מָקוֹר
מכון נתן קליין, אורנגבורג, ניו יורק, 10962, ארה"ב. [מוגן בדוא"ל]
תַקצִיר
ילדים ומתבגרים נחשפים יותר ויותר לפסיכו-סולימולנטים, באופן בלתי חוקי או לטיפול בתנאים נוירופסיכיאטריים נפוצים, כגון הפרעת קשב וריכוז עם היפראקטיביות וללא פעילות. למרות השימוש הנפוץ בתמריצים פסיכו-מוטוריים בקבוצות גיל צעירות, מעט ידוע על תגובות נוירו-יציבות מולקולריות כרוניות לסוכנים אלו במוח הבלתי מפותח. כאן אנו מדגימים את זה, לאחר ניהול כרוני של psychostimulants קוקאין ו אמפטמין, גורם שעתוק דלתא הוא upregulated בגרעין accumbens של peridadolescent עכברים אבל לא אחרי-משחק או מבוגר עכברים. אינדוקציה של דלתא גם מתרחשת באופן בלעדי ב putamen של caudate peridadolescent עכברים לאחר אמפטמין הממשל. תוצאות אלה מדגימות את הפלסטיות הייחודית במוח המתבגר של מולקולה ביקורתית המסדירה פעולה פסיכו-סוליטית ומציעה ששינויים נוירו-יציבותיים אלו עשויים להיות מעורבים בגישור של משופר מגמות ממכרות אצל המתבגר יחסית למבוגר.
מבוא
פסיכוסטימולנטים משמשים לטיפול בהפרעות בילדות נפוצות, כגון הפרעת קשב וריכוז. בנוסף, התעללות בממריצים, כולל אמפטמין וקוקאין, שכיחה בקרב מתבגרים, גיל שבו יש ראיות לנטיות מגבירות משכרות ביחס למבוגרים (Estroff ואח ', 1989; מיירס ואנדרסון, 1991). למרות נתונים המצביעים על השפעות התנהגותיות מוסדרות מבחינה התפתחותית, מעט מאוד ידוע על תגובות נוירו-יציבות מולקולריות במוח הבלתי מפותח המתרחשות בזמן ניהול של סוכנים אלו. קוקאין ואמפטמין עשויים להשפיע על שינויים התנהגותיים לאורך זמן באמצעות גירוי של דופמין D1קולטנים ועלייה ברמות גורמי שעתוק, כולל ΔFosB, בסטריאטום הגבי (כלומר, פוטאמן מבוקר) והסטריאטום הגחוני (כלומר, גרעין אקומבנס)חן ואח ', 1997). עלייה ברמות של ΔFOSB, אולי באמצעות ייצוב של מוצרי חלבון, מתמשכת במשך מספר שבועות לאחר חשיפה כרונית לקוקאין או אמפטמין ומווסתת לפחות בחלקו על ידי מסלול התמרה האות דופאמין (חן ואח ', 1997; נסלר ואח ', 2001).
מערכת דופאמינרגית מרכזית של בעלי חיים צעירים הוא מאוד שטף כתוצאה של רמות משתנות של מולקולות קריטיות במהלך ההתפתחות הרגילה, כולל דופמין D1קולטן DARPP-32 (dopamine ו- cAMP מוסדר phosphoprotein, Mr של 32 kDa) ו cAMP (ארליך ואח ', 1990;טייכר ואח ', 1993; Perrone-Capano ואח ', 1996; טרזי ואח ', 1999;אנדרסן, 2002). חשיפה במהלך תקופה זו כדי psychostimulants, אשר משפרים נוירוטרנסמינציה דופאמינרגית, ולכן עלול לגרום לתגובות מולקולריות כמותית ו / או איכותית, כולל שינויים בביטוי ΔFosB. כדי לבדוק את ההשערה כי יש תגובות נוירו-יציבותיות תלויי גיל במהלך חשיפה כרונית לפסיכו-סולימולנטים, שלוש קבוצות של עכברים נותחו בניסויים סדרתיים: מבוגרים (60 זקן בהתחלה של זריקות), periadolescent (33 בן בהתחלה של זריקות) ו post-wanling (24 d הישן בתחילת הזרקה). זוהי ההשוואה הישירה הראשונה של תגובות נוירו-יציבות מולקולריות לחשיפה פסיכוסטימולנטית כרונית בשלוש קבוצות גיל אלו. מצאנו כי, לאחר פרדיגמות טיפול זהים, עכברים periadolescentcent להראות משופר ΔFOSB upregulation בתגובה הן קוקאין ואמפטמין.
