PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Breytingar á kókaíni af völdum genatjáningar valda breytingum á taugakerfi og hegðun sem kann að liggja undir fíkn í kókaíni. Við bentum á mikilvægu hlutverki fyrir histón 3 lýsín 9 (H3K9) dímetýleringu og lýsín dímetýltransferasa G9a í uppbyggingu og hegðunarplastleika af kókaíni. Endurtekin gjöf kókaíns minnkaði hnattrænt magn H3K9 dímetýleringu í kjarnanum. Tminnkun hans á histónmetýleringu var miðluð með kúgun G9a á þessu heila svæðinu, sem var stjórnað af uppskriftarstuðli ocaFB af kókaíni. Með því að nota skilyrt stökkbreytingu og veirumiðað genaflutning, komumst við að því að G9a niðurlæging jók aukningu á tindarhrygg á taugafrumum í nucleus accumbens og eykur val á kókaíni og staðfesti þar með lykilhlutverk fyrir histónmetýleringu til langs tíma aðgerðir kókaíns.
Hvernig gengur lífið dag frá degi? Er það í jafnvægi og allt eins og það á að vera? Er jafnvægi hvort sem litið er á veraldlega stöðu eða andlega? Lífið er eins og það er. Það er ekki alltaf sólskyn. Það koma reglulega lægðir með rok og rigningu. Við vitum að í heildar samhenginu er lægð hluti af vistkerfi að leita að jafnvægi. Stundum erum við stödd í miðju lægðarinnar. Þar er logn og gott veður, sama hvað gengur á þar sem stormurinn er mestur. Sama lögmál gildir varðandi þitt eigið líf. Ef þú ert í þinn miðju, þínum sannleik þá heldur þú alltaf jafnvægi átakalaust. Sama hvað gustar mikið frá þér þegar þú lætur til þín taka. Huldufólk hefur gefið okkur hugleiðslu sem hjálpar okkur að finna þessa miðju, finna kjarna okkar og sannleikann sem í honum býr. Þegar þú veist hver þú ert og hvers vegna þú ert hér, mun líf þitt vera í flæðandi jafnvægi. Hugleiðslan virkjar þekkinguna sem er í vitund jarðar og færir hana með lífsorkunni inn í líkama okkar. Þar skoðar hún hugsana og hegðunar munstrið og athugar hvort það myndar átakalausu flæðandi jafnvægi. Hinn möguleikinn er falskt jafnvægi sem hafa þarf fyrir að viðhalda með tilheyrandi striti, áhyggjum og ótta. Síðan leiðbeinir þessi þekking okkur að því jafnvægi sem er okkur eðlilegt. Við blómstrum átakalaust, líkt og planta sem vex átakalaut frá fræi í fullþroska plöntu sem ber ávöxt.
Endurtekin útsetning fyrir kókaíni einkennist af viðvarandi breytingum á tjáningu gena og breyttum taugafrumum innan kjarna accumbens (NAc), lykilþáttur í umbunarbraut heilans (1-2). Endurnýjun á krómatíni er mikilvæg við fráviksbreytingar umbreytingar á þessu heila svæði sem kunna að liggja að baki þáttum kókaínfíknar. (3-9). Kókaínstýring á krómatín uppbyggingu í NAc leiðir að hluta til af beinum breytingum á kókaíni af völdum krómatín ensím véla sem leiðir til breytinga á histón asetýleringu og fosfórýleringu (4, 7-9); Hins vegar hafa hlutverk fyrir ensím sem stjórna histónmetýleringu ekki enn verið rannsökuð.
Nýleg erfðagreining á örvandi erfðagreining þar sem notuð var krómatín ónæmisútfelling, samtengd örörpum (ChIP-Chip), benti á breytt mynstur á bælandi históni H3 lýsín 9 (H3K9) og 27 (H3K27) metýleringu við sérstaka genaefli í NAc meðferðinni eftir c)6). Við prófuðum því fjölda lysínmetýltransferasa (KMTs) og demetýlasa (KDM) sem vitað er að stjórna H3K9 eða H3K27 metýleringu (Mynd 1A). Aðeins tvö ensím, G9a og GLP, sýndu viðvarandi eftirlitsreglugerð 24 klukkustundum eftir endurtekna gjöf kókaíns, þegar tjáning beggja genanna var verulega niðurregluð. Vegna þess að G9a og GLP hvata sérstaklega dimetýleringu H3K9 (H3K9me2), er niðurregla þeirra með kókaíni í samræmi við minnkað alheimsþéttni heilkvíða H3K9me2 á þessum tímapunkti (Mynd 1B). Aftur á móti hélst alþjóðlegt magn af heterókrómatískum H3K27 metýleringu óbreyttum vegna endurtekinna útsetningar fyrir kókaíni (Mynd S1 í stuðningi við netefni). Vegna mikils hvata virkni hvort tveggja vitro og in vivo (10), lögðum við af stað til að kanna frekar virkni mikilvægis G9a kúgunar eftir endurtekna váhrif af kókaíni í NAc. Stig G9a próteins, eins og magn mRNA þess, var verulega lækkað 24 klukkustundum eftir endurtekna gjöf kókaíns (Mynd S2). Þrátt fyrir að G9a mRNA tjáning hafi verið lækkuð um 35% í NAc, kom ónæmisheilbrigðafræðileg greining fram á hóflegri 15% lækkun á G9a próteinmagni, í samræmi við 21% lækkun á H3K9me2 eftir endurtekna gjöf kókaíns (Mynd 1B). G9a mRNA tjáning var einnig stjórnað niður á þessu heila svæði um 20% í kjölfar endurtekinnar sjálfsmeðferðar kókaíns (Mynd S3).
