Framhaldsfræðingur. 2018; 9: 81.
Birt á netinu 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun garðurinn,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* og Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstract
Bakgrunnur
Ávanabindandi notkun internetsins og netleiki er hugsanleg geðröskun sem kallast IGD (Internet gaming disorder). Greint hefur verið frá breyttum microRNA (miRNA) tjáningarsniðum í blóði og heilavef sjúklinga með ákveðna geðrænan sjúkdóm og lagðir til sem lífmerkir. Engar skýrslur hafa þó borist um miRNA snið í blóði í IGD.
aðferðir
Til að uppgötva IGD-tengda miRNA, greindum við miRNA tjáningarsnið 51 sýni (25 IGD og 26 stýringar) með TaqMan Low Density miRNA Array. Til staðfestingar gerðum við magn öfug umritunar PCR með 36 óháðum sýnum (20 IGD og 16 stýringar).
Niðurstöður
Með uppgötvun og sjálfstæðri staðfestingu greindum við þrjú miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) sem voru verulega niðurregluð í IGD hópnum. Einstaklingar með allar þrjár breytingar á miRNA höfðu miklu meiri hættu á IGD en þeir sem höfðu enga breytingu [líkindahlutfall (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11], og OR hækkaði skammtinn háð með fjölda breyttra miRNA. Spáð genamiðum þriggja miRNA tengdust taugaleiðum. Við könnuðum prótein tjáningu þriggja neðri markmarka gena með western blot og staðfestum að tjáning GABRB2 og DPYSL2 var marktækt hærri í IGD hópnum.
Niðurstaða
Við fylgjumst með því að tjáningar hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p og hsa-miR-652-3p voru lækkaðar á IGD sjúklingum. Niðurstöður okkar munu koma að gagni við að skilja sjúkdómalífeðlisfræði IGD.
Hvernig gengur lífið dag frá degi? Er það í jafnvægi og allt eins og það á að vera? Er jafnvægi hvort sem litið er á veraldlega stöðu eða andlega? Lífið er eins og það er. Það er ekki alltaf sólskyn. Það koma reglulega lægðir með rok og rigningu. Við vitum að í heildar samhenginu er lægð hluti af vistkerfi að leita að jafnvægi. Stundum erum við stödd í miðju lægðarinnar. Þar er logn og gott veður, sama hvað gengur á þar sem stormurinn er mestur. Sama lögmál gildir varðandi þitt eigið líf. Ef þú ert í þinn miðju, þínum sannleik þá heldur þú alltaf jafnvægi átakalaust. Sama hvað gustar mikið frá þér þegar þú lætur til þín taka. Huldufólk hefur gefið okkur hugleiðslu sem hjálpar okkur að finna þessa miðju, finna kjarna okkar og sannleikann sem í honum býr. Þegar þú veist hver þú ert og hvers vegna þú ert hér, mun líf þitt vera í flæðandi jafnvægi. Hugleiðslan virkjar þekkinguna sem er í vitund jarðar og færir hana með lífsorkunni inn í líkama okkar. Þar skoðar hún hugsana og hegðunar munstrið og athugar hvort það myndar átakalausu flæðandi jafnvægi. Hinn möguleikinn er falskt jafnvægi sem hafa þarf fyrir að viðhalda með tilheyrandi striti, áhyggjum og ótta. Síðan leiðbeinir þessi þekking okkur að því jafnvægi sem er okkur eðlilegt. Við blómstrum átakalaust, líkt og planta sem vex átakalaut frá fræi í fullþroska plöntu sem ber ávöxt.
Ávanabindandi notkun á Internetinu og leikjum sem byggjast á netinu er ekki bara félagslegt fyrirbæri í löndum með víðtæka innviði fyrir netaðgang, heldur hugsanlegan geðröskun sem nefnist Internet gaming disorder (IGD) (1-3). Samkvæmt faraldsfræðilegum skýrslum er tíðni IGD hjá unglingum mismunandi milli landa, allt frá 0.8 til 26.7% (4). Sérstaklega sýna rannsóknir algengi yfir 10% hjá unglingum í mörgum löndum Asíu eins og Suður-Kóreu, Kína, Taívan, Hong Kong og Singapore (4). IGD tengist skerðingu á vitsmunum, sál-félagslegum tengslum og daglegu lífi; til dæmis, minnkandi námsárangur eða starfsárangur (4-7). IGD er nú innifalið í kafla III (skilyrði fyrir frekari rannsóknum) fimmtu endurskoðunar á greiningar- og tölfræðilegri handbók um geðraskanir (DSM-V) (8). En þrátt fyrir klínískt félagslegt mikilvægi er lítið vitað um sameinda erfðafræðilega fyrirkomulagið á bak við IGD.
