思春期発育中のラット（2010）のおいしそうな食物報酬ピークに対する報酬感受性

実験計画

3 つの実験すべてに異なる動物群が使用され、SCM 摂取 (1)、漸進比率 (PR) テスト (2)、食欲をそそる匂い条件付けによる c-fos 刺激 (3) によって、思春期、特に思春期から成人期までの報酬感受性のさまざまな行動的および神経生物学的側面の発達が評価されました。雄ラットの思春期は、生後 40 日目から 60 日目頃までです (Schneider、2008 )。思春期とは対照的に、実験動物では思春期の正確な時期を定義することはかなり困難です。定義によれば、思春期は、思春期を含め、幼少期から成人期までの全期間をカバーします (Sisk および Foster、2004 )。したがって、思春期は離乳直後の幼若期 (生後 22 日目頃) に始まり、思春期の終わりまでに性成熟に達し、成人期初期 (雄ラットでは約 70/80 日目) まで続きます。

すべての行動実験において、報酬刺激としてSCM（ネスレAG、ドイツ、フランクフルト；水道水で1:3に希釈）が使用された。最初の実験の1日前、ラットはホームケージ内で一晩SCMに慣れさせられた。(XNUMX) SCM摂取量は、グループ（n=12）思春期前の動物を30日、40日、50日、60日、70日、80日、90日齢で追跡し、思春期前から成体までの全期間にわたる完了データを得た。さらに、これらのラットの体重増加の進行を継続的に測定した。体重は1日ごとに記録し、以前の体重に対する体重増加率を{[体重増加量（t2−t1）/体重（tXNUMX）]×100}。さらに、成体動物のXNUMX番目のグループ（n=12) は、繰り返し試験の影響をコントロールするために、100、110、120、130日目にSCM摂取量の繰り返し試験が行われた。(2) PR実験では、40つの動物群が試験された: 試験日時点でXNUMX歳の初期思春期ラット(n=15）、試験日時点で50歳であった思春期中期のラット（n=15歳）と90歳の成体動物日々 （n=（11）最後に、3つの異なる年齢群でキュー誘発性c-fos刺激を実施し、動物の半分は匂い連想訓練を受け、残りの半分は模擬訓練を受けた。匂いへの曝露はpd 40（n=10）、pd 50（n=10）、またはpd 90（n=10）。

行動テスト

c-fosの免疫組織化学

凍結脳はクライオスタットで10μmの冠状切片に切片化され、直ちにスーパーフロストスライドガラス上に解凍してマウントされた。本研究では、側坐核の核（NACc）と殻（NACs）、そして背側線条体（dStr）を関心領域として選択した。脳切片を4% PFAで固定した後、1mLの緩衝液で洗浄した。× PBSおよび内因性ペルオキシダーゼは0.3% Hでクエンチした。₂O₂ in 1× PBSでスライドを洗浄した。× PBSと1× PBS/Tween-20で処理し、ヤギ血清でブロックした。c-fosシグナル伝達を改善するために、15アビジンおよびビオチン（VectorLab、カリフォルニア州バーリンゲーム、米国）のブロッキングを実施した。C-fosウサギポリクローナル抗体（Abcam、英国ケンブリッジ）を1:100に希釈し、1mlの×PBSで切片を30分間インキュベートした。37℃で分。二次抗体は、ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG（VectorLab、カリフォルニア州バーリンゲーム、米国）を1:200で1mLに希釈したものであった。× PBSおよびヤギ血清を添加し、30分間インキュベートした。室温で30分間染色した。Vectastain Elite ABCキット（VectorLab、カリフォルニア州バーリンゲーム、米国）を切片に塗布し、DAB染色前に室温で2分間静置した。染色は、スライドをアクアビデストで洗浄することにより停止させた。その後、脳切片を段階的エタノール浴で脱水し、キシロールで透徹した後、Eukittにマウントした。画像は、Axioskop 20顕微鏡（Zeiss、イエナ、ドイツ）と0.5倍対物レンズ（NA 3）およびOlympus ColorView 2カメラを使用して撮影した。切片面レベル+1.6～+XNUMXにおいてパキシノスとワトソンによれば、ブレグマからmm離れている（1998）ラット脳アトラス、250ミクロン×250μm をサンプル領域にランダムに配置し、このセクション内のすべての c-fos 標識細胞を ImageJ を使用してカウントしました。