חומרים ושיטות
בעלי חיים וניהול סמים. זכר CD-1 עכברים (Charles River Laboratories, Kingston, NY) היו שוכנים על XRUMX hr אור / מחזור כהה (12: 6 AM ל 00: 6 PM) עם מודעהגישה למזון ומים. בעלי חיים הורשו להתאים את חדר בעלי החיים עבור מינימום של 10 ד לפני תחילת זריקות. בעלי חיים טופלו על ידי שני חוקרים שביצעו את כל הזריקות באותו חדר שבו שוכנו בעלי החיים. כל בעלי החיים נגמלו ב 21 ד של גיל. הזרקות החלו ב- 24 (לאחר הפציעה), 33 (periadolescent) או 60 (מבוגר) של גיל. בעלי חיים קיבלו 20 מ"ג / ק"ג קוקאין (סיגמא, סנט לואיס, MO), 5 מ"ג / ק"ג אמפטמין (סיגמא), או נפח שווה של intraperitoneally מלוחים בין 4: 00 ו 5: 00 PM מדי יום עבור 7 ד. בעלי חיים נהרגו בעריפת ראש לאחר חשיפה קצרה ל- CO2 ב 10: 00 AM ביום שלאחר ההזרקה הסופית. מוח הוצא מיד מהגולגולת, והפטאמן הזקן והגרעין המתוקן גוזרו במהירות על קרח. כל הניתוחים בוצעו מפרוסות מוח קורונליות על ידי חוקר אחד, ותמציות חלבון הוכנו מרקמה טרייה ללא הקפאה. כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש היו בהתאם המוסדות הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
ניתוח כתם המערבי. עבור מנתח כתם המערבי, כמויות שוות של חלבון (40 מיקרוגרם עבור פוטאמן caudate ו 20 מיקרוגרם עבור גרעין accumbens) מכל מדגם נטענים בכל נתיב של XNXX% SDS-polyacrylamide ג'ל לאחר המדידה של ריכוז חלבון עם assay BCA (פירס, רוקפורד, אילינוי). שווה חלבון טעינה אושרה גם על ידי הדמיה של החלבון הכולל על ידי פונצ'ו אדום לאחר העברת ניטרוצלולוזה ו / או סופג עם נוגדן אנטי אקטין (10: 1, Sigma). אנטיגן אנטיגן הקשור ל- FOS, המזהה את האיזופורמים ΔFosB, סופק בנדיבות על ידי ד"ר מ. ידרולה (מכוני הבריאות הלאומיים, בת'סדה, MD) והשתמש בריכוז של 500: 1. לימודים קודמים (חן ואח ', 1997; Hiroi ואח ', 1997), כולל preesorption של FRA antraum עם M-peptide immunogen, הוכיח את הספציפיות של antisum זה. DARPP-32 5a נוגדנים חד שבטיים, בשימוש ב 1: 10,000, סופק בנדיבות על ידי ד"ר. יו המינגס ופול גרינגרד (אוניברסיטת רוקפלר, ניו יורק, ניו יורק). נוגדנים דופמין טרנספורטר (DAT) היה מ Chemicon (Temecula, CA). כתמים היו מגיבים עם NEN-DuPont (בוסטון, MA) chemiluminescence מערכת חשופים לסרט. ערכים Densitometric עבור ∞FosB immunoreactivity הושגו באמצעות ScanAnalysis עבור אפל (Biosoft, פרגוסון, MO). משמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות ANOVA חד כיווני, ואחריו פוסט הוק מבחן ההשוואה המרובה של טוקי או סטודנט לא זוגי, דו-זניתי t הבדיקה כפי שצוין באגדות דמות. עבור הניסויים לטיפול בסמים, ניתוח של כל קבוצת גיל בוצע על כתם נפרד, ולכן, כל קבוצה מלוחים הוקצה באופן שרירותי ערך 100% להשוואה בין קבוצות הגיל. עבור מחקרים ontogeny, דגימות מכל קבוצות הגיל נותחו יחד על כתם אחד.
