Cdk5 fosfórýlöt dópamín D2 viðtaka og dregur úr niðurstreymismerkjum (2013)

Athugasemdir: Virðist til að sýna að Cdk5 valdi niðurfærslu Dopamine D2 viðtaka. Ótrúlega, þýðingar þáttur deltafosb örvar framleiðslu á Cdk5.


Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, o.fl. (2013) PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Abstract

Dopamín D2 viðtakinn (DRD2) er lykilviðtaka sem miðlar dópamínstengdum heilaaðgerðum eins og skapi, umbun og tilfinningum. Hýklínháð kínasa 5 (Cdk5) er prólínstýrð serín / þreónín kínasi sem hefur verið lögð áhersla á heila umbunarbrautina. Í þessari rannsókn, leiddum við í ljós að serine 321 leifar (S321) í þriðju innanfrumu lykkjunni á DRD2 (D2i3) er ný sköpunarsíða Cdk5. Cdk5 háð fosfórýleringu S321 í D2i3 kom fram í vitro og frumuræktarkerfi.

Við komumst að því að fosfórun S321 dregur úr örvandi örvandi yfirborði tjáningu DRD2 og minnkað G prótein tengingu við DRD2. Þar að auki var niðurstaðan cAMP ferli fyrir áhrifum á heterologous kerfi og í frumumæxlismyndunum frá p35 knockout fósturvísi sem líklega stafar af minni hemlandi virkni DRD2. Þessar niðurstöður benda til þess að Cdk5-miðlað fosfórýlering á S321 hamlar DRD2 virkni og veitir skýringarmynd fyrir dopamínmerki.

tölur

Tilvitnun: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, o.fl. (2013) Cdk5 fosfórýlöt dópamín D2 viðtaka og dregur úr niðurstreymismerkjum. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Ritstjóri: James Porter, University of North Dakota, Bandaríkin

Móttekið: Maí 20, 2013; Samþykkt: Nóvember 14, 2013; Útgáfuár: Desember 31, 2013

Höfundaréttur: © 2013 Jeong o.fl. Þetta er opið aðgangs grein sem er dreift samkvæmt skilmálum þess Creative Commons Attribution License, sem leyfir ótakmarkaða notkun, dreifingu og æxlun á hvaða miðli sem er, að því tilskildu að upphaflegir höfundar og heimildir séu lögð fram.

Fjármögnun: Þetta verkefni var styrkt af styrkjum (NRF-2012R1A2A2A01012923 og NRF-2012R1A4A1028200) frá kóreska ríkisstjórninni (MSIP) og einnig studd undir ramma alþjóðlegu samstarfsáætlunarinnar sem stýrt er af NRF í Kóreu (2012K2A1A2033117) og Kóreuheilbrigðisrannsóknarstofnuninni (KBRI) Grunnrannsóknaráætlun MSIP (2031-415). SKP var viðtakandi 2004 og 2006 National Alliance fyrir rannsóknir á geðklofa og þunglyndi (NARSAD) Young Investigator Awards. Fjármögnunaraðilarnir höfðu ekkert hlutverk í rannsóknarhönnun, gagnasöfnun og greiningu, ákvörðun um að birta eða undirbúa handritið.

Samkeppnis hagsmunir: Höfundarnir hafa lýst því yfir að engar hagsmunir séu til staðar.

Hvernig gengur lífið dag frá degi? Er það í jafnvægi og allt eins og það á að vera? Er jafnvægi hvort sem litið er á veraldlega stöðu eða andlega? Lífið er eins og það er. Það er ekki alltaf sólskyn. Það koma reglulega lægðir með rok og rigningu. Við vitum að í heildar samhenginu er lægð hluti af vistkerfi að leita að jafnvægi. Stundum erum við stödd í miðju lægðarinnar. Þar er logn og gott veður, sama hvað gengur á þar sem stormurinn er mestur. Sama lögmál gildir varðandi þitt eigið líf. Ef þú ert í þinn miðju, þínum sannleik þá heldur þú alltaf jafnvægi átakalaust. Sama hvað gustar mikið frá þér þegar þú lætur til þín taka. Huldufólk hefur gefið okkur hugleiðslu sem hjálpar okkur að finna þessa miðju, finna kjarna okkar og sannleikann sem í honum býr. Þegar þú veist hver þú ert og hvers vegna þú ert hér, mun líf þitt vera í flæðandi jafnvægi. Hugleiðslan virkjar þekkinguna sem er í vitund jarðar og færir hana með lífsorkunni inn í líkama okkar. Þar skoðar hún hugsana og hegðunar munstrið og athugar hvort það myndar átakalausu flæðandi jafnvægi. Hinn möguleikinn er falskt jafnvægi sem hafa þarf fyrir að viðhalda með tilheyrandi striti, áhyggjum og ótta. Síðan leiðbeinir þessi þekking okkur að því jafnvægi sem er okkur eðlilegt. Við blómstrum átakalaust, líkt og planta sem vex átakalaut frá fræi í fullþroska plöntu sem ber ávöxt.

Dópamínmerki tekur þátt í ýmsum heilastarfsemi, þar á meðal mótor samhæfingu, andrúmslofti og umbunarkerfi [1]. Stór hluti af dópamínsmerkingu hjá hryggleysingjum er beitt af striatala miðlungs spiny neurons (MSNs) sem velja sértækt undirhóp dópamínviðtaka og fá dopamínvirka inntak aðallega frá ventral tegmental area (VTA) og substantia nigra (SN) [2]. Dópamínviðtökur eru G prótein tengdar viðtökur (GPCR) með sjö frumum um miðtaugakerfi og samanstanda af tveimur undirhópum, D1-eins og D2-eins og viðtökur, sem miðla gagnkvæmum aðgerðum við dopamínviðvörun [1]. Til dæmis virkja dópamín D1-eins viðtaka (D1, D5) adenýlyl hringrás gegnum Gαs og aukið innanfrumuþéttni cAMP, en dópamín D2-eins viðtaka (D2, D3, D4) hamla adenýlyl hringrás gegnum Gαi og minnka innanfrumu stig cAMP [1], [3].

Meðal dópamínviðtaka er D2 viðtaka (DRD2) þátt í sjúkdómsgreiningu margra meiriháttar geðrænna sjúkdóma þ.mt geðklofa og fíkniefni [4], svo að mörg geðrofslyf séu að minnsta kosti að hluta til miðuð við DRD2. Það er einnig vitað að DRD2 virkni tengist vel með hegðunarvandamálum af völdum misnotkunar í dýraformum [5]. Þunglyndislyf og verkun á jafnvægisvirkni hefur einnig verið tengd breytingum á frumuyfirborðsþrýstingi DRD2 eða niðurstreymis innanfrumumerkja sem miðlað er af PKA, ERK og GSK3 [1], [4], [6]. Þrátt fyrir þessar mikilvægu hlutverki fyrir DRD2 í heilanum, eru nákvæmar skýringar á nákvæmar reglur sem fela í sér ólíkleika og flókið eiginleika DRD2.