Nýlegar stórar stærðar tvíburarannsóknir hafa bent til erfðafræðilegrar bakgrunns við IGD (9, 10). Vink o.fl. kannaði einstaka mun á nauðungarnotkun á Interneti með 5,247 einstofna og tvíkviða tvíburum í tvíburaskrá Hollands og greint frá því að 48% mismunanna hafi verið skýrt með erfðaþáttum (9). Li o.fl. fylgdust með 825 pörum kínverskra táninga táninga og greindu frá því að erfðafræðilegir þættir skýrðu 58 – 66% af mismuninum (10). Í samræmi við það eru fjölbrigði genanna sem taka þátt í taugaboð, vitsmuna og athygli eins og dópamínviðtaka D2 gen (DRD2), katekólamín-O-metýltransferasa gen (COMT), serótónín flutningsgen (5HTTLPR), og kólínvirka viðtaka nikótín alfa 4 gen (CHRNA4) hefur verið greint frá því að það sé verulega tengt netfíkn (11-13). Nýlega, Kim o.fl. skimað afbrigði af meira en 100 frambjóðandi genum sem tengjast framleiðslu, verkun og umbroti taugaboðefna með næstu kynslóð raðgreiningar og greint frá því að rs2229910 af NTRK3 gen er tengt IGD (14).
Til viðbótar við erfðaþættina er það einnig vel þekkt að svipgerðir á taugahegðunarstýringu stjórnast á erfðabreytileika með RNA sem ekki eru kóðaðir, þar á meðal örRNA (miRNA) (15, 16). miRNA eru litlar stakstrangar RNA sameindir sem ekki eru kóðaðar (u.þ.b. 20 – 23 kjarnar að lengd), sem stjórna neikvæðum tjáningu próteinkódandi gena með því að niðurbrjóta mRNA og gegna mikilvægu hlutverki í meinafræðilegu ferli fjölbreyttra sjúkdóma (17). Sönnunarlínur hafa sýnt fram á að miRNA eru mikið í miðtaugakerfi manna og miða að því að fínstilla tjáningarstig markgena þeirra sem taka þátt í þróun og þroska miðtaugakerfisins (15). Reyndar hafa nýlegar rannsóknir leitt í ljós að miRNA tjáningarsnið er breytt í heilavef sjúklinga með geðraskanir, sem bendir til þess að tjáningarsnið þeirra gæti verið lífmerki fyrir geðraskanir (15, 16, 18). Til dæmis, með greiningu eftir fæðingu, Lopez o.fl. greint frá því að tjáning á miR-1202, sem stjórnar tjáningu metabótrópísks glútamats viðtaka-4 gena og spáir svörun við þunglyndislyfi, hafi verið stjórnað niður í forrétthyrndum barkavef hjá sjúklingum með alvarlega þunglyndisröskun (19). Hvað varðar skimun á lífmerkjum hefur þessi nálgun takmarkaða takmörkun vegna þess að það er ómögulegt að framkvæma vefjasýni á miðtaugavef fyrir skimun. Þar sem hægt er að greina miRNA í blóði (plasma eða sermi), hafa miRNA í blóðrás eindreginn yfirburði sem ekki ífarandi lífmerki við taugasjúkdóma. Hins vegar hafa hingað til engar rannsóknir verið gerðar á dreifingu miRNA sniða í IGD. Betri skilningur á sniðum miRNA tjáningarsniðs gæti hjálpað til við að skýra gangverk þróunar IGD og auðvelda klíníska þýðingu.
Í þessari rannsókn miðuðum við að því að bera kennsl á IGD-tengda miRNA merkjum með því að fylgjast með mismunandi tjáðum miRNA-plasmum milli IGD og samanburðarhópa og kanna líffræðileg áhrif þeirra.
Efni og aðferðir
Námsgreinar
Við könnuðum 3,166 unglinga (á aldrinum 12 – 18 ára) með DSM-V IGD stigagjöf. Meðal þeirra voru 251 (168 karlar og 83 konur) greindir sem IGD samkvæmt DSM-V viðmiðunum (8). Alls 91 einstaklingar (49 IGDs og 42 stjórntæki) veittu upplýst samþykki fyrir þessari rannsókn. Meðal þeirra voru fjórir einstaklingar útilokaðir samkvæmt útilokunarviðmiðunum. Að lokum voru 87 einstaklingar (45 IGD einstaklingar og 42 heilbrigðir samanburðar einstaklingar) skráðir í þessa rannsókn. Meðal þeirra voru 51 þátttakendur (25 IGD sjúklingar og 26 eftirlit) ráðnir sem uppgötvunarsett frá 2014 til 2016. Hinir 36 þátttakendurnir (20 IGD sjúklingar og 16 stjórntæki) voru ráðnir sem sjálfstæð staðfesting sett frá 2016. Allir þátttakendurnir voru kóreskir einstaklingar, skráðir frá Seoul St. Mary sjúkrahúsinu (Seoul, Suður-Kóreu) og Seoul National University Boramae Hospital (Seoul, Suður-Kóreu). Allir þátttakendur fóru í skipulagt viðtal hjá geðlækni byggða á kóresku Kiddie tímaáætluninni fyrir sótttruflanir og geðklofa (K-SADS-PL) (20). Allir þátttakendur luku Block Design og Vocabulary undirprófum á kóreska-Wechsler upplýsingaöflun fyrir börn, 4th útgáfa (K-WISC-IV) (21). Hvatvísi var metin með Barratt Impulsiveness Scale (BIS) (22). Hegðunarkerfi (BInS) og atferlisörvunarkerfi (BAS) voru mæld til að meta persónuleikavídd (23). Útilokunarviðmið voru ma fyrri eða núverandi meiriháttar læknisfræðilegir sjúkdómar (td sykursýki), taugasjúkdómur (td flogaköst, höfuðáverka), geðraskanir (td meiriháttar þunglyndisröskun, kvíðaröskun), þroskahömlun eða hvers kyns vímuefnaneyslu (td , tóbak, kannabis, áfengi). Almenn einkenni rannsóknarefnanna eru tekin saman í töflu Table1.1. Rannsókn þessi var samþykkt af stofnananefnd stjórnar kaþólska háskólans í Kóreu (MC16SISI0120). Allir þátttakendur og foreldrar þeirra veittu skriflegt samþykki.