累進比率

PRテストセッション中、思春期中期pd 50ラットは、若いラットや成体ラットと比較して、SCMを得るためにレバーを押す頻度が有意に高かった（ANOVA F_2,38 =4.23 p=0.02 フィッシャー LSD p=それぞれPD0.05/成人で0.008/40）（図 （図3A）。3A) 従って、HCRはpd 50ラットで有意に高かった（ANOVA F_2,38 =4.78 p=0.01 フィッシャー LSD p=それぞれPD0.05/成人で0.005/40）（図 （図3B）。3B) 思春期前期ラットと成体ラットのレバー押し回数とHCRには有意差はなかった（p>0.05）。XNUMXつの年齢群すべてにおいて、ブレークポイントに差は見られなかった（分散分析） F_2,38 =1.37 p=0.27）（図 （図3C）。3C) 体重補正後のSCM摂取量をPR試験で比較したところ、すべてのグループ間に非常に有意な差が認められた（ANOVA F_2,38 =53,68 p≤0.001）。40歳ラットの摂取量が最も高かったが、両思春期グループは成体動物とは有意に異なっていた（p≤0.001）（値：pd40：5.35±0.27; pd 50: 4.18±0.17; pd 90: 2.17±0.13 すべての値はml/kg BW単位です±（SE）。

 

図3

思春期初期（pd 40）、思春期中期（pd 50）、および成体ラット（pd 90）の漸進的比率パフォーマンスこの図はレバー操作の総数を示している。 （）、HCR （B） ブレークポイント（IR） （C）思春期中期のラットの成績は思春期前期のラットの成績と大きく異なっていた。 ...

制限された自由摂取SCM

生後 30 日 (思春期前) から生後 90 日 (成体) までの制限アクセス パラダイムでの SCM 摂取量の繰り返し測定により、体重に対する摂取量が、成体期と比較して思春期に有意に高いことが明らかになった。この嗜好性の高い液体の思春期における高い摂取量は、生後 28 日～42 日の思春期初期の雄 Sprague-Dawley ラットでテストされた 1% スクロース溶液について報告されたデータと一致している (Wilmouth and Spear, 2009 )。この研究では、14 日間にわたる 2 ボトル選択テストで、水と 1% スクロースの 24 時間摂取量を測定した。思春期のラットは成体よりも有意に多くのスクロースを飲み、水よりも多く飲んだが、成体ラットでは水とスクロースの摂取量に差はなかった。本研究の縦断的デザインにより、生後42日目以降の思春期の自然報酬摂取の進行を体系的にモニタリングすることが可能になった。SCM摂取のピークは生後50日目に見られ、その後生後70日目まで急激に減少し、さらに減少して生後90日目までに安定した成体レベルの摂取に達した。BPSを思春期開始の明確なマーカーとして用いることで、雄ラットの思春期の時期はおおよそ生後40日目から60日目の間と考えられている（Schneider、2008）。したがって、今回のデータから、思春期の発達の制限された期間が報酬摂取の増加に最も敏感な時期であると考えられる。

自然報酬の消費は、主に嗜好性と生物の恒常性維持状態によって左右されます。発達段階における消費テストにおいて考慮すべき主要な点は、思春期の過食です。ヒトとラットは、生涯を通じて最も体重に対するカロリー摂取量が多い時期です（Nance, 1983; ポストとケンパー、 1993）。SCM摂取による様々なカロリー需要の干渉を最小限に抑えるために、ラットは恒久的に アドリブで15の短い実験的アクセス中にSCMの消費量が増加したしたがって、思春期ラットにおけるSCM摂取量の減少は、カロリー需要を補うのではなく、報酬に対する嗜好の高まりを反映している可能性がある。これは、思春期における体重増加に関する我々の知見によってさらに裏付けられている。体重増加は対数関数に従い、成長期は30日齢から40日齢の間に最も急激に増加した。したがって、カロリー需要はこの特定の期間に最も高くなるはずである。したがって、SCM摂取量に対するカロリー需要の増加の潜在的な影響も、30日齢から40日齢の間に最も強くなると予想される。したがって、50日齢で観察されるSCM摂取量のピークは、カロリー需要の影響が少なく、SCMの報酬特性に対する感受性の向上によって主に影響を受けていると考えられる。摂取量のピークと思春期の始まりに伴う急激な成長期との間に直接的な相関関係は見られなかったものの、思春期のようなダイナミックな成長期における高カロリー食品への潜在的な嗜好は進化論的な観点から重要であり、カロリー要求の影響を完全に排除することはできない。しかしながら、思春期における報酬感受性の増大は食物報酬に限らず、カロリー含有量とは無関係に、他の自然報酬や薬物報酬にも見られることが示されている（Spear, 2000; ブレンハウスとアンダーセン、 2008).

