(HUMAN) Hegðunar- og byggingarviðbrögð við langvarandi kókínu Krefjast næstu lykkju sem felur í sér ΔFosB og kalsíum / kalmodúlín-háð prótein kínasa II í Nucleus Accumbens Shell (2013)

J Neurosci. 2013 Mar 6;33(10):4295-4307.

Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, Wee S, Koob G, Turecki G, Neve R, Thomas M, Nestler EJ.

Heimild

Fishberg Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Mount Sinai School of Medicine, New York, New York, 10029, Department of Neuroscience and Psychology, Institute of Human Genetics, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota 55455, Committee on Neurobiology of Addictive Disorders , Scripps rannsóknastofnunin, La Jolla, Kaliforníu 92037 þunglyndisröskunarprógramm, Douglas geðheilbrigðisháskólastofnun og McGill háskólinn, Montréal, Québec, Kanada, H4H 1R3, og heila- og hugvísindadeild, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts 02139 .

Abstract

Umritunarstuðull ΔFosB og heila auðgað kalsíum / calmodulin háð prótein kínasa II (CaMKIIα) eru framkölluð í nucleus accumbens (NAc) með langvarandi útsetningu fyrir kókaíni eða öðrum geðörvandi lyfjum vegna misnotkunar, þar sem próteinin tvö miðla næm lyfjasvörun . Þrátt fyrir að ΔFosB og CaMKIIα stjórni bæði AMPA glútamatviðtaka tjáningu og virka í NAc, hefur tindrandi hryggmyndun á NAc miðlungs spíta taugafrumum (MSNs) og hreyfiofnæmi fyrir kókaíni verið fram til þessa. Hér sýnum við fram á að ΔFosB er fosfórýlerað með CaMKIIα við próteinstöðugleika Ser27 og að CaMKII er krafist fyrir uppsöfnun kókaíns sem miðlað er af osFosB í NAc rottum.

Hins vegar sýnum við að ΔFosB er bæði nauðsynlegt og nægilegt til að framkalla kókaín af CaMKIIα genatjáningu in vivo, áhrif sem eru sértæk fyrir D1-tegund MSNs í NAc skelasvæðinu.

Enn fremur er framköllun á dendritic spines á NAc MSNs og aukin hegðunarsvörun gagnvart kókaíni eftir of mikið tjáningu NAFosB á NAC bæði CaMKII.

Mikilvægt er að við sýnum í fyrsta skipti framkalla ΔFosB og CaMKII í NAc of manna kókaínfíklar, sem bendir til hugsanlegra markmiða til meðferðar í framtíðinni. Þessi gögn staðfesta að osFosB og CaMKII taka þátt í frumu-gerð og heila-svæði sérstaka jákvæð feedforward lykkju sem lykill fyrirkomulag til að stjórna umbun hringrás heilans sem svar við langvarandi kókaíni.

Hvernig gengur lífið dag frá degi? Er það í jafnvægi og allt eins og það á að vera? Er jafnvægi hvort sem litið er á veraldlega stöðu eða andlega? Lífið er eins og það er. Það er ekki alltaf sólskyn. Það koma reglulega lægðir með rok og rigningu. Við vitum að í heildar samhenginu er lægð hluti af vistkerfi að leita að jafnvægi. Stundum erum við stödd í miðju lægðarinnar. Þar er logn og gott veður, sama hvað gengur á þar sem stormurinn er mestur. Sama lögmál gildir varðandi þitt eigið líf. Ef þú ert í þinn miðju, þínum sannleik þá heldur þú alltaf jafnvægi átakalaust. Sama hvað gustar mikið frá þér þegar þú lætur til þín taka. Huldufólk hefur gefið okkur hugleiðslu sem hjálpar okkur að finna þessa miðju, finna kjarna okkar og sannleikann sem í honum býr. Þegar þú veist hver þú ert og hvers vegna þú ert hér, mun líf þitt vera í flæðandi jafnvægi. Hugleiðslan virkjar þekkinguna sem er í vitund jarðar og færir hana með lífsorkunni inn í líkama okkar. Þar skoðar hún hugsana og hegðunar munstrið og athugar hvort það myndar átakalausu flæðandi jafnvægi. Hinn möguleikinn er falskt jafnvægi sem hafa þarf fyrir að viðhalda með tilheyrandi striti, áhyggjum og ótta. Síðan leiðbeinir þessi þekking okkur að því jafnvægi sem er okkur eðlilegt. Við blómstrum átakalaust, líkt og planta sem vex átakalaut frá fræi í fullþroska plöntu sem ber ávöxt.

Aukin sönnunargögn styðja þá skoðun að breytingar á genatjáningu stuðli að fyrirkomulagi eiturlyfjafíknar (Robison og Nestler, 2011). Einn mikilvægur sáttasemjari þessara breytinga er ΔFosB, umritunarstuðull Fos fjölskyldna (Nestler, 2008). Langvarandi gjöf nánast hvers kyns misnotkunarlyfja veldur langvarandi uppsöfnun ΔFosB í nucleus accumbens (NAc), limbískt svæði sem er nauðsynleg til að umbuna hegðun. Sörvun virkar sérstaklega fyrir flokk NAC miðlungs spiny taugafrumu (MSN) sem tjáir D1 dópamínviðtaka. Óeðlileg oftjáning á osFosB í þessum D1 tegundum NAc MSN eykur hreyfingu og gefandi svör við kókaíni og morfíni (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), þ.mt aukin sjálfsstjórnun kókaíns (Colby et al., 2003). Enn fremur dregur erfðafræðileg eða veiruhömlun á osFosB umritunarvirkni ábætandi áhrif þessara lyfja (Zachariou et al., 2006), sem gefur til kynna að þessi viðvarandi örvun ΔFosB sé mikilvægur milligöngumaður varanlegra breytinga sem framkallað eru í NAc með langvarandi lyfjagjöf.

Óvenjulegur stöðugleiki ΔFosB (miðað við öll önnur Fos fjölskylduprótein) er bæði innri eiginleiki sameindarinnar vegna styttingar af degron lénum sem eru til staðar í FosB í fullri lengd (Carle o.fl., 2007), og skipulegt ferli. ΔFosB er fosfórýrað vitro og in vivo við Ser27, og þessi viðbrögð stöðugast enn frekar ΔFosB, ~ 10-falt, í frumurækt og NAc in vivo (Ulery-Reynolds o.fl., 2009). Þrátt fyrir að sýnt hefur verið fram á að Ser27-ΔFosB er hvarfefni fyrir kasein kínasa-2 vitro (Ulery o.fl., 2006), vélbúnaður þess in vivo fosfórun er enn óþekkt.

Kalsíum / kalmodúlín háð prótein kínasa II (CaMKII) er mjög tjáður serín / þreónín kínasi, þar sem α og β ísóform mynda tvöfaldur myndatöku homó- og heteró-holóensím. in vivo, og eru nauðsynleg fyrir margskonar taugaplastík (Lisman o.fl., 2002; Colbran og Brown, 2004). CaMKIIα er framkallað sértækt í NAc skel með langvarandi amfetamíni (Loweth o.fl., 2010) og lyfjafræðileg hömlun á virkni CaMKII í NAc skel dregur úr næmni hegðunar fyrir amfetamíni (Loweth o.fl., 2008) og kókaín (Pierce et al., 1998), meðan veiruofstrenging CaMKIIα í þessu NAc undirsvæði eykur hreyfingu á hreyfingu og sjálfri gjöf amfetamíns (Loweth o.fl., 2010). CaMKIIα getur haft áhrif á launahegðun með mótun AMPA glútamatsviðtakaeininga (Pierce et al., 1998), þar sem virkni CaMKIIα hefur lengi verið tengd AMPA viðtakastarfsemi og samstilltri miðun á nokkrum tegundum taugastarfsemi (Malinow og Malenka, 2002).

Þessar bókmenntir sýna fram á nokkrar hliðstæður ΔFosB og CaMKII: báðar eru nauðsynlegar og nægar til margra atferlisáhrifa misnotkunarlyfja, bæði uppbyggir tindarhryggur í ýmsum taugafrumutegundum in vivo (Jourdain o.fl., 2003; Maze et al., 2010), og bæði beita að minnsta kosti sumum atferlisáhrifum þeirra með mótun AMPA viðtaka (Kelz et al., 1999; Malinow og Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Þrátt fyrir þessar hliðstæður er enginn virkur hlekkur milli ΔFosB og CaMKII þekktur. Hér erum við að koma á gagnkvæmri reglugerð milli ΔFosB og CaMKII, og sýna fram á að próteinin tvö mynda D1-gerð MSN-sértækrar fram-lykkju í NAc skel sem er framkölluð af kókaíni og stjórnar ýmsum kókaínviðbrögðum in vivo.

Fara til:

Efni og aðferðir

Tilraun 1: iTRAQ prótómagreining á NAc skel og kjarna eftir kókaínmeðferð (Mynd 1A)

Fullorðnum (8 vikum) karlrottum var gefið 20 mg / kg kókaín eða saltvatnsburðar IP einu sinni á dag í sjö daga. 24 klst. Eftir síðustu inndælingu, NAc skel og kjarna voru örgreind (Mynd 1A) og blossa frosin. iTRAQ greiningar voru gerðar eins og áður hefur verið lýst (Ross o.fl., 2004; Davalos o.fl., 2010).

Mynd 1

Mynd 1

Skeljar sértæk örvun CaMKII í NAc með kókaíni

Tilraun 2: Magn magns á próteinbreytingum í rottu NAc kjarna og skel eftir kókaínmeðferð (Mynd 1B – D)

Fullorðnum (8 vikum) karlrottum var gefið 10 mg / kg kókaín eða saltvatnsburðar IP einu sinni á dag í sjö daga í hreyfiskrárhólfum. Locomotor svör við einni inndælingu af kókaíni (5 mg / kg IP) var skráð hjá þeim dýrum sem voru meðhöndluð áður með kókaíni (kallað „langvarandi“) og hluti þeirra sem meðhöndlaðir voru með saltvatni (kallað „bráð“) og hreyfingarviðbrögð við saltvatni eitt og sér var skráð í dýrunum sem meðhöndluð voru með saltlausn (kölluð “saltlausn”). Rannsóknir á hreyfingarvirkni voru framkvæmdar eins og lýst er (Hiroi o.fl., 1997). Í stuttu máli voru fullorðnir karlrottur settar í 18 ”× 24” PAS opið reit upptökusvæði (San Diego Instruments) í 30 mín til að venja sig, fengu eina IP innspýtingu af saltvatni og fylgjast með 30 mín í viðbót og fengu stak IP inndæling af 5 mg / kg kókaíni og fylgst með í 30 mín.