Tafla 1
Almenn einkenni rannsóknarefnanna.
| Discovery | löggilding | Samsett | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Stjórna | IGD | P- gildi | Stjórna | IGD | P- gildi | Stjórna | IGD | P- gildi | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Aldur (ár) | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 13 (12-17) | 13 (12-15) | 0.759 | 15 (13-18) | 14.5 (12-18) | 0.628 | 14 (12-18) | 14 (12-18) | 0.509 |
| Vikutímar fyrir netspil (h) | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 5.25 (2-17) | 18 (6-46) | 1.27E − 6a | 5.5 (2-23) | 8 (1-112) | 0.374 | 5.5 (2-23) | 14 (1-112) | 1.63E − 5a |
| Mánaðarlegar heimilistekjur (milljónir KRW) | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.588 | 4 (4-4) | 2 (2-2) | 1.000 | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.460 |
| Menntun (ár) | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 8 (7-9) | 8 (7-9) | 0.584 | 12 (12-12) | 6 (6-13) | 0.305 | 8 (7-12) | 8 (6-13) | 0.269 |
| K-WISC: lokahönnun | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 10.5 (4-17) | 10 (4-16) | 0.544 | 10 (3-16) | 12.5 (4-15) | 0.125 | 10 (3-17) | 11 (4-16) | 0.598 |
| K-WISC: orðaforði | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 9 (5-17) | 7 (5-13) | 0.174 | 9.5 (8-15) | 11.5 (5-15) | 0.595 | 9 (5-17) | 9 (5-15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 24 (17-36) | 37 (22-51) | 3.81E − 6a | 29 (17-34) | 59 (22-108) | 1.2E − 5a | 25 (17-36) | 40 (22-108) | 2.05E − 10a |
| BIS | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 63 (35-75) | 67.5 (45-81) | 0.080 | 61 (45-79) | 63 (32-82) | 0.835 | 62 (35-79) | 65 (32-82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 31 (15-40) | 31 (13-51) | 0.558 | 36.5 (22-48) | 34 (27-52) | 1.000 | 32 (15-48) | 34 (13-52) | 0.637 |
| BINS | |||||||||
| Miðgildi (mín – max) | 18 (10-26) | 17.5 (13-27) | 0.642 | 18.5 (12-25) | 20 (13-21) | 0.138 | 18 (10-26) | 19 (13-27) | 0.302 |
IGD, sjúklingar með netspilunarröskun; KS, kóreska mælikvarði á netafíkn; BIS, Barratt Impulsivity Scale; BAS, atferlisörvunarkerfi; BInS, hegðunarhömlunarkerfi; KRW, kóreska won.
aP <0.05 (Mann – Whitney – Wilcoxon próf).
TaqMan lágþéttleiki miRNA Array (TLDA) tilraunir
Jaðarblóði var safnað frá hverjum þátttakanda og fluttur á rannsóknarstofuna innan 4 klst. Til að lágmarka blóðfrumnalýsingu. Sýnið var skilvindt við 3,000 snúninga á mínútu í 10 mínútur við stofuhita. Síðan var flotvatni (plasmalag) safnað án þess að menga blóðkornin. MiRNA í blóðrás var dregið út með TaqMan miRNA ABC hreinsunarbúnaði (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) samkvæmt fyrirmælum framleiðanda. Í stuttu máli var 50 μL af plasmasýni og 100 μL af ABC biðminni blandað saman. Eftir blendinga með mark-sértækum and-miRNA segulperlum var afmarkaðri streymandi miRNA voru elúaðir úr perlunum með 100 pl af skolunarbuffi. Í uppgötvunarstiginu voru 381 miRNA rannsökuð úr 51 plasma sýnum (25 IGDs og 26 stjórntækjum) með því að nota TaqMan miRNA ABC hreinsunarbúnaðinn (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðandans. Megaplex umritun og forstækkunarviðbrögð voru framkvæmd til að auka magn af cDNA fyrir miRNA tjáningargreiningu með því að nota MegaplexPreAmp Primers Human Pool A og TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). TLDA spjaldið A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) var keyrt á ViiA7 rauntíma PCR kerfinu (Thermo Fisher Scientific) til að meta tjáningu miRNA. Hrá gögn voru unnin með því að nota ExpressionSuite hugbúnað v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) til að ákvarða Ct gildi fyrir hvert miRNA.