Samsvörunarlínur benda til þess að margvíslegar breytingar eftir breytingarnar taki þátt í að fínstilla DRD2 virkni. Mikil glýkósýlering á DRD2 var ljós í snemma rannsóknum á myndafræðilegri merkingu [7], og myndun díúlfíðbindinga innan DRD2 var einnig þekkt sem mikilvæg breyting á bindingu bindis [8]. Enn fremur voru fosfórunarstöðvar DRD2 auðkenndar með vitro greining með geislavirkni, sem veitir leiðir til ýmissa reglnaferla sem miðlað er af ýmsum kinasa [9]. Reyndar er próteinkínasi C (PKC) stjórnað DRD2 miðlaðri virkjun á innanfrumukalsíumi og móddar milliverkanir DRD2 með frumur í frumum [10]. Fosfórýlering með GPCR kínasa 2 (GRK2) stjórnar örvandi völdum resensitization mynstur DRD2 [11].

Cyclínháð kínasa 5 (Cdk5) er prólínskerið serín / þreónín kínasi sem hefur forvarnarstarfsemi vegna heilaþátta tjáningu nauðsynlegra virkjana þess, p35 og p39 [12]. Cdk5 tekur þátt í ýmsum taugafrumum, þ.mt taugafrumum og axonleiðsögn, og Cdk5 og p35 null mýs sýna galla í cortical layering [13]. Nýlega var sýnt fram á að fosfórun WAVE1 og ephexíns með Cdk5 stýrir dendritic hryggmyndun [14]. Enn fremur stjórnar Cdk5 einnig yfirborði tjáningarmagn NMDA viðtaka, NR2B og NR2A miðlað NMDA straumar [15], [16]. Það er athyglisvert að margvíslegar sönnunargögn benda til náinn tengsl milli Cdk5 og dópamínkerfisins. Cdk5 fosfórýliserar týrósínhýdroxýlasa (TH), sem stjórnar stöðugleika þess og þar með viðheldur dopamínvirka heimilisstað [17]. Í postsynaptic taugafrumum, þegar T75 leifar dópamíns og hringlaga AMP skipulegs fosfópróteins-32kD (DARPP-32) eru fosfórýleruð með Cdk5, getur það hamlað PKA virkni og þannig mótað dopamín DRD1 miðlað PKA merkja [18]. Athyglisvert er að þegar kókaín, óbeint örvandi dópamínsviðtaka, er gefið tímabundið hjá rottum, mRNA og próteinmagn Cdk5 hækkun á miðlungs hreinum taugafrumum [19]. Samhliða virðist Cdk5 taka þátt í lyfjafræðilegum aðlögunaraðgerðum. Í þessari rannsókn sýnum við virk samskipti DRD2 og Cdk5 sem lengir enn frekar hlutverk Cdk5 við dópamínmerki.

Efni og aðferðir

Mótefni

Krabbameinsveirur voru hækkaðir gegn peptíðum sem innihéldu fosfó-serín 321 (pS321) í þriðja innanfrumu lykkju DRD2 (D2i3). Fosfópeptíð, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), var notað til að búa til peptíð-samtengda súlu til sækni í sækni (20401, PIERCE). Anti-pS321 mótefni var auðgað með sótthreinsunarkerfi samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Hreinsað fosfó mótefni var geymt í PBS með 0.1% natríumasíði og 0.1% gelatíni. Anti-mús and-Cdk5 mótefni (sc-249) og and-rabbit and-p35 mótefni (sc-820) voru notuð til vestrænna blottunar og ónæmisbælandi lyfja Cdk5 / p35. Andstæðingur-mús and-GFP mótefni (sc-9996) var notað við ónæmisútfellingu og vestræna blottun á DRD2-GFP. Anti-kanína gegn FLAG mótefni (sc-807), and-rabbit and-HA mótefni (sc-805), and-mús and-GST mótefni (sc-138) og and-mús and-GAPDH mótefni (sc- 32293) voru keypt af Santa Cruz Biotechnologies.

Dýr

P35 knockout músin var góður gjöf frá Dr. Katsuhiko Mikoshiba hjá RIKEN Brain Science Institute í Japan og notaður til frumtaugafræðinnar. Grunneiningar fyrir genotyping voru 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC og 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT eins og áður hefur verið lýst [20]. ICR mýs og Sprague Dawley rottur voru notaðir til að framleiða heila lysat. Öll dýraferli voru samþykkt af Pohang University of Science and Technology Institutional Animal Care and Use Committee.

Plasmíðbyggingar

Mannleg DRD2 langvarandi ísóform í EGFP-N1 plasmíðvektor og þriðja intracellular lykkja af DRD2 (212-373 amínósýruleifum, þar með talin viðbótar amínósýruleifunum 29 sem eru einstök fyrir DRD2 langvarandi ísóformi) í pFLAG-CMV-2 plasmíðvektor voru notuð. Human Cdk5 var sett í pCMV-HA plasmíð vektor og p35 manna var sett í PCDNA 3.1 plasmíðvektor. Human Cdk5 var sett undir cýtómegalóveiru (CMV) stuðningsmaður ásamt p35 manna í PCDNA 3.1 vektor til að búa til tvöfalda tjáningarbyggingu (Cdk5 / p35) fyrir ónæmisbælandi eitilfrumum,35S] -GTPγS bindandi greiningu, geislalandi bindandi greiningu og immunóprófi í cAMP ensím.

Í Vitro Kínasa prófun

IP tengd vitro kínasa prófun var gerð sem hér segir. Eitt heilan músar heila var litað í 3 mL rauðkornavökuljósaboðara (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) með 20 höggum Dounce homogenizer til að fá einsleita heila lysata . Lysötin voru ræktuð á ís fyrir 30-mín, sonicated og centrifuged at 16,000 × g fyrir 10 mín. Flotið var ónæmisútfellt með and-rabbíni and-p35 mótefni til að fá virkt Cdk5 / p35 flókið. Cdk5 / p35 flókið og hreinsað GST samrunaprótein var blandað með adenósín 5'-þrífosfat, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) og inkúberað í kínasa biðminni (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) fyrir 1 h við stofuhita [18], [21]. Hreinsað Cdk5 / p25 flókið (14-516, Millipore) var einnig notað fyrir vitro kínasa prófun eins og lýst er hér að ofan. 2 × sýnishornsláðajafnan var bætt við hvarfblönduna og soðin við 100 ° C. Sýnin voru síðan látin sæta SDS-PAGE og þurrkað hlaup var metið með sjálfgeislun.