24 klst. Eftir þessa loka inndælingu, voru rottur aflögð án svæfingar til að forðast áhrif svæfingarlyfja á taugapróteinmagn og fosfó-ástand. Gáfur voru sneiddar í röð í 1.2 mm fylki (Braintree Scientific) og markvefurinn var fjarlægður í fosfatjafnaða saltvatni sem inniheldur próteasa (Roche) og fosfatasa (Sigma Aldrich) hemla með því að nota 14 málstimpil fyrir NAc kjarna og 12 málstaf af því sem eftir var vefur fyrir NAc skel (sjá Mynd 1A) og strax fryst á þurrum ís. Sýnin voru samstillt með léttri hljóðvistun í breyttu RIPA jafnalausn: 10 mM Tris basi, 150 mM natríumklóríð, 1 mM EDTA, 0.1% natríum dodecyl súlfat, 1% Triton X-100, 1% natríum deoxycholate, pH 7.4 hemill, protease og eins og fyrir ofan. Eftir að Laemmli stuðpúði var bætt við, voru prótein aðskilin á 4 – 15% polyacrylamaide hallageli (Criterion System, BioRad) og Western blotting var framkvæmd með Odyssey kerfinu (Li-Cor) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda.

Tilraun 3: Magnið á próteinbreytingum í rottu NAc kjarna og skel eftir afturköllun kókaíns (Mynd 1E)

Fullorðnum (8 vikum) karlrottum var gefið 10 mg / kg kókaín eða saltvatnsburðar IP einu sinni á dag í sjö daga. 14 dögum eftir lokainndælingu fengu dýr sem fengu meðferð með saltvatni aðra saltvatnsinnspýtingu (kallað „saltvatn“) og dýr sem fengu meðferð með kókaíni fengu aðra saltvatnsinnspýtingu (kallað 14 daga hætt eða „14d WD“) eða staka kókaínsprautun ( kallaði „14d WD Chal“ til áskorana). Einni klukkustund eftir lokainnspýtinguna voru dýr höfð á höfði og vestræna blotting gerð eins og í Tilraunir 2.

Tilraun 4: Magn magn próteinsbreytinga í NAc kjarna og skel rotta eftir sjálfsstjórnun kókaíns (Fig 2A – C)

Rottur voru þjálfaðar til að gefa 0.5 mg / kg / innrennsli af kókaíni sjálf á einum klukkutíma lotu undir föstu hlutfalli 1 áætlunar í níu daga. Eftir níu upphafsstundir var rottunum skipt í tvo hópa sem voru jafnvægi með kókaínneyslu síðustu tvær loturnar. Einn hópur rottna fékk leyfi til að gefa sjálfan sig kókaín (0.5 mg / kg / innrennsli) á einni klukkustundar lotu (stutt aðgengi, ShA) en hinn hópurinn af rottum sjálf gefið kókaíni í sex tíma lotur (langur aðgangur, LgA ) í tíu daga til viðbótar (stigmagnunarstundir).

Heilaþættir voru unnir fyrir ónæmisgeðrofi eins og lýst er (Perrotti o.fl., 2004). Heilar voru blandaðir 18 – 24 klst. Eftir síðustu váhrif á lyfið, sem olli niðurbroti á öllum FosB próteinum í fullri lengd þannig að öll ónæmisvirkni sem eftir er endurspeglar ΔFosB. Þessi niðurbrot voru staðfest með vestrænum blotting sem sýndu engan marktækan litun með mótefni beint gegn C enda FosB í fullri lengd sem þekkir ekki ΔFosB (gögn ekki sýnd). Eftir að hafa sneiðað í 35 um hluta var fjöldi ΔFosB ónæmisbæjarfrumna magngreindur af blinduðum áheyrnarfulltrúa í tveimur hlutum í gegnum NAc hverrar rottu og meðalgildi á 40 × reit voru síðan reiknuð út fyrir svæði fyrir hvert dýr. Hvert dýr var álitið einstök athugun fyrir tölfræðilega greiningu. Áhugasvæði voru greind með Paxinos og Watson (Paxinos og Watson, 2007).

Magngreining CaMKIIa ónæmisvirkni var framkvæmd með því að nota leyfisveitendakerfi eins og lýst er (Covington et al., 2009). Samþætt styrk CaMKII og GAPDH var ákvörðuð með Odyssey hugbúnaði. Niðurstöður eru kynntar sem samþætt styrkleiki á mm2 og eru kynnt sem þýðir ± sem (n = 4 – 10 í hverjum hópi). Gildi fyrir GAPDH voru notuð sem tilvísun til að staðla CaMKII styrkleika fyrir þykkt sneiða og aðstæður.

Mynd 2

Mynd 2

Innleiðing CaMKII í NAc skel af rottum og kókaínfíklum manna sem gefa sjálfan sig

Tilraun 5: Magn magn próteins í kókaínháðum mönnum (Mynd 2D)

Málsmeðferð

Heilavefur eftir fæðingu var fenginn frá Quebec sjálfsvígsheilabankanum (Douglas Mental Health University Institute, Montreal, Quebec, Kanada). Varðveisla vefja gekk í meginatriðum eins og lýst er (Quirion o.fl., 1987). Í stuttu máli, þegar búið er að draga það út, er heilinn settur á blautan ís í gólfkornakassa og hraðað til aðstöðu Quebec sjálfsvígsheilbrigðisbankans. Hemispheres eru aðskilin strax með sagittal skera í miðjum heila, heila stilkur og heila. Blóðæðar, kirtill í kirtill, krómæðasléttur, hálft heila og hálfur heili stilkur eru yfirleitt sundraðir frá vinstra heilahveli sem síðan er skorið kransæða í 1 cm þykkar sneiðar áður en það frýs. Seinni hluti smábarnanna er skorinn sagittally í 1cm þykkar sneiðar áður en það frystir. Vefir eru frosnir í 2-metýlbútani við −40 ° C í ~ 60 sek. Öllum frosnum vefjum er geymt sérstaklega í plastpokum við −80 ° C til langtímageymslu. Sértæk heilasvæði eru krufin úr frosnum kransæðarsneiðum á ryðfríu stáli plötu með þurrís allt í kring til að stjórna hitastigi umhverfisins. Vesturblæstrun var framkvæmd eins og lýst er í Tilraunir 2.

Árgangur

Árgangurinn samanstóð af 37 karlkyns og 3 kvenkyns einstaklingum, á aldrinum milli 15 – 66 ára. Allir einstaklingar létust skyndilega án langvarandi viðbragðsástands eða langvinnra læknisfræðilegra veikinda. Í báðum tilvikum var dánarorsök staðfest af Coroner skrifstofunni í Quebec og eiturefnafræðilegur skjár var gerður með vefjasýni til að fá upplýsingar um lyf og ólöglega notkun fíkniefna við andlátið. Viðfangshópurinn samanstóð af 20 einstaklingum sem uppfylltu SCID-I skilyrðin fyrir kókaínfíkn. Í samanburðarhópnum voru 20 einstaklingar án sögu um kókaínfíkn og engar meiriháttar geðrænar greiningar. Allir einstaklingar dóu skyndilega af orsökum sem höfðu engin bein áhrif á heilavef. Hópar voru samsvaraðir miðað við meðalaldur, kælingu seinkun og pH. Fyrir alla einstaklinga voru sálfræðilegar krufningar framkvæmdar eins og áður hefur verið lýst (Dumais o.fl., 2005), sem gerir okkur kleift að fá aðgang að ítarlegum upplýsingum um sálfræði og sjúkrasögu, svo og önnur viðeigandi klínísk og félagsvísindaleg gögn. Í stuttu máli framkvæmdi þjálfaður viðmælandi Skipulagt klínískt viðtal fyrir DSM-IV Geðraskanir (SCID-I) með einum eða fleiri uppljóstrurum hins látna. Varðandi heilsugæslulækna fór yfir mat á SCID-I, skýrslur um mál, athugasemdir við lækninn og sjúkraskrár til að fá sáttar geðgreiningar.

Tilraun 6: Chromatin ónæmisfrumnafjölgun fyrir NAC rotta (Fig 3A – C)

Fullorðnum (8 vikum) karlrottum var gefið 10 mg / kg kókaín eða saltvatnsburðar IP einu sinni á dag í sjö daga. 24 klst. Eftir síðustu inndælingu voru NAc skel og kjarna örgreind. Krómatín ónæmisfrestun (ChIP) var framkvæmd með tvíhliða NAc kýlum af skel eða kjarna úr sjö rottum í hverjum hópi í 14 heildarhópum (98 dýr samanlagt, 7 kókaín laugar, 7 saltlaugar). Vefir voru krossbundnir, þvegnir og geymdir við −80 ° C þar til krómatín klippt var með hljóðvist. Skerað krómatín var ræktað yfir nótt með mótefnum sem áður voru bundin við segulperlur (Dynabeads M-280, Invitrogen). IgG sem var ónæmt var notað sem stjórnun. Eftir öfug tengsl og DNA hreinsun var qPCR notað til að mæla stig CaMKIIa promoter DNA. Grunnur voru hönnuð til að magna svæði sem inniheldur AP-1 samkvæmisröð staðsett ~ 450 bp fyrir upphafsstað uppritunar (Fram: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Mynd 3

Mynd 3

Frumu- og svæðasértæk ΔFosB örvun CaMKIIα in vivo

Tilraun 7: Mæling CaMKII umritunar og próteintjáningar með frumugerðarsértæku ΔFosB ofþjáningu (Mynd 3D)

Karlkyns bitransgenic mýs unnin úr NSE-tTA (lína A) × TetOp-ΔfosB (lína 11) og NSE-tTA (lína B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (lína 11) mýs (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme o.fl., 2002; Zachariou et al., 2006) voru getin og hækkuð á 100 μg / ml doxýcýklín til að bæla ΔFosB tjáningu meðan á þróuninni stóð. Littermates var skipt við fráfærni: helmingurinn hélst áfram á doxycycline og helmingnum var skipt yfir í vatn og dýrin voru notuð 8 til 11 vikum síðar þegar afritunaráhrif ΔFosB voru hámarks (Kelz et al., 1999; McClung og Nestler, 2003). Við greiningar á umritun voru músir fljótt afléttar og gáfur voru fjarlægðar og settar á ís. Mælingar á NAc voru teknar með 14 gauge nálarstoppi og frystar fljótt á þurrum ís þar til RNA var dregið út. RNA einangrun, qPCR og gagnagreining voru framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (LaPlant et al., 2009). Í stuttu máli var RNA einangrað með TriZol hvarfefni (Invitrogen), hreinsað frekar með RNAeasy örbúnaðinum frá Qiagen og skoðað hvort gæði væru með Bioilalyzer Agilent. Afturritun var gerð með iScript (BioRad). qPCR var framkvæmt með Applied Biosystems 7900HT RT PCR kerfi með eftirfarandi lotu breytum: 10 mín. við 95 ° C; 40 lotur 95 ° C í 1 mín., 60 ° C í 30 sek., 72 ° C í 30 sek. stigið upphitun í 95 ° C til að búa til aðgreiningarkúrfa til staðfestingar á stökum PCR vörum. Ónæmisfræðilegra greininga á expressionFosB og CaMKIIα prótein tjáningu voru gerðar eins og lýst er í Tilraunir 4.