Gagnagreining fyrir TLDA
Við mældum fyrst þröskuldslotur (Ct gildi) hvers miRNA. miRNA með Ct gildi> 35 voru talin ógreinanleg og útilokuð frá síðari greiningu. Öll Ct gildi voru stöðluð í Ct gildi miR-374b (ΔCt gildi), eitt mest stöðuga tjáða miRNA sem dreifist í plasma manna (24). Log2 brotabreytingarhlutfall (ΔΔCt gildi) tjáningar var reiknað með meðalgildum stjórnarsýna sem kvarða í HTqPCR pakkanum í Bioconductor (25). Hlutfallsleg magngreining (RQ) hvers miRNA markmiðs var skilgreind sem 2-ΔΔCt. Við tilgátuprófun á munnum á tjáningu milli tveggja hópa beittum við staðgönguspennu greiningu (SVA) til að fanga misleitni eins og lotuáhrif í tilraunum með sva pakki í lífleiðara (26). miRNA með a P-gildi <0.05 voru talin vera marktækt mismunandi milli tveggja hópa.
Genasett auðgunargreining
Við greiningar á auðgun gena notuðum við ToppFun í ToppGene Suite (27) til að álykta verulega auðgað Gene Ontology (GO) (28) hugtök, leið og sjúkdómsskilmálar. Sem inntak fyrir þessa nálgun notuðum við 1,230 spáð markgeni umsækjanda miRNA. Stígagreining var notuð til að finna verulegar leiðir fyrir spáð mark gena samkvæmt KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP og MSigDBin í ToppGene leiðunum. Mikilvægi virkni auðgunarskilmála var ákvarðað út frá Bonferroni aðlagað P-virði.
Magnbundin umritunar PCR (qRT-PCR) löggilding og endurtekning
Til að sannreyna 10 miRNA sem voru mismunandi á svip á stigi uppgötvunar var qRT-PCR framkvæmd með TaqMan MicroRNA greiningunni (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3, 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5 # 002340 -483p, #5; og miR-002338-652p, #3) og ViiA002352 kerfið (Life Technologies) í samræmi við siðareglur framleiðanda. Tíu nanógrömmum af heildar RNA var breytt í fyrsta strengi cDNA með miRNA-sértækum grunnur með því að nota TaqMan MicroRNA línur umritunarbúnaðar (#7, Life Technologies), fylgt eftir með rauntíma PCR með TaqMan rannsaka. RQ hvers miRNA var skilgreint sem 4366596−ΔCt, þar sem ΔCt er mismunur á þröskuldarferlum fyrir viðkomandi sýni, staðlað gegn innrænu miRNA (miR-374b-5p, #001319). Öll PCR viðbrögð voru framkvæmd í þríriti og Ct gildi þeirra voru að meðaltali. Við reiknuðum log2 brjóta breytingahlutfall (ΔΔCt) fyrir hvert miRNA á sama hátt og í fylking byggðri greiningu. Mann-Whitney-Wilcoxon próf, sem ekki var valið, var prófað til að prófa mismuninn á tjáningarstig miRNA í tveimur hópum með þröskuld P-Gildi 0.05.