Til að greina hvort breytingar á heilkvíða H3K9me2 voru í samræmi við erfðabreyttar breytingar á genatjáningu í NAc notuðum við örbylgjugreiningar til að skoða genatjáningarsnið sem framkölluð voru með áskorunarskammti af kókaíni hjá dýrum með eða án sögu um fyrri útsetningu fyrir kókaíni (sjá viðbótar genalista í Töflur S1 – S3). Dýr sem höfðu fengið endurtekið kókaín sýndu verulega aukna genatjáningu 1 klukkustund eftir kókaínáskorun í samanburði við dýr sem voru meðhöndluð með háu stigiMynd 1C). Þessi aukna genatjáning átti sér stað enn sem svar við kókaínáskorun sem gefin var eftir 1 viku frásögn úr endurteknu kókaíni. Í samræmi við fyrri skýrslur sýndi lítið hlutfall gena (~ 10%) ónæmt afritunarviðbrögð eftir endurtekna gjöf kókaíns (Mynd 1C; sjá Tafla S1) (5). Til að rannsaka beint hlutverk G9a niðurlægingar í aukinni genatjáningu sem kom fram eftir endurtekið kókaín, fengu músar innspýtingar í NAc af Herpes simplex vírusum (HSV) vektorum sem tjáðu annað hvort GFP eða G9a og voru meðhöndlaðar með saltvatni eða endurteknu kókaíni til að ákvarða hvort G9a ofþjáning. nægði til að hindra endurtekna aukningu á tjáningu gena á kókaíni. Úr hópi af 12 af handahófi völdum genum sem sýndu aukið tjáningarstig í kjölfar endurtekins kókaíns, sáum við að G9a dró verulega úr aukinni tjáningu 50% þessara gena (Tafla S4).
Til að bera kennsl á atburði í uppstreymi sem miðast við endurtekna kókaínvökva kúgun á G9a tjáningu, könnuðum við mögulegt hlutverk fyrir osFosB, mjög stöðuga skurðarafurð strax snemma gensins fosB. Δ FosB safnast upp í NAc eftir endurtekna váhrif af kókaíni, þar sem það hefur verið tengt við aukin kókaín umbun (11). Δ FosB getur virkað sem annað hvort transcriptional activator eða repressor eftir því markgeni sem um er að ræða (3, 5, 6, 12). Notkun bitransgenic NSE-tTA × tetOP-ΔFosB músum, þar sem hægt er að framkalla expressionFosB tjáningu sérhæfða í NAc og borsstrok fullorðinna dýra (13), við skoðuðum áhrif ΔFosB tjáningar á kókaínreglugerð á H3K9me2 og KMTs í NAc. Over Yfirtjáning FosB nægði til að draga úr stigum bæði H3K9me2 (Mynd 1D) og G9a tjáningu (Mynd 1E), og hermir þar með eftir endurteknum kókaíni. Aftur á móti minnkaði osFosB ekki GLP tjáningu á þessu heilasvæði og hafði engin áhrif á SUV39H1 og EZH2, helstu trimetýlerandi ensím fyrir H3K9, og H3K27, hvort um sig (Mynd S4). Til að staðfesta þessi gögn með því að nota sjálfstætt ΔFosB oftryggingarkerfi, fengu fullorðnar músir af villtu tegund tvíhliða innspýting NAC af Adeno-tengdum vírus (AAV) vektorum sem tjáðu annað hvort GFP eða ΔFosB. Veiru-miðlað oftjáning á osFosB minnkaði stig G9a tjáningar á þessu heila svæði (Mynd 1E).
Slík áberandi og sértæk reglugerð um G9a varð til þess að við rannsökuðum hvort breyting á G9a tjáningu sérstaklega í NAc taugafrumum stjórnar hegðunarviðbrögðum við kókaíni. Mús villtra tegunda fengu innspýtingar innan NAc af HSV-vektorum sem tjáðu GFP eða G9a og voru síðan greindar með óhlutdrægri kókaínskilyrðri staðsetningarpróf, sem veitir óbeinan mælikvarða á lyfjaverðlaun. Veiruofsýni G9a í NAc taugafrumum var staðfest í kjölfar hegðunarprófa (Mynd 2A). G9a ofþjáning minnkaði marktækt val á kókaíni í samanburði við dýr sem ofvirkja GFP (Mynd 2B) og hækkuðu H3K9me2 stig í NAc (Mynd 2C). Ofþjáning á hvata dauða stökkbrigði af G9a (G9aH1093K) (14) hafði ekki áhrif á val á kókaíni (Mynd 2B) og hafði engin áhrif á H3K9me2 stig á þessu heila svæði (Mynd 2C).
Til að rannsaka frekar hlutverk G9a í hegðunaráhrifum kókaíns, og nánar tiltekið til að líkja eftir endurtekinni kókaínvöldum kúgun G9a tjáningar í NAc, fullorðnum G9afl / fl mýs (14) fengu inndælingu innan NAc af AAV vektorum sem tjáðu Cre raðbrigða eða GFP sem stjórn. AAV-Cre niðurbrot G9a í NAc, sem var staðfest ónæmisfræðilega efnafræðilega (Mynd S5), juku verulega áhrif kókaíns í staðartilraunartilraunum og lækkuðu H3K9me2 stig í NAc (Mynd 2D, E.). Lyfjafræðilegur hemill G9a og GLP, sem er fáanlegur í atvinnuskyni, BIX01294 (15-16), var notað til að ganga úr skugga um hvort ensímhömlun hafi svipað áhrif á hegðunarviðbrögð við kókaíni. Reyndar jók lyfjafræðileg hömlun G9a og GLP marktækt val á kókaíni og minnkaði H3K9me2 í NAc (Mynd 2F, G).