Tilraun 8: Áhrif D1 og D2 dópamínviðtakablokka innan í NAc á kókaín-miðluð próteinbreytingar (Fig 3H)

Fullorðnum (8 vikum) karlrottum var gefið 10 mg / kg kókaín eða saltvatnsburðarefni („ökutæki“ hópur) einu sinni á dag í sjö daga. 30 mín. Fyrir hverja kókaíninndælingu, rottum var gefið IP annað hvort D1 viðtakablokkinn SCH 23390 (0.5 mg / kg, „D1 maur“ hópurinn), eða D2 viðtakablokkinn eticlopride (0.5 mg / kg, „D2 maur“ hópurinn) , eða saltvatnsstjórnunarinnspýting („kókaín“ hópur). 24 klst. Eftir lokadælingu voru dýr aflögð og prótein magngreind með Western blotting samkvæmt Tilraunir 2.

Tilraun 9: Áhrif AAV-miðlaðs Δ FosB ofþjöppunar á próteintjáningu (Fig 4 A – C)

Stereótaxísk skurðaðgerð var gerð á fullorðnum karlrottum (8 vikur) til að sprauta AAV-GFP (grænt flúrperur) eða AAV-GFP-osFosB (Maze et al., 2010). 33 málnálar (Hamilton) voru notaðir við allar aðgerðir, þar sem 0.5 gl af hreinsaðri hávísa veiru var gefið tvíhliða á 5 mín. Tímabili, fylgt eftir með viðbótar 5 mínútu eftir innrennsli. Allar vegalengdir eru mældar miðað við Bregma: 10 ° horn, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 dögum eftir skurðaðgerð var dýrum gefin ein IP innspýting af 10 mg / kg kókaíni í eftirlitsstjórnunarhólfum til að meta hegðunaráhrif overFosB ofþrýstings. 24 klst. Eftir þessa loka inndælingu, voru rottur afléttar eins og skv Tilraunir 2og örgreining vefja var gerð undir flúrljómun smásjáleiðsögn til að fá GFP-jákvæða NAc vef. Western blotting var síðan framkvæmd eins og skv Tilraunir 2.

Mynd 4

Mynd 4

ΔFosB er bæði nauðsynlegt og nægilegt fyrir kókaín-miðlað D1 viðtakaháð CaMKIIα örvun í NAc skel

Tilraun 10: Áhrif af AAV-miðluðu ΔJúnD ofþjöppun á kókaínháðri próteingjáningu (Fig 4 D – F)

Stereótaxísk innspýting af AAV-GFP eða AAV-GFP-ΔJunD var framkvæmd skv. Tilraunir 8. 14 dögum eftir skurðaðgerð voru dýrum gefin 10 mg / kg kókaín eða saltvatnsburðar IP einu sinni á dag í sjö daga í hreyfilokunarhólfum. Svörun við hreyfingu við stakri kókaínsprautun (5 mg / kg IP) eða saltvatni var skráð. 24 klst. Eftir þessa loka inndælingu, rottum voru höfð á höfði, vefjum safnað og vesturblettir gerðir eins og í Tilraunir 9.

Tilraun 11: Í Vitro Prótein Kinase próf (Mynd 5A – D)

Raðbrigða CaMKIIa og ΔFosB voru hreinsaðar úr skordýrafrumum (Brickey o.fl., 1990; Jorissen o.fl., 2007) og prótein kinasapróf voru framkvæmd (Colbran, 1993), eins og áður hefur verið lýst. Í stuttu máli var CaMKII ræktað á ís með 2.5 μM (eða gefinn styrkur) af ofFosB, 1 mM Ca2+, 40 mM Mg2+, 15 µM ​​calmodulin, og 200 mM HEPES pH 7.5. Fosfórýlering var hafin með því að bæta við 200 µM ​​ATP með eða án [γ-32P] ATP og leyfði að halda áfram í 10 mín við stofuhita (Mynd 5A og B) eða 2 mín. á ís (Mynd 5C & D). Vörur voru leystar með Western blotting (Mynd 5A og B) eða með sjálfvirkum aðdráttarafli og talningu (mynd B – D).

Mynd 5

Mynd 5

ΔFosB er öflugt undirlag fyrir CaMKIIα

Tilraun 12: Auðkenning Ser27 ΔFosB fosfórun (Mynd 5E)

In vitro kínasapróf voru framkvæmd samkvæmt pr Tilraunir 11, prótein voru aðskilin með SDS-PAGE, og bönd sem samsvara osFosB voru skorin út og látin gangast undir fjöldamassa litróf. M / z verkefnin af samsvarandi jónbrotum í öllum spjöldum eru merkt ofan á jónatoppana. Ekki eru allir brotjónir merktir vegna takmarkana á plássi. Almennt er textinn fyrir jónamerki brotanna litaður í svörtu nema þegar þeir staðfesta beint eða bæta við sönnunargögnum um að fosfórýlunarstaðir séu áhugaverðir, en þá eru þeir merktir með rauðu. Vísbendingar um sundurliðunarafurðir burðarásar eru sýndar í röðarlestri fosfóepteptíðsins með greinilegum stað fosfórýlunarleifa sem er tilgreindur með rauðu með einni amínósýru stafagerð. Töluleg lýsing á brotnum jónunum, sem sést, eru einnig merkt á peptíðröðinni sem b og y jónir. Aðdráttarstuðlarnir fyrir köflum m / z ásins til að sýna brotjónir með lægri styrk eru merktir efst á hverju brotamassa. Brotsjónirnar, sem sýndar eru í spjaldi H, staðfestir tilvist Ser27 fosfórýleraðs ísóforms, þó, innan blöndu af öðrum fosfórýleruðum ísóformum á stöðum Ser28, Ser31, Ser34 og Thr37. Tilvist pa5, pa5-P, pb5 og pb5-P jóna staðfestir á fosfórýleringu Ser27 leifanna.

Tilraun 13: Magn á Ser27 fosfórýleringu (Mynd 5F)

Hefðbundin peptíð voru hönnuð til að líkja eftir fosfó- og fosfóformum Ser27 ΔFosB. Eftir myndun og hreinsun var hvert „þungt“ fíflalítil peptíð leyst upp í 50 / 50 asetónítríl / vatnsbuffi og sent til amínósýrugreiningar til að ákvarða algeran styrk á tilbúið peptíð stofnlausn. Hvert „þunga“ peptíð var síðan beint innrennsli í 4000 QTRAP massagreininguna (MS) til að ákvarða bestu árekstrarorkuna fyrir MS / MS sundrungu og tvær til fjórar MRM umbreytingar. Næst voru snyrtilegu „þungu“ peptíðin látin fara í LCMS á 4000 QTRAP til að tryggja aðskilnað peptíðs. Tækið var keyrt í þrefalda fjórfætlsstillingu, með Q1 stillt á tiltekið forveri m / z gildi (Q1 er ekki skönnun), og Q3 stillt á sérstaka m / z gildi sem samsvarar tilteknu broti þess peptíðs. Í MRM stillingu var röð stakra viðbragða (undanfara / brot jónaskipta þar sem árekstrarorka er stillt til að hámarka styrk brotjónanna sem vekur áhuga) mæld í röð og hringrásin (venjulega 1 – 2 sek.) Var lykkjuð í gegn allan tímann við aðskilnað HPLC. MRM umbreytingar voru ákvörðuð út frá MS / MS litróf þeirra peptíða sem fyrir voru. Tveir umbreytingar á peptíði, sem samsvara jónum með háa styrkleika, voru síðan valdar og árekstrarorkan bjartsýni til að hámarka merkisstyrk MRM umbreytinga með sjálfvirkni hugbúnaðar. Toppar sem fengust úr stöðluðum peptíðum og ΔFosB sýnum sem voru útsettir fyrir CaMKII eða samanburði voru síðan bornir saman til að ákvarða algilt magn hvers peptíðforms í hvarfinu. Gagnagreining á LC-MRM gögnum er framkvæmd með því að nota AB Multiquant 1.1 hugbúnað.

Tilraun 14: Innleiðing ΔFosB í CaMKII ofþjöppun músa (Mynd 5G & H)

Meðfæddar mýs sem ofþjappa T286D CaMKII (Mayford o.fl., 1996; Kourrich et al., 2012) og villtra tegundir félögum voru alin upp í fjarveru doxycycline til að leyfa tjáningu transgena. Fullorðnum músum var gefið 20 mg / kg kókaín eða saltvatns IP einu sinni á dag í 14 daga. 24 klst. Eftir loka inndælingu, dýrum var aflýst og ónæmisheilbrigðafræði og magngreining ΔFosB tjáningar var framkvæmd eins og í Tilraunir 4.