תוצאות
אינדוקציה של ΔFosB לאחר קוקאין ואמפטמין מתרחשת בגרעין accumbens של עכברים periadolescent בלבד
הביטוי של ΔFosB נמדד בגרעיני אקטומבוס ובפוטאמן מבושל של עכברים לאחר לידה, periadolescent, ומבוגרים לאחר 7 ד של אמפטמין או ממשל קוקאין. הגרעין המקיף הוא אזור המוח האמין כי הוא קריטי ביותר עבור מתווך את ההשפעות מתגמלת של psychostimulants. ΔFosB immunoreactivity (35 kDa) היה המושרה באופן סלקטיבי בגרעין accumbens של חיות periadolescent לאחר ניהול כרוני של אמפטמין (איור 3). 1 A) או קוקאין (איור 3). 1 B). לעומת זאת, רמות של ΔFosB (35 kDa) לא השתנו באופן משמעותי בגרעין של בעלי חיים לאחר הפציעה או בבגרות (איור 3).1 A,B). ב Putamen caudate, רמות ΔFosB (35 kDa) היו גם upregulated משמעותית לאחר הממשל amphetamine כרונית רק חיות periadolescent (איור 3).2 A). כל שלוש קבוצות הגיל הראו עליות משמעותיות ביטוי ΔFosB (35 kDa) ב Putamen caudate לאחר ניהול כרוני של קוקאין (איור 3).2 B). עם זאת, גודל האינדוקציה היה גדול יותר בחיות הפריאדיות, במיוחד בהשוואה לפוסט-וינלינג (איור 3). 2 B). איסופורמים אחרים של FRA ו- Fos לא השתנו בכל קבוצות הגיל (הנתונים אינם מוצגים).
ΔFosB immunoractivity בגרעין Accumbens לאחר ניהול כרוני psychostimulant. CD-1 עכברים הוזרקו פעם ביום עם מלוחים, אמפטמין, או קוקאין עבור 7 ד החל ביום 24 (P24; לאחר וינינג), יום 33 (P33; periadolescent), או יום 60 (מְבוּגָר). רמות של ΔFosB (35 kDa) immunoreactivity בגרעין accumbens מוצגים לאחר amphetamine כרונית (A) או קוקאין (B). נציג immunoblots מ מלוחים- (S), amphetamine- (A), וקוקאין (C) מוזרק לאחר וינינג (P24), periadolescent (P33), ועכברים בוגרים מוצגים לוחות העליון. פאנלים תחתונים מראים ממוצע ± SEM אחוז הביטוי הבסיסי ΔFosB. n ערכים עבור כל קבוצה מוצגים סורגים. עליות משמעותיות ב- ΔFOSB נמצאו בגרעין הנבדק של העכברים הפריאדלסנטיים בלבד. *p <0.05; **p <0.01 (סטודנטים t הבדיקה; סלין נגד סמים).
