Aukin virkni hýdrínháðrar kínasa 5 leiðir til dregið úr kókaín miðlaðri dópamínmerki (2005)

Proc Natl Acad Sci US A. 2005 febrúar 1; 102(5): 1737-1742.

Birt á netinu 2005 janúar 21. doi:  10.1073 / pnas.0409456102
PMCID: PMC547862
Neuroscience
Þessi grein hefur verið vitnað af Aðrar greinar í PMC.

Abstract

Kókaín, sem er misnotkunarlyf, eykur synaptísk dópamínmagn í striatum með því að hindra endurupptöku dópamíns við axon skautanna. Sýklínháð kínasa 5 (Cdk5) og virkjari þess p35, prótein sem taka þátt í fosfórýleringu hvarfefna í postmitótískum taugafrumum, hefur reynst vera uppstýrt eftir langvarandi útsetningu fyrir kókaíni. Til að skoða frekari áhrif Cdk5 og p35 örvunar á dópamín merkjastríði, myndum við tvær óháðar erfðabreyttar músalínur þar sem Cdk5 eða p35 var of tjáð sérstaklega í taugafrumum. Við greinum hér frá því að aukin virkni Cdk5, vegna p35 en ekki vegna ofdráttar á Cdk5, leiði til minnkunar á kókaín-miðluðu dópamín merkjasendingum. Aukin Cdk5-miðluð fosfórýlering af dópamíni og cAMP-stjórnuðu fosfópróteini, sameindamassa 32 kDa (DARPP-32) við Thr-75, fylgdi minni fosfórun DARPP-32 við Thr-34. Aukin Cdk5-miðluð fosfórýlering utanfrumu merkjastýrð kínasa kínasa 1 við Thr-286 fylgdi minni virkjun á utanfrumu merkisstýrðu kínasa 1 / 2. Þessi áhrif áttu þátt í að draga úr fosfórun kókaíns af völdum cAMP svörunarþáttabindandi próteins sem og til minni örvunar á c-fos í striatum. Þessar niðurstöður styðja hugmyndina um að virkni Cdk5 taki þátt í breyttri tjáningu gena eftir langvarandi útsetningu fyrir kókaíni og hefur því áhrif á langvarandi breytingar á taugafrumum sem liggja að baki kókaínfíkn.

Leitarorð: kókaínfíkn, fosfórun, striatum

Kókaín eykur synaptísk dópamínmagn í striatum og breytir genatjáningu í dópamínóviðtaka taugafrumum með því að virkja innanfrumuleiðir sem dreifa upphafsmerkinu frá dópamíni D1 viðtakanum í kjarnann (1). Langvarandi váhrif á uppkóka af kókaíni stjórna nokkrum uppskriftarþáttum, sem hafa í för með sér langvarandi breytingar á tjáningu gena sem talið er liggja að baki taugafræðilegum aðlögun í kókaínfíkn (2). ΔFosB, auðkenndur sem slíkur umritunarstuðull (3), hefur verið sýnt fram á að auka hegðunarsvörun dýra við kókaíni (4, 5). Þess vegna er gert ráð fyrir að auðkenning mark genanna sem stjórnast af ΔFosB örvun stuðli að meiri skilningi á sameindaaðgerðinni sem liggur að baki kókaínfíkn. Undanfarið hefur verið sýnt fram á að langvarandi meðferð á dýrum með kókaíni stýrir tjáningu sýklínháðs kínasa 5 (Cdk5) og virkjunar þess p35 í striatum með örvun ofFosB (6, 7).

Cdk5 er aðili að Cdk fjölskyldu serín / þreónín kínasa. Ólíkt öðrum geisladiskum sem eru helstu eftirlitsaðgerðir framvindu frumna, er Cdk5 aðallega þátttakandi í fosfórýleringu hvarfefna í postmitótískum taugafrumum. (8). Taugafræðileg sértæki Cdk5 virkni næst með því að tengjast virkjunum þess, annað hvort p35 eða p39, sem eru aðallega tjáð í postmitotic taugafrumum (8). Til viðbótar við meginhlutverk Cdk5 í heilaþróun (9, 10), it hefur einnig verið beitt við dópamínvirka smit í heila eftir fæðingu (11, 12). Hömlun á virkni Cdk5 leiðir til aukinnar losunar dópamíns í striatum, sem bendir til þess að Cdk5 hafi forstillta virkni sem neikvæð eftirlitsstofn losun dópamíns. (11). Ennfremur mótar Cdk5 verkun postsynaptískra dópamínmerkja með fosfórýleringu dópamín- og cAMP-stjórnaðs fosfópróteins, mólmassa 32 kDa (DARPP-32) við Thr-75, sem breytir DARPP-32 í háð kinam (PAM) (12).