Tilraun 15: Áhrif HSV-miðluð ΔFosB ofþjáning og CaMKII hömlun á NAc dreifitækjum (Fig 6A – E)

Fullorðnum karlmúsum (8 vikur) var sprautað með stereótaxískum hætti í NAc með HSV-GFP, HSV-GFP-osFosB (Olausson o.fl., 2006), HSV-GFPAC3I, eða HSV-GFPAC3I-osFosB. Í þessum smíðum er AC3I, peptíðbundinn hemill á virkni CaMKII, sameinaður í C-enda GFP. GFPAC3I var klónað með PCR með því að nota pMM400-vektorinn sem inniheldur GFPAC3I sem sniðmát með eftirfarandi grunnur: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTakNUMX; GFP-AC3I-R: 3 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 5' (klemmuBspEIstop). PCR afurðin, sem myndaðist, var sett í p3 + og p1005 + -Δ FosB vektorana með því að nota NheI og BspEI síður. Smíðin var staðfest með röð. Stereotaxic hnit voru: 1005 ° horn, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = −1.5 mm (Barrot o.fl., 4.4). Innbrot og snið frá heila voru framkvæmd samkvæmt skv Tilraunir 4.

Hrygggreining var framkvæmd eins og lýst erChristoffel o.fl., 2011). Í stuttu máli voru tindarhlutar 50 – 150 um frá sósunni valdir af handahófi úr HSV-sýktum frumum sem tjá GFP. Myndir voru aflað á ruglandi LSM 710 (Carl Zeiss) til formgerðagreiningar með því að nota NeuronStudio með geislamyndunaralgríminu. NeuronStudio flokkar spines sem þunnt, svepp eða stubby miðað við eftirfarandi gildi: (1) myndhlutfall, (2) hlutfall höfuð og háls og (3) höfuð þvermál. Hrygg með háls má flokka annað hvort þunnt eða sveppi og þeir sem eru án verulegs háls flokkast sem þrjóskur. Spines með háls eru merktir sem þunnir eða sveppir miðað við þvermál höfuðsins.

Mynd 6

Mynd 6

Blokkun á virkni CaMKII kemur í veg fyrir formgerð og hegðunaráhrif ΔFosB í NAc

Tilraun 16: Áhrif HSV-miðluð Δ FosB ofþekking og CaMKII hömlun á kókaín svörum (Mynd 6F)

Fullorðnum karlmúsum var sprautað með vírusum skv Tilraunir 15og svörun við hreyfingu við stakri 5 mg / kg inndælingu af kókaíni mældist eins og pr Tilraunir 9. Vélvægagögn eru gefin upp sem heildargeislabrot yfir 30 mín. Eftir inndælingu kókaíns.

Viðbótarupplýsingar

Dýrahúsnæði

Karlkyns Sprague Dawley rottur (250 – 275 g; Charles River rannsóknarstofur) voru parhúsalögð. Átta vikna gamlar C57BL / 6J karlmýs (Jackson rannsóknarstofan) voru hýstar að hámarki fimm dýr í búri. Öll dýrin voru vistuð í dýraaðstöðunni í ≥1 viku fyrir tilraunameðferð og voru hýst í loftslagsstýrðum herbergjum (23 – 25 ° C) á 12 klst. Ljós / dökkri lotu (ljós kviknað á 7: 00 AM) með aðgang að mat og vatn ad libitum. Tilraunir voru gerðar í samræmi við viðmiðunarreglur Félags um taugavísindi og stofnananefnd um dýraumönnun og notkun (IACUC) við Mount Sinai.

Drugs

Lyf voru gefin IP og leyst upp í sæfðu saltvatni, þ.mt kókaíni (5 – 20 mg / kg á 10 µl fyrir mýs, á 1 ml fyrir rottur, NIDA) og SCH 23390 eða eticlopride hýdróklóríð (0.5 mg / kg á 1 ml, Tocris) . Fyrir stereótaxíska skurðaðgerð voru mýs svæfðar með „kokteil“ af ketamíni (100 mg / kg) og xýlazíni (10 mg / kg) (Henry Schein) í sæfðu saltvatni.

Mótefni

CaMKIIα (samtals): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII fosfó-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (samtals): Cell Signaling 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfó-Ser27: Fosfósólausnir, 1: 500

GluA1 (samtals): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfó-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfó-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Tölfræðilegar greiningar

Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota Prism 6 hugbúnaðarpakka (GraphPad). T-próf ​​nemenda voru notuð í öllum parvísum samanburði (tilgreint í Niðurstöðum þar sem t gildi er gefið), og einstefna ANOVA voru notuð við alla margfalda samanburð (tilgreint í niðurstöðum þar sem F gildi er gefið).

Fara til:

Niðurstöður

Langvinn kókaín framkallar CaMKII í NAc skelinni

Margar rannsóknir hafa bent til þess að MSN í NAc skelinni og kjarna hafa mismunandi lífefnafræðilega og lífeðlisfræðilega svörun við langvarandi útsetningu fyrir misnotkun lyfja (Kourrich og Thomas, 2009; Loweth o.fl., 2010) og að undirsvæðin tvö stjórna áfengisleitandi hegðun á mismunandi hátt (Ito o.fl., 2004). Til að ákvarða mismunáhrif kókaíns á próteinhluta NAc skeljar vs kjarna notuðum við margþættan isobaric tagging (iTRAQ) og fjöldamassa litrófsgreiningar (MS / MS). Fullorðnum karlrottum var sprautað IP með kókaíni (20 mg / kg) eða saltvatni daglega í 7 daga; 24 klst. Eftir síðustu inndælingu, NAc skel og kjarna voru örgreind (Mynd 1A) og blossa frosin. Prótein í þessum sýnum voru síðan magngreind með iTRAQ. Allir fjórir CaMKII ísóformin sýndu miklar aukningar á tjáningu eftir kókaínmeðferð sem voru sértækir fyrir NAc skel samanborið við kjarna. Nokkrir próteinfosfatasa, þar á meðal PP1 hvata- og reglugerðaeiningar og PP2A, sem áður hafa verið tengdir ýmsum CaMKII hvarfefnum í öðrum kerfum (Colbran, 2004), fylgdu svipuðu mynstri. Þessar niðurstöður gáfu nýjar, óhlutdrægar vísbendingar um að CaMKII merkjaslóðin sé áberandi stjórnað af kókaíni í NAc á skel-sértækan hátt.

Til að staðfesta þessa uppgötvun meira magnbundnar, meðhöndluðum við rottur eins og hér að ofan með kókaíni (í mismunandi skömmtum) eða saltvatni og mældum svörun við hreyfingu við kókaíni (5 mg / kg) eða saltvatnsskammt. Endurtekin útsetning fyrir 10 mg / kg kókaíni leiddi til dæmigerðs hreyfingarofnæmis (Mynd 1B). Frekari rannsóknir með þessari skammtaáætlun leiddu í ljós með því að nota vestræna blotting að endurtekið kókaín örvar CaMKIIα sértækt í NAc skel 24 klst. Eftir loka inndælingu kókaíns (Mynd 1C og D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Að auki var fosfórýlering á Canonical CaMKII hvarfefninu Ser831 í GluA1 undireiningunni AMPA viðtakinn verulega aukin í NAc skelinni og ekki kjarna (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), en CaMKIIα Thr286 autophosforylering hafði sterka en ekki veruleg þróun í átt að örvun í skel eingöngu (Mynd 1D). Nokkrir aðrir viðtaka glútamats voru ekki fyrir áhrifum. Öfugt við þessar mælingar á CaMKII sýndu sömu vefjasýni örvun á osFosB í báðum skelinni (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) og kjarna (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) í NAc (Mynd 1C og D), í samræmi við fyrri niðurstöður (Perrotti o.fl., 2008).

Þar sem nokkrar fyrri rannsóknir á stjórnun kókaíns á AMPA viðtökum greindu dýr eftir ~ 14 daga fráhvarf úr langvinnu kókaíni (sjá umfjöllun), endurtókum við þessar lífefnafræðilegar greiningar á þessum tímapunkti. Við fundum að 14 dögum eftir loka inndælingu á kókaíni, ΔFosB er enn hækkað í NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), en hvorki CaMKII né fosfórun GluA1 Ser831 er enn aukin (Mynd 1E). Samt sem áður, 1 klst. Eftir stakan 10 mg / kg áskorunarskammt af kókaíni, stig heildar CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) og GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosfórun er bæði hækkuð að svipuðu leyti og fannst eftir upphaflega langvarandi útsetningu fyrir kókaíni (Mynd 1E). Þessar upplýsingar benda til þess að NAc skeljar taugafrumur séu byrjaðir til að framkalla CaMKII á langan tíma bindindis, ef til vill með beinni grunnsetningu CaMKII genaörvunarinnar (sjá umfjöllun). Ennfremur bendir sú staðreynd að ΔFosB örvun er viðvarandi en CaMKII örvun til viðbótar fyrirkomulag, hvort sem það er byggt á krómatíni eða á annan hátt, sem beita „bremsu“ á CaMKII reglugerð, eins og fjallað er um í umfjölluninni.

Til að styrkja þessar athuganir enn frekar könnuðum við líkön af sjálfsstjórnun kókaíns, sem fela í sér neyslu vímuefna. Fullorðnir karlrottur fengu annað hvort stuttan eða langan aðgang að kókaíni; eins og mátti búast við (Ahmed og Koob, 1998), aðeins langir aðgangsaðstæður leiddu til þess að sjálf lyfjagjöf lyfsins hefur stigmagnast (Mynd 2A). ΔFosB var framkallað í meira mæli um langt skeið vs stuttur aðgangur að kókaíni í bæði NAc skelinni (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) og kjarna (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Aftur á móti var CaMKIIα framkallað í NAc skel aðeins með löngum aðgangi að kókaíni (Mynd 2B og C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Það er áhugavert að bera saman meðaltal daglega kókaínneyslu milli dýra með stuttan aðgang (~ 12 mg / kg IV), dýra með langan aðgang (~ 70 mg / kg IV) og dýr sem fengu tilraunir (10 mg / kg) og spyrja hvers vegna hið síðarnefnda vekur öfluga virkjun ΔFosB og CaMKII en stuttur aðgangur gerir það ekki. Þetta misræmi er líklega vegna mismunur á hámarksþéttni kókaíns (kókaín gefið með reynslumanni er gefið sem einn bolus IP, en sjálf-gefið kókaín er gefið með mörgum skömmtum í IV) eða af mismunur á útsetningu fyrir lyfjum (7 dagar fyrir tilraunaaðila gjöf, 19 dagar til sjálfsgjafar).

