgi – Cox aðferðina til að greina áhrif geðörvandi lyfja á þéttleika hryggs (34), og DiI aðferðin sem notuð var hér skilaði niðurstöðum sem voru megindlega sambærilegar. Við þróuðum tvímenningsaðferðina vegna þess að litun Golgi er ekki samhæfð ónæmisheilbrigðafræði. Ónæmisþétting krefst venjulega síuþéttni vefja með þvottaefni, ferli sem venjulega leiðir til leysingar fitusækinna litarefna frá himnunni (38). Í núverandi rannsóknum okkar krafðist GFP ónæmisþéttni þó ekki mikinn styrk þvottaefnis til að síga í gegnum vefi og því væri hægt að nota það í tengslum við merkingu á fitusæknum litarefni. Tvímenningsaðferðin okkar ætti að vera almennt gagnleg til rannsókna á skipulagsbreytingum á tindarhrygg, til dæmis þegar hún er notuð til greiningar á BAC erfðabreyttum músalínum þar sem GFP er gefið upp í sérstökum hópum taugafrumna í heilaberki (36).
Þrátt fyrir að vera enn nokkuð umdeildur er talið að D1 og D2 viðtakar séu að mestu leyti aðgreindir frá beinum (striatonigral) og óbeinum (striatopallidal) striatal projection neurons, hver um sig (17, 41). Upphafleg einkenni staðsetningar GFP í Drd1-EGFP og Drd2-EGFP músunum var í samræmi við þessa niðurstöðu (36). Ennfremur er greining okkar á fjölda GFP-jákvæðra taugafrumna í NAcc frá Drd1-EGFP og Drd2-EGFP músum í samræmi við þá ályktun að ≈50% MSN tjái aðeins D1 viðtaka, að N35 – 40% tjái aðeins D2 viðtaka, og að ≈10 – 15% samtryggi bæði D1 og D2 viðtaka. Þetta gildi samdráttar er svipað því sem gefið er í skyn í rannsóknum á ristli á baki sem sameinuðu plástur-klemmagreiningar á stakri taugafrumum með RT-PCR tækni til að einangra og magna mRNA (≈17% samleiðslu enkephalins og efnis P) (42). Það skal tekið fram að núverandi rannsóknir okkar taka ekki til spurningarinnar um tjáningu D3, D4 og D5 viðtaka, né fjalla þær einnig um lítið tjáningarstig D1 viðtaka í MSN sem tjá mikið magn D2 viðtaka eða öfugt.
Nokkrar fyrri rannsóknir hafa skoðað staðsetningu taugafrumna á geðörvandi framkallaðri Fos tjáningu og hlutverk D1 og D2 viðtaka (43-45). Þessar rannsóknir studdu þá niðurstöðu að örvun Fos og ΔFosB sé miðluð með virkjun D1 viðtaka. Hins vegar er staðsetning Fos-tjáningar í frumum undir áhrifum af umhverfissamhengi þar sem geðörvandi lyf eru gefin (46, 47). Til dæmis framkallar amfetamín eða kókaín sem gefið er í heimabúrinu strax snemma gen (þar með talið Fos) helst í P-jákvæðum frumum efna sem sameina D1 viðtaka. Aftur á móti geta þessi lyf framkallað Fos tjáningu í bæði D1 og D2 viðtaka sem innihalda MSN þegar þau eru gefin í nýjum aðstæðum. Samskiptareglurnar sem notaðar voru í núverandi rannsóknum okkar innihéldu ekki pörun lyfjagjafar við útsetningu fyrir nýjum umhverfi. Samt sem áður getum við ekki útilokað einhverskonar samhengisháðan streitu sem er ábyrgur fyrir expressionFosB tjáningu í MSN sem innihalda D2 viðtakann.