ΔFosB immunoreactivity ב Putamen caudate לאחר הממשל הפסיכוסטימולנטי. CD-1 עכברים הוזרקו פעם ביום עם מלוחים, אמפטמין, או קוקאין עבור 7 ד החל ביום 24 (P24; לאחר וינינג), יום 33 (P33; periadolescent), או יום 60 (מְבוּגָר). רמות של ΔFosB (35 kDa) immunoreactivity ב Putamen caudate מוצגים לאחר amphetamine כרונית (A) או קוקאין (B). נציג immunoblots מ מלוחים- (S), amphetamine- (A), וקוקאין (C) הזריקו עכברים periadolescent (P33) מוצגים בלוחות העליון. פאנלים תחתונים מראים ממוצע ± SEM אחוז הביטוי הבסיסי ΔFosB. n ערכים עבור כל קבוצה מוצגים סורגים. מגביר משמעותי amphhetamine-Induced ∞FosB immunoreactivity נמצאו ב Putamen caudate של רק עכברים periadolescent (A). מינהל קוקאין כרוני הפיק עליות ב- ΔFosB בכל שלוש קבוצות הגיל (B). *p <0.05; **p <0.01 (סטודנטים t הבדיקה; סלין נגד סמים).
DAT ו- DARPP-32 רמות לא השתנו לאחר קוקאין כרונית או אמפטמין
מספר מולקולות מפתח לידי ביטוי נוירונים דופאמין ו / או דופאמינוטיבי, כולל DARPP-32, D1 קולטן דופמין ו- DAT, תורמים לתגובות חריפות וכרוניות לפסיכו-סולימולנטים (Moratalla ואח ', 1996; פינברג ואח ', 1998; סורה ואח ', 1998; Gainetdinov ואח ', 2001). נתונים מ- DARPP-32, D1 קולטן, ו- DAT null ו DAT דפיקות עכברים מצביעים על מערכת יחסים מורכבת בין רמותיהם, הסדרת פעילות דופאמינרגית, ותגובות psychostimulants. למעשה, אינדוקציה ΔFosB לא מתרחשת DARPP-32 עכברי ריק כי מקבלים קוקאין כרונית (פינברג ואח ', 1998). בעכברים בוגרים, לעומת זאת, חשיפה 7 D ל 20 מ"ג / ק"ג קוקאין אינו משנה את הרמות הכלליות של DARPP-32 (פינברג ואח ', 1998). DAT חלבונים לא דווחו בעבר בעכברים שנחשפו כרונית כדי psychostimulants, למרות שינויים ברדיוליגנד מחייב את טרנספורטר דופמין לאחר חשיפה psychostimulants דווחה בכמה מינים (Letchworth ואח ', 2001). כאן מדדנו את רמות החלבון DARPP-32 ו- DAT כדי לקבוע אם הביטוי של חלבונים אלו משתנה לאחר טיפול פסיכוסטימולנטי כרוני בכל אחד משלושת הגילאים של העכברים. הממצאים שלנו מצביעים על כך שלא היו שינויים משמעותיים ברמות של DARPP-32 או DAT בסך הכל Putamen caudate או גרעין accumbens לאחר ניהול כרוני של קוקאין או אמפטמין בכל אחת משלוש קבוצות גיל (טבלה 1).
רמות הבסיס של ΔFOSB מוסדרים מבחינה התפתחותית
בחנו את אונטוגני של ΔFBB בגלל עכברים בוגרים עם הגברה מהונדסים גנטית ביטוי של ΔFOS ב הסטריאטום יש תגובה התנהגותית גבוהה יותר psychostimulants (Kelz ואח ', 1999). מצאנו כי רמות הבסיס של ΔFOSB היו נמוכות משמעותית בקרב בעלי חיים צעירים בהשוואה למבוגרים, הן אצל הפוטמן והן אצל הגרעין.3 A). רמות של סמנים פונקציונליים של מערכת דופמין, כולל DARPP-32 (ארליך ואח ', 1990), DAT (Perrone-Capano ואח ', 1996), וקולטני דופאמין (טייכר ואח ', 1993; טרזי ואח ', 1999) מוסדרים גם מבחינה התפתחותית. דיווחים קודמים בעכברים CD-1 מצביעים על שיא ב- DARPP-32 סטריאטלי ביום הלידה 28 (P28)ארליך ואח ', 1990). ב עכברוש פוטמן caudate וגרעין accumbens, D1רמות קולטן שיא מ P28 ל P40 (טייכר ואח ', 1993; טרזי ואח ', 1999), אך מחקרים דומים לא בוצעו העכבר. לעומת זאת, כאן מצאנו כי רמות חלבון DAT ב putamen caudate ו numbus accumbens היו קבועים בין 24 יום לאחר הלידה לבין הבגרות (איור 3). 3 B). לפיכך, היחס היחסי בין D1 קולטנים, DAT, DARPP-32 ו- ΔFosB נבדלים בין קבוצות גיל, דבר שעלול לגרום להבדלים ב- D1 פעילות קולטן אשר יכול להשפיע על מידת אינדוקציה Δ FosB.