カロリー含有量が嗜好性の高い食品の摂取にとって主に重要ではないという仮説を支持する同様の結果は、ギルバートとシャーマン（1970）によって以前に報告されている。彼らは、食物を奪われたラットにおいて、スクロースと非カロリーのサッカリン溶液の液体摂取量が同程度であることを発見し、嗜好性の高い液体の栄養価と比較して、甘味の方が摂取に強い影響を与えることを示した。さらに、我々の現在の知見と一致して、げっ歯類とヒトの両方において、思春期に甘味物質に対する嗜好が高まることが観察されており（Desor and Beauchamp、1987 ; Vaidya et al.、2004 ）、発達期に食物報酬の食欲特性に対する感受性が一時的に増加することを示している。思春期における食欲をそそる食物刺激と嫌悪感をそそる食物刺激に対する快楽感受性の変化に関するさらなる証拠は、ウィルマウスとスピア（ 2009 ）によって提供された。経口で提示された刺激の快楽価値を直接測定すると考えられている味覚反応パラダイム（Grill and Norgren、1978）を用いて、異なる濃度のショ糖溶液またはキニーネ含有液体の経口注入に対する思春期（生後30～34日）および成体ラット（生後72～73日）の定型的肯定的および否定的行動を測定した。思春期ラットは、10%ショ糖の注入中に成体動物よりも有意に多くの肯定的反応を示し、成体ラットの反応パターンが水条件と異ならなかった3.4%のショ糖濃度ですでにこの反応が増加した。対照的に、キニーネの注入は、成体ラットのみで水と比較して有意に多くの否定的反応を引き起こした。

総合すると、これらのデータは、報酬刺激の肯定的な快楽的側面に対する感受性が青年期のラットでは一時的に高まる一方で、否定的に評価される刺激に対する感受性は弱まることを示しており、これらの知見は、思春期における SCM 摂取量の増加に関する現在の観察結果と一致しています。

本研究では、成体ラットにおけるSCM摂取量の反復試験において、再試験効果なく飲水量が一定であることが示されました。これらのデータは、SCM摂取量の反復試験によってこの食物報酬に対する慣れや感作が生じないことを示しており、したがって、青年期におけるSCM摂取の特徴的な経過は、いかなる交絡因子とも関連がないことを示しています。

累進比率

思春期前期、思春期中期、そして成人期におけるSCMの動機づけの潜在的な変化を評価するため、各年齢の動物をPRパラダイムで試験した。この課題では、強化子獲得のためにレバーを押す回数を増やす必要があるため、PRパフォーマンスは、動機づけと、強化子獲得のために被験者が払う意思のある努力の指標として一般的に用いられてきた（Hodos and Kalman, 1963; スタッフォードら、 1998; Sanchis-SeguraとSpanagel、 2006）。SCMのPRにおけるパフォーマンスは、思春期中期のpd 50ラットでは、pd 40思春期および成体ラットと比較して、レバー押しの合計回数とHCRが有意に高かったことを明らかにした。思春期ラットは成体ラットとパフォーマンスに差はなかった。しかし、成長したラットと比較して、若いラットのレバー押しの身体的負担が大きいことを考慮すると（pd 40および成体ラットの平均体重は147gと331g）を見ると、思春期初期のラットがレバー押し合計回数およびHCRにおいて成体動物と同等の成績を示したことは注目に値する。