Þessar athuganir benda til þess að Cdk5 og p35 séu eftirlitsstofnanir eftir langvarandi virkjun dópamínmerkja eftir langvarandi útsetningu fyrir kókaíni og þar með vegna kókaínfíknar. Til að fjalla frekar um hlutverk Cdk5 við striatal dópamín merkjagjaf, bjuggum við til tvær erfðabreyttar músalínur þar sem annað hvort Cdk5 eða p35 voru of tjáð sérstaklega í taugafrumum undir stjórn p35 verkefnisstjórans. Niðurstöður okkar bentu til þess að Cdk5 virkni væri stjórnað upp með auknu magni af p35 próteini en ekki Cdk5 próteini, sem bendir til þess að magn p35 próteins sé takmarkandi fyrir Cdk5 virkni. Við veitum hér in vivo vísbendingar um að aukin virkni Cdk5, sem afleiðing af ofstrengingu p35, leiði til veikingar á kókaín-miðluðu dópamínmerki við kjarnann með hindrun á PKA og utanfrumuvökva (ERK) kípósum.

Efni og aðferðir

Mótefni. Polyclonal mótefni gegn Cdk5 (C-8) og p35 (C-19) voru keypt frá Santa Cruz líftækni. Fosfórunarháð og og óháð mótefni gegn ERK kínasa (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 og cAMP-svörunarþáttbindandi prótein (CREB) voru fengin frá Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Mótefnin gegn fosfó-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfó-Thr-75 DARPP-32 (12), samtals DARPP-32 (12) og c-fos (14) voru notuð eins og lýst er. Mótefni gegn aktíni var keypt af Sigma.

Tilraunadýr. Við klónuðum áðan músin p35 gen Cdk5r1, sem kóðar p35 prótein, og einkenndi erfðauppbyggingu þess (15). Til að búa til erfðabreyttu músina með ofákveðni í taugafrumum á p35 (Tgp35), er 6-kb EcoRI-EcoRI brot sem innihélt 1.2-kb kynningar svæðið var undirklónað í pGEM9Z (-) plasmíð, og 45-bp merki úr SV40 var sett í KpnÉg set niður fyrir poly (A+) merki (Fig. 1A). Merkið innihélt a speÉg er til staðar fyrir arfgerðir á dýrunum. 6-kb brotið var skorið úr plasmíðinu og hreinsað, fylgt eftir með framkjarna innspýtingu á transgeninu til að búa til erfðabreyttu mýsnar. Til að skoða tjáningarsnið á transgeninu undir stjórnun 1.2-kb p35 verkefnisstjórans in vivo, tvöföld erfðafræðileg mús (Tgp35; p35 - / -) var frekar mynduð með því að nota tveggja þrepa ræktunarstefnu þar sem Tgp35 músin var endurnýjuð í innrænum p35-núllgrunni. Önnur músamódel sem notuð voru í þessari rannsókn voru p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/–, og erfðabreytt mús með taugafrumusofsýni af Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Arfgerðir þessara músa voru ákvarðaðar með því að framkvæma annað hvort Southern blot greiningu eða PCR á erfðafræðilegu DNA sem voru einangruð úr halasýni. Mýs voru hýstar undir 12-klst ljós / 12-h dimma hringrás. Öll umönnun var gefin í samræmi við leiðbeiningar National Institute of Health um umönnun og notkun rannsóknarstofu og tilraunadýra.

Fig. 1.  

Myndun meðfæddra músa með ofákveðni í taugafrumum á p35 undir stjórn p35 verkefnisstjórans (Tgp35). (A) Transgen smíðið er sýnt með skýringarmyndum villtra gerða og markvissra p35 samsætna. Rauðir strikar benda til rannsóknarinnar sem notaður var við arfgerð. ...

Suðurblettagreining. Erfðafræðilegt DNA sem unnið var úr lífríki í hala var melt með EcoRI og speÉg rafskautaði á 0.9% agarósagel og flutti yfir á nylonhimnu. Himnan var blönduð með slembiröðun 32P-merkt rannsaka við 42 ° C yfir nótt. 485-bp rannsakinn til arfgerðar á p35 rothöggi (p35 - / -) og Tgp35 músum var myndaður með PCR með því að nota eftirfarandi grunnara: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ og 5′-CCACTGTAAAAGN. Blönduðu himnan var þvegin tvisvar sinnum í 3 × SSC / 2% SDS við 0.1 ° C í 42 mín., Og tvisvar í 10 × SSC / 0.1% SDS við 0.1 ° C í 65 mín., Og útsett fyrir röntgenmynd.