Western Blot Greining
Hvert sermisýni var fyrnt úr efstu 14 próteinum í miklu magni (albúmíni, immúnóglóbúlíni G, ónæmisglóbúlíni A, serótransferríni, haptóglóbíni, alfa-1 antitrypsíni, fíbrínógeni, alfa-2 makróglóbúlíni, alfa-1 sýru glýkóprólín ónóg, Mótefni, , apólípróprótein A-II, viðbót C3 og transthyretin) með því að nota MARS-14 dálkinn (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) áður en Western blot greining var gerð. Óbundna hlutinn, sem fenginn var úr MARS-14 súlunni, var þéttur með því að nota Amicon Ultracel-3 miðflótta síu (3 kDa niðurskurð), og síðan var próteinstyrkur ákvarðaður með því að nota bíkínkónínsýru aðferðina. Sama magn (frá 10 til 30 μg) af samanburðar- og IGD sermisýni voru aðskilin á 4 – 20% Mini-PROTEAN TGX forsteikt hlaup (Bio-Rad, CA, USA) og flutt yfir í pólývínýlidendíflúoríðhimnu. Næst var himna lokað í TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris – HCl, pH 7.5 og 0.05% Tween 20) með 5% ófitu þurrmjólk við stofuhita í 30 mín. Himnurnar voru síðan ræktaðar með aðal mótefnum gegn DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, Bandaríkjunum), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, Bandaríkjunum), og CNR1 (1: XNUMechn, Santa , Inc., Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum), DUSP100 (4: 1, MybioSource, San Diego, CA, Bandaríkjunum), og PI500 (15: 1, MybioSource, San Diego, CA, Bandaríkjunum) í TBS-T með 500 % ófitu þurrmjólk við 5 ° C yfir nótt og síðan með viðeigandi aukamótefnum annað hvort nautgripamús (4: 1, Santa Cruz Biotechnology) eða geitavörn gegn kanínu (1,000: 1, Cell Signaling, Beverly, MA, USA ) samtengd við piparrótperoxídasa við stofuhita í 1,000 klst. Merkjasending var framkvæmd með því að nota kemiluminescence með ECL hvarfefni (GE heilsugæslustöð, Piscataway, NJ, Bandaríkjunum). Við töluðum niðurstöður Western blot með því að nota TotalLab 1D greiningarhugbúnað (Non-lineear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Síðan var þéttleiki hlutfallsgildisins reiknað með því að deila þéttleiki gildi hvers sýnis eins og lýst er annars staðar (29). Sem stjórnun á eðlilegleika var sermisýni safnað saman úr 46 IGD og samanburðarsýni voru notuð við hverja tilraun. Tölfræðileg marktækni var ákvörðuð með því að nota Mann-Whitney – Wilcoxon próf sem ekki var valið með hliðsjón af þröskuldinum P-Gildi 0.05.
Niðurstöður
Einkenni rannsóknarefnanna
Lýðfræðilegur og klínískur eiginleiki rannsóknarinnar var sýndur í töflu Table1.1. Þegar við bárum saman IGD og samanburðarhópa samkvæmt kóreska netafíkninni Mælikvarða (K-Kvarða) eins og lýst er annars staðar (20, 30) sýndi IGD hópurinn marktækt hærra miðgildi K-mælikvarða en samanburðarhópurinn (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Tafla (Table1) .1). Miðgildi tímans sem varið var í netspilun í IGD hópnum var marktækt lengri en stjórntækin (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Þó að enginn marktækur munur væri á milli tveggja hópa í aldri, mánaðarlegum tekjum heimilanna, lengd menntunar, hönnunar á blokk og niðurstöðum K-WISC, BIS, BInS og BAS.
Mismunandi áberandi miRNA milli IGD og stýringar
Til að uppgötva IGD-tengda miRNA samþykktum við tveggja þrepa (uppgötvun og óháð staðfestingu) nálgun. Hönnun rannsóknarinnar og heildarstefnan er sýnd á mynd S1 í viðbótarefni. Á uppgötvunarstiginu greindum við miRNA tjáningarsnið af 51 sýnum (25 IGDs og 26 stjórntækjum) með því að nota miRNA fylkið sem inniheldur 384 miRNA. Tjáningarstig 10 miRNA reyndust vera marktækt mismunandi milli IGD og samanburðarhópa (tafla (Table2) .2). Hlutfallsleg tjáningarstig þessara 10 miRNA eru sýnd á mynd Figure1.1. Meðal þeirra voru tveir (hsa-miR-423-5p og hsa-miR-483-5p) uppfærðir og átta (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-XNX, hsa-miR-3b-125p, hsa-miR-5c-200p, hsa-miR-3c-337p, hsa-miR-5-411p og hsa-miR-5-652p) voru stjórnað niður í IGD hópnum.
Tafla 2
Öðruvísi tjáðir microRNAs (miRNAs) og brjóta breytingar.
| miRNA | Discovery | löggilding | Samsett | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P- gildi | Fellibreyting | P- gildi | Fellibreyting | P- gildi | Fellibreyting | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNA breyttist verulega í bæði uppgötvun og staðfestingarsettum á stöðugan hátt.
qRT-PCR Mat á frambjóðandi miRNA
Til að sannreyna 10 frambjóðandi miRNA, gerðum við qRT-PCR með sjálfstæðri staðfestingarsett (20 IGDs og 16 stýringar) (tafla S1 í viðbótarefni). Þrjú af þessum miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p og hsa-miR-652-3p) voru marktækt niðurregluð í IGD hópnum í staðfestingarsettinu (tafla (Table2) .2). Þrjú önnur miRNA (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b og hsa-miR-423-5p) voru einnig lækkuð í IGD hópnum en ekki marktækt. Eftirstöðvar fjögurra miRNAs (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p og hsa-miR-423-5p) voru sett fram andstætt í löggildingarmyndinni. Þegar við sameinuðum uppgötvun og staðfestingarsett (samtals 45 IGD einstaklingar og 42 stýringar) voru þrjú staðfestu miRNA stöðugt marktæk (Tafla (Table2) .2). Ítarlegar upplýsingar, litninga staðsetningar, þroskaðir raðir og tjáningarstig í miðtaugakerfi þessara þriggja miRNA eru fáanleg í töflu S2 í viðbótarefni.