ブレークポイントの発生（2週間以上の活動停止と定義）に関しては、各グループ間に差は見られなかった。分）。ブレークポイントの発生は動機づけの側面だけでなく、予期せぬ報酬の喪失によって引き起こされるフラストレーションも、この最初の固執の中断に寄与する可能性がある。この点に関して、以前の研究で、30分間のセッション中のレバー押し回数とHCRはオピオイド受容体拮抗薬ナロキソンによって大幅に減少したにもかかわらず、この治療はSCMのブレークポイントには影響を与えなかったことが示されている。これは、これらの指標に対する神経制御の違いを示唆している（Schneider et al., 2010したがって、本研究で得られたデータは、年齢がフラストレーションイベントへの反応に影響を与えていないことを示していますが、この最初の反応の中断後も、思春期中期のラットは、美味しい食物報酬のためにより多くの努力を費やし続け、その結果、思春期前期および成体動物と比較して、レバー押しとHCRの合計回数が増加しました。思春期のラットがSCMに費やしたより高い努力は、この年齢でのSCMに対する動機付けのインセンティブの潜在的な増加によって媒介されている可能性があります。以前の報告では、青年期のラットでは、社会的遊びや目新しいものなどの他の自然報酬に対する動機付けが向上することがすでに示されています（レビューについては、Doremus-Fitzwater et al.、 2010これらの研究では、条件付け場所嗜好（CPP）パラダイムが、それぞれ社会的パートナーまたは新しい物体と以前にペアになった区画に近づく動機の間接的な尺度として使用されていました（Douglas et al.、 2003, 2004いずれの場合も、ペアリングされた区画での滞在時間とペアリングされていない区画での滞在時間の比率は、雄の青年期ラット（pd 38）の方が成体ラットよりも高かった。しかし、サッカリンを求めてレバーを押す訓練を受けた思春期ラット（pd 40）と成体ラットでは、固定スケジュールまたはPRスケジュールでテストした場合、レバーを押す回数に差は見られなかった（Shram et al., 2008）。同様のオペラント反応があったにもかかわらず、受け取ったサッカリン強化が動物の体重に合わせて調整された場合、青年期のラットではテストセッション中に有意に高いサッカリン消費量が観察されました。この差は、最高の固定比率（FR 5）スケジュールで、サッカリン濃度が上昇した場合、最も顕著でした。PRテストで得られた強化子の量（SCM）を計算（体重に合わせて調整）した場合、同様の結果が検出されました。体重に対するSCMの量が最も多かったのは、成体動物と比較して、思春期前期および中期のラットでした。PRテスト中の調整された消費量は、青年期に自然報酬に対する動機付けが強化されたという解釈を強く支持するだけでなく、発達研究における道具的行動の注意深いパフォーマンス分析も示しています。試験された動物の体重、身体的努力、または摂取容量における部分的に大きな違いの影響は、オペラントパフォーマンスの解釈と年齢比較において考慮される必要があります。

PRで測定される行動は、動機づけのインセンティブや強化子の快楽的側面、あるいは被験者の内面状態といった複数の変数の影響を受けます。青年期および成人のヒトおよび動物におけるインセンティブおよび動機づけ処理に関連する神経基質の活性化と神経伝達物質の放出を比較したところ、脳の皮質下および前頭前野領域とその神経回路に顕著な成熟変化が認められました（Chambers et al., 2003; クルーら、 2007; ケーシーら、 2008; エルンストら、 2009; ガイヤーとルナ、 2009思春期には、前頭線条体系のモノアミン作動性活性化が増強される（中野および水野、 1996; アンダーセンとテイチャー、 2000; タラジとバルデッサリーニ、 2000; ヘイコックら、 2003）は、衝動性や報酬や薬物に対する反応性が高まることと関連している（Chambers et al., 2003; クーンら、 2009; Doremus-Fitzwater他、 2010同様に、報酬の快楽的側面を媒介するとされる2つの神経ペプチド系、すなわちオピオイド系とエンドカンナビノイド系においても、相当な発達的変化が報告されている（Solinas and Goldberg, 2005; ソリナスら、 2007; エルグレンら、 2008思春期におけるエンドカンナビノイドシステムの一時的なアップレギュレーションは、辺縁系構造におけるカンナビノイド受容体1（CB1）への放射性リガンドの結合の増強によって示唆される（Rodriguez de Fonseca et al., 1993）または思春期開始時（38日目）にNACや尾状核などの複数の脳領域でアナンダミドの発現が増加する（Ellgren et al.、 2008）または視床下部（Wenger et al., 2002詳細なレビューについてはシュナイダーを参照。 2008）。しかし、思春期にはメチオニンエンケファリンとμオピオイド受容体（μOR）のレベルが安定していることが報告されている（Ellgren et al., 2008）、μORアゴニストDAMGOの社会的促進に対するより高い刺激効果が思春期初期に発見された（VarlinskayaおよびSpear、 2008).

思春期に伴う神経発達の変化を総合すると、この発達段階においては、報酬刺激に対する神経生物学的反応の増強により、自然報酬だけでなく乱用薬物の快楽的側面と動機づけ的側面に対する感受性が高まることが強く示唆されます。思春期ラットのPRにおけるSCMの努力と消費量の増加は、この仮説をさらに裏付けています。SCMに関する我々の完了データと一致して、動機づけ効果は思春期中期のラットでより顕著でした。

C-fos発現

即時初期遺伝子c-fosの翻訳産物であるc-fosタンパク質レベルの発現は、一般的に、複数の刺激に対する特定の脳領域の神経活動のマーカーと考えられている（Hughes and Dragunow、1995）。本研究では、思春期（生後40日目と50日目）および成体（生後90日目）のラットにSCM関連の匂いの手がかりを提示した後、背側および腹側線条体におけるc-fosタンパク質レベルを測定した。