ביטוי התפתחותי של ΔFosB ו- DAT. A, ΔFOSB (35-37 kDa) immunoreactivity ב putamen caudate ו accumbens גרעין של עכברים CD-1 נאיבי כפונקציה של גיל. נציג immunoblots מוצגים לוחות העליון.פאנלים תחתונים להראות אומר ± SEM של שלושה עכברים לכל קבוצה. *p <0.05, מבוגר לעומת P24; #p <0.05, מבוגר לעומת P36 (מבחן ההשוואה המרובה של Tukey לאחר ANOVA). B, ערכים Densitometric של immunoractivity DAT ב Putamen caudate ו גרעין accumbens עבור נאיבי CD-1 עכברים כפונקציה של גיל. רמות DAT לא היו שונות בין שלוש קבוצות הגיל.
דיון
ההשפעות ההתנהגותיות של ממריצים פסיכומוטוריים תלויים בגיל. מגמות ממכרות הן הגבוהות ביותר בגיל ההתבגרות, כאשר השימוש בחומרים אסורים עולה (Estroff ואח ', 1989; מיירס ואנדרסון, 1991). למעשה, ילדים צעירים לעיתים קרובות להיות dysphoric כאשר נחשף psychostimulants, בעוד מתבגרים ומבוגרים חווים אופוריה (רפופורט ואח ', 1980). במודלים של מכרסמים, מחקרים מסוימים מצביעים על כך שלבעלי חיים periadolescent יש רמות פעילות גבוהות יותר (חנית ובלם, 1983) ותגובות שהשתנו לפסיכו-סטימולנטים ביחס לבעלי חיים צעירים ומבוגרים. לפיכך, הם מראים פחות גירוי תנועה ומחקר חדשני בתגובה למינון נמוך של מינון נמוך של פסיכו-סטימולנטים ביחס לבעלי חיים של נקניקיות ושל בעלי חיים מבוגרים, אך מוגברת היפראקטיביות לאחר טיפול במינון גבוה. עם ניהול כרוני, רגישות לקוקאין- Induced תנועה הוא גדול יותר חולדות periadolescent לעומת מבוגרים, בעוד רגישות סטריאוטיפי נמוך. כמו כן, נתונים microdialysis חשפו הבדלים בין חולדות periadolescent ו מבוגרים לגבי רגישות כדי שחרור דופמין המושרה אמפטמין (לביאולה ואח ', 1995; אדריאני ואח ', 1998; אדריאני ולביאולה, 2000;לביאולה ואח ', 2001). עם זאת, ישנם מחקרים סותרים לגבי התגובה לטווח ארוך קוקאין לאחר methylphenidate הממשל בחולדות מתבגרים (ברנדון ואחרים, 2001; אנדרסן ואח ', 2002). שני הדוחות האחרונים מדגישים את הקושי בהשוואת מחקרים כאשר נעשה שימוש בפרדיגמות ניסוייות שונות. ניסיונות להשוות בין מחקרים התנהגותיים בבעלי חיים צעירים מתבלבלים עוד יותר בשימוש במינים שונים ובזנים שונים.