Endurtekin gjöf kókaíns eykur þéttleika tindarhryggja á NAc miðlungs spíta taugafrumum (17), ferli sem tengist starfrænum breytingum við örvandi glutamatergic synapses á þessar taugafrumur (18-19) og næm hegðunarviðbrögð við lyfinu (17, 20). Við komum þannig fram að niðurlæging á virkni G9a í NAc með endurteknu kókaíni gæti miðlað getu kókaíns til að stjórna þéttleika hryggs hryggs í taugafrumum. Með því að nota krómatín ónæmisfrumnafjölgun (ChIP) með and-G9a mótefni, bentum við á nokkur afdráttarlaus G9a genamarkmið í NAc, sem hvert þeirra hefur áður verið beitt í kókaín af völdum dendritískri plastleiki (Mynd 3A) (20-26). Við komumst að því að endurtekin gjöf kókaíns minnkaði marktækt G9a bindingu, svo og stig H3K9me2, við þessa genahækkendur (Mynd 3B). Aftur á móti ráðlagði bráð kókaíngjöf G9a hratt til sumra þessara sömu genaörvunar, í samræmi við aukna tjáningu G9a sem sást í NAc 1 klukkustundinni eftir bráðan skammt af kókaíni (Mynd S6). Þrátt fyrir að G9a-binding við sérstaka genaforritara sé í samhengi við breytingar á tjáningu þess, er enn óljóst hvort slíkir atburðir eru miðlaðir af breyttu alþjóðlegu stigi G9a í NAc og / eða með mismun á nýliðun G9a eftir bráða vs endurtekin gjöf kókaíns.
Byggt á reglugerð G9a um fjölmörg plöntutengd gen í NAc, skoðuðum við beint hvort viðhald G9a tjáningar á þessu heila svæði eftir endurtekna kókaínmeðferð var nægjanlegt til að hindra myndun á tindrandi hrygg af kókaíni. Notkun kókaínmeðferðarferlis sem áður hefur verið sýnt fram á að stuðla að framkalla tindarhryggs í NAC20), skoðuðum við þéttleika hryggs í dýrum sem var sprautað með annað hvort HSV-GFP eða HSV-G9a. Í samræmi við fyrri niðurstöður, sáum við verulega aukningu á þéttleika tindar hryggs í NAC í kjölfar kókaínmeðferðar, áhrif sem var stöðvuð með G9a ofþjáningu (Mynd 3C). G9a ofþrýstingur einn og sér var ekki nægur til að draga úr þéttleika NA-tindar hryggs án kókaíns. Til að bæta við þessi gögn, G9afl / fl mýs fengu innspýtingu í NAV af HSV-Cre og þéttleiki hryggs var magngreindur og borinn saman við dýr sem fengu HSV-GFP án kókaíns. Brotthvarf G9a tjáningar jók marktækt hryggþéttni á NAc miðlungs spiny taugafrumum (Mynd 3C).
Miðað við sönnunargögn um að G9a niðurlæging í NAc eftir endurtekið kókaín sé miðlað af ΔFosB, skoðuðum við næst hvort þessi umritunarstuðull er sömuleiðis þátttakandi í stjórnun NAc tindrænna hryggs. Þrátt fyrir að osFosB hafi ekki áður verið tengt orsakavaldi við slíka dendritic plasticity, hafa nokkur markmið þess, þar á meðal Cdk5 og NFκB undireiningar, verið beitt svo (20-23), og persist Þrávirk tjáning FosB í NAc taugafrumum tengist aukinni þéttleika hryggs hryggs eftir endurtekna kókaínmeðferð (27). Í fyrsta lagi fundum við að örvun ΔFosB í bitransgenískum músum án kókaíns, sem stjórnaði G9a og H3K9me2 tjáningu (Mynd 1D, E.), minnkaði G9a bindingu við fjölmörg gen sem tengjast plasti, og mörg þeirra hafa einnig verið sýnd bein markmið við ΔFosB sjálft (Mynd 3D) (3, 6). Við sýndum næst að ofveirusýking á osFosB í NAc jók verulega þéttleika hryggs hryggs við grunnaðstæður, svipað og kom fram eftir endurtekna gjöf kókaíns (Mynd 3E). Aftur á móti hindraði ofdráttur í NAc fyrir unJunD, ráðandi neikvætt stökkbreytt prótein sem mótvægir transFosB umritunarvirkni getu endurtekins kókaíns til að auka myndun á hrygg í hryggnum (Mynd 3C).
Athugun okkar á því að osFosB stýrir tjáningu G9a í NAc, og að osFosB og G9a stjórna sumum sömu markgenum, leiddi til þess að við skoðuðum aðrar milliverkanir ΔFosB og G9a. Eftir bráð kókaín, þegar G9a magn var hækkað, bindur G9a við fosB genið var aukið, en eftir endurtekið kókaín, þegar G9a tjáning var bæla, binddi G9a við fosB geninu var minnkað (Mynd 3A). Slík lækkun G9a bindingar eftir að ekki var endurtekið kókaín c-fos, þar sem G9a bindið er aukið með endurteknu kókaíni (Mynd S7). Þetta er í samræmi við þá staðreynd að ólíkt fosB, c-fos er kúgað, ekki framkölluð, vegna langvarandi geðörvandi váhrifa (5). Over Ofbirting FosB í bitransgenískum músum nægði til að draga verulega úr G9a bindingu við fosb gen (Mynd 3D). Ennfremur nægði ofdráttur á G9a til að draga úr aukinni tjáningu FosB eftir endurtekna gjöf kókaíns (Tafla S4). Þessi gögn benda til reglugerðar lykkju þar sem G9a takmarkar upphaflega örvun ΔFosB vegna bráðrar kókaíngjafar. Hins vegar, þar sem ΔFosB safnast upp með endurteknum váhrifum á lyfjum, kúgar það G9a og styrkir þar með eigin frekari örvun.