Liquid chromatography (LC) -Mass Spectrometry (MS) / MS Analysis

Rombónískt GST-D2i3 prótein var greind með LC-MS / MS eftir IP-tengda vitro kínasa prófun. Við framkvæmdum peptíðgreiningu á LC-MS / MS gögnum með X !! Tandem (útgáfa Dec-01-2008). Hver RAW gagnaskrá var fyrst breytt í mzXML með því að nota transprótomic leiðsluna (TPP; útgáfa 4.3). MS / MS skannar í umbreyttum mzXMLs voru síðan látin leita á UniProt músarprótínröðargagnagrunninum (losun 2010_07) þar á meðal GST-D2i3 röð með X !! Tandem. Umburðarlyndi var stillt á 3 Da fyrir forvera jónir og 2 Da fyrir brot jónir. Enzyma sértækni fyrir trypsín var notað. Breytileg breytingarmöguleikar voru notaðar við karbamídómetýleringu cysteíns (57.021 Da), oxun metíóníns (15.995 Da), vatnsrof á asparagíni (0.987 Da) og fosfórun sermis (79.966 Da).

Ónæmisupptaka

Ónæmisútfelling var framkvæmd á frumuskýlum í ELB-lýsisstuðul. Anti-GFP mótefni var bætt við lysötin og ræktuð fyrir 3 h við 4 ° C. Ónæmiskomplex voru hreinsuð með því að nota prótín-A agarósa. Botnfallin voru ræktuð með SDS sýnishornafjöðu stuðpúði fyrir 30 mín við 37 ° C og látin sæta SDS-PAGE og Western blots.

GST Dragðu niður prófun

10 μg af hreinsaðri GST og GST-D2i3 voru ræktuð með rottuháðarlýsu fyrir 1.5 h við 4 ° C. 30 μL af glútaþíon (GSH) tengdum Sepharose 4B perlum (17-0756-01, GE Healthcare) jafnað með lyfjubúnaði var bætt við og ræktuð til viðbótar 1 h. Perlur voru safnað með skilvindu við 2,000 ×g og skola með ljósabúnað 4 sinnum [22], [23]. Úrgangur var greindur með Western blotting með því að nota and-Cdk5 og and-p35 mótefni.

Ónæmisbrotsemi

Transfektar HEK 293 frumur og striatal taugafrumur sem ræktuð eru á hlífðarhúð voru þvegin einu sinni með fosfötpúða saltlausn (PBS) og fastur með því að dýfa í köldu 4% paraformaldehýði / PBS fyrir 30 mín. Aðal mótefni var þynnt í blokkunarlausninni (2% hestasermi og 1% Triton X-100 í PBS). Alexafluor-647-samtengdur and-mús mótefni (A20990, Invitrogen) og Alexafluor-568-samtengt gegn kanína mótefni (A11011, Invitrogen) voru notuð sem aukaverkun mótefna. Hoechst voru notuð til að lita á kjarna. Myndir voru fengnar með confocal smásjá (Olympus, FluoView-1000).

Receptor Internalization Assay

24 klst eftir transfection, voru frumur meðhöndlaðir með 1 μM kínpíróli (Q102, Sigma) fyrir 30 mín og 90 mín við 37 ° C. Frumur voru aftur lokaðir í 2 mL köldu PBS og 200 μL skammtar voru notaðir fyrir hverja hvarf. Lyfjameðferð var framkvæmd við stofuhita fyrir 3 h við eftirfarandi styrk; 3 nM [3H] -spiperón (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiríð (895, TOCRIS), 10 μM haloperidól (H1512, Sigma). Vatnsfælin [3H] -spiperón var notað til að merkja heildar uppteknar viðtaka og vatnsfælna sulpiríð var notað til að skipta um himnubundna viðtaka bundið [3H] -spiperónsmerki. Myndefnatengd viðtaka merki voru reiknuð með því að draga frá gildi innanfrumu viðtaka frá heildar tjáðum viðtökum. Frumur voru síaðir á GF / B (Millipore) síu og þvegnar 3 sinnum með þvottabúlu (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Síur voru þurrkaðir út og leifar geislavirknin var mæld með því að nota vökvaþrýstingsgreiningartæki [24].

Cell Membrane Preparation

Töflufrumur í 100 mm ræktunardiskum eftir transfection voru skolaðir með íköldu PBS og höfðu safnað í 1 mL HME stuðpúði (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Sameinaðar lysata voru skiljaðar með 500 × g fyrir 15 mín. Og flotin voru síðan skilin með 36,000 x g fyrir 30 mín. Pellets re-suspended in HME buffer were used for assays.

[35S] -GTPγS bindandi prófun

Frum himnafrumur voru fyrirfram inkúberaðar með 1 ^ M kínpíróli (Q102, Sigma) í prófunarstuðlinum (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA og 0.01 mM GDP) fyrir 10 mín. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) var bætt við endanlega styrk 3 nM í 30 μL og frekar inkúberað fyrir 90 min. 170 μL af íköldu stuðpúði (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, og 0.1 mM GTP) var bætt við til að stöðva hvarfið. Möndlur voru síaðir á GF / B síu (Millipore) og þvegnar 3 sinnum með þvottabúlu (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Síur voru þurrkaðir og geislavirkni var mæld með því að nota scintillation gegn [25], [26].

Radioligand Binding Assay

Framleiddir frumuhimnur voru ræktaðir með 0.01 nM [3H] -spiperón (NET-565, PerkinElmer) og aukin styrkur quinpirole (Q102, Sigma) fyrir 30 min í prófunarstuðlinum (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Möndlur voru síaðir á GF / B síu (Millipore) og þvegnar 3 sinnum með þvottabúlu (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Viðbrögðin voru hætt með hraðri síun gegnum GF / C síur. Leifar geislavirknin var mæld með því að nota vökvaþrýstingsgreiningartæki [27]-[29].

cAMP ensím ónæmisprófun

Transfektar HEK 293 frumur voru formeðaðir með 10 μM roliprami (R6520, Sigma) fyrir 1 h og síðan meðhöndlaðir með 0.1 μM forskólini (F6886, Sigma) og aukin styrkur quinpirole (Q102, Sigma) fyrir 30 min. Helstu ræktaðar taugaveiklur í taugafrumum voru meðhöndlaðir með 10 μM roliprami fyrir 1 h og síðan 1 μM dópamín fyrir 1 h [22]. Cellelysöt voru framleidd með 0.1 M HCI og cAMP stig voru greind með CAMP ensím ónæmisprófunarbúnaði (Sapphire Bioscience) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Primary Cultured Striatal Neuron

Striatal svæði var einangrað úr fósturhimnuhimnu (E15). Dissected vefja var dissociated í lágmarki nauðsynlegra miðla (MEM) (11095, Invitrogen) sem innihélt 0.25% trypsín (T4549-100, Sigma) og 0.1% DNase I fyrir 6 mín við 37 ° C. Frumur voru endurupptækir í málmhúðamiðlinum (MEM með 0.01 M HEPES (pH 7.4) og 10% (rúmmál / rúmmál) hestaserma (16050-122, GIBCO)). Taugafrumur voru ræktaðir í 7 daga vitro (DIV 7) í MEM með B27 viðbót (17504-044, Invitrogen) áður en það er notað til immunimmuns cAMP ensíms.