Samverkandi áhrif samtímis breytinga þriggja miRNA á IGD áhættu
Til að meta samanlögð áhrif þriggja miRNA, fylgdumst við með líkindahlutföllum (OR) fjögurra undirhópa (með 0, 1, 2 eða 3 miRNA breytingum). breyting á miRNA var skilgreind með RQ gildi eins og lýst er í kafla “Efni og aðferðir. “Vegna þess að öll þrjú merkin um miRNA voru niðurregluð í IGD hópnum var trítlað með miRNA sem hafði gildi RQ fyrir neðan eitt sem breytt. Ítarlegar upplýsingar um RQ gildi hvers námsgreinar fyrir þrjú miRNA eru í boði í töflu S3 í viðbótarefni. Fyrir hvern undirhóp voru líkurnar reiknaðir sem hlutfall fjölda stýringa og IGDs, þá var hver OR reiknaður með því að deila líkum hvers undirhóps með líkum undirhópsins án breytinga á miRNA. Einstaklingar með þrjár breytingar á miRNA sýndu 22 sinnum meiri áhættu en þeir sem voru án breytinga á miRNA (EÐA 22, 95% CI 2.29 – 211.11). OR sýndu aukna þróun með fjölda breyttra miRNA frá 0 til 3 (r2 = 0.996) (mynd (Mynd22).
GO og leiðargreining á markgeni frambjóðandi miRNA
Til að fá innsýn í aðgerðir þriggja miRNA merkja sem verulega voru stjórnaðir í IGD hópnum var spáð genum þeirra með því að nota miRWalk 2.0 gagnagrunninn (31). Alls var 1,230 genum stöðugt spáð sem niðurföllum markmiðum með fjórum reikniritum (miRWalk, miRanda, RNA22 og Targetscan) með því að nota miRWalk gagnagrunninn (32-34) (Tafla S4 í viðbótarefni). Genasett auðgunargreining með því að nota ToppFun í ToppGene Suite sýndi að mark genin á þeim miRNA voru marktækt tengd taugaþróunarferlum eins og „Axon leiðsögn“ og GO hugtök eins og „neurogenesis“ (tafla S5 í viðbótarefni).
Tjáning genanna sem spáð er
Meðal neðangreindra markgena þriggja miRNA, var 140 spáð samtímis fyrir tvö eða fleiri miRNA (tafla S4 í viðbótarefni). Við völdum 2 gen til að kanna hvort próteinstjáningargildi þeirra undirmarka gena sem eru mismunandi eftir IGD og samanburðarhópunum (DUSP4 og PI15), sem er spáð sem markmiðum fyrir öll 3 miRNA og 3 gen til viðbótar (GABRB2, DPYSL2og CNR1) frá þeim sem spáð var fyrir 2 miRNA og framkvæmt western blot greining með plasma sýnum úr 28 IGD og 28 stýringum sem voru tiltækar fyrir tilraunina. Við bárum saman tjáningu fimm markmiðanna milli IGD og samanburðarhópa með því að mæla styrkleiki og svæði eins og lýst er annars staðar (29). Meðal þeirra, tjáningarstig DPYSL2 (28 IGDs og 28 stjórntæki, P = 0.0037) og GABBR2 (27 IGD og 28 stýringar, P = 0.0052) voru marktækt hærri í IGD hópnum (mynd (Mynd3) .3). Hins vegar gátum við ekki fylgst með mismunandi tjáningum CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) og PI15 (P = 0.6346).
Discussion
Greint hefur verið frá því að miRNA taka þátt í taugafrumum (35, 36), og mismunandi tjáning á heila miRNA sést í geðsjúkdómum eins og geðklofa (37). Þess vegna er líklegt að miRNA snið í dreifingu geti verið gagnleg lífmerkir fyrir IGD. Ráðlagt hefur verið að dreifa miRNA sem lífmerkjum fyrir fjölbreyttum geðsjúkdómum (38-40); samt eru sameindirnar að baki þróun IGD enn að mestu óþekktar þrátt fyrir klínískt og félagslegt mikilvægi þess. Sérstaklega hafa engar rannsóknir verið gerðar á IGD-tengdum miRNA. Markmið þessarar rannsóknar var tvíþætt. Í fyrsta lagi reyndum við að uppgötva miRNA í plasma í tengslum við IGD. Í öðru lagi lögðum við mat á líffræðilega afleiðingu miRNA frambjóðendanna með því að kanna próteintjáningu og GO af undirmarkmiðsgenum. Í gegnum erfðamengd skimun á miRNA tjáningarsniðum og staðfestingu neðri frambjóðenda uppgötvuðum við að tjáning þriggja miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p og hsa-miR-652-3p) var marktækt lægri hjá IGD sjúklingum en samanburðarhópum. Þó að tjáningarmynstur annarra sjö miRNA frambjóðenda hafi ekki verið endurtekið við staðfestinguna, getur það verið rangt neikvætt vegna lítillar sýnishorns í þessari rannsókn. Að okkar vitneskju er þetta fyrsta skýrslan um möguleikann á því að miRNA tjáningarsnið gæti verið gagnlegt lífmerk fyrir IGD. Samsetning þriggja miRNA merkja gæti þjónað sem lítið ífarandi tæki til að bera kennsl á fólk á hættu á IGD snemma.