Að lokum höfum við sýnt fram á að histón lýsín metýlering í NAc hefur gagnrýninn þátt í að stjórna tjáningu taugafruma sem svar við kókaíni. Kúgun G9a og H3K9me2 eftir endurtekna gjöf kókaíns ýtir undir val á kókaíni, að hluta til, með umritunarvirkjun fjölmargra gena sem vitað er að stjórna afbrigðilegum tegundum dendritic plasticity. Að öðlast betri skilning á genum sem stjórnað er með slíkum aðferðum mun bæta þekkingu okkar á flóknum líffræðilegum grunni eiturlyfjafíknar og gæti hjálpað til við að þróa skilvirkari meðferðir við ávanabindandi kvillum.
Efni og aðferðir
Dýr og meðferðir
Nema annað sé tekið fram voru mýs hýstar fjórum til fimm í hverju búri í nýlenda með 12 klukkustundar ljós / dökkri hringrás (ljós loga frá 7: 00 AM til 7: 00 PM) við stöðugt hitastig (23 ° C) með ad libitum aðgang að vatni og mat. Allar dýrareglur voru samþykktar af IACUC við bæði UT Southwestern Medical Center og Mount Sinai School of Medicine.
Til að nota kókaíntilraunir [ónæmisheilbrigðasjúkdómur, vestrænt blotting, magn PCR (qPCR), örörpagreining og krómatín ónæmisfrestun (ChIP)], voru 8- til 10 vikna gamlar karlkyns C57BL / 6J mýs. Dýr fengu daglega inndælingu af annað hvort 'saltvatni' (7 meðferðar saltvatni, ip), 'bráðu' kókaíni (6 meðferðir saltvatni + ein meðferð 20 mg / kg kókaín-HCl, ip) eða 'endurtekið' kókaín (7 meðferðir 20 mg / kg kókaín-HCl, ip). Músum var fórnað annað hvort 1 klukkustund eða 24 klukkustundum eftir lokameðferðina. Í rannsóknum á örörkum voru dýr meðhöndluð daglega með annað hvort 'saltvatni' (15 meðferðar saltvatni, ip), 'bráðu' kókaíni (14 meðferðir saltvatni + 1 meðferð 20 mg / kg kókaín-HCl, ip), 'endurtekið + brátt' kókaín ( 7 meðferðir saltvatni + 8 meðferðir 20 mg / kg kókaín-HCl, ip) eða „endurtekin fráhvarf + bráð“ kókaín (7 meðferðir 20 mg / kg kókaín-HCl + 7 meðferðir saltvatni + 1 áskorunarmeðferð 20 mg / kg kókaín-HCl, ip) og var fórnað 1 klukkustund eftir lokameðferðina. Í hegðunartilraunum voru mýs hýstar sérstaklega eftir aðgerð og voru meðhöndlaðar með 10 mg / kg kókaíni-HCl, ip eins og lýst er hér að neðan. Fyrir greiningu á tindarhrygg og staðfestingu örörvunar í kjölfar HSV-GFP og HSV-G9a-GFP sýkingar voru mýs meðhöndlaðar með 'saltvatni' (5 meðferðum saltvatni, ip) eða 'endurteknu kókaíni' (5 meðferðir 20 mg / kg kókaín-HCl, ip ) yfir 3 daga, þar sem áður hefur verið sýnt fram á að þessi sprautunarferli hefur aukið þéttleika hryggs á taugafrumum í nucleus accumbens (NAc) innan tímaramma Herpes simplex vírusa (HSV) transgen tjáningar (Viðbótar tilvísun S1). Músum sem notaðar voru við greiningu á hrygg hrygg, var fórnað 4 klukkustundum eftir síðustu meðferð.
Til að framkalla staðbundna eyðingu G9a umritsins takmarkað við NAc taugafrumur notuðum við stökkbreyttar músar einsleitar fyrir flæðandi G9a samsætu, sem lýst hefur verið í smáatriðum annars staðar (S2). Breyting af völdum Cre sem framleiðir exon 22 til 25 skarð utan ramma sem leiðir til bull-miðlaðra rotnun stökkbreyttra afrita. Við notuðum G9a floxed mýs sem voru að fullu aftur krossaðar til C57BL / 6J músa. Músum var sprautað með sterotaxically í NAc með Adeno-tengdum vírus (AAV) vektorum (serótýpu 2) sem tjáðu GFP eða Cre-GFP á aldrinum 7 til 10 vikna. Ónæmisfræðileg greining var notuð til að sannreyna skilvirkni Cre-miðluðrar endurstillingar (sjá Viðbótar mynd. S5). Við notuðum AAV sprautað dýr 21 daga eftir skurðaðgerð vegna þess að samsöfnun í G9a floxed músum var stöðug og hámarks á þessum tímapunkti, í samræmi við birtar skýrslur (S3-S4). G9a og ΔJunD yfirtjáningartilraunir voru gerðar á svipaðan hátt með því að nota HSV vírusvektara sem tjáðu annað hvort GFP, villtegund G9a-GFP, hvata dauða G9aH1093K-GFP eða ΔJunD-GFP (sjá S2 til að fá upplýsingar varðandi þróun G9a smíða). HSV ofþjöppunarmús voru notuð 3 dögum eftir aðgerð þar sem ofþjáning var hámarks á þessum tímapunkti, eins og fram kom í ónæmisviðbrögðum. Vegna tímabundins eðlis HSV tjáningar og töluvert stöðugra eðlis AAV tjáningar voru HSV vigrar notaðir í tilraunum sem krefjast skjótrar skammtímatjáning á transgeni, en AAV vektorar voru notaðir í tilraunum sem krefjast lengri tíma transgen tjáningar. Sýnt hefur verið fram á að báðir vigrarnir, í víðtækum fyrri rannsóknum, smituðu eingöngu taugafrumum innan innsprautaðs heilasvæðis, án þess að nokkur afbrigðileg eða afbrigðileg taugafruma hafi smitast.