Lyfjameðferð. Kókaín (Sigma) var leyst upp í sæfðu saltvatni. Dýrum var ip-sprautað með kókaíni (15 mg / kg) eða jafn miklu magni af salti á aldrinum 3 mánuðum og drepið við höfnun á mismunandi tímapunktum (15, 30, 60 og 120 mín) eftir inndælinguna. Gáfur voru fljótt fjarlægðir og kældir í ísköldu PBS. Strípurnar voru síðan krufnar út og þær látnar greina Northern eða Western blot. Fyrir ónæmisgeðrofsefnafræðilega greiningu voru strídaleikir fengnir úr músum 2 h eftir inndælinguna.

Norðurblettagreining. Heildar RNA var dregið út úr striata með TRIzol hvarfefni (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) og látið í ljós Northern blot greining eins og lýst er (18). Til að greina c-fos mRNA var 189-bp brot af c-fos cDNA músar notað sem rannsaka eins og lýst er (19). Stig c-fos mRNA voru magngreind með því að mæla ljósþéttni sértæku hljómsveitarinnar með því að nota myndgreiningarkerfi með nih myndhugbúnaði, útgáfu 1.62.

Vesturblettagreining. Striatal vefir voru hljóðbeinaðir í 1% SDS og soðnir í 10 mín. Próteinstyrkur í hverju sýni var ákvarðaður með BCA próteingreiningu (Pierce). Jafnt magn af próteini var aðskilið með SDS / PAGE áður en það var flutt á nitrocellulose himnu. Himnurnar voru læstar í 1 × PBS sem innihélt 5% undanrennu og 0.05% Tween 20 og var ræktað með aðal mótefnum yfir nótt við 4 ° C. Ræktun með peroxidasatengdu and-mús eða kanínu IgG (Sigma) var framkvæmd við stofuhita í 60 mín. Merki greindist með aukinni kemiluminescence (Pierce) og sjónþéttleiki hljómsveitarinnar var magngreindur eins og lýst er hér að ofan.

Cdk5 Kinase greining. Striatal lysata voru framleidd með ljósblásara sem samanstóð af 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenýlmetýlsúlfónýl flúorín / Xml / X ml ml leupeptín / fosfatasahemlar (fosfatasahemlar blanda I og II, Sigma). Lýsötin voru ónæmisfrömuð með annað hvort and-Cdk1 (C-1) eða and-p5 (C-8) mótefni. Cdk35 ónæmisfrumnafæðin voru framleidd með ræktun á 19 μl af lysatinu (sem samsvarar 5 μg af próteini) með and-Cdk300 mótefni (300 μg) yfir nótt við 5 ° C og síðan frekari ræktun með 3 μl af próteini A-agarós % slurry í ljósabuffunni; Santa Cruz líftækni) fyrir 4 h við 25 ° C. Til að framleiða p50 ónæmisfrumnafjölda var 3 μl af lysatinu (samsvarandi 4 mg af próteini) ræktað með and-p35 mótefni (500 μg) eins og lýst er hér að ofan. Ónæmisfrumnafæðin voru þvegin tvisvar með lýsisstuðpúða og tvisvar með kínasabuffi sem samanstóð af 1 mM Tris · HCI, pH 35 / 3 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, blandað aftur í 60 μl af kínasa stuðpúðanum. Kínasa virkni var mæld með því að nota histón H1 sem hvarfefni (18).

Ónæmissjúkdómafræði. Mýs voru svæfðar með ip sprautum af avertíni (250 mg / kg, Fluka) og blandaðar með hjartadrepi með 0.1 M natríumfosfatjafnalausn, pH 7.4, fylgt eftir með Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), sem hefur ekki þverbindandi fixative. Aðskildir gáfur voru enn frekar festir í sömu lagfæringarfræðinni yfir nótt við 37 ° C. Síðan voru gáfur felld inn í parafíni, skorin í 5-μm þykka kransæðahluta og látin verða undir ónæmisheilbrigðafræði með því að nota avidin-biotin-peroxidase flókin tækni (Vector Laboratories) með diaminobenzidini sem hvarfefni. Þættirnir voru ræktaðir með sækni-hreinsaðri fjölheilbrigðismótefni gegn c-fos yfir nótt við 4 ° C. Sértæk litun var metin með því að sleppa aðal mótefninu.