Niðurstöður

Cdk5 fosfórýlöt Serine 321 í þriðja innra frumu Loop DRD2 vitro

Til að greina nýjar Cdk5 hvarfefni, gerðum við kerfisbundið leit með (S / T) PX (K / H / R) sem Cdk5 viðurkenningarsamræmingaröðin [30] og benti á DRD2 sem frambjóðandi undirlag. Samræmingarröðin, þar með talin serín 321, er staðsett í þriðja innanfrumu lykkju DRD2 (D2i3) þar sem ýmsar reglur hafa verið gerðar [3], [10], [11]. Röðin er evrópskuð varðveitt í DRD2 hjá hryggdýrum, sem felur í sér hagnýtur mikilvægi leifarinnar (Mynd 1A).

smámynd

Mynd 1. Cdk5 fosfórýliserar serín 321 í þriðja innanfrumu lykkju DRD2 in vitro.

(A) Aminósýruröð röðun sem sýnir varðveitt svæði DRD2 úr ýmsum tegundum (skyggða). Möguleg Cdk5 fosfórunarstöðin er táknuð með stjörnu. (B) IP-tengd vitro kínasa prófun með raðbrigða GST-D2i3 og GST-D2i3 stökkbreytandi próteinum. Cdk5 / p35 flókið auðgað úr músarheiluþykkni með and-p35 ónæmisútfellingu var notað við kínasaviðbrögð. Örvunarrit af fosfórýleruðu próteinum er sýnt ásamt Coomassie ljómandi bláum litun á sama geli. Arrowhead gefur til kynna geislavirkt merki sem samsvarar GST-D2i3s og opið örvunarmerki gefur til kynna geislavirk merki frá p35. (C) MS / MS litróf af fosfórýlerað peptíð brot af D2i3. Fræðilegu sundrungsmynstur eru sýndar undir litrófinu. Meðal allra brotjónanna eru greindir j- og b-jónir merktir í litrófinu. Y6 og y7 jónir benda eindregið til fosfórunar á serín 321. (D) In vitro kínasa prófun með hreinsuðu Cdk5 / GST-p25 flóknu með GST-D2i3 og GST-D2i3 stökkbrigðum próteinum. Phosphorylated prótín voru sýnd í autoradiograph ásamt Coomassie brilliant blá litun. Arrowhead gefur til kynna geislavirkt merki sem samsvarar GST-D2i3 og opinn örvunarmerki gefur til kynna geislavirk merki frá GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Til að meta getu Cdk5 að fosfórýlera D2i3, gerðum við IP tengda vitro kínasa prófanir með virku Cdk5 / p35 flóknu sem auðgað er úr músum heila lysat með p35 ónæmisafurðun með hreinsuðu, raðbrigða GST-D2i3 (amínósýruleifum 212-373) próteinum sem hvarfefni. Við sjáum fosfórunarmerki í hreinsuðu GST-D2i3 og GST-D2i3 S297A próteinum en merkiin minnkaði verulega með því að nota GST-D2i3 S321A (Mynd 1B). Til að sannreyna frekar fosfórun á serín 321 í GST-D2i3, gerðum við LC-MS / MS greiningu sýnanna úr IP tengdum vitro kínasa prófanir með því að nota LTQ XL massagreiningu. Samhliða var fosfópeptíð sem svarar til massa fosfó-seríns 321 peptíða batna (Mynd 1C). Miðað við að gögn háð kaup á LC-MS / MS greiningu hefur tilhneigingu til að greina mikið prótein í sýninu [31], benda þessar upplýsingar til þess að serín 321 leifin er ríkjandi fosfórunarstöð Cdk5 í D2i3 svæðinu. Til að sanna bein fosfórun sermis 321 í GST-D2i3 með Cdk5, vitro kínasa prófun með því að nota hreinsað Cdk5 / GST-p25 flókið með hreinsaðri raðbrigða GST-D2i3 próteinum var framkvæmt. Við bentum á veruleg fosfórunarmerki í GST-D2i3 sem var fjarverandi í GST-D2i3 S321A (Mynd 1D). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að D2i3 S321 leifin sé ívilnandi markmið fyrir Cdk5-miðlað fosfórun.

Cdk5 fosfórýlöt Serine 321 í þriðja innra frumufjölgun DRD2 í frumum

Til að greina fosfórun sermis 321, vöktum við mótefni sem eru sértæk fyrir fosfó-serín 321 (pS321). Sýnishorn úr IP-tengdum vitro kínasa prófun voru greind með Western blotting með því að nota and-pS321 mótefni. Blots sýndu sérstakt band í kínasa viðbrögðum sem var háð GST-D2i3 (Mynd 2A). Til að sannreyna hugsanlega fosfórýleringu serine 321 í DRD2 með Cdk5 í frumum voru and-GFP ónæmisprófanir úr HEK 293 frumum sem tjáðu DRD2-GFP og DRD2 S321A-GFP með eða án HA-Cdk5 og p35 greind með Western blotting með því að nota and-GFP og and-pS321 mótefni. Einkennandi smitandi hljómsveit merki gegn and-GFP mótefni, sem vitað er að eru vegna mikils glýkósýleringar DRD2, sést aðeins í viðurvist DRD2-GFP og and-pS321 mótefni uppgötvaði svipaða DRD2 merki aðeins með Cdk5 / p35 samþjöppunMynd 2B) [7]. Til að staðfesta frekar fosfórun serine 321 með Cdk5, voru D2i3 (FLAG-D2i3) og stökkbreytt form D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) myndað. FLAG-D2i3 og FLAG-D2i3 S321A, gefin út með eða án HA-Cdk5 og p35 í HEK 293 frumum, voru greindar með SDS-hlaup hreyfanleikaskiptingarprófi. Verulegur Cdk5 háð hreyfanleikaskipting varð fyrir FLAG-D2i3, en ekki fyrir FLAG-D2i3 S321A (Mynd 2C). Við metum einnig fosfórunarstig DRD2 við Ser321 við örvunarörvun. HEK 293 frumur sem tjáðu DRD2-GFP og Cdk5 / p35 flókin voru örvaðar af quinpirole og ónæmissvörun gegn GFP úr frumuskýlum var greind með Western blotting með því að nota and-GFP og and-pS321 mótefni. Við komumst að því að Cdk5-miðlað fosfórýlering á DRD2 við Ser321 hafði ekki áhrif á örvandi örvun, sem virðist vera frábrugðin GRK- og PKC-miðluðum fosfórýleringar (Mynd 2D) [32], [33]. Saman þessa benda þessar niðurstöður til þess að Cdk5 geti fosfórýlat serín 321 leifar DRD2 í frumu umhverfi.