העכבר הופך להיות מודל בעל חיים חשוב יותר ויותר במחקר של שימוש והתעללות של psychostimulants, וזהו ניתוח שיטתי הראשון של תגובות נוירודפטיבית מולקולרית בשלושה גילאים התפתחותיים שונים בעכבר או כל מין אחר. מחקרים קודמים מהם נגזרנו הפרדיגמות הטיפול שלנו הוכיחו עלייה ΔFosB בסטריאטום הגבי מבודדים הגחון של חולדות בר wild-type לאחר קוקאין כרונית הממשל amphetamine (הופעה ואחרות, 1994; Nye et al., 1995; טורג 'ו et al., 1997), אך רק בשילוב הסטריאטום הגבי והשרירי או בסטראטום הגבי המבודד של עכברים בוגרים מסוג wild-type לאחר קוקאין כרונית (פינברג ואח ', 1998; Zachariou ואח ', 2001).
כעת אנו מדגימים הבדלים מרחביים וכמותיים ב- fosB המושרה על ידי פסיוסטוסטמולנטים בעכברים שלאחר הלידה, הפריאדיסלנט, והמבוגרים. התצפית על תגובה מוגברת בחיות הפריאדלסנט בהשוואה למבוגרים ופוסט-וינלינג מתחזקת על ידי העובדה שהתגובה דומה בעכברים של קוקאין ואמפטמין. הקוקאין והאמפטמין של הפסיכו-אקוסטינים מגבירים דופמין סינפטי, כמו גם סרוטונין ונוראפינפרין, אלא על ידי מנגנונים שונים. קוקאין נקשר אל מובילי הפלסמימה עבור דופמין, סרוטונין ונוראדרנלין ומעכב את החזרתם מחדש אל מסופים presynaptic. לעומת זאת, אמפטמין מקדם את שחרורם של משדרים אלה. אינדוקציה סלקטיבית של ΔFosB בגרעין accumbens רק של קבוצת גיל periadolescent לאחר 7 ד של הממשל ממריץ ואת אינדוקציה מוגברת יחסית של ΔFosB ב Putamen caudate עשוי להיות ייצוג נוירוביולוגי או הגורם הנטייה הגוברת שצוינו לעיל התעללות psychostimulants זה קבוצת גיל (Estroff ואח ', 1989; מיירס ואנדרסון, 1991) ושינויים ארוכי טווח אחרים בביטוי גנים, אשר נבדלים בין קבוצות גיל (אנדרסן ואח ', 2002). יתר על כן, הבדלים אלה עשויים להיות מוסדר מהותי על ידי שינויים התפתחותיים ברמות של מולקולות מפתח, כולל ΔFOSB עצמו. ההשלכות האפשריות של הבדלים ברמות הבסיס של ΔFOSB בין קבוצות גיל מקבילות לאלה המוצעות לגבי הבדלים בין זני חולדה (היילה ואח ', 2001). למעשה, אנו צופים כי הבדלים זן דומים יימצאו בין עכברים inbred. ייתכן גם כי עכברים בגילאים שונים יראו התאמות מולקולריות שונות באזורים של המוח מלבד הגרעין accumbens. ניתוח נוסף באמצעות עכברים periadolescent עם שינויים מהונדסים גנטית ברמות של מולקולות מפתח ותצפיות התנהגותיות בו זמנית יהיה לבחון עוד השערות אלה.
הערות שוליים
- קיבל אפריל 8, 2002.
- התקבלה העדכון אוגוסט 6, 2002.
- מְקוּבָּל אוגוסט 8, 2002.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ו- Stroke Grant NS41871 (MEE ו- EMU) והמכון הלאומי למניעת התעללות בסמים P30-DA13429 (EMU).
התכתבות צריכה להיות מופנית אל ד"ר מישל א ארליך, אוניברסיטת תומס ג 'פרסון, קרטיס 310, 1025 אגוז רחוב, פילדלפיה, הרשות הפלסטינית 19107. דואר אלקטרוני: [מוגן בדוא"ל].
- זכויות יוצרים © 2002 החברה עבור מדעי המוח
;