Niðurstöður

Kynslóð af erfðabreyttum músum með taugafrumukvilla á p35. Transgenið sem notað var til að ná fram aukinni taugatjáningu p35 samanstóð af 6-kb broti af klónuðu músinni p35 geninu sem innihélt 1.2-kb próteininn og alla kóðunarröð p35 (Fig. 1 A). Arfgerðir músanna voru ákvörðuð með Southern blot greiningu með því að nota rannsaka sem var hönnuð til að greina p35 - / - og Tgp35 mýs frá villum tegundum músa (Fig. 1 A og B). Til að skoða transgene tjáninguna undir stjórn 1.2-kb p35 kynningarinnar, myndum við tvöfalda erfðabreyttar mýs (Tgp35; p35 - / -) þar sem p35 tjáningu var eingöngu ekið frá transgeninu. P35 tjáningin í Tgp35; p35 - / - músum kom aðeins fram í heila (Fig. 1C), þar sem staðbundna tjáningarmynstrið var svipað og hjá villtum tegundum músa (Fig. 1D). Sýnt hefur verið fram á að skortur á p35 hefur í för með sér óeðlilegt lagskipulag í heila- og heilaberki músa (10). Samt sem áður, Tgp35; p35 - / - músin sýndu fullkomna björgun á p35 - / - heila svipgerð (Fig. 1E). Þessar upplýsingar bentu til þess að 1.2-kb p35 kynningarstjórinn stjórnaði tjáningu transgensins með svipaðri tjáningarsnið og p35 frá innrænu p35 geninu.

Prótínstigið p35 er takmarkandi fyrir upp reglugerð Cdk5 virkni. Við skoðuðum áhrif skammta gena sem kóðu p35 og Cdk5 á tjáningu próteina í stríði útdrætti úr p35 - / -, p35 +/–, villigerð, Tgp35, Cdk5 +/– og TgCdk5 músum á aldrinum XNUM. Stig p3 og Cdk35 próteins tengdust vel genaskammtunum, hvort um sig (Fig. 2 A og B). Tgp35 mýs sýndu ≈1.6 sinnum aukningu á p35 próteinmagni samanborið við villtar tegundir músa en Cdk5 próteinmagn var ekki fyrir áhrifum af mismunandi stigum p35 próteins. TgCdk5 mýs sýndu ≈1.9 sinnum aukningu á Cdk5 próteinmagni samanborið við villtar tegundir músa en p35 próteinmagn var ekki fyrir áhrifum af mismunandi stigum Cdk5 próteins. Til að kanna áhrif mismunandi magns af p35 próteini á virkni Cdk5 var Cdk5 ónæmisframsogað úr stríði útdrætti með and-Cdk5 mótefni og kínasa virkni var mæld. Sömuleiðis, til að kanna áhrif mismunandi magns af Cdk5 próteini á virkni kínasa, var p35 ónæmisframsýnt frá striatal útdrætti með and-p35 mótefni og kínasa virkni var mæld. Cdk5 virkni samsvaraði vel stigi p35 próteins en ekki við stig Cdk5 próteins (Fig. 2 C og D). Þessar niðurstöður bentu til þess að magn p35 próteins er takmarkandi þáttur fyrir virkni Cdk5. Við notuðum því Tgp35 mýs til að kanna áhrif aukinnar virkni Cdk5 á stafratal dópamín merkjasendingar.

Fig. 2.  

Uppstýring á virkni Cdk5 er takmörkuð við p35 próteinmagn. (A) Vesturblettir sem sýna að próteinmagn p35 og Cdk5 samsvarar genaskömmtum p35 og Cdk5 genanna, hvort um sig. (B) Hlutfallslegt magn af p35 eða Cdk5 próteini ...

Kókaín-framkallað fosfórýlering af DARPP-32 við Thr-34 er dregið úr í Tgp35 músum. Virkni DARPP-32 fer eftir fosfórýleringarástandi þess á mörgum stöðum (20). PKA fosfórýlat DARPP-32 við Thr-34 en Cdk5 fosfórýlat DARPP-32 við Thr-75. Þannig skoðuðum við fosfórýleringarástand DARPP-32 í frægum útdrætti úr villtum tegundum og Tgp35 músum. Magn fosfó-Thr-75 DARPP-32 var hærra hjá Tgp35 músum (Fig. 3A; 1.6 ± 0.2-falt yfir gildi villtra tegunda músa). Næst metum við áhrif aukinnar Cdk5 virkni á dópamín merkjasendingar. Við skoðuðum KKA-örvaða PKA örvun í Tgp35 músum með því að greina fosfórýleringarástand DARPP-32 við Thr-34. Magn fosfó-Thr-34 DARPP-32 var aukið í villtum tegundum músa 15 mín. Eftir kókaíninnspýtingu (Fig. 3B; 1.8 ± 0.2-falt yfir grunn stigi). Hins vegar voru áhrif kókaíns á Thr-34 fosfórýleringu DARPP-32 minnkuð í Tgp35 músum (1.2 ± 0.3-falt yfir grunnþéttni). Þessar niðurstöður bentu til þess að aukning á virkni Cdk5 hafi dregið úr virkni PKA af völdum kókaíns, sennilega í gegnum DARPP-32 fosfórýleringu við Thr-75 (6, 12). Einnig er hugsanlegt að aukning á virkni Cdk5 fyrirfram hafi orðið til þess að losa dópamín og að það stuðli að minni áhrifum kókaíns. Sérstaklega hafði ein innspýting af kókaíni ekki áhrif á magn p35 og Cdk5 próteins svo og virkni kínasa (Fig. 3 C og D). Þetta er öfugt við fyrri rannsókn þar sem sýnt hefur verið fram á að langvarandi útsetning fyrir kókaíni stýrir tjáningu p35 og Cdk5 (6).