smámynd

Mynd 2. Cdk5 fosfórýliserar serín 321 í þriðja innanfrumu lykkju DRD2 í frumum.

Cdk5-miðlað fosfórun á serín 321 var greind með því að nota and-pS321 mótefni. (A) Sýnishorn úr IP-tengdum vitro kínasa prófun með GST-D2i3 próteinum var greind með Western blotting (WB) með tilnefndum mótefnum. Arrowheads benda til GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP og DRD2 S321A-GFP var gefin upp með eða án HA-Cdk5 og p35 í HEK 293 frumum. Ónæmissvörun gegn GFP var greind með Western blotting með því að nota and-GFP og and-pS321 mótefni. Bracket gefur til kynna DRD2 merki og opinn örvun gefur til kynna ósértæk merki frá ónæmisprófunum gegn GFP. '% inntak' er% rúmmál heildarlýsats fyrir IP-viðbrögð. Veikir, ónæmar Cdk5 merki voru auðkennd með stjörnum. (C) Greiningarmörk fyrir hlaup hreyfanleika. HEK 293 frumur transfected eins og bent var á voru greind með Western blotting. (D) Transfected HEK 293 frumur voru meðhöndlaðir með quinpirole og ónæmissvörun gegn GFP ónæmissvörun voru greind með Western blotting með and-GFP og and-pS321 mótefni. Opið örvunarhorn gefur til kynna ósértæk merki frá ónæmisprófum gegn GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex og DRD2 eru líkamlega tengdir

Við rannsökuð hugsanlega líkamlega samskipti milli Cdk5 / p35 flókinnar og DRD2 vegna þess að margir Cdk5 hvarfefni eru vitað að vera líkamlega tengd við Cdk5 / p35 flókið [23], [34], [35]. Í fyrsta lagi var GST niðurdráttar tilraunin framkvæmd. Hreinsað raðbrigða GST-D2i3 prótein var ræktað með rottum heila lysat og GST niðurdregnum precipitates voru greindar fyrir Western blotting. Eins og sýnt er í Mynd 3A, innfallandi Cdk5 og p35 voru greindar í niðurfellingum, sem bentu til líkamlegrar milliverkunar milli DRD2 og Cdk5 / p35 flókinnar (Mynd 3A). Þar að auki voru HA-Cdk5 og p35 greind í and-GFP ónæmispróteinunum úr HEK 293 frumulýsötum sem tjáðu DRD2-GFP og Cdk5 / p35 (Mynd 3B). Að auki gerðum við rannsóknir á ónæmiskerfefnum og sáu að DRD2-GFP, HA-Cdk5 og p35 sýndu veruleg samhliða staðsetningarmerki á himnuhimnu svæði HEK 293 frumna (Mynd 3C, efri spjöld). Við rannsökuð einnig samhliða staðsetningu DRD2 og Cdk5 / p35 í taugafrumum. Samhliða sýndu DRD2-GFP einnig veruleg samhliða staðsetning með innbyggðum Cdk5 og p35 í ræktunarmörkum taugafrumum (DIV7), sem styður enn frekar virk tengsl milli DRD2 og Cdk5 / p35 (Mynd 3C, botnplötur). Niðurstöðurnar benda til þess að DRD2 og Cdk5 / p35 geti myndað flókið og styðja þannig þá hugmynd að DRD2 sé lífeðlisfræðileg hvarfefni Cdk5.

smámynd

Mynd 3. Cdk5 / p35 getur myndað flókið með DRD2.

(A) GST niðurdráttarprófun með því að nota hreinsað raðbrigða GST-D2i3 prótein með rottuheilaþykkni. GST niðurdregnar precipitates voru greindir með vestrænum blettum. "Bead" gefur til kynna niðurfallsbóluna án GST próteina. (B) Ónæmisupptaka DRD2 og Cdk5 / p35 flókið. Anti-GFP IP frá lysötum frá transfected frumum voru greindar með vestrænum blettum. Bracket gefur til kynna DRD2 merki og opinn örvun gefur til kynna ósértæk merki frá ónæmisprófunum gegn GFP. Oftekinn blettur fyrir inntak er einnig sýndur í hægri. (C) Immunocytochemical greiningar á DRD2 og Cdk5 / p35. HEK 293 frumur sem tjáðu DRD2-GFP og Cdk5 / p35 voru litaðar með and-Cdk5 og and-p35 mótefnum (efri spjöldum). DRD2-GFP var gefið eitt sér í ræktunarmörkum taugafrumum og litað með and-Cdk5 og and-p35 mótefni (neðri spjöld). Hoechst voru notuð til að lita á kjarna. Stærðarmálið er 5 μm. Allar myndir voru fengnar með því að nota confocal smásjá (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-miðlað fosfórýlering á DRD2 dregur úr viðtaka virkni

Það hefur verið greint frá því að fosfórýlering stuðlar að mikilvægum eiginleikum GPCRs eins og G prótein tengingu, viðtaka innanhúss, innanfrumu staðsetning og tengsl við mótorprótein [9], [11], [24]. AInnbyggð viðtaka innbyggðra viðtaka er mikilvægt eftirlitsferli um merkileiðslu. Við rannsökuð Cdk5 miðlað mótun DRD2 innri skipulagningu. HEK 293 frumur sem tjáðu DRD2-GFP og DRD2 S321A-GFP með eða án Cdk5 / p35 voru inkúberaðar með 1 μM kínpíróli til að örva frumueyðandi DRD2 innri meðferðMynd 4A). [3H] -spiperóns merki DRD2-GFP tjáðra frumna voru marktækt minni við 30 min quinpirole meðferð og endurheimt við 90 mín. Athyglisvert er að [3H] -spiperónsmerki DRD2-GFP og Cdk5 / p35 tjáfrumna voru einnig minnkuð við 30 min quinpirole meðferð en ekki endurheimt við 90 mín (Mynd 4A, seinni hluti). Á hinn bóginn, [3H] -spiperónsmerki DRD2 S321A-GFP tjáðra frumna voru minnkaðir við 30 mín og endurheimt við 90 mín, óháð sam-tjáningu með Cdk5 / p35. Fyrstu rannsóknir hafa sýnt að innbyggð DRD2 endurheimtir aftur í plasma himnuna við langvarandi örvunarörvandi örvun [11]. Thus virðist sem Cdk5-miðlað fosfórýlering á DRD2 er þátt í resensitization ferlunum sem fylgja með frumuvirkni DRD2 innanhúss.

smámynd

Mynd 4. Cdk5-miðlað fosfórýlering dregur úr DRD2 yfirborðsþrýstingi og niðurstreymismerkjum.