Fyrir hegðunartilraunir með lyfjafræðilega G9a / GLP hemilinn, BIX01294 (25 ng / μl), voru músir græddar með sterotaxískum hætti með tveimur undirdælingar undir húð, sem og tvíhliða leiðslurúða, í NAc. Míníudælur voru virkjaðar 12 klukkustundum fyrir ígræðslu og hófst stöðug fæðing (0.25 μl / klukkustund) hvors annars burðarefnisins (5 hýdroxýprópýl ß-sýklódextrín) eða lyf í 14 daga, meðan á því var framkvæmt mat á hegðun.
Fyrir os FosB oftilitunartilraunir [western blotting, qPCR og ChIP], karlkyns bitransgenísk NSE-tTA × tetOP-ΔFosB mýs voru notaðar (10 vikna gamlar), þar sem í fjarveru tetrasýklínafleiðu doxýcýklíns (8 vikna frá doxýcýklíni), sýndu dýr sterk traustatal takmarkaða myndandi tjáningu ΔFosB (S5). Δ FosB ofþjáning hjá þessum músum var staðfest með qPCR. Til að staðfesta niðurstöður með því að nota NSE-tTA × tetOP-ΔFosB músum, villigerð 8 vikna gömul C57BL / 6J karlmús, voru stunguæxð sprautuð innan NAc með AAV vektorum sem tjáðu annað hvort GFP eða ΔFosB-GFP. AAV vektorar voru notaðir, í þessu tilfelli, til að tryggja hámarks ΔFosB tjáningu 8 vikum eftir skurðaðgerð, sem gerði kleift að hafa beinan samanburð á milli veirusýktra og bitransgenískra osFosB ofþjáningarmúsa. Veiruofsjást var staðfest með qPCR 8 vikum eftir aðgerð (15-mál NAc kýlingar voru krufnir undir stungustað). AAV-GFP og AAV-osFosB-GFP ofþjöppunarmús sem ekki voru notuð við qPCR voru meðhöndluð með saltvatni (14 meðferðir saltlausn, ip) eða endurteknum kókaíni (14 meðferðir 30 mg / kg kókaín-HCl, ip) frá og með 6 vikum eftir að skurðaðgerð. 4 dögum eftir lokameðferð voru gáfur lagðar með 4% paraformaldehýð, sett á titring og notað til greiningar á tindarhrygg.
Western blot greining
14-gauge NAc kýlingar voru teknar úr 1 mm kransæðahlutum sem fengnir voru með því að nota ryðfríu stáli músa heila fylki og voru hljóðbeinaðir í 1 M HEPES lýsibuffer (1% SDS) sem innihélt próteasa og fosfatasa hemla. 10-30 μg sýni af heildarpróteini voru rafskilin á 18% SDS geli. Prótein voru flutt í PVDF himnur og ræktað með annað hvort H3K9me2 (einstofna mús, 1: 500), and-ß-túbúlín (einstofna mús, 1: 60,000), and-heildar histón H3 (polyclonal mús, XN), X andstæðingur-GFP (notað til að sannreyna jafna veirutjáningu í götuðum vef) (polyclonal kanína, 1: 5,000), andstæðingur-H1K1000me3 (polyclonal kanína, 27: 3) eða and-aktín mótefni (monoclonal mús, 1) NUM: XUM 500 ° C (allar himnur voru læstar í 1% mjólk eða 60,000% albúmíni í nautgripum). Himnur voru síðan ræktaðar með peroxídasa merktum aukamótefnum (4: 5-1: 60,000 háð aðal mótefni sem notað var) og bönd voru sjón með SuperSignal West Dura undirlaginu. Hljómsveitir voru magngreindar með NIH Image J Software og H3K9me2 hljómsveitir voru normaliseraðar í annað hvort aktín eða P-túbúlín og að heildar históni H3 til að stjórna fyrir jafna álag. Endurtekið kókaín hafði engin áhrif á magn aktíns (Mynd S8) eða heildar histón 3 (Mynd S1) í NAc. Ennfremur höfðu HSV-G9a-GFP og HSV-G9aH1093K-GFP sýking engin áhrif á heildarmagn ß-túbúlíns í NAc (Mynd S8).
Immunohistochemistry
Mýs voru róaðar með banvænum skammti af klórhýdrati og blandaðar með 4% paraformaldehýði áður en þær voru greindar með stökum eða tvöföldum ónæmisviðbrögðum eins og áður hefur verið lýst (S6). Í stuttu máli voru post-fastir gáfur ræktaðir við stofuhita yfir nótt í 30% súkrósa áður en þeim var skipt niður á 35 um (gáfur sem notaðir voru við greiningar á hrygg hrygg voru skiptir á titil við 100 μm hluta í fjarveru 30% súkrósa). Frífljótandi NAc hlutar voru þvegnir með 1X PBS, lokaðir (3% venjulegt asnasermi, 0.1% tritonX, 1X PBS) og síðar ræktað með and-GFP (polyclonal kjúklingi, 1: 8000) og / eða and-G9a (polyclonal kanína) , 1: 500) mótefni í blokka lausn. Þáttum, sem greindar voru með mænuvökva, voru ræktaðar með fjöl margra mótefni gegn GFP kanínu við 1: 200. Eftir ræktun yfir nótt var NAc hlutum skolað 3 sinnum í 10 mínútur með 1X PBS, fylgt eftir með ræktun með Cy2 og / eða Cy3 flúrljómandi tengdum mótefnum í 1X PBS blokka lausn í 2 klukkustundir. Þáttum, sem notaðir voru við formgerðarannsóknir, voru ræktaðir í annarri mótefni yfir nótt við stofuhita. Kölnun á kjarnorku náðist með því að rækta hluti í 1X PBS sem innihélt DAPI (1: 50,000) í 10 mínútur. Hlutar voru aftur þvegnir, síðan etanól ofþornun og komið fyrir með DPX. Allir hlutar voru teknir með confocal smásjá.