Fig. 3.  

Uppstýring á virkni Cdk5 eykur stig fosfó-Thr-75 DARPP-32 og dregur úr virkni PKA af völdum kókaíns. (A) Ónæmiskerfi sem sýndi aukna fosfórýleringu á DARPP-32 við Thr-75 (P-D32 Thr-75) í striatal útdrætti úr Tgp35 músum. Í ...

Uppstýring á virkni Cdk5 dregur úr virkjun kókaíns af völdum ERK1 / 2. Nýlegar vísbendingar benda til þess að virkjun dópamínviðtaka í striatum virkji einnig aðrar merkjasendingar, þar með talið ERK leið (21, 22), sem hefur mikilvægt hlutverk í hegðunarviðbrögðum við kókaíni (23). Við könnuðum því hvort virkni Cdk5 gæti haft áhrif á örvun kókaíns af völdum ERK ferilsins. Virkjun ERK ferilsins kom fram eftir inndælingu kókaíns í stríði útdrætti úr villtum tegundum músa, eins og augljóst var af aukinni fosfórýleringu MEK1 / 2 við Ser-217 og Ser-221 (1.5 ± 0.2-falt yfir grunnstiginu) og ERK1 / 2 við Thr-202 og Tyr-204 (ERK2 fosfórun: 1.5 ± 0.2-falt yfir grunnstiginu) (Fig. 4 A og B). Samt sem áður var örvun kókaíns af völdum MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-falt yfir grunnstiginu) og ERK1 / 2 (ERK2 fosfórýlering: 1.2 ± 0.2-falt yfir grunnstiginu) mýkt í Tgp35 mice (Fig. 4 A og B). Ennfremur voru grunnþéttni fosfó-ERK1 / 2 lægri í Tgp35 músum (0.8 ± 0.2-falt undir gildi villtra tegunda músa) en þessi þróun var ekki tölfræðilega marktæk. Þessari síðarnefndu niðurstöðu mætti ​​rekja til Cdk5 háðs fosfórýleringu MEK1 við Thr-286, sem leiddi til minnkunar hvatavirkni (24). Til að meta þennan möguleika skoðuðum við fosfórýleringarástand MEK1 við Thr-286 og komumst að því að hærra magn fosfó-Thr-286 MEK1 var til staðar í stríði útdrætti úr Tgp35 músum (Fig. 4C; 1.3 ± 0.1-falt yfir gildi villtra tegunda músa). Ennfremur var fosfórunarástandi MEK1 við Thr-286 ekki breytt með einni inndælingu af kókaíni, í samræmi við þá niðurstöðu að Cdk5 virkni hafi ekki haft áhrif á meðferðina (Fig. 3D).

Fig. 4.  

Cdk5-miðluð hömlun á MEK1 / 2 leiðir til veikingar á örvun kókaíns af völdum ERK1 / 2. Striatal útdrætti voru framleidd úr villtum tegundum (WT) og Tgp35 músum 15 mín. Eftir inndælingu á annað hvort kókaíni eða saltvatni og voru settir í ónæmisblöðru ...

Fjölgun dópamínmerkja til kjarnans er aukin með aukinni virkni Cdk5. Kókaín örvun örvunar margra merkjaslóða þar sem PKA og ERK leiða til síðari virkjunar á umritunarstuðli CREB í kjarnanum með fosfórýleringu hans í Ser-133 (22, 25). Til að kanna hvort Cdk5-miðluð hamlandi áhrif á PKA og ERK örvunarhylki geta fallið saman á CREB fosfórýleringu í kjarna, skoðuðum við fosfórýlunarástand CREB við Ser-133 í stríði útdrætti úr villtum tegundum og Tgp35 músum. Grunnstyrkur fosfó-CREB var lægri í Tgp35 músum (0.7 ± 0.1-falt af gildi villtra tegunda músa) (Fig. 5). Sem svar við inndælingu á kókaíni var magn fosfó-CREB aukið í striatum villtra tegunda músa (1.5 ± 0.1-falt yfir grunnstiginu), en þetta svar við kókaíni var dregið úr í Tgp35 músum (1.2 ± 0.1- brjóta yfir grunnstigið) (Fig. 5).