(A) DRD2 yfirborði tjáning mælt með [3H] -píperón bindingarannsókn. Transfektar HEK293 frumur voru örvaðar með 1 μM kínpíróli í tilgreindan tíma og uppskera, fylgt eftir með 3 nM [3H] -spiperone meðferð í 3 klst. Geislavirkni var mæld og yfirborðsmerki reiknað. Villustikur tákna meðaltal ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Einhliða ANOVA með Dunnett eftirprófi: berðu saman alla dálka samanborið við dálk). (B) [35S] -GTPγS bindandi prófun. Frumhimnur voru framleiddar úr frumunum sem voru transfektar eins og sýnt er. Myndefnablöndur voru ræktuð með 1 μM kínpíróli fylgt eftir af 3 nM [35S] -GTPγS í 90 mín. Villustikur tákna meðaltal ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; einstefna ANOVA með Bonferroni eftirprófi: berðu saman öll dálkapör). (C) Kínpiról-keppandi [3H] -píperón bindingarannsókn. Myndefnablöndur frá transfektum frumum voru ræktuð með 0.01 nM [3H] -spiperón og vaxandi styrkur kínpiróls í 30 mín. Ólínuleg aðhvarf fékkst af GraphPad. Villustikur gefa til kynna meðaltal ± SE (n = 3). (D) cAMP ensím ónæmisgreiningar í transfected HEK 293 frumum. Sýktar frumur voru meðhöndlaðar með 10 pM rolipram í 1 klst. Og síðan meðhöndlaðar með 0.1 pM forskólíni og auknum styrk kíníróls í 30 mínútur. Ólínuleg aðhvarf fékkst af GraphPad. Villustikur tákna meðaltal ± SE (n = 4; ** p <0.01; tvíhala tprófanir). (E) Ræktaðar taugafrumur úr villtum gerðum og p35 knockout fósturvísa (DIV 7) voru meðhöndlaðir með 10 μM roliprami fyrir 1 h fylgt eftir með 1 μM dópamín fyrir 1 h. Villa bars tákna meðaltal ± SE (n = 4; **p<0.01; tvískiptur tprófanir).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Við metum frekar hugsanlega breytingu á örvandi örvandi G prótein tengingu við DRD2 í tengslum við Cdk5 miðlað fosfórun með því að nota [35S] -GTPγS bindandi prófun [25], [26]. DRD2-GFP og DRD2 S321A-GFP með eða án Cdk5 / p35 voru gefin upp í HEK 293 frumum. Membranes voru unnin og örvuð með 1 μM kínpíróli og frekar leyft [35S] -GTPγS innleiðing. DRD2-GFP og Cdk5 / p35 tjáð frumuhimnu sýndu verulega skerta [35S] -GTPγS bindandi í samanburði við öll önnur frumuhimnur (Mynd 4B). Þessar niðurstöður benda til þess að Cdk5-miðlað fosfórýlering niðurstýrir örvandi örva G próteinbindingu við DRD2.

Að auki, quinpirole-keppandi [3H] -píperónbindingarannsóknir voru gerðar til að kanna hvaða hugsanlega breytingu á örvandi sækni við DRD2 með Cdk5-miðluð fosfórýleringu. Samkeppnisbinding [3H] -spíperón við meðferð á aukinni þéttni quinpirole við himnablönduna frá transfected var mæld. Samkeppnisbinding quinpirole og [3H] -spiperón í DRD2-GFP og DRD2 S321A-GFP gerðu svipaða logKi gildi (-9.789 fyrir DRD2-GFP; -9.691 fyrir DRD2 S321A-GFP), sem gefur til kynna að sækni bindis við DRD2 hafi ekki veruleg áhrif á Cdk5-miðlað fosfórun við DRD2 (Mynd 4C).

Cdk5-miðlað fosfórýlering niður - stjórnar DRD2-cAMP Signal Pathway

Næstum við rannsakað hvort breytingin á DRD2 með Cdk5 hefur áhrif á niðurstreymismerkingarleiðir. Við fylgst með DRD2 miðlaðri hömlun á forskólínörvandi cAMP framleiðslu með adenýlyl hringrás í frumunum sem tjá DRD2-GFP og DRD2 S321A-GFP með því að nota immun immunoassay CAMP. DRD2 tjáandi frumur sýndu lækkað cAMP gildi sem svar við quinpirole á skammtaháðan hátt. Einkum minnkaði samhliða tjáning Cdk5 / p35 marktækt hámarks hömlun á myndun cAMP (Mynd 4D, vinstri spjaldið). Á hinn bóginn, í DRD2 S321A-GFP tjáð frumunum, voru cAMP formanirnar virkilega hamlar til að bregðast við quinpirole meðferð án tillits til tjáningar Cdk5 / p35 (Mynd 4D, hægri spjaldið). Þessar niðurstöður benda til þess að Cdk5-miðlað fosfórýlering á DRD2 dregur úr hemlandi virkni DRD2 á downstream cAMP-merkjunarferlinu. Til að enn frekar staðfesta fyrirbæri í lífeðlisfræðilega viðeigandi stillingu notum við frumkultuðum taugafrumum úr fósturvísum sem eru ónæmir í p35, ómissandi Cdk5 virkjunarvél. Helstu ræktaðar taugaveiklur í taugafrumum voru meðhöndlaðir með 1 μM dópamíni og greind með ónæmissvörun cAMP ensíms. Taugafrumur úr p35 knockout músum sýndu lækkun á cAMP stigum samanborið við villta tegund taugafrumna þegar þau voru örvuð með dópamíni (Mynd 4E). Taken saman, komst að þeirri niðurstöðu að Cdk5-miðlað fosfórýlering á DRD2 leiðir til lækkunar á hemlandi tónn á cAMP leiðinni sem DRD2 framkvæmir.