RNA einangrun og qPCR
Tvíhliða 14 gauge NAc högg voru einsleit í Trizol og unnin samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. RNA var hreinsað með RNAesy Micro dálkum og litrófsgreining staðfesti að RNA 260/280 og 260/230 skammtarnir voru> 1.8. RNA var síðan endurritað með Bio-Rad iScript Kit. cDNA var magnað með qPCR með SYBR Green. Hver viðbrögð voru keyrð í tvíriti eða þrígreind og greind í samræmi við ΔΔCt aðferðina eins og áður var lýst með því að nota glýseraldehýð-3-fosfat dehýdrógenasa (GAPDH) sem eðlisstjórnun (S7). Sjá viðbótartafla S5 fyrir mRNA grunnröð.
DNA örörpagreining
Fjórir hópar (3 óháðir líffræðilegir endurtekningar í hverjum hópi) voru notaðir til örörpunarrannsóknarinnar, samtals 12 örmögnun. 1 klukkustund eftir síðustu kókaínsprautun voru dýr fljótt aflögð og gáfur fjarlægðar og settar á ís. Mælingar á NAc voru teknar með 15 gauge nálarstoppi og voru frystar fljótt á þurrum ís þar til RNA var dregið út. Tvíhliða kýlum var sameinuð úr fjórum dýrum á hvert endurtekningu, samtals 12 mýs á hvern hóp. RNA einangrun, örörvinnsla og gagnagreining voru framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (S8). Stuttlega var RNA einangrað og hreinsað eins og lýst er hér að framan og var kannað með tilliti til gæða með Agilent's Bioanalyzer. Afturritun, mögnun, merking og blendingur við Illumina MouseWG-6 v2.0 fylki voru gerðar með venjulegum aðferðum með UT Southwestern's microarray algerlega. Hrá gögn voru dregin frá bakgrunni og eðlilegt magn af magni notað með Beadstudio hugbúnaði. Stöðluð gögn voru greind með GeneSpring hugbúnaði og erfðalistar voru unnir með því að nota mikilvægisviðmið fyrir 1.3 sinnum breytingarmörk ásamt ekki ströngum p-gildismörkum p <0.05.
Við höldum mikilli trausti á þessum gögnum af ýmsum ástæðum. Í fyrsta lagi voru öll dýr meðhöndluð, meðhöndluð og drepin á sama tíma við sömu aðstæður. Eins var öll RNA og fylkisvinnsla framkvæmd á sama tíma. Í öðru lagi gerðum við þrírit fylki og sameinuðum mörg dýr í hverri sýnishorni og lágmörkuðum þar með mismun vegna breytileika einstaklingsins og jókst tölfræðilegur kraftur (S9). Í þriðja lagi er mælt með gagnagreiningarviðmiðunum sem notuð voru við rannsókn okkar með MicroArray gæðaeftirlitsverkefninu þar sem þessi viðmið hafa verið fullgilt til að veita mikla gráðu fyrir endurtekningargetu og fjölföldun milli og innan flatar (S10-S11).
Smíði veiru vektora
Vegna þrenginga á stærð veiruinnsetningar í stærð, voru kóðunarraðir fyrir annað hvort villtan tegund G9a (G9a) eða hvata dauðan G9a (G9aH1093K) undirklónaðir í tvíhverfa p1005 + HSV plasmíð sem tjáði GFP undir stjórn mannsins strax snemma ceromegal (cytomegal) innsetningarstærð var ~ 9 kb, sem er umfram hámarksinnsetningarstærð fyrir AAV-3.96 vigra). IE2 / 4 verkefnisstjórinn knýr G5a tjáningu. Brot voru undirklönnuð í tvíkistróna p9 + HSV plasmíðinu með óbeinum endatengingum með Klenow meðhöndluðu PmeI og EcoRI melti G1005a (úr pcDNA9) og CIP meðhöndluðu p3.1 + eftir EcoRI meltingu. Til framleiðslu á HSV-ΔJunD-GFP var kóðunarröðin fyrir unJunD flankað með EcoRI takmörkunarstöðum mynduð með PCR með því að nota frumstæðar fákirni sem innihéldu EcoRI staðinn. PCR afurðin var síðan látin liggja inn á EcoRI stað p1005 + vektorins. Staðbundin tjáning á Cre raðbrigða í NAc taugafrumum var náð með veirumiðluðum genafæðingu með því að nota AAV vektor eins og lýst er (S12). GFP eða N-terminal samrunun GFP við Cre var undirklónaður í raðbrigða AAV-2 vektor sem inniheldur CMV stýrisvél með skurðgjafa viðtakaröð og pólýadenýlamerki. Allar vektorinnsetningar voru staðfestar með myndbandssundaröð. Veiruktar voru framleiddir með þreföldum transfection, hjálparlausri aðferð, eins og áður hefur verið lýst (S13). Hreinsað vírus var geymt við −80 ° C. Veirugæði voru metin með smitandi títri sem var metinn í HEK293 frumum. AAV-osFosB-GFP vírusar voru gerðir á svipaðan hátt. Fyrir HSV-Cre var Cre tjáning rekin af IRES verkefnisstjóra, öfugt við IE4 / 5 verkefnisstjórann, til að lágmarka tjáningu Cre og koma í veg fyrir eituráhrif á taugafrumur (sjá S14 til veirubyggingar). Í öllum tilvikum var veiruofsjáreynsla staðfest, bæði vitro og in vivo, með qPCR, og vírusar voru staðfestir með ónæmisviðbrögðum til að sýna tjáningu á NAc-takmörkun eftir aðgerð.