Greint hefur verið frá því að miRNA sem greind voru í þessari rannsókn hafi tekið þátt í fjölbreyttum geðsjúkdómum. Greint hefur verið frá því að tjáningu hsa-miR-200c í blóði sé stjórnað af nokkrum geðsjúkdómum svo sem geðklofa (41) og helstu þunglyndisþættir (42). Greint var frá því að miR-200c hafi meira verið tjáð í synaptic brotum en í heildar framheilanum (43) og einnig til að tengjast taugafrumudauða (44). Byggt á þessum fyrri skýrslum, miR-200c tekur þátt í taugarþróun og getur tengst taugasjúkdómum ef tjáning þess er trufluð. Nokkrar rannsóknir hafa bent til tengsl milli miR-652 og hættu á taugasjúkdómum. Líkt og nálgun okkar, til að bera kennsl á lífmerkja í blóði fyrir geðklofa, Lai o.fl. framkvæmdi TLDA greiningu með geðklofa sjúklingum og eðlilegum samanburði og kom í ljós að sjö miRNA, þ.mt hsa-miR-652, voru mismunandi áberandi hjá geðklofa sjúklingum (45). Í síðari rannsókninni hönnuðu þeir forspárlíkan með því að nota tjáningargögn miRNA og aðgreindu geðklofa með góðum árangri frá venjulegri stjórn (46). Breytt tjáning hsa-miR-652 kom einnig fram hjá alkóhólistum (47). Hsa-miR-26b reyndist vera virkjaður við taugafrumumunun (48). Perkins o.fl. greint frá því að hsa-miR-26b hafi verið stjórnað niður í forstilltu heilaberki sjúklinga með geðklofa (49).
Þrátt fyrir að engar beinar vísbendingar séu fyrir því að styðja sambandið milli truflaðrar tjáningar þessara miRNA og meinafræði IGD, getum við ályktað að truflun á þessum miRNA gæti verið tengd meinafræðinni í IGD byggð á ýmsum fyrri skýrslum um erfðabreyttu genin sem við spáðum . Nokkur af eftirliggjandi genum þriggja miRNA eins og GABRB2, CNR1, NRXN1og DPYSL2 er greint frá því að það tengist taugasjúkdómum. Gamma-amínó smjörsýra (GABA) er aðal hindrandi taugaboðefni í miðtaugakerfinu. Aðgreining GABA viðtakans, hefur áhrif á taugasjúkdóma, þ.mt fíkn, kvíða og þunglyndi (50), sem eru einnig meginatriði IGD (8). Tilkynnt hefur verið um að fjölbreytileiki erfða í GABA viðtaka genum tengist áfengisfíkn og geðklofa (51, 52). Dihydropyrimidinase-lík 2 (DPYSL2) er meðlimur í samanburðarpróteinfjölskyldunni Collapsin svörun, sem gegnir hlutverki í míkrótúlu samsetningu, sinaptic merki og stjórnun axonal vaxtar. Þess vegna hefur þessari sameind verið stungið upp sem lífmerki fyrir geðraskanir (53, 54). Fjölbrigði í DPYSL2 gen var einnig tengt áfengisnotkunarsjúkdómi (55). Fyrri skýrslur og gögn okkar benda til þess að ofdreifing GABRB2 og DPYSL2, neðansjávar markmið neðri stjórnaðra miRNA, hafi afleiðingar fyrir meingerð taugasjúkdóma, þ.mt IGD. Kannabínóíðviðtaka gerð 1 (CNR1) er forstigsaðsogar viðtaka sem mótar losun taugaboðefna og truflanir í merki um kannabisefni tengjast tengslum við ýmis taugasjúkdóma (56). Erfðafjölbreytni CNR1 vitað er að gen er tengt efnafíkn hjá hvítum.57). Í rottulíkani truflar virkjun ventral hippocampus CNR1 eðlilega félagslega hegðun og vitsmuna (58). Vitað er að erfðabreytingar í NRXN fjölskyldunni taka þátt í fjölbreyttum geðsjúkdómum, þar með talið fíkn (59).