Discussion

Við bentum á DRD2 sem skáldsöguefni Cdk5. Fosfórunin virðist hafa áhrif á DRD2 yfirborðsþrýsting með því að hafa áhrif á örlög DRD2 í kjölfar viðtaka innviðrar og dregur þannig úr DRD2 Gi-coupling og downstream cAMP leið. Þar sem fosfórunarefnið S321 er til staðar bæði í langvinnum og stuttum ísóformum DRD2, getur fyrirhugað aðferðir í þessari rannsókn verið almenn stjórntæki í DRD2-miðlaðri merkingu.

DRD2 í miðlungs hvítum taugafrumum hefur ekki aðeins verið talin vera stórt dópamín viðtaka undirtegund en hefur einnig verið viðurkennt fyrir næmi fyrir breytingum á aðgengi sem svar við umhverfisörvum. Örvandi örvun og endurtekning á DRD2 hefur verið rannsakað mikið [11], [24]. Sérstaklega hefur fjöldi rannsókna sýnt fram á að áhrif langvinnrar geðhvarfafræðilegrar útsetningar, svo sem kókaín og amfetamín, sem hækka utanfrumuþéttni dopamíns í samdrætti í heilablóðfalli, fylgja dynamic breytingum á DRD2 eftir sjónskerpu [36]. Reyndar eru langvarandi kókaínnotendur vitað að hafa minnkað DRD2 stig á striatal svæðinu og DRD2 framboð í kjarnanum accumbens (NAcc) sýnir neikvæð fylgni við lyfjahugleiðingar og styrkleikahópa hjá músum og primötum [37]-[39]. Þessar niðurstöður benda til þess að virkni DRD2 sé mjög næm fyrir aðlögunarhæf eða reglulegum reglum til að bregðast við ýmsum áreitum, þ.mt langvinna lyfjaáhrifum. Niðurstöður okkar sýna að S321 leifar í þriðja intracellular lykkju DRD2 geta verið fosfórýleruð með Cdk5, sem leiðir til lækkunar á hemlandi áhrifum DRD2 á cAMP ferli. Þessi samskipti leggur til nýjan regluverkskerfi sem tengist Cdk5 í dopaminceptive taugafrumum sem gætu verið tengd við dynamic eðli DRD2 yfirborðs framboðs.

Það skal tekið fram að Cdk5 er vitað að vera lykilþáttur í að miðla aðlögunarbreytingum á taugafrumum. Til dæmis eru skipulagslegar og hagnýtar breytingar á dendritic spines í taugafrumum limbic hringrásinni eitt af afleiðingum endurtekinna geðveikandi áhrifum [40]. Þessar breytingar fylgja ýmsar sameindabreytingar þar með talin örvun á cAMP viðbrögð frumefni bindandi próteinum (CREB) og ΔFosB, umritunarþættir sem sýna varanlega uppreglu sem svar við langvarandi kókaín gjöf [41], [42]. Mikilvægt er Cdk5 miða á ΔFosB [19], og margir mikilvægir þættir sem taka þátt í virkni dendritic spine, svo sem PSD-95, p21-virkja kínasa (PAK), β-katenín og spírópídín, voru skráð sem Cdk5 hvarfefni [43]-[46]. Algengt er að erfðafræðileg eða lyfjafræðileg meðferð á Cdk5 virkni valdi breytingum á dendritic hryggjafræðilegri svörun og hegðunarviðbrögðum við kókaíni, sem felur í sér mikilvægar hlutverk fyrir Cdk5 í sameinda og formfræðilegum breytingum á mesólimbísk dópamínrásum [47], [48]. Niðurstöður okkar sem sýna að DRD2 er skáldsaga miða við Cdk5 veitir frekari innsýn í aðlögunarhæfar breytingar á dópamínkerfinu sem svar við langvinnri útsetningu fyrir lyfjum vegna þess að eftirfylgjandi ΔFosB-miðlað uppregla Cdk5 getur valdið tómatískri aukningu á fosfórun DRD2 . Þar að auki er DRD2 þekkt fyrir að hafa áhrif á fjölmargar frumuferli, þar á meðal stjórnun á cAMP og MAP kínasa ferlum og niðurstreymisþrepum [42], [49]. Þannig geta niðurstöðurnar í þessari rannsókn ekki aðeins sýnt fram á bein reglur um DRD2 með Cdk5 heldur einnig að veita nýjan innsýn í aðlögunarsvörun dópamíns kerfisins við langvinnri útsetningu lyfja.

Höfundur Framlög

Hannað og hannað tilraunirnar: JJ YUP DH SKP. Framkvæma tilraunirnar: JJ YUP DKK YK. Greind gögnin: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Framlagð hvarfefni / efni / greiningarverkfæri: YHS. Skrifaði blaðið: JJ SKP.