Fig. 5.  

Uppstýring á virkni Cdk5 leiðir til minnkaðs fosfórýleringu CREB við Ser-133 hjá músum með inndælingu á annað hvort salti eða kókaíni. Striatal útdrætti voru framleidd úr villtum tegundum (WT) og Tgp35 músum 30 mín eftir inndælingu og voru settir í ónæmisblöðru ...

Fosfórýlering á CREB við Ser-133 eykur umritunarvirkni þess með cAMP svörunarþætti á efla svæðinu ákveðinna gena, þar á meðal c-fos gensins (26). Við könnuðum því framköllun c-fos í striatum villtum tegundum og Tgp35 músum eftir kókaínsprautun. Hjá villtum tegundum músa jókst stig c-fos mRNA í hámarksgildi (1.8 ± 0.2-falt yfir grunnstiginu) 30 mín. Eftir inndælingu af kókaíni og síðan aftur í grunnstig um 120 mín. Eftir inndælingu (Fig. 6 A og B). Samt sem áður var magn c-fos mRNA ≈30% lægra í Tgp35 músum en hjá villtum tegundum músum þar til 30 mín. Eftir inndælingu (Fig. 6 A og B). Minni framköllun c-fos í Tgp35 músum var staðfest með frekari ónæmisviðbrögðum (Fig. 6 C-F). Kókaíngjöf jók ónæmisviðbragð c-fos, sterklega í dorsomedial – dorsocentral hlutum striatum og veikt í hliðarhlutum, bæði í villtum tegundum og Tgp35 músum. Hins vegar var aukning á kókaíni af völdum c-fos ónæmissæmisfrumna sérstaklega dregin úr í striatum Tgp35 músa (Fig. 6G). Saman bentu þessar niðurstöður til þess að kókaín-miðluð aukning á dópamín merkjasendingum til kjarnans var hindruð í Tgp35 músum, líklega afleiðing af aukinni virkni Cdk5.

Fig. 6.  

Uppstýring á virkni Cdk5 hefur í för með sér lækkun á tjáningu c-fos frá stríði og minni örvun eftir gjöf kókaíns. (A) Northern blot sem sýnir tímabraut c-fos örvunar í villtum tegundum (WT) og Tgp35 (Tg) músum eftir kókaíninnspýtingu. ...

Discussion

Cdk5 og virkjari þess p35 hafa verið skilgreind sem markgen sem eru stjórnað upp með langvarandi útsetningu fyrir kókaíni (6). Við greinum hér frá vísbendingum um að aukin virkni Cdk5, vegna p35 upp reglugerðar frekar en Cdk5 upp reglugerðar, leiði til lækkunar á kókaínstýrðu dópamín merkjasendingum í taugafrumum. Til að kanna afleiðingar uppstýrðrar tjáningar annaðhvort Cdk5 eða p35 á striatal dópamín merkjasendingum voru tvær erfðabreyttar músalínur, TgCdk5 og Tgp35 mýs, greindar. Við fundum að Cdk5 virkni var uppstýrt í hlutfalli við aukið magn af p35 próteini en var ekki fyrir áhrifum af auknu stigi Cdk5 próteins. Fyrri skýrsla okkar hefur einnig sýnt fram á að virkni Cdk5 í TgCdk5 músarheilanum var minni en í músarheilum af villigerð þegar virkni var mæld með því að nota Cdk5 ónæmisfrumur (17), sem bendir til þess að ofdráttur Cdk5 leiði til aukins stigs einliða Cdk5 ef p35 stigið er ekki aukið. Þessar niðurstöður bentu til þess að magn p35 próteins er takmarkandi þáttur fyrir virkni Cdk5.