ショ糖溶液などの嗜好性の高い食物報酬へのアクセスは、ラットのさまざまな脳領域でc-fos発現を強力に誘導することが示されている（例：Streefland et al., 1996 ; Grippo et al., 2004 ; Norgren et al., 2006 ; Mungarndee et al., 2008）。以前に報酬と対になったキューの提示でさえ、c-fos発現を活性化することができる（Miller and Marshall, 2005 ; Zhang et al., 2005）。本研究では、年齢に関係なく、匂い報酬連合トレーニングを受けたグループでは、匂いキュー提示後のc-fos発現が偽トレーニング対照グループと比較して常に高いことがわかり、条件付けられた匂いに対する神経活動の特異的な増加を示している。さらに、思春期群のラットでは、成体ラットと比較して、線条体背側部（dStr）および側坐核（NACc）におけるc-fosの発現が有意に高いことが観察された。c-fos陽性細胞は全ての思春期ラットで検出されたが、その増加は生後50日目のラットでより顕著であった。側坐核においては、思春期ラットと成体ラットの間で有意な差は認められなかった。

報酬に関連する脳構造における c-fos 活性は、報酬知覚と報酬処理の相関的尺度のみを反映していると考えられているが、ラットの頭蓋内自己刺激後には、報酬の大きさが c-fos 発現の誘導に直接影響を与えることが実証されている (Panagis et al., 1997 )。我々の知見は、思春期ラットに報酬に関連する手がかりを提示した後、報酬に関連する脳構造の神経活動が増強されることを示しており、したがって、報酬刺激は思春期に高いインセンティブを持ち、その逆ではないという仮説を支持している。この知見は、ヒトおよびげっ歯類における他の研究と一致している (Laviola et al., 2003 ; Ernst et al., 2005 ; Galvan et al., 2006 ; Mungarndee et al., 2008 ; Kringelbach and Berridge, 2009 )。例えば、Ernst et al. （2005年）は、fMRIを用いて、金銭的報酬の予測、獲得、または欠如時の青年および成人被験者の脳活動をモニタリングした。報酬を獲得した際、青年は成人に比べてNACの活動が高かった。

本研究で観察されたdStrにおける顕著なc-fosタンパク質発現は、報酬提示後にこの領域で活性化が増強され持続するという他の研究報告と一致している（Delgado et al., 2003）。同様に、fMRI研究では、一次報酬（O'Doherty et al., 2002）または二次報酬（Knutson et al., 2001）のいずれかを予期している間、dStrにおける血中酸素濃度依存性（BOLD）反応の増加が報告されている。dStrは、脳の動機付けおよび報酬システムの主要な構成要素とも考えられている（Wise, 2009）。このドーパミン作動性サブシステムは、動機付けおよび報酬関連プロセスに重要な役割を果たすことが知られており（Wise, 2004）、思春期の成熟変化の根底にある（Spear, 2000 ; Andersen, 2002）。思春期における報酬関連脳構造の報酬に対する感受性と反応性の亢進は、今回の研究で思春期動物のdStrとNACcにおけるc-fos標識細胞が成体動物よりも有意に高いという結果に反映されている。思春期中期のラットにおけるNACcの発現の強さは、SCMに対する感受性の増大によって説明できる可能性があり、条件付けされた手がかりの評価が高まり、その提示に対する神経応答が強化される。前述のように、思春期中期のラットはSCMに対する消費行動と動機付け行動も最も高かった。NACは報酬の快楽的評価を媒介する重要な脳構造と考えられてきたが（Pecina and Berridge, 2000）、この特定の領域におけるc-fos発現の思春期ラットと成体ラットの差は検出できなかった。今回の実験設定では、c-fos発現は関連する匂いの手がかりの提示後に調べられ、SCMの直接提示後に調べられなかったため、NACの神経活性化の亢進が弱くなった可能性がある。実際、いくつかの研究では、条件刺激と無条件刺激の関連付けの形成と、手がかりによって誘発される薬物探索において、NACcがより顕著な役割を果たしていることが示されています（Parkinson et al., 1999 ; Miller and Marshall, 2005 ; Chaudhri et al., 2010）。

総合すると、本研究結果は、快刺激に関連する手がかりの処理における線条体構造の重要性を強く支持するものである。さらに、思春期ラットでは成体ラットと比較して手がかり誘発性のc-fos発現が増強されていることから、思春期発達期における欲求刺激に対するニューロンの反応性が高まることが示唆される。

本研究は、Land BW（NAR）およびDFG（SCHN 958/3-1）からの助成金によって支援されました。素晴らしい技術サポートをいただいたElisabeth Roebel氏に深く感謝申し上げます。