Athyglisverður eiginleiki núverandi niðurstaðna var samsíða mynstur aukinnar þéttleika hryggs og expressionFosB tjáningu. Aukinn þéttleiki hryggs og expressionFosB tjáning átti sér stað upphaflega í MSN sem tjáðu Drd1-EGFP og Drd2-EGFP. Samt sem áður voru þessar breytingar einungis stöðugar í taugafrumum sem innihalda D1 viðtakann. Ein möguleg skýring á athuguninni á því að aukinn þéttleiki hryggs og expressionFosB tjáningu fannst tímabundið í taugafrumum sem innihalda D2 viðtaka, er að þetta átti sér stað í litla broti MSN sem sameina bæði D1 og D2 dópamínviðtaka. Þannig getur skammvinn eðli þessara hækkana tengst mótlætisáhrifum af virkjun D2 viðtaka á D1 háð merkjaslóð (48). Það vekur áhuga að breytingar á þéttleika hryggs og expressionFosB tjáningu voru afturkræfar, sem gætu endurspeglað getu D2 viðtakaháðra merkjaslóða til að hafa áhrif á stöðugleika ΔFosB.
Athugunin að samsíða breytingar eru á tjáningu ΔFosB og þéttleika hryggs er í samræmi við þá hugmynd að ΔFosB sé þátttakandi í upphafsmynduninni og síðari viðhaldi á dendritískum hryggjum í taugafrumum sem innihalda D1 viðtakann í NAcc. Tjáningu ΔFosB er stjórnað af D1 / DARPP-32 / PP1 háð merkjaslóð í MSNs (49). Nokkrar rannsóknir hafa sýnt að osFosB gegnir mikilvægu hlutverki í gefandi og hreyfingaraðgerð aðgerða geðörvandi lyfja (39), líklega með því að hafa áhrif á tjáningu margra gena sem innihalda taugaboðefnaviðtaka, merkjaprótein og prótein sem taka þátt í stjórnun á taugafrumulögun (50). Samt sem áður eru ekki þekktir sértækir sameindir sem tengjast þátttöku í langvinnri myndun hrygg. Fyrri rannsóknir okkar hafa sýnt að innrennsli innrennslis af Cdk5 hemlinum roscovitine dregið úr kókaínvöldum hækkaði þéttleika hryggsins (51). Ennfremur er Cdk5 downstream markmið gen fyrir ΔFosB og hefur verið beitt í jöfnunaraðlögunarbreytingum sem tengjast langvinnri kókaínmeðferð (52). Þess vegna er breyting á Cdk5 háð fosfórýlering trúanleg fyrirkomulag sem liggur að baki myndun hryggmyndunar af völdum kókaíns og / eða stöðugleika í hrygg. PAK (53), ß-katenín (54), PSD-95 (55), og spínófílín (56) eru hvarfefni fyrir Cdk5 og taka öll þátt í stjórnun á myndun hryggjar (57-60). Frekari lýsing á þessum og öðrum Cdk5 hvarfefnum í hryggjum mun vonandi varpa ljósi á aðferðir sem koma við sögu í stjórnun hryggmyndunar með geðlyfjum.
aðferðir
Dýr.
Mýs sem báru EGFP transgen undir stjórn D1 eða D2 dópamínviðtaka voru búnar til með Gensat BAC erfðabreyttu verkefni (36). Þær erfðabreyttu mýs sem notaðar voru í þessari rannsókn voru 4 – 5 vikna gamlar og voru á svissnesk-Webster bakgrunni. Músum var haldið í 12: 12-h ljós / dökk hringrás og hýst í hópum 2 – 5 með mat og vatni í boði ad libitum. Allar dýrareglur voru í samræmi við National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og voru samþykktar af Rockefeller háskólanum dýraverndun og notkun nefndarinnar.
Lyfjameðferð.