Tgp35 mýs sýndu minni hvata á bæði CREB fosfórýleringu og c-fos í striatum eftir bráða inndælingu á kókaíni, sem benti til þess að svörun við kókaíni hafi verið hindruð með aukinni virkni Cdk5. Dreifing kókaínstýrðra dópamínmerkja í Tgp35 músum var líklega náð með Cdk5-miðluðu hömlun á fjölmörgum merkjasiglingum sem innihéldu DARPP-32, PKA og ERK. Kókaíngjöf jók PKA fosfórýleringu DARPP-32 við Thr-34 hjá villtum tegundum músa, en þetta svar var dregið úr í Tgp35 músum. Sýnt hefur verið fram á að PKA fosfórun DARPP-32 við Thr-34 hindrar virkni próteinsfosfatasa 1 (PP1), ensímið sem ber ábyrgð á affosfórun Ser-133 í CREB (27). Þannig væri PP1 virkni ekki mótvægi með DARPP-32 / PP1 ferli í Tgp35 músum.

Virkjun af völdum kókaíns af völdum ERK1 / 2 var einnig dregin úr í Tgp35 músum. Það eru nokkrir aðgreindir aðferðir sem Cdk5 gæti hindrað virkjun á kókaíni af völdum ERK1 / 2. Í fyrsta lagi gæti Cdk5 háð fosfórýlering DARPP-32 við Thr-75 hamlað PKA, sem leitt til síðari hömlunar á PKA-miðluðu MEK1 / 2 örvun sem þarf til ERK1 / 2 örvunar. Nýleg rannsókn hefur einnig komist að því að fosfórýlering DARPP-32 við Thr-34 er nauðsynleg til að virkja ERK1 / 2 með kókaín-miðluðu virkni með mörgum leiðum sem fela í sér óbeina stjórnun á MEK örvun sem og fela í sér stjórnun á striatal-auðgaðum fosfatasa, týrósíni fosfatasa sem virkar beint á ERK1 / 2 (28). Stuðningur við þennan möguleika er sýndur með því að finna að kókaín af völdum fosfórýleringu af MEK1 / 2 við Ser-217 og Ser-221 var afnumið í Tgp35 músum. Önnur líkleg leið er í gegnum Cdk5 háð fosfórýleringu MEK1 við Thr-286, sem myndi leiða til minnkunar hvatavirkni þess og leiða til hömlunar á virkni ERK1 / 2 (24).

Sýnt hefur verið fram á að hömlun á virkni Cdk5 í striatum styrkir hegðunaráhrif langvarandi kókaínmeðferðar hjá dýrum (6). Í samræmi við tilgátuna um að uppstýring á virkni Cdk5 geti stuðlað að aðlögun taugafrumna til að vinna gegn áhrifum endurtekinnar gjafar kókaíns (6), komumst við að því að Cdk5-miðluð fosfórýlering DARPP-32 og MEK1 stuðlaði að því að draga úr örvun kókaíns af völdum ERK1 / 2, sem leiddi til minni örvunar á CREB fosfórýleringu og c-fos í striatum. Niðurstöður okkar styðja þá hugmynd að aukin virkni Cdk5, vegna uppbótarreglugerðar p35, geti breytt genatjáningu í striatum eftir langvarandi útsetningu fyrir kókaíni. Þetta getur komið fram með breytingum á starfsemi umritunarþátta eins og CREB og c-fos. Þannig getur Cdk5 virkjarinn p35, í krafti hraðatakmarkandi áhrifa á virkni Cdk5, stuðlað að langvarandi breytingum á taugafrumum sem liggja til grundvallar kókaínfíkn.

Acknowledgments

Við þökkum dr. Mary Jo Danton, Philip Grant og Sashi Kesavapany fyrir gagnrýna lestur handritsins. Þessi vinna var studd af National Institutes of Health Grant Z01DE00664-05 (til ABK), bandarísku opinberu heilbrigðisþjónustustyrkjunnar DA10044, og styrkir frá Simons Foundation, Peter J. Sharp stofnuninni og Picower Foundation (til PG).

Skýringar

Skammstafanir: Cdk5, hjólreiðaháð kinase 5; ERK, utanfrumu merkisstýrð kínasa; DARPP-32, dópamín og cAMP-stjórnað fosfóprótein, mólmassi 32 kDa; PKA, cAMP háð kinase; MEK, ERK kinase; CREB, cAMP-svar þáttar-bindandi prótein.