Meðmæli

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) dópamínviðtökur: frá uppbyggingu til virkni. Physiol Rev 78: 189-225.
  2. 2. Wise RA (2002) Brain verðlaun hringrás: innsýn frá unsensed hvata. Neuron 36: 229-240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Skoða grein
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Skoða grein
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Skoða grein
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Skoða grein
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Skoða grein
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Skoða grein
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Skoða grein
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Skoða grein
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Skoða grein
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Skoða grein
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Skoða grein
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Skoða grein
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Skoða grein
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Skoða grein
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Skoða grein
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Skoða grein
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Skoða grein
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Skoða grein
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Skoða grein
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Skoða grein
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Skoða grein
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Skoða grein
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Skoða grein
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Skoða grein
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Skoða grein
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Skoða grein
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Skoða grein
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Skoða grein
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Skoða grein
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Skoða grein
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Skoða grein
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Skoða grein
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Skoða grein
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Skoða grein
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Skoða grein
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Skoða grein
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Skoða grein
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Skoða grein
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Skoða grein
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Skoða grein
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Skoða grein
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Skoða grein
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Skoða grein
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Skoða grein
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Skoða grein
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Skoða grein
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Skoða grein
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Viðbrögð við dópamínviðtaka. J Upptökuprófunarflutningur Res 24: 165-205. gera: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, o.fl. (2008) Möguleg þátttaka íhluta eftir dopamín D2 viðtaka í sjúkdómsgreiningu geðklofa. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197-205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Hlutverk dópamín D2-eins og viðtaka í kókaíns sjálfs gjöf: rannsóknir á D2 viðtökum stökkbrigðum músum og nýjum D2 viðtaka mótlyfjum. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, et al. (2012) Valproat breytir dópamínmerki í tengslum við örvun Par-4 prótein tjáningu. PLOS One 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Mismunandi glýkósýlering og innanfrumukrabbamein fyrir langa og stutta ísóforma D2 dópamínviðtaka. J Biol Chem 270: 29819-29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Lesandi TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Sértæk [3H] raclópríðbinding við neostriatal dópamín D2 viðtaka: hlutverk disúlfíðs og súlfhýdrýlhópa. Neurochem Res 17: 749-759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (1994) fosfórýlering og palmitóýlering manna D2L dópamínviðtaka í Sf9 frumum. J Neurochem 63: 1589-1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Mótun dópamín D (2) viðtaka merki með actin-bindandi próteini (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Blóðflagnafrumukrabbamein og viðtaka fosfórýlering miðla endurskynjun dópamín D (2) viðtaka. Mol Endocrinol 24: 574-586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 er taugasértæka reglulega undireiningu á sýklínháðri kínasa 5. Náttúran 371: 419-423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) Áratug af CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749-759. gera: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Sýklínháð kínasa 5 tengir utanfrumurækt við actín frumu-kísill við þróun dendritic hryggs. Cell Adh Migr 1: 110-112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Cdk5 virkjun hvetur hippocampal CA1 frumudauða með beint fosfórýlerandi NMDA viðtaka. Nat Neurosci 6: 1039-1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 stýrir fosfórun á tyrosíni 1472 NR2B og yfirborðsþrýsting NMDA viðtaka. J Neurosci 28: 415-424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Sýklínháð kínasa 5 fosforýliserar serín 31 af týrósínhýdroxýlasi og stjórnar stöðugleika þess. J Biol Chem 279: 54487-54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, o.fl. (1999) Fosfórýlering DARPP-32 með Cdk5 breyti dópamínmerki í taugafrumum. Náttúran 402: 669-671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (2001) Áhrif langvarandi útsetningar fyrir kókaíni eru stjórnað af taugafrumum próteininu Cdk5. Náttúran 410: 376-380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Synergistic framlag cýklínháðrar kínasa 5 / p35 og Reelin / Dab1 við staðsetningu cortical taugafrumna í þróunar músarheilanum. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2764-2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Sýklínháð kínasa 5 fosfórýliserar N-enda lénsins eftir PSD-95 eftir sjónskerpuþéttni í taugafrumum. J Neurosci 24: 865-876. doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, o.fl. (2005) Par-4 tengir dópamínmerki og þunglyndi. Cell 122: 275-287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL er skáldsaga Cdk5 hvarfefni sem tengist LIS1 og frumudrepandi dýnefni. Neuron 28: 697-711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, o.fl. (2001) Mismunandi reglugerð dópamín D2 og D3 viðtaka með G prótein-tengdum viðtaka kínasa og beta-arrestínum. J Biol Chem 276: 37409-37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Mismunandi losun A1 adenosín og D2 dópamínviðtaka með suramín og dímetýleruðu suramini (NF037). Mol Pharmacol 53: 808-818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. (2000) Binding calmodúlíns við D2-dópamínviðtakann dregur úr viðtökumerki með því að handtaka G prótein virkjun rofi. J Biol Chem 275: 32672-32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. Listi SJ, Seeman P (1981) Upplausn dópamín- og serótónínviðtakaþáttar í [3H] spiperóns bindingu í rottum heila svæðum. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620-2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, undarlegt PG (1998) Agonistverkun við D2 (langa) dópamínviðtaka: bindiefni bindandi og hagnýtar prófanir. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Dópamídín dreifir dópamídón frá dopamín D2003 viðtaka, en ekki [3H] raklópríð eða [2H] spiperóni í ristilfrumum: Áhrif á tómstundamyndun í mönnum. Synapse 3: 3-49. doi: 209 / syn.215
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Próteóma-breiður spá fyrir um milliverkanir við frumur sem nota stuttar myndefni. Nucleic Acids Res 31: 3635-3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Líkan fyrir handahófskennt sýnatöku og mat á hlutfallslegu próteinmagni í hagkerfinu. Anal Chem 76: 4193-4201. doi: 10.1021 / AC0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Sequestration dópamín D2 viðtaka fer eftir samþynningu G-prótein tengdum viðtaka kínasa 2 eða 5. Eur J Biochem 260: 112-119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Prótínkínasi C miðlar fosfórýleringu, ónæmingu og mansal á D2 dópamínviðtakanum. J Biol Chem 279: 49533-49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Cdk5-miðlað fosfórun á endóphílíni B1 er krafist fyrir framkallað sjálfsæxli í líkönum Parkinsonsveiki. Nat Cell Biol 13: 568-579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 binst og fosforýliserar beta-kötín og stjórnar beta-kataín / presenilín-1 samskiptum. Eur J Neurosci 13: 241-247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Dópamínhugsunin á styrkandi eiginleika kókaíns. Stefna Neurosci 14: 299-302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (1990) Áhrif langvarandi kókaíns misnotkun á postsynaptic dópamínviðtökum. Er J geðlækningar 147: 719-724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, et al. (2007) Nucleus accumbens D2 / 3 viðtökur spá eiginleikum hvatvísi og kókaín styrking. Vísindi 315: 1267-1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (2006) PET hugsanlegur dópamín D2 viðtaka við langvarandi kókaín sjálfs gjöf hjá öpum. Nat Neurosci 9: 1050-1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Viðvarandi uppbyggingarbreytingar í kjarnanum og fyrirframbrjóstum taugafrumum sem framleiddar eru af fyrri reynslu af amfetamíni. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Breytingar á formgerð dendrites og dendritic spines í kjarnanum accumbens og prefrontal heilaberki eftir endurtekna meðferð með amfetamíni eða kókaíni. Eur J Neurosci 11: 1598-1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Reglugerð um genþrýsting og kókaínverðlaun CREB og DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208-1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, o.fl. (2000) Spinófilín stjórnar myndun og virkni dendritic spines. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287-9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Modular flutningur eftirlitsþéttni-95 klasa og tengsl við stöðugar hryggjafræðingar við snemma þroska barkstera. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarization dregur beta-Catenin í taugafrumum sem stuðla að breytingum á synaptic uppbyggingu og virkni. Neuron 35: 91-105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, o.fl. (2004) Breytingar á cortical synaptic formgerð og skert minni samdráttur í forvarnar-sértækum ríkjandi neikvæðum PAK transgenic músum. Neuron 42: 773-787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLone RJ, et al. (2007) Cdk5 breyti kókaínsverðlaun, hvatning og streituþrýstingi. J Neurosci 27: 12967-12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. (2008) Striatal dysregulation á Cdk5 breytir staðbundnum svörum við kókaíni, hreyfimyndun og dendritic formgerð. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561-18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Gerð nýjar tengingar: hlutverk ERK / MAP kínasa merkingar í taugaþéttni. Neuron 23: 11-14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3