Sagt var að langvinn kókaínmeðferð (30 mg / kg, daglega) myndi framleiða öfluga aukningu á hryggþéttni MSN í bæði kjarna og skel NAcc frá rottum, en lægri skammtur (15 mg / kg) jók þéttleika hryggs aðeins í skelin (61). Við notuðum því hærri skammt af kókaíni til að framkalla uppbyggingu í báðum hlutum NAcc. Mýs fengu eina inndælingu (ip) af 30 mg / kg kókaíni-HCl (eða saltvatni) á hverjum degi í 5 daga samfleytt, á eftir fylgdu 2 inndælingarlausir dagar, og þessi aðferð var endurtekin í 4 vikur samfleytt. Stungulyf voru framkvæmd í búrinu heima. 2WD eða 30WD, músarheili voru unnar fyrir DiI merkingu og / eða ónæmisheilbrigðafræði.
Ballistic Merking með flúrperu litarefni DiI.
Mýs voru svæfðar með 80 mg / kg natríum pentobarbitali og perfusaðir með hjarta með 5 ml af PBS, fylgt eftir með skjótum flæðingu með 40 ml af 4% paraformaldehýð í PBS (20 ml / mín). Gáfur voru fljótt fjarlægðir úr hauskúpunni og festir aftur í 4% paraformaldehýð í 10 mín. Heilasneiðar (100 μm) voru merktar með ballistískri afhendingu á flúrperu litarefni DiI (Molecular Probes) eins og lýst er í tilvísun. 38. Samsett DiI merking – ónæmisheilbrigðafræði var þróuð með lágum styrk þvottaefnis. DiI-merktir hlutar voru síaðir með 0.01% Triton X-100 í PBS í 15 mín og síðan ræktaðir í 0.01% Triton X-100 og 10% venjulegt geitasermi í PBS fyrir 1 h til að lágmarka ósértæka merkingu. Vefjuhlutar voru síðan ræktaðir með 1% venjulegu geitasermi / 0.01% Triton X-100 og andstæðingur-GFP mótefni (Abcam, Cambridge, MA) í 2 h við stofuhita, þvegið og ræktað í 1: 1,000 þynningu af FITC- samtengd aukamótefni (Molecular Probes). Hlutar voru settir á smásjárrennibrautir og hyljaðir með festingarefni. Blönduð merkingaraðferð gerði kleift að gera nákvæma greiningu á uppbyggingu hryggjarðar og niðurstöðurnar sem fengust voru eðlisfræðilega og megindlega samanburðarhæfar við fyrri rannsóknir með Golgi – Cox gegndreypingaraðferð í heilasneiðum rottna34). Hins vegar, öfugt við fyrri rannsóknir, sáum við sjaldan tvíhöfða hrygg í DiI-lituðum taugafrumum. Þessi munur getur stafað af næmi litunaraðferða eða breytileika músar (þessi rannsókn) á móti rottuvef (34).
Ónæmissjúkdómafræði.
Dýr voru svæfð og blandað eins og lýst er hér að ofan. Gáfur voru fjarlægðar og geymdar yfir nótt í 4% paraformaldehýð við 4 ° C. Heilir voru fluttir yfir í 30% súkrósa í PBS lausn til að verja. Kransæðahlutar (12 μm) voru skornir á frysti smáfrumu (Leica) og síðan unnir til ónæmisheilbrigðafræði. Heilaþættir voru síðan síaðir í 0.3% Triton X-100 í PBS í 15 mín og skolaðir tvisvar í PBS. Þættirnir voru ræktaðir í 10% venjulegu geitasermi í PBS fyrir 1 klst. Við 37 ° C, útsettir fyrir aðal mótefnum (þynnt í 1% venjulegu geitasermi í PBS) yfir nótt við 4 ° C, og síðan skolað í PBS og ræktað með efri hluta mótefni fyrir 1 h við 37 ° C. Eftirfarandi mótefni voru notuð: kanína gegn pönnu-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz líftækni), mús andstæðingur-NeuN (Chemicon), kanína andstæðingur-GFP, FITC-samtengd and-kanína IgG og rhodamine- samtengt and-mús IgG (Molecular Probes). Til þrefaldrar merkingar (ΔFosB, NeuN og GFP) voru heilahlutar fyrst ónæmismeðhöndlaðir með and-pönnu FosB mótefni og and-NeuN mótefni og síðan ræktaðir með efri mótefni (rhodamine-samtengd and-kanína IgG og cyan-samtengd and-mús IgG ). Tvílitaðar heilaþættir voru frekar unnir fyrir GFP ónæmisþéttingu með því að nota Zenon merkingar tækni (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Anti-pan-FosB mótefnið var alið upp í N enda FosB og viðurkennir ΔFosB og FosB í fullri lengd (62). Byggt á fyrri rannsóknum sem sýndu að ΔFosB en ekki FosB eða önnur Fos-tengd mótefnavaka er stöðugt tjáð eftir langvarandi kókaínmeðferð, gerum við ráð fyrir að langvarandi aukning á ónæmisvirkni tákni stöðuga tjáningu á FosB. Auðkenni ónæmisviðbragðs FosB merkisins sem kom fram í saltmeðhöndluðum músum er þó ekki þekkt. Tölfræðileg greining í Tafla 1 notaði námsmanninn t próf.