Meðmæli

1. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, SE & Nestler, EJ (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 89, 5764 – 5768. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
2. Nestler, EJ, Hope, BT & Widnell, KL (1993) Neuron 11, 995 – 1006. [PubMed]
3. Hope, BT, Nye, HE, Kelz, MB, Self, DW, Iadarola, MJ, Nakabeppu, Y., Duman, RS & Nestler, EJ (1994) Neuron 13, 1235 – 1244. [PubMed]
4. Kelz, MB, Chen, J., Carlezon, WA, Jr., Whisler, K., Gilden, L., Beckmann, AM, Steffen, C., Zhang, YJ, Marotti, L., Self, DW, et al. (1999) Náttúra 401, 272 – 276. [PubMed]
5. McClung, CA & Nestler, EJ (2003) Nat. Neurosci. 6, 1208 – 1215. [PubMed]
6. Bibb, JA, Chen, J., Taylor, JR, Svenningsson, P., Nishi, A., Snyder, GL, Yan, Z., Sagawa, ZK, Ouimet, CC, Nairn, AC, et al. (2001) Náttúra 410, 376 – 380. [PubMed]
7. Chen, J., Zhang, Y., Kelz, MB, Steffen, C., Ang, ES, Zeng, L. & Nestler, EJ (2000) J. Neurosci. 20, 8965 – 8971. [PubMed]
8. Dhavan, R. & Tsai, LH (2001) Nat. Séra Mol. Hólf. Biol. 2, 749 – 759. [PubMed]
9. Ohshima, T., Ward, JM, Huh, CG, Longenecker, G., Veeranna, Pant, HC, Brady, RO, Martin, LJ & Kulkarni, AB (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 93, 11173 – 11178. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
10. Chae, T., Kwon, YT, Bronson, R., Dikkes, P., Li, E. & Tsai, LH (1997) Neuron 18, 29 – 42. [PubMed]
11. Chergui, K., Svenningsson, P. & Greengard, P. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2191 – 2196. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
12. Bibb, JA, Snyder, GL, Nishi, A., Yan, Z., Meijer, L., Fienberg, AA, Tsai, LH, Kwon, YT, Girault, JA, Czernik, AJ, et al. (1999) Náttúra 402, 669 – 671. [PubMed]
13. Snyder, GL, Girault, JA, Chen, JY, Czernik, AJ, Kebabian, JW, Nathanson, JA & Greengard, P. (1992) J. Neurosci. 12, 3071 – 3083. [PubMed]
14. Young, ST, Porrino, LJ & Iadarola, MJ (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88. Bandaríkin, 1291 – 1295. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
15. Ohshima, T., Kozak, CA, Nagle, JW, Pant, HC, Brady, RO & Kulkarni, AB (1996) Genomics 35, 372 – 375. [PubMed]
16. Ohshima, T., Ogawa, M., Veeranna, Hirasawa, M., Longenecker, G., Ishiguro, K., Pant, HC, Brady, RO, Kulkarni, AB & Mikoshiba, K. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 98, 2764 – 2769. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
17. Tanaka, T., Veeranna, Ohshima, T., Rajan, P., Amin, ND, Cho, A., Sreenath, T., Pant, HC, Brady, RO & Kulkarni, AB (2001) J. Neurosci . 21, 550 – 558. [PubMed]
18. Takahashi, S., Saito, T., Hisanaga, S., Pant, HC & Kulkarni, AB (2003) J. Biol. Chem. 278, 10506 – 10515. [PubMed]
19. Grimm, C., Wenzel, A., Hafezi, F. & Reme, CE (2000) Mol. Vis. 6, 252 – 260. [PubMed]
20. Nairn, AC, Svenningsson, P., Nishi, A., Fisone, G., Girault, JA & Greengard, P. (2004) Neuropharmacology 47, 14 – 23. [PubMed]
21. Nestler, EJ (2001) Nat. Séra Neurosci. 2, 119 – 128. [PubMed]
22. Zanassi, P., Paolillo, M., Feliciello, A., Avvedimento, EV, Gallo, V. & Schinelli, S. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11487 – 11495. [PubMed]
23. Valjent, E., Corvol, JC, Pages, C., Besson, MJ, Maldonado, R. & Caboche, J. (2000) J. Neurosci. 20, 8701 – 8709. [PubMed]
24. Sharma, P., Veeranna, Sharma, M., Amin, ND, Sihag, RK, Grant, P., Ahn, N., Kulkarni, AB & Pant, HC (2002) J. Biol. Chem. 277, 528 – 534. [PubMed]
25. Hyman, SE, Cole, RL, Konradi, C. & Kosofsky, BE (1995) Chem. Skynfæri 20, 257 – 260. [PubMed]
26. Dash, PK, Karl, KA, Colicos, MA, Prywes, R. & Kandel, ER (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88. Bandaríkin, 5061 – 5065. [PMC ókeypis grein] [PubMed]
27. Greengard, P., Allen, PB & Nairn, AC (1999) Neuron 23, 435 – 447. [PubMed]
28. Valjent, E., Pascoli, V., Svenningsson, P., Paul, S., Enslen, H., Corvol, JC, Stipanovich, A., Caboche, J., Lombroso, P., Nairn, AC, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 103, 491-496.