Þrátt fyrir miklar fræðirit um osFosB og CaMKII varðandi kókaínverkun, eru engar rannsóknir á þessum próteinum hjá kókaínnotendum manna. Hér leggjum við fram fyrstu sönnunargögnin að stig beggja ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) og CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) eru aukin í NAc hjá kókaínháðum mönnum (Mynd 2D, Tafla 1). Þessar upplýsingar benda til þess að skoðun okkar á osFosB og CaMKII örvun með kókaíni í nagdýra nagdýrum sé klínískt mikilvæg fyrir kókaínfíkn manna.

Tafla 1

Tafla 1

Lýsing á sýnum frá kókaínfíklum úr mönnum og samsvarandi samanburðarhópi

ΔFosB stjórnar CaMKII umritun að eigin vali í D1 tegund MSNs af NAc Shell

Niðurstaðan um að bæði CaMKII og osFosB séu uppstýrt af kókaíni í nagdýra NAc leiddi til þess að við ákvarðum hvort ΔFosB gæti stjórnað umritun CaMKII gensins. Við höfðum áður greint frá CaMKIIα sem mögulegt markmið fyrir ΔFosB í óhlutdrægri örgerðargreiningu á NAc (McClung og Nestler, 2003), en þessi niðurstaða var ekki staðfest frekar í þeirri rannsókn. Við notuðum fyrst magn ChIP (qChIP — ChIP og síðan magn PCR) til að ákvarða hvort osFosB binst CaMKIIα genaörvunina í NAc hjá fullorðnum karlkyns rottum og fannst sláandi að þessi binding er verulega aukin, með langvarandi kókaíngjöf, í skelinni ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), en ekki kjarninn, undirsvæði (Mynd 3A). Til að skilja frekar fyrirkomulag sem tengjast þessum undirsvæðasértækum mismun á FosB bindingu við CaMKIIα verkefnisstjóra notuðum við qChIP til að einkenna ástand histónbreytinga á þessu genamengi. Fyrri rannsóknir sýndu framköllun kókaíns af H3 asetýleringu á CaMKIIa kynningu í heildar NAc músum (Wang og fleiri, 2010). Aftur á móti komumst við að því að kókaín dregur úr H3 asetýleringu við CaMKIIa kynningarefnið sértækt í NAc kjarna (Mynd 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), án breytinga sjáanleg í skel, í samræmi við undirsvæðissértækar litskiljunarbreytingar umfram ΔFosB bindingu. qChIP fyrir kúgunarmerkið, dímetýlerað H3 lýsín 9 (H3K9me2), leiddi í ljós þróun fyrir fækkun bæði skelja og kjarna undirsvæða (Mynd 3C).

Til að ákvarða hvort osFosB stjórnar CaMKIIα umritun in vivo, notuðum við tvær bitransgenic músalínur sem framkalla ofvirklega ΔFosB sérstaklega í D1 vs D2 tegund MSNs á þann hátt sem stjórnað er af gjöf doxycycline í drykkjarvatni (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme o.fl., 2002). Fullorðnir karlkyns mýs sem ofþjáðu ΔFosB eingöngu í D1 gerð MSN höfðu marktækt aukið magn CaMKIIα mRNA í NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), áhrif sem ekki hafa sést hjá músum sem ofreyndu ΔFosB aðallega í D2 gerð MSN (Mynd 3D). Aukningunni á CaMKIIα mRNA, framkölluð af ΔFosB tjáningu í D1 gerð MSN, fylgdi samtímis aukning á CaMKIIα próteini í báðum NAc skelinni (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) og kjarna (p = 0.0392; t = 2.275; t = 14; t = XNUMX; t = XNUMX) = XNUMX; df = XNUMX; Fig. 3E og F). Þessi gögn sýna að ΔFosB er fær um að knýja fram CaMKIIα gen tjáningu í D1 gerð MSN í báðum undirsvæðum, þó Mynd 3B bendir til þess að breyting á kókaíni-miðluðum litningi við CaMKIIa kynningu (td minnkað asetýlering) komi í veg fyrir að osFosB enduruppbyggi CaMKII í kjarnasvæðinu eftir kókaín.

Vegna þess að erfðabreytt músagögn okkar gáfu til kynna að ΔFosB örvun CaMKII genatjáningar væri sértæk fyrir MSN af D1 gerð í NAc, leituðum við næst að því að ákvarða hvort kókaínháð uppstýring á CaMKII krefst virkjunar D1 dópamín viðtakans. Fullorðnum karlrottum var gefið langvarandi kókaín eða saltvatn eins og áður, en 30 mín fyrir hverja inndælingu var rottum í kókaínhópnum gefið IP-inndæling með saltvatni, D1 mótlyndinu SCH 23390 (0.5 mg / kg) eða D2 viðtakablokknum etiklopríði. (0.5 mg / kg). Dýr voru greind 24 klst. Eftir síðustu kókaínsprautu. Western blotting leiddi í ljós að D1, en ekki D2, mótþrói hindraði kókaínmiðaða aukningu á ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18) eins og áður hefur verið greint fráNye et al., 1995), sem og í CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G og H). Þessi gögn styðja þá tilgátu að kókaín hafi áhrif á ΔFosB-miðlaða aukningu á CaMKII genatjáningu sérstaklega í D1 MSN gerðum af NAc skel. Það væri mikilvægt í framtíðarrannsóknum að sýna fram á með beinum hætti þessi frumutegunduáhrif kókaíns á CaMKII tjáningu á þessu heila svæði.

ΔFosB er bæði nauðsynlegt og nægir fyrir kókaínleiðslu CaMKII í NAc Shell

Til að bæta við notkun bitransgenískra músa könnuðum við næst hlutverk ΔFosB við að miðla kókaínleiðslu CaMKIIa með því að nota veirumiðlað genaflutning hjá rottum. Við sprautuðum tvíhliða adeno-tengdum veiru (AAV) agnum í NAc skel fullorðinna karlrottna (þar sem hægt er að miða skelinn sértækt) til að ofreyna ΔFosB auk GFP eða GFP eingöngu. Dýrunum var síðan gefin ein IP innspýting af 10 mg / kg kókaíni. Dýrin, sem ofþjáðu ΔFosB / GFP, sýndu aukið hreyfisvörun samanborið við dýr sem ofþjáðu GFP ein (Mynd 4A). 24 klst. Eftir staku kókaínsprautuna, var GFP-jákvæður NAc vefur skorinn úr þessum dýrum með krufningu undir flúrljómandi ljósgjafa. Vesturblæja af þessum vef (Mynd 4B og C) leiddi í ljós sterka ΔFosB ofþjáningu auk marktækrar aukningar á heildar CaMKIIα próteini samanborið við GFP dýr (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), svipað og örvunin sem sést við langvarandi gjöf kókaíns. Að auki var CaMKIIα autophosphorylering við Thr286 (vísbending um virkjun ensíma) aukin með ΔFosB ofþrýstingi (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), eins og fosfórýlering á CaMKII hvarfefninu, Ser831 af GluA1 (p = XUMX; 0.0540; df = 2.012), sem líkir aftur eftir aðgerðum langvarandi kókaíns (Mynd 1C og D). TTil marks um þetta veita þessar upplýsingar frekari vísbendingar um að ΔFosB tjáning í NAc skel nægi til hreyfingarnæmis fyrir kókaíni og fyrir CaMKII örvun og virkjun í þessu undirsvæði.

Við notuðum svipaða nálgun til að ákvarða hvort osFosB er einnig nauðsynlegt til að framkalla CaMKIIα í kókaín miðlað í NAc skelinni. AAV var notað til að ofþjappa styttu JunD prótein, kallað ΔJunD, sem er neikvæð eftirlitsstofnun ofFosB umbreytingarvirkjunar (Winstanley o.fl., 2007) plús GFP eða GFP einn. Tveimur vikum síðar, þegar tjáningu transgena er hámarks, voru dýr gefin kókaín (10 mg / kg) eða salt daglega í 7 daga og prófuð á svörun við hreyfingu við kókaínáskorun (5 mg / kg) 24 klst. Eftir síðustu langvinnu inndælingu (Mynd 4D). Un Yfirdreifing JUND kom í veg fyrir næmingu á hreyfingum fyrir kókaíni og kom einnig í veg fyrir örvun og virkjun CaMKIIα í NAc skel (Mynd 4E og F; p = 0.0437; F = 2.997; heildar df = 38), sem bendir til þess að ΔFosB umritunarvirkni sé nauðsynleg til að framkalla CaMKIIα í kókaín í þessu undirsvæði. Athyglisvert er að við fundum að unJunD minnkaði magn ΔFosB bæði við saltvatns- og kókaínmeðhöndlað skilyrði (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), sem hækkaði þann nýja möguleika að ΔFosB veltur á AP-1 virkni fyrir eigin tjáningarstig.

CaMKII fosfórýlat ΔFosB í Ser27

Notkun vitro próteinkínasapróf, við komumst að því að hreinsað ΔFosB er öflugt undirlag fyrir CaMKIIα. Ræktun hans6-ΔFosB með CaMKIIα og ATP olli uppsveiflu rafskautafræðilegs hreyfanleika ΔFosB (Mynd 5A); nokkrar hljómsveitir, sem urðu til, bentu til margra staða fosfórýleringa Svipað vitro kínasa prófanir með [γ-32P] ATP sýndi að geislamerkið fosfat var fært inn í edFosB hljómsveitir (Mynd 5B), sem sýnir bein fosfórun próteins. Við mynduðum fosfó-sértækt mótefni gegn áður einkenndu Ser27 af ΔFosB (Ulery o.fl., 2006). Þó að þetta mótefni gefi ekki merki gegn heilaútdráttum sem innihalda Ser27-fosfórýlerað ΔFosB (gögn ekki sýnd), gátum við greint Ser27 fosfórýlering í vitro kínasa próf með CaMKII (Mynd 5B). Hreyfigreining á CaMKII fosfórýleringu ΔFosB bendir til þess að það sé öflugt hvarfefni fyrir kínasa (Mynd 5C), með áberandi KM af 5.7 ± 2.0µM og KCAT af 2.3 ± 0.3min-1. Þessar niðurstöður eru sambærilegar við margar vel einkenndar in vivo hvarfefni CaMKII (Colbran og Brown, 2004). Að auki komumst við að því að CaMKII fosfórýlöt ΔFosB með stoichiometry af 2.27 ± 0.07 mól / mól (Mynd 5D), sem gefur til kynna að það séu að minnsta kosti þrír staðir af CaMKII fosfórýleringu innan His6-ΔFosB prótein, í samræmi við Mynd 5A.