Dendritic hrygggreining.
Einstök MSN í NAcc voru valin til hrygggreiningar út frá nokkrum forsendum. (i) Það var lágmarks eða engin skörun við aðrar merktar frumur til að tryggja að ferlar frá mismunandi frumum myndu ekki ruglast. (ii) Að minnsta kosti þrjár frumskiljanir þurftu til að vera sýnilegar fyrir frumur til að nota til greiningar. (iii) Distal dendrites (terminal dendrites eða nálægt terminal dendrite) voru skoðaðir. Dendrítar frá báðum MSN í kjarna og skel NAcc voru greindir. Þrátt fyrir að við gætum lítilla MSNs (spiny type II) greindum við aðeins MSN (spiny type I) þétt spined. Til að reikna þéttleika hryggs var lengd dendríts (> 20 μm að lengd) rakin með því að nota confocal smásjá (Zeiss LSM 510) með olíudýfu linsu (× 40). Allar myndir af dendríti voru teknar á mismunandi hátt z stig (0.5 – 1 μm dýpt millibili) til að skoða formgerð tindrænna hryggs. Allar mælingar voru gerðar með myndgreiningarhugbúnaði með myndbreytingu (Universal Imaging, Downingtown, PA). Tölfræðileg greining notaði Kolmogorov – Smirnov prófið.
Útstæðir frá dendrites voru flokkaðar í fjórar tegundir miðað við lengd þeirra eins og lýst er í tilvísunum. 63 og 64. Útskot í flokki 1, einnig kallað stubbuð útblástur, voru <0.5 μm að lengd, skorti stórt hrygghöfuð og virtist ekki hafa háls; flokkur 2, eða sveppalaga hryggir, voru á bilinu 0.5 til 1.25 μm að lengd og einkenndust af stuttum hálsi og stórum hrygghöfuð; flokkur 3, eða þunnir hryggir, voru á bilinu 1.25 til 3.0 μm og með lengja hryggháls með litlum hausum; flokkur 4, eða filopodial framlengingar, voru löng þráðbrot sem skorti greinanlegt hrygghöfuð.
Acknowledgments
Þessi vinna var studd af opinberri heilbrigðisþjónustu Bandaríkjanna, Grant DA10044 (til PG og ACN) og af Simons Foundation, Peter J. Sharp stofnuninni, Picower Foundation og FM Kirby Foundation.
Skammstafanir
- NAcc
- kjarna accumbens
- MSN
- meðalstór spiny taugafruma
- BAC
- gervilitning baktería
- Drd1
- dópamínviðtaka D1 stýrisvél
- Drd2
- dópamínviðtaka D2 stýrisvél
- DiI
- 1,1′-díótadecýl-3,3,3 ′, 3′-tetrametýlindókarbósýanín perklórat
- 2WD
- 2 dögum eftir síðustu lyfjameðferð
- 30WD
- 30 dögum eftir síðustu lyfjameðferð.
Meðmæli