Stereótaxísk skurðaðgerð
Undir ketamíni (100 mg / kg) / xýlazíni (10 mg / kg) svæfingu voru mýs staðsettar í litlu dýrum staðalímyndunartæki og kraníaryfirborðið var afhjúpað. Þrjátíu og þrjár gauge sprautunálar voru notaðir til að gefa 0.5 μl af vírusi tvíhliða inn í NAc við 10 ° horn (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) á 0.1 μl / mín. Dýr sem fengu HSV sprautur fengu að jafna sig í 2 daga eftir skurðaðgerð, en mýs, sem notaðar voru við atferlisprófanir sem fengu AAV-vigra, fengu að jafna sig í 20 daga áður en þær voru settar í staðhitun. Þessir tímar eru í samræmi við tímabil hámarks veirumiðlaðs transgen tjáningar fyrir vektorana tvo. Fyrir innrennsli með BIX01294 voru hverjar tvær minidælur staðsettar undir húð á bak músarinnar. Uppsöfnun á kanúlum var náð með því að bora tvö lítil kranahol fyrir ofan NAc og með afhendingu kanilsins frá bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Mýs fengu að jafna sig eftir skurðaðgerð í 4 til 5 dögum áður en farið var í staðmeðferð á kókaíni eins og lýst er hér að neðan.
Ástandsstaðsetning
Aðferð við staðhitun var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst, með eftirfarandi breytingum (S7). Stuttlega, 3 dögum eftir innrennsli innan HS og HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP eða HSV-GFP, voru músum komið fyrir í skilyrðishólfin, sem samanstanda af þremur aðgreindum umhverfi. Mýs sem sýndu marktækan kost fyrir annað hvort tveggja skilyrðingarklefa voru útilokaðir frá rannsókninni (<10% allra dýra). Síðan var jafnvægi gert á skilyrðingarhópum til að laga fyrir hlutdeild í hólfinu sem enn gæti verið til staðar. Næstu daga var dýrum sprautað með saltvatni og lokað í eitt hólf síðdegis í 30 mínútur og síðan sprautað með kókaíni (10 mg / kg, ip) og lokað í 30 mínútur í hitt hólfið að kvöldi í 2 daga (tveir saltvatn og tvö kókaínpörun). Á prófdaginum var músum komið fyrir aftur í tækið án meðferðar í 20 mínútur og prófað til að meta hvoru megin þær vildu. Hreyfisviðbrögð við kókaíni voru metin með geislabrotum í kókaínpöruðu hólfunum til að tryggja virkni lyfjameðferðar. Fyrir AAV og BIX01294 CPP tilraunir var notuð svolítið breytt siðareglur. Dýrum var aftur sprautað annaðhvort með saltvatni eða kókaíni (10 mg / kg, ip) og bundið við sérstök hólf í 30 mínútna lotur, en í staðinn var aðeins skilyrt einu sinni á dag í 4 daga, síðan prófið á degi 5 (dýr voru skilyrt um kvöldið og skipt var um ástandsmeðferðir). Fyrir alla hópa var hreyfing á grunnlínu viðbrögð við saltvatni metin til að tryggja að hreyfing hefði ekki áhrif á veirumeðferð eða hemlum.
Sjálf gjöf kókaíns í bláæð
Karlkyns unglingar með Long-Evans rottum, sem vegu 230 – 250 g í upphafi tilraunarinnar, fengust. Þeir voru til húsa í rakastigi og hitastýrðu umhverfi í öfugri 12 klukkustundar ljós / dökk hringrás (ljósin slökkt klukkan 9: 00 am) með ad libitum aðgangur að mat og vatni. Rottum var leyft að aðlagast í nýju umhverfi sínu og var meðhöndlað daglega í 1 viku fyrir upphaf tilraunarinnar. Allar aðgerðir voru gerðar í samræmi við leiðbeiningar Þjóðháskólastofnunar um umönnun og notkun á rannsóknarstofudýrum og voru samþykktar af dýraríki og notkunanefnd Mount Sinai. Sjálfsstjórnunarbúnaðurinn var með innrauða geisla til að mæla hreyfihegðun. Sjálfstjórnun var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (S15-S16) með holleggi ígræddum í hægri hálsæð undir ísóflúrani (2.4-2.7%) svæfingu. Holum var skolað með 0.1 ml af saltlausn sem innihélt 10 U heparín og ampicillin (50 mg / kg). Eftir eina viku bata eftir skurðaðgerð hófst sjálfsafgreiðsluþjálfun í myrkri áfanga ljóss / myrkurs hringrásar. Dýrum var heimilaður þriggja klukkustunda daglegur aðgangur að kókaíni (3 mg / kg / innrennsli) undir föstu hlutfalli-0.75 (FR1) styrktaráætlun, þar sem 1 virk lyftistöng ýtti af sér einu innrennsli lyfs. Rottur komu stöðugleika á kókaíninntöku eftir 1 daga (<6% breytileiki í svörunarhlutfalli í 15 daga í röð, þar sem að minnsta kosti 3% svöruðu á styrktu lyftistönginni). Sólarhring eftir lokaflutninguna á eigin lyfjum voru rottur fljótlega afhöfðaðir, heilinn fjarlægður hratt og unninn til RNA einangrunar og qPCR.