Til að kanna einstaka staði fosfórun, notuðum við MS greiningar á sýnum úr okkar vitro kínasa próf. Mynd 5E sýnir ΔFosB fosfórýleringu við Ser27 sem áður einkenndist og á nokkrum viðbótarstöðum (gögn eru ekki sýnd). Miðað við fyrri virkni Ser27, lögðum við áherslu á þennan vef með því að búa til merkt tilbúin peptíð sem líkja eftir fosfó- og nonfosfó ríkjum Ser27, notuðum síðan þekkt magn af þessum peptíðum sem staðla í MRM greiningum á ΔFosB fyrir og eftir vitro fosfórun með CaMKII. Síðari magngreining (Mynd 5F) staðfestir að Ser27 er öflugt undirlag fyrir CaMKII. Þessar niðurstöður benda til þess að meðal margra fosfórýleraðra leifa innan ΔFosB sé Ser27 sérstaklega áhrifaríkt undirlag fyrir CaMKII.

CaMKII miðlar kókaínsöfnun ΔFosB í NAc skelinni

Þar sem CaMKII getur fosfórýlat ΔFosB vitro á vefsvæði sem eykur stöðugleika þess verulega vitro og in vivo (Ulery o.fl., 2006; Ulery-Reynolds o.fl., 2009), við ákvörðum hvort CaMKII virkni stýrir ΔFosB stigum í NAc in vivo. Til að taka á þessari spurningu notuðum við fyrst músalínu sem ofreystir kalsíum óháð stökkbrigði af CaMKIIα (T286D) á mörgum heilasvæðum þar á meðal NAc (Mayford o.fl., 1996; Kourrich et al., 2012). Við sprautuðum saman aldursspiluðum fullorðnum karlkyns stökkbreyttum og villtum tegundum strákfélögum með 20 mg / kg kókaíni eða saltvatni einu sinni á dag í 14 daga og greindum dýrin síðan einum degi eftir lokadælingina. Við fundum að grunnþéttni ΔFosB var aukin hjá stökkbreyttu dýrunum í NAc skelinni (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), en ekki kjarna (Fig 5G og H). Það kemur á óvart að kókaínháð örvun ΔFosB var læst hjá stökkbreyttu dýrunum bæði í skel og kjarna, sem bendir til þess að þrátt fyrir að CaMKII geti beinlínis stjórnað ΔFosB stöðugleika í NAc skelinni, þá gæti það einnig liggja andstreymis ΔFosB í kókaínvirkum leiðum í báðum NAc undirsvæðum .

CaMKII virkni er krafist vegna Δ FosB-miðlaðs uppbyggingar- og atferlisplastleika

Kókaín örvun dendritískra hryggja á NAc MSNs er ein besta aðlöguð lyfjavirkjun á þessu heila svæði, og slík örvun hryggs hefur verið tengd við næm hegðunarviðbrögð við lyfinu (Robinson og Kolb, 2004; Russo o.fl., 2010) og greint frá því að vera sértækir fyrir D1 tegund MSNs (Lee et al., 2006). Við höfum sýnt fram á að undanförnu að örvun kókaíns á dendritískum hryggjum í NAc er háð osFosB og eftirlitsáætlun þess (Maze et al., 2010). Þó að það séu til umfangsmiklar fræðirit um þátttöku CaMKII í vefmyndun hrygg hryggs og framkalla á öðrum heila svæðum og tilraunakerfum (Jourdain o.fl., 2003; Penzes o.fl., 2008; Okamoto o.fl., 2009), hlutverk þess í NAc MSN hryggmyndun hefur ekki verið rannsakað. Þess vegna ákváðum við hvort þörf er á CaMKII virkni vegna ΔFosB-miðlað örvunar á MSN dendritískum hryggjum með því að nota HSV-miðlaða ofþrýsting á CaMKII hemla peptíðinu AC3I sameinað GFP, smíði sem áður hefur verið sýnt fram á að hamla CaMKII virkni in vivo (Zhang o.fl., 2005; Klug o.fl., 2012). Veiruþjöppun á ΔFosB í NAc skel fullorðinna músa olli verulegri aukningu á þéttni MS í dendritískri hrygg (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Mynd 6A og B) eins og áður hefur verið greint frá (Maze et al., 2010), og var þessi aukning aðallega knúin áfram af þunnum (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) og þrjóskum (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) hryggtegundum (báðar taldar vera óþroskaðar hryggjar) (Fig 6C – E). Engin áhrif sáust á þroskaðri, sveppalaga hrygg. Þegar GFP-AC3I var samtímis tjáð, var ΔFosB örvun hryggjar felld alveg niður (Fig 6A – E), sem gefur til kynna að CaMKII virkni sé nauðsynleg vegna ΔFosB örvunar á tindarhrygg í NAc skel.

Við notuðum næst sömu veirutæki til að ákvarða hvort CaMKII virkni er nauðsynleg vegna áhrifa FosB á hegðunarnæmi fyrir kókaíni. 72 klst. Eftir veiruinnspýtingu í NAc skel, dýrum var gefin stök inndæling af 5 mg / kg kókaíni og hreyfingarvirkni þeirra var skráð. Eins og áður hefur verið sýnt með aukinni AAV oftryggingu ΔFosB (Mynd 4A), HSV-miðluð oftjáning á ΔFosB jók hreyfiskipanæmi fyrir kókaíni (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Mynd 6F). Eins og við örvun á tindarhrygg, hindraði virkni CaMKII með samleiðslu GFP-AC3I algerlega ΔFosB-miðluðu aukningu á kókaínnæmi, sem bendir til þess að CaMKII virkni sé nauðsynleg vegna ΔFosB-framkallaðra breytinga á hegðunaráhrifum kókaíns.

Fara til:

Discussion

Þessi rannsókn skýrir frá nýjum aðferðum til að framsenda þar sem kókaín örvar ΔFosB í NAc, sem reglir uppskrift af CaMKIIα geninu að eigin vali í NAc skelinni. CaMKIIa fosfórýlates síðan og stöðugast ΔFosB sem leiðir til meiri ΔFosB uppsöfnun og til frekari örvunar CaMKIIα (Mynd 6G). Samhliða stigmagnandi próteinin tvö við langvarandi útsetningu fyrir kókaíni stuðla síðan að nauðsynlegum leiðum til næmra hegðunarviðbragða við lyfinu. Þetta er sérstaklega aðlaðandi tilgáta þar sem bæði ΔFosB og CaMKII hafa áður verið sýnd fram á að vera nauðsynleg vegna aukinna hegðunarviðbragða við kókaíni (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), og við endurtökum þessa niðurstöðu fyrir osFosB í NAc skel sérstaklega með veiruaðferð (Figs 4 og And66).

Þrátt fyrir að erfðabreyttar ΔFosB ofþrýstingur í D1 gerð MSN geta ýtt undir CaMKII örvun í bæði NAc skel og kjarna naivna dýra af kókaíni, í samhengi við kókaín, þá er uppsöfnun innræns ΔFosB, sem á sér stað í báðum undirsvæðum, virkjun CaMKII sérstaklega í NAc skel . Þessi munur gæti tengst hærra stigi FosB af völdum bitransgenic líkans okkar, en það gæti einnig endurspeglað getu kókaíns til að breyta CaMKIIα kynningaranum í skel á mismunandi hátt vs kjarna MSN til að annaðhvort stuðla að ΔFosB bindingu í því fyrra eða útiloka það í síðarnefnda svæðinu. Reyndar styðja ChIP gögn okkar, sem sýna kókaín-miðluð dísetýleringu históna við CaMKIIa genaörvunina í NAc kjarna aðeins mögulega þátttöku á litningi. Í samræmi við þessa tilgátu gat osFosB ofþrýstingur í D1 gerð MSN-lyfja knúið CaMKIIα framköllun í NAc kjarna í fjarveru kókaíns (Mynd 3F), sem bendir til þess að það séu virkar breytingar á CaMKIIa kynningaranum sem koma í veg fyrir þessa örvun við langvarandi útsetningu fyrir kókaíni. Reglugerð á litskiljuninni á CaMKII verkefnisstjóranum gæti einnig skýrt hvers vegna CaMKII er framkölluð af áskorunarskammti af kókaíni í NAc skel af langvinnum rottum sem draga frá kókaíni (Mynd 1E) en ekki af dýralyfjum sem ekki höfðu verið gefin (Mynd 1D). Þetta gæti verið táknræn áhrif “genaframleiðslu” á erfðaefni “FosB” (Robison og Nestler, 2011), og gæti því verið einn sameindakerfi við ræktun á kókaínþrá (Pickens o.fl., 2011). Til þess að þessi litningaskipting væri orsakatengd við ræktun þrá, þyrfti hún að aukast með tímanum. Það verður fróðlegt að ákvarða hvort þetta er tilfellið og kanna hvort önnur gen sýni ΔFosB-háð, sérstökum reglum eftir kókaíni. Það er einnig mikilvægt að hafa í huga að fram-fram-lykkjan sem við lýsum leiðir ekki til endalausrar uppsöfnunar CaMKII eða ΔFosB (Mynd 1E); að afhjúpa sameind „bremsuna“ sem ber ábyrgð á þessu er mikilvægt markmið framtíðarrannsókna.