Til að kanna líffræðilega afleiðingu þriggja miRNA frambjóðenda á beinari hátt skoðuðum við próteintjáningu markmiðs gena þeirra í neðra streymi. Vegna takmarkaðs framboðs á blóðsýnum, af 140 algengu frambjóðendunum (spáð sem niður fyrir 2 eða fleiri miRNA), skoðuðum við 5 markmið (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 og PI15) eftir western blot og staðfestum að tjáning GABRBXUM og DPYSL2 var marktækt hærri í IGD hópnum. Fyrri skýrslur og gögn okkar benda til þess að ofdreifing GABRB2 og DPYSL2, neðri stig markmiðs neðri stjórnaðra miRNA, geti haft afleiðingar fyrir meingerð taugasjúkdóma, þ.mt IGD. Niðurstöður GO og leiðargreiningar á taugaþróunarferlum styðja einnig taugasálfræðilega afleiðingu miRNA merkisins. Önnur áhugaverð niðurstaða voru samverkandi áhrif samtímis breytinga á miRNA. Einstaklingar með lækkun á öllum 2 miRNA sýndu 3 sinnum meiri áhættu en þeir sem ekki höfðu reglur um neinar niðurstöður, og hækkuðu OR á skammtaháðan hátt. Þrátt fyrir að CI fyrir þessar þrjár breytingar væru breiðar vegna takmarkaðs sýnisstærðar var skýr jákvæð fylgni (r2 = 0.996) styður samverkandi áhrif miRNAs þriggja.
Þrátt fyrir að við uppgötvuðum IGD tengda miRNA merkjum og einstaklingar með allar þrjár miRNA breytingar höfðu áhættu 22 sinnum hærri en þær sem voru án miRNA breytinga, eru nokkrar takmarkanir í þessari rannsókn. Í fyrsta lagi jók litla sýnishornið líkurnar á því að vanta aðra marktæka miRNA-merki. Í öðru lagi, þar sem gögn okkar voru ekki næg til að skýra hvort plasma-miRNA sniðin eru annað hvort orsök eða afleiðing, getum við ekki staðfest líffræðilega hlutverk þessara merkja sem ekki hafa verið ífarandi í klínískum aðstæðum. Frekari upplýsingar um miRNA og genagreining þeirra í eftirliggjandi geðvef með mönnum úr heilavefsbanka getur gefið beinara svar. Heilagreining á vefjum með dýralíkani leikjatruflana væri einnig gagnleg. Í þriðja lagi, vegna takmarkaðs framboðs á blóðsýnum, skoðuðum við aðeins fimm sameindir frambjóðenda. Að kanna fleiri niðurföll markmið með stærra sýnishorni mun vera gagnlegt til að skilja enn frekar sameindatækni IGD.
Í stuttu máli, við erfðamengi skimun á miRNA tjáningarsniðum og óháð staðfestingu, fundum við þrjú IGD tengd miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p og hsa-miR-652-3p). Sagt er að mörg af downstream genunum þeirra hafi þátt í fjölbreyttum taugasjúkdómasjúkdómum og tilraunamat á breyttri tjáningu þessara downstream gena styður vísbendingu um miRNA sem greind voru í þessari rannsókn. Við komumst að því að einstaklingar með niðurlægingu á öllum þremur miRNA eru í mikilli hættu á IGD. Ásamt þekktum klínískum eða umhverfislegum áhættuþáttum og greiningarviðmiðum geta niðurstöður okkar auðveldað snemma íhlutun til að hjálpa fólki sem er í meiri hættu á IGD.
Siðareglur Yfirlýsing
Rannsókn þessi var samþykkt af stofnananefnd stjórnar kaþólska háskólans í Kóreu (MC16SISI0120). Allir þátttakendur og foreldrar þeirra veittu skriflegt samþykki.
Höfundur Framlög
ML og HC lögðu jafn mikið af mörkum við þessa grein. ML, D-JK og Y-JC hannuðu rannsóknina. SJ, S-MC, YP, DC, og JL gerðu tilraunir og gagnaöflun. J-WC, S-HP, J-SC og D-JK söfnuðu blóðsýnum og klínískum upplýsingum. ML, HC, S-HY og Y-JC greindu gögn. ML, HC, S-HY og Y-JC lýstu handritinu. Y-JC hafði umsjón með verkefninu.
Hagsmunaárekstur
Höfundarnir lýsa því yfir að rannsóknirnar hafi farið fram án þess að viðskiptabundin eða fjárhagsleg tengsl gætu talist hugsanleg hagsmunaárekstur.
Neðanmálsgreinar
Fjármögnun. Þessi vinna var studd af styrk frá heilarannsóknaráætluninni í gegnum National Research Foundation of Korea (NRF), styrkt af vísinda- og upplýsingatækni- og framtíðarskipulagi (NRF-2015M3C7A1064778).
Viðbótarefni
The viðbótarefni fyrir þessa grein er að finna á netinu á http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Meðmæli
;