Ónæmisútskilningur krómatíns (ChIP)
Ferskir NAc kýlingar voru formaldehýð þvertengdir og búnir til ChIP eins og áður hefur verið lýst (S17-S18) með smávægilegum breytingum. Í stuttu máli var 4 14-gauge NAc kýlum á hvert dýr (5 dýr sameinuð fyrir hvert sýni) safnað, krossbundið með 1% formaldehýð og slokknað með 2 M glýsíni áður en það frysti við −80 ° C. 1 degi fyrir sýnatöku sýni voru sauðfjár gegn kanína / mús (fer eftir botnfallsmótefni) IgG segulperlur framleiddar með því að rækta viðeigandi segulperlur með annað hvort and-G9a (polyclonal ChIP gráðu kanína) eða and-H3K9me2 (monoclonal ChIP bekk músar) mótefni yfir nótt við 4 ° C við stöðugan snúning í blokklausn. Vefjasónagerð og krómatín klipping voru framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (S17). Eftir hljóðvistun var jöfnum styrk krómatíns fluttur í nýjar slöngur og ~ 5% af endanlegu afurðunum var vistað til að þjóna sem „inntak“ stjórntæki. Eftir ítarlega þvott og blöndun á samtengdum perlu- / mótefnablöndu var jafnt magn af mótefni / perlublöndu (~ 7.5 μg mótefni / sýni) bætt við hvert krómatsýni og ræktað í ~ 16 klukkustundir við stöðugan snúning við 4 ° C. Sýnin voru ennfremur þvegin og öfug krossbundin við 65 ° C yfir nótt fyrir DNA hreinsun með PCR hreinsunarbúnaði. Eftir hreinsun DNA voru sýni látin fara á qPCR og voru eðlileg við viðeigandi „inntak“ eftirlit eins og áður hefur verið lýst (S17). Venjuleg IgG ónæmisútfelling músar með því að nota fjöl margra mótefni gegn IgG músum var einnig framkvæmt til að stjórna viðeigandi auðgun magnunar merkisins. Adenín fosfóríbósýltransferasi (APRT) var notað sem neikvæð stjórn á kókaíni og ΔFosB yfirtjáningartilraunum. Sjáðu Viðbótartafla S5 fyrir próteinröðrur.
Dendritic hrygggreining
Til að kanna hlutverk G9a í stjórnun taugafrumulækninga in vivo notuðum við aðferðir sem áður var lýst með eftirfarandi breytingum (S1). Þremur dögum eftir inndælingu HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (allir vírusar voru notaðir í villtum tegundum C57Bl / 6J músum), eða HSV-Cre-GFP (notaðir í G9afl / fl mýs), þegar veirutjáning var hámörk, voru músar fullkomnar, gáfur voru varnarvörn og seinna skipt við 100 μm á titring. Þáttum var síðan ónæmislægt með því að nota mótefni gegn GFP eins og lýst er hér að ofan (sjá Immunohistochemistry). Til að meta áhrif G9a ofþrýstings og rothögg á fjölda hryggs, svo og áhrif ΔJunD ofþrýstings, mældum við fjölda hryggja á u.þ.b. 1 – 2 taugafrumur á hverja taugafrumu sem jafngildir að minnsta kosti 299 μm af aukagildum frá GFP-tjáandi NAc miðli spiny neurons (MSNs). Í ljósi þess að MSN eru frábrigðilega frábrugðin öðrum taugafrumum í NAC, svo og fyrri skýrslur sem benda til þess að HSV smiti fyrst og fremst DARPP-32 sem tjáir taugafrumur á þessu heila svæði (S19) erum við fullviss um að MSNs voru eingöngu metin í þessum rannsóknum. Fyrir hvert dýr skoðuðum við ~ 6 – 8 taugafrumur í 3 – 4 dýrum í hverjum hópi (7 hópar), en eftir það var meðalgildi fengin fyrir hvert dýr fyrir tölfræðilega greiningu. Tilraunir sem hannaðar voru til að kanna áhrif ΔFosB ofátjáningar á þéttleika NAc hryggs voru gerðar á svipaðan hátt og lýst er hér að ofan, að undanskildum að AAV vektorar voru notaðir til að tjá GFP eða ΔFosB-GFP í langan tíma (8 vikur). Allar HSV myndir voru teknar með stillanlegu smásjá með 100X olíudýfingarmarkmiði (AAV myndir voru teknar með 63X olíudýfingarmarkmiði). Myndir voru aflað með pinnaholssettinu við handahófskennda 1 einingu og 1024 × 1024 rammastærð. Dendritic lengd var mæld með því að nota NIH Image J hugbúnaðinn, og fjöldi hryggs var taldur blindur af aðal tilraunaaðilanum þar sem glærurnar voru kóðaðar fyrir tilraunaskönnun. Meðalfjöldi hryggja á 10 μm af dendrite var reiknaður.
tölfræðigreining
Ein- og tvíhliða ANOVA-lyf voru framkvæmd til að ákvarða mikilvægi fyrir skilyrtan staðval og greiningar á hryggjarliðum með meiri en tveimur hópum. T próf nemenda voru notuð við annan samanburð, þ.mt qPCR, vestræna blotting, dendritic hrygggreiningu þar sem HSV-GFP var borið saman við HSV-Cre í G9afl / fl mýs, örflagsgreiningar (sjá hér að ofan) og tilraunir með ónæmisútfellingu á krómatíni. T-próf fyrirhugaðra nemenda voru notuð í kjölfar tvíhliða ANOVA greiningar á þéttni hryggþéttni eftir ΔFosB yfirtjáningu með staðfestingu á verulegum helstu áhrifum lyfjameðferðar og vírusa. Öll gildi sem eru innifalin í þjóðsögunum tákna meðaltal ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Ítarlegar tölfræðilegar greiningar fyrir Figs. 1-3 í aðaltextanum eru gefnar í: Ítarlegar mynd þjóðsögur þar með talin tölfræði.
Neðanmálsgreinar
Ég votta að ekkert af þeim efnum sem eru í handritinu sem ber yfirskriftina Nauðsynleg hlutverk histónmetýltransferasa G9a í plasti af völdum kókaíns hafa áður verið gefnar út eða eru til umfjöllunar annars staðar, þar á meðal á Netinu.
Öll vinna sem felst í notkun dýra var unnin í samræmi við stofnana- og IACUC leiðbeiningar bæði við University of Texas Southwestern Medical Center og Mount Sinai School of Medicine.
Tilvísanir og athugasemdir
;