Þekkt aðgerðir ΔFosB og CaMKII í nokkrum tilraunakerfum og heilasvæðum renna saman á mörgum stigum (Mynd 6F). Báðar sameindirnar eru nátengdar vaxtarhrygg í hryggnum: CaMKII hefur samskipti við frumufrumugerðinn (Okamoto o.fl., 2009), stjórnar háls hryggs (Matsuzaki o.fl., 2004), og er bæði nauðsynlegt og nægjanlegt fyrir aukningu á mænuvökva og fjölgunarþéttni í nýmyndun í hippocampal líffræðilegrar sneiðarækt.Jourdain o.fl., 2003), wHIL ΔFosB er bæði nauðsynlegt og nægjanlegt fyrir myndun kókaíns af völdum dendritic hryggs í NAc MSNs (Maze et al., 2010). Að auki hafa báðar sameindirnar verið tengdar við stjórnun AMPA glútamat viðtaka. CaMKII stjórnar ekki heildarmagni AMPA viðtakaeininga, heldur rekur innsetningu AMPA viðtaka í samsöfnun og eykur leiðni AMPA rásar með því að fosfórera GluA1 við Ser831 í hippocampal pýramída taugafrumum í menningu og in vivo (skoðað í (Malinow og Malenka, 2002; Colbran og Brown, 2004)). Slík aukning mansals á GluA1 við samlíkinguna hefur einnig verið tengd við langvarandi kókaínverkun (Boudreau og Wolf, 2005). Ennfremur eru hegðunarviðbrögð við virkjun AMPA viðtaka í NAc aukin með ofmældri CaMKIIα á D1 dópamínviðtakaháðum hætti (Singer o.fl., 2010). Sýnt hefur verið fram á að D1-sértækur oftjáning til langs tíma á ΔFosB örvar GluA2 umritun í NAc (Kelz et al., 1999), sem dregur úr AMPA svörun sem miðluð er með GluA1, meðan við sýnum hér að skemmri tíma ΔFosB ofþrýsting - sem og skammtímavitun kókaíns - hafa engin áhrif á þessa undireining (Mynd 1). Engu að síður höfum við komist að því að undanförnu að skammtímatilraun ΔFosB dregur engu að síður úr AMPA svörum í D1 tegundum MSN í NAc (Grueter et al., 2013). Þessar upplýsingar benda til tímabundins aðgreiningar sem geta verið tímabundin röð taugaaðlögunar að kókaíni sem liggja að baki mismunandi þáttum í framvindu fíknar sem ekki er enn vel skilið. Á hegðunarstiginu eru bæði CaMKII og ΔFosB nauðsynleg vegna hreyfingarofnæmis fyrir kókaíni (sjá hér að ofan), og hvort tveggja er nauðsynlegt fyrir viðvarandi sjálfsstjórnun kókaíns í nagdýrum (Colby et al., 2003; Wang og fleiri, 2010), sem bendir til þess að próteinin tvö séu mikilvæg fyrir bæði skamm- og langtímaaðlögunaraðlögun að váhrifum lyfja, þó með aðgreindu undirliggjandi verkunarháttum. Væntanlega, ΔFosB og CaMKII stjórna svo flóknum aðlögunaraðferðum með hegðun með breytingum á samstillingu NAc, þó að mikil frekari vinna sé nauðsynleg til að tengja synaptísk fyrirbæri beint við hegðunarbreytingar.

CaMKII holóensímið hefur samtímis áhrif á margs konar próteina sem tengjast synapse (Robison o.fl., 2005) sem talið er stjórna miðun sinni á þéttleika postsynaptic (PSD), fyrirbæri sem lagt er til að væri mikilvægt fyrir synaptic plasticity. Sérstaklega var sýnt fram á að samspil CaMKII við GluN2B undireininguna á glútamatsviðtaka af gerðinni NMDA stýrði bæði synaptic plasticity og námi (Halt o.fl., 2012). Þó að AC3I peptíð líki eftir sjálfvirka hindrunarsviði CaMKII og hamli þannig hvata ensímvirkni, hindrar það einnig margfeldi prótein-prótein milliverkana (Strack o.fl., 2000; Robison o.fl., 2005). Þannig geta hegðunar- og formfræðileg áhrif HSV-GFP-AC3I sem hér er greint frá gerst með minni fosfórýleringu á CaMKII markpróteinum, breytingum á CaMKII miðun eða breytingu á fyrirhuguðu uppbyggingarhlutverki CaMKII við samstillingu (Lisman o.fl., 2002).

Takmörkun fyrirhugaðrar ΔFosB-CaMKII lykkju við NAc skelina er sérstaklega athyglisverð, þar sem nýleg vinna hefur sýnt fram á nokkra lífeðlisfræðilegan mun á NAC skelinni og kjarna til að bregðast við kókaíngjöf, hugmynd sem staðfest er með óhlutdrægum iTRAQ (töflu S1) gögnum . MSN í NAc skel sýna þunglyndi í afkastagetu eftir langvarandi kókaín sem er viðvarandi í margar vikur, meðan kjarna MSN frá sömu dýrum sýna tímabundna (1 – 3 dag) aukningu á skothæfni sem skilar sér í grunnstyrk innan 2 vikna (Kourrich og Thomas, 2009). Að auki eru fjölmörg synaptísk prótein með mismunandi hætti í NAc skelinni vs kjarna dýra sem verða fyrir langvarandi kókaíni, þ.mt GluA2 (Knackstedt o.fl., 2010). Þar sem langvarandi amfetamín örvar CaMKIIα sérstaklega í NAc skel (Loweth o.fl., 2010), það kemur ekki á óvart að við finnum svipuð áhrif með kókaíni. Hins vegar, þar sem ΔFosB er framkallað bæði í NAc skelinni og kjarna af langvarandi kókaíni (Perrotti o.fl., 2008), og þar sem við sýnum fram á að CaMKIIa örvun í skel er ΔFosB háð, þá sýna niðurstöður okkar nýjar vísbendingar um mismunandi aðskildar umritunaraðgerðir á CaMKIIα verkefnisstjóra milli þessara tveggja undirsvæða, sem eru ábyrgir fyrir sértæka framköllun CaMKIIa í skel.

Mikið af nýlegri vinnu hefur einbeitt sér að því að afmarka mismun milli D1- og D2 tegundar NAc MSN. Þó að bæði D1 og D2 viðtakar taki þátt í gefandi áhrifum kókaíns (Sjálf, 2010), nýleg vinna sýnir fram á að optogenetic örvun MSN af gerðinni D1 eykur hegðunarviðbrögð við kókaíni en D2 gerð MSN virkjun hefur þveröfug áhrif (Lobo o.fl., 2010). Í samræmi við þessar niðurstöður, eru D1-viðtökuvörn músar skortir við að afla sjálfsstjórnunar kókaíns (Caine et al., 2007), meðan D2 rothögg eru ekki (Caine et al., 2002). D1 gjöf örvandi lyfja beint í NAc kallar fram hegðun kókaíns sem leitast við að koma aftur á hugmyndafræði (Sjálf, 2010). Athyglisvert er að þessi áhrif þurfa D1-viðtakaháða aukningu á virkni CaMKII í NAc skelinni, en ekki kjarna (Anderson o.fl., 2008), niðurstaða sem fléttast vel saman við D1- og skel-sértæka ΔFosB-CaMKII lykkjuna sem hér er lögð til.

Við greindum frá því áður að Ser27 í ΔFosB er hægt að fosfórýera með kasein kínasa-2 (Ulery o.fl., 2006) við staðfestum hins vegar hér að CaMKII fosfórýlöt ΔFosB á þessum og öðrum stöðum með miklu meiri hreyfiorku og stúkómetríu og geta endurtekið hærra sýnilega Mr sést fyrir ΔFosB (Mynd 5A) með útsetningu fyrir kókaíni in vivo (Nestler, 2008). Við vitum nú þegar að Ser27 fosfórýlering eykur stabilityFosB stöðugleika og umritunarvirkni (Ulery o.fl., 2006; Ulery and Nestler, 2007; Ulery-Reynolds o.fl., 2009). Framtíðarstörf munu nú beinast að því að bera kennsl á og hagnýtar afleiðingar skáldsagna af fosfórýleringu FosB sem er sýnd með þessari rannsókn.

Framleiðslöngulásin sem lýst er hér veitir áreiðanlegan nýjan gang með því að endurtekin gjöf kókaíns rekur stigvaxandi frávik í NAc. Sem slík getur þessi lífefnafræðilega leið veitt mikilvægt markmið fyrir framtíðarmeðferðarúrræði við ávanabindandi sjúkdóma. Vegna þess að CaMKII er alls staðar nálægur og þarfnast margra grunntaugafrumna og hegðunaraðgerða, hefur forðast meðferð beina notkun CaMKII hemla sem fíknimeðferð. Gögn okkar benda til þess að fíngerðari miðun á verkun CaMKII framköllunar, sem er sértæk fyrir einstaka frumugerð og undirsvæði launagreiðslna heilans, gæti veitt lækningarmarkmið sem myndu forðast fylgikvilla almennrar CaMKII hömlunar.

Fara til:

Þakkir

Þessi vinna var studd af styrkjum frá National Institute on Drug Abuse (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR og EJN) og Hartwell Foundation (AJR). Höfundar vilja þakka Gabby Rundenko fyrir rausnarlega gjöf hreinsaðs ΔFosB og Roger Colbran fyrir rausnarlega gjöf hreinsaðs CaMKIIα.

Fara til:

Meðmæli

  1. Ahmed SH, Koob GF. Breyting frá miðlungs til mikilli inntöku af völdum lyfsins: breyting á blæðingarhættu. Vísindi. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
  2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: lífefnafræðileg brú sem tengir dópamín accumbens og glútamat í kókaínleitum. Nat Neurosci. 2008; 11: 344 – 353. [PubMed]
  3. Boudreau AC, Wolf ME. Hegðunarnæmi fyrir kókaíni tengist aukinni tjáningu AMPA viðtaka í kjarnanum. J Neurosci. 2005; 25: 9144 – 9151. [PubMed]
  4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Tjáning og einkenni alfa-undireininga Ca2 + / calmodulin-háðs próteinkínasa II með því að nota baculovirus tjáningarkerfið. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578 – 584. [PubMed]
  5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Hlutverk dópamín D2-eins viðtaka í sjálfsstjórnun kókaíns: rannsóknir á D2 viðtakamútum músum og nýjum D2 viðtaka andstæðinga. J Neurosci. 2002; 22: 2977 – 2988. [PubMed]
  6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gull LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Skortur á sjálfsstjórnun kókaíns í dópamíni D1 viðtakamúsum. J Neurosci. 2007; 27: 13140 – 13150. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasome háð og ósjálfstætt kerfi fyrir óstöðugleika FosB: auðkenning FosB degron lén og afleiðingar fyrir DeltaFosB stöðugleika. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009 – 3019. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Meðfædd dýr með örvandi, markvissa genatjáningu í heila. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
  9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kínasi stjórnar félagslegum ósigri af völdum synaptísks og hegðunarplastleiks af völdum streitu. J Neurosci. 2011; 31: 314 – 321. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  10. Colbran RJ. Að virkja Ca2 + / calmodulin háð prótein kínasa II með sjálfsfrumnafæðarfrumum. J Biol Chem. 1993; 268: 7163 – 7170. [PubMed]
  11. Colbran RJ. Próteinfosfatasa og kalsíum / kalmodúlín háð prótein kinase II háð synaptískri plastleika. J Neurosci. 2004; 24: 8404 – 8409. [PubMed]
  12. Colbran RJ, Brown AM. Kalsíum / calmodulin háð prótein kinase II og synaptic plasticity. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318 – 327. [PubMed]
  13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatal frumu-sértæk yfirfækkun DeltaFosB eykur hvata fyrir kókaín. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
  14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Þunglyndislyf verkun histón deacetylase hemla. J Neurosci. 2009; 29: 11451 – 11460. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Tölulegar próteindir af caveolin-1-stjórnuðum próteinum: einkenni fjölliðu i og afritunarstuðul / CAVIN-1 Í æðaþelsfrumum. Mólfrumuprótefni. 2010; 9: 2109 – 2124. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Áhættuþættir fyrir því að sjálfsvíg ljúki við meiriháttar þunglyndi: Rannsókn á rannsókn á áreynslu og árásargjarn hegðun í menn. Am J geðlækningar. 2005; 162: 2116 – 2124. [PubMed]
  17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. Δ FosB mótar mismunandi aðgerðir kjarna accumbens beina og óbeina ferli. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 í blöðum. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII binding við GluN2B er lykilatriði við samloðun minni. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB stökkbreyttar mýs: tap á langvarandi kókaín framköllun Fos tengdra próteina og aukið næmi fyrir geðhreyfingum og gefandi áhrifum kókaíns. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Mismunandi eftirlit með hegðun kókaíns sem leitað er eftir kjarna og skel kjarna accumbens. Nat Neurosci. 2004; 7: 389 – 397. [PubMed]
  21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Útvíkkun og DNA-bindandi eiginleikar umritunarstuðils DeltaFosB. Lífefnafræði. 2007; 46: 8360 – 8372. [PubMed]
  22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalsíum / calmodulin háð prótein kinase II stuðlar að virkni-háðri vöðvavöxt og myndun hryggs. J Neurosci. 2003; 23: 10645 – 10649. [PubMed]
  23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Tjáning umritunarstuðils deltaFosB í heila stjórnar næmi fyrir kókaíni. Náttúran. 1999; 401: 272 – 276. [PubMed]
  24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Erfðahömlun á CaMKII í ristli á miðlægum kyrrum taugafrumum dregur úr virkni örvandi myndunar og eykur áreynslu. PLoS Einn. 2012; 7: e45323. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Útrýmingarþjálfun eftir sjálfsstjórnun kókaíns örvar glutamatergic plastleika til að hindra leit að kókaíni. J Neurosci. 2010; 30: 7984 – 7992. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  26. Kourrich S, Thomas MJ. Svipaðar taugafrumur, gagnstætt aðlögun: geðörvandi upplifun breytir á mismunandi hátt hleypiseiginleikum í kjarna samanborið við skel. J Neurosci. 2009; 29: 12275 – 12283. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-sjálfstæð áhrif Striatal alphaCaMKII stuðlar að næmingu á kókaínlaun. J Neurosci. 2012; 32: 6578 – 6586. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Hlutverk kjarnaþáttar kappaB í ofnæmis stressi af eggjastokkum hjá kvenmúsum. Líffræðileg geðlækningar. 2009; 65: 874 – 880. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Kókaín af völdum dendritic hryggmyndunar í D1 og D2 dópamínviðtaka sem innihalda miðlungs spiny taugafrumur í kjarna accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 – 3404. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Sameindargrundvöllur CaMKII virka í synaptic og hegðunarminni. Nat séraungur. 2002; 3: 175 – 190. [PubMed]
  31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Sértækt tap frumna á BDNF merkjum líkir eftir myndunarvaldi á kókaínlaun. Vísindi. 2010; 330: 385 – 390. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Hömlun á CaMKII í skel kjarna accumbens dregur úr aukinni inntöku amfetamíns í næmum rottum. Neurosci Lett. 2008; 444: 157 – 160. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Tímabundin yfirtjáning á alfa-Ca2 + / calmodulin-háð prótein kinase II í kjarna skálanna eykur hegðun viðbrögð við amfetamíni. J Neurosci. 2010; 30: 939 – 949. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  34. Malinow R, Malenka RC. AMPA viðtakamiðlun og synaptic plasticity. Annu séraður Neurosci. 2002; 25: 103 – 126. [PubMed]
  35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Uppbyggingargrundvöllur til langs tíma aukningar í stökum tindarhrygg. Náttúran. 2004; 429: 761 – 766. [PubMed]
  36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Stjórna minni myndun með stjórnaðri tjáningu á CaMKII transgeni. Vísindi. 1996; 274: 1678 – 1683. [PubMed]
  37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Nauðsynlegt hlutverk histónmetýltransferasa G9a í plasti af völdum kókaíns. Vísindi. 2010; 327: 213 – 216. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  38. McClung CA, Nestler EJ. Reglugerð um genatjáningu og kókaínlaun hjá CREB og DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 1215. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Endurskoðun. Yfirfærsluferli fíknar: hlutverk DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 3255. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Lyfjafræðilegar rannsóknir á stjórnun langvarandi FOS-tengdum mótefnavaka framköllun með kókaíni í striatum og nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671 – 1680. [PubMed]
  41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Hlutverk CaMKII og F-aktíns í burðarvirkni dendritískra hryggja: hugsanleg sameindaeinkenni samstillingarmerki? Lífeðlisfræði (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [PubMed]
  42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB í kjarnanum accumbens stjórnar matvæla styrktum hegðun og hvatningu. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
  43. Paxinos G, Watson C. Rottuheilinn í stereótaxískum hnitum. 6th útgáfa. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
  44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Örindanleg, sértæk tjáning á heila svæðinu af ríkjandi neikvæðum stökkbrigði af c-Jun hjá erfðabreyttum músum dregur úr næmi fyrir kókaíni. Brain Res. 2003; 970: 73 – 86. [PubMed]
  45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Samleit CaMK og RacGEF merki stjórna uppbyggingu og virkni dendritic. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405 – 413. [PubMed]
  46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Innleiðing deltaFosB í umbunartengdum heilauppbyggingum eftir langvarandi streitu. J Neurosci. 2004; 24: 10594 – 10602. [PubMed]
  47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Greinilegt mynstur DeltaFosB örvunar í heila með misnotkun lyfja. Synapse. 2008; 62: 358 – 369. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiology á ræktun lyfjaþrá. Þróun Neurosci. 2011; 34: 411 – 420. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Annað boðberi með kalsíum mótar svip á hegðun næmi fyrir kókaíni. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171 – 1176. [PubMed]
  50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Mannheilbrigðisviðtaka fyrir heila viðtaka með heilum heilahvelkafla: almenn aðferð sem lágmarkar vefjarminjar. Synapse. 1987; 1: 446 – 454. [PubMed]
  51. Robinson TE, Kolb B. Styrkleiki í tengslum við vímuefnaneyslu. Neuropharmacology. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
  52. Robison AJ, Nestler EJ. Transcriptional og epigenetic fíkn. Nat séraungur. 2011; 12: 623 – 637. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Fjölgildar milliverkanir kalsíum / calmodulin háðs próteinkínasa II við postsynaptic þéttleika próteina NR2B, densin-180 og alfa-actinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329 – 35336. [PubMed]
  54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Margfaldað magn próteina í Saccharomyces cerevisiae með því að nota amínviðbrögð ísóbalísk merkingarhvarfefni. Mólfrumuprótefni. 2004; 3: 1154 – 1169. [PubMed]
  55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. The hávaði synapse: kerfi synaptic og uppbyggingu plasticity í kjarnanum accumbens. Stefna Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  56. Sjálf DW. Í: Dópamínviðtökurnar. Neve KA, ritstjóri. New York: Humana Press; 2010. bls. 479 – 524.
  57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Tímabundin veirumiðuð ofþrýstingur á alfa-kalsíum / calmodulin háðri prótein kinase II í kjarna accumbens skeljarinnar leiðir til langvarandi virkrar uppbyggingar alfa-amínó-3-hydroxyl-5 -metýl-4-ísoxazólprópíónat viðtaka: dópamín gerð-1 viðtaki og prótein kínasa A háð. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243 – 1251. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Verkunarháttur og stjórnun á kalsíum / kalmodúlínháðu prótein kínasa II sem miðar að NR2B undireiningunni N-metýl-D-aspartat viðtakanum. J Biol Chem. 2000; 275: 23798 – 23806. [PubMed]
  59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosfórun á DeltaFosB miðlar stöðugleika þess in vivo. Taugavísindi. 2009; 158: 369 – 372. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  60. Ulery PG, Nestler EJ. Reglugerð um DeltaFosB umritunarvirkni með Ser27 fosfórýleringu. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 230. [PubMed]
  61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Reglugerð um DeltaFosB stöðugleika með fosfórýleringu. J Neurosci. 2006; 26: 5131 – 5142. [PubMed]
  62. Vialou V, o.fl. DeltaFosB í umbunarbrautum heila miðlar seiglu við streitu og svörun þunglyndislyfja. Nat Neurosci. 2010; 13: 745 – 752. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Langvinnt kókaín af völdum H3 asetýleringu og uppskriftar virkjun CaMKIIalpha í kjarna safnanna er mikilvægt fyrir hvatningu fyrir styrkingu lyfja. Neuropsychopharmology. 2010; 35: 913 – 928. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
  64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB stjórnar hjólahlaupi. J Neurosci. 2002; 22: 8133 – 8138. [PubMed]
  65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB örvun í heilaberki utan sporbrautar miðlar umburðarlyndi gagnvart vitrænu starfi vegna kókaíns. J Neurosci. 2007; 27: 10497 – 10507. [PubMed]
  66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Ómissandi hlutverk DeltaFosB í kjarnanum accumbens í morfín aðgerð. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
  67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Price EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Hömlun á calmodulin kinase II verndar gegn uppbyggingu hjartasjúkdóma. Nat Med. 2005; 11: 409 – 417. [PubMed]