側坐核（2011）におけるオピオイドおよびカンナビノイド受容体を介したシグナル伝達に対するΔFosB過剰発現の影響

Neuropharmacology. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ、Cassidy MP、Sparta A、Zachariou V、Nestler EJ、Selley DE。

ソース

米国バージニア州リッチモンドのバージニアコモンウェルス大学医学部薬理・毒物学科および薬物アルコール研究所。

抽象

安定転写因子ΔFosBは、いくつかの乱用薬物への慢性的な曝露により側坐核（NAc）で誘導され、線条体でのΔFosBの遺伝子導入発現はモルヒネとコカインの報酬特性を増強する。しかし、これらの観察のメカニズム的根拠は完全には理解されていない。我々は、ドーパミンD(1)受容体/ダイノルフィン含有線条体ニューロンでΔFosBを誘導的に発現する二重遺伝子導入マウスモデルを使用して、NAcにおけるオピオイドおよびカンナビノイド受容体シグナル伝達に対するΔFosB発現の影響を調べた。結果は、ΔFosBを発現するマウスのNAcでμオピオイドを介したGタンパク質活性とアデニル酸シクラーゼの阻害が増強されていることを示した。同様に、ΔFosBを発現するマウスではκオピオイドによるアデニル酸シクラーゼの阻害が増強されていた。対照的に、カンナビノイド受容体を介したシグナル伝達は、ΔFosBを過剰発現させたマウスと対照マウスの間で差がなかった。これらの結果は、オピオイド受容体とカンナビノイド受容体のシグナル伝達がΔFosBの発現によって異なる調節を受けていることを示唆しており、ΔFosBの発現は、側坐核におけるμおよびκオピオイド受容体のシグナル伝達の増強を介してその効果の一部を発揮する可能性があることを示している。

キーワード： Gタンパク質、アデニリルシクラーゼ、線条体
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はじめに

オピオイド受容体とカンナビノイドCB1 受容体（CB1R）は、モルヒネ、ヘロイン、処方オピオイド、マリファナ（Δ9-テトラヒドロカンナビノール（THC））。 オピオイドとカンナビノイドの急性効果は、主にGを活性化するGタンパク質共役受容体によって媒介されます私は/ o タンパク質を生成し、アデニリルシクラーゼの阻害などの下流エフェクター応答を生成します（Childers、1991, チルダーズら、1992, ハウレットら、2002）。 Δの運動、記憶障害および精神活性効果9-THCはCBによって生成されます1R（Huestis、et al。、2001, Zimmerら、1999）、脳に広く分布し、大脳基底核、海馬、小脳に高レベルで存在します（Herkenham、et al。、1991）。 最も臨床的に関連性が高く乱用されたオピオイド薬の鎮痛効果と報酬効果は、主にミューオピオイド受容体（MOR）によって媒介されます（Matthes、et al。、1996）、大脳辺縁系と脳幹が豊富です（マンスール他、1994）。 腹側被蓋野（VTA）から側坐核（NAc）へのドーパミン作動性投射で構成される中脳辺縁系は、オピオイドとカンナビノイドの報酬効果に重要な役割を果たしています（BozarthとWise、1984, ヴァッカリーノ他、1985, ザンゲン他、2006）、およびその他の乱用薬物（Koob and Volkow、2010）。 さらに、内因性オピオイドおよびカンナビノイドシステムは、複数のクラスの向精神薬の報酬効果に関与しています（マルドナド他、2006, Trigo、et al。、2010）。 したがって、オピオイドとCBのメカニズムを解明することが重要です1RシグナリングはNAcで規制されています。

薬物乱用分野における中心的な課題は、精神活性薬の急性効果から長期効果への移行を媒介するタンパク質を特定することである。AP-1転写因子ΔFosBは、乱用薬物や自然報酬への反復曝露によって蓄積するfosb遺伝子の安定した切断スプライスバリアント産物であるため、特に興味深い（McClungら、2004年、Nestler、2008年、Nestlerら、1999年）。我々は、モルヒネ、 Δ9 -THC、コカイン、エタノールへの反復曝露後に脳​​内でΔFosBが誘導され、各薬物がΔFosB発現の独自の領域パターンを生み出すことを発見した（Perrottiら、2008年）。薬物全体を通して一貫して見られた所見は、ΔFosBが線条体で高度に誘導されることであり、4つの薬物すべてがNAcコアでΔFosBを誘導し、Δ9 - THCを除くすべてがNAcシェルと尾状核・被殻で有意に発現を誘導した。

薬理学的研究により、ドーパミンDの同時投与が示された1 受容体（D1R）拮抗薬SCH 23390は、コカインまたはモルヒネを断続的に投与した後のNAcおよび尾状核被殻におけるΔFosB誘導をブロックし、Dの潜在的な重要性を示唆しました1R発現ニューロン（ミュラーとウンターワルド、2005, ナイ他、1995）。 薬物媒介行動に対するΔFosB誘導の影響は、NAcおよび背側線条体の特定のニューロン集団でΔFosBを発現する二重トランスジェニックマウスを使用して調査されています（チェン他、1998）。 ダイノルフィン/ DでΔFosBを発現するマウス1NAcおよび背側線条体（線11A）のR陽性ニューロンは、乱用薬物に対する反応の変化、特にコカインまたはモルヒネの報酬効果に対する感度の向上（コルビー他、2003, ケルツ他、1999, ザチャリウ他、2006）。 これらの変化は、MORまたはさまざまなGタンパク質サブユニットのレベルに変化がない場合に発生しました。 ただし、ダイノルフィンmRNAレベルは、ΔFosB発現マウスのNAcで減少しました（ザチャリウ他、2006）、ΔFosBの1つの標的が内因性オピオイドペプチドをコードする遺伝子であることを示唆しています。 ΔFosBの誘導は、NAcの受容体シグナル伝達を調節することで行動の変化を引き起こす可能性もありますが、この可能性は調査されていません。 したがって、現在の研究では、ダイノルフィン/ DでのΔFosBの過剰発現の有無を判断するために、バイトランスジェニックマウスモデルを使用しました。1Rを含む線条体ニューロンは、NAcでMORを介したGタンパク質活性とMORおよびKORを介したアデニリルシクラーゼ阻害を変化させます。 CBに対するΔFosBの影響1R媒介Gタンパク質活性も評価された9-THC投与はNAcにΔFosBを誘導します（ペロッティ他、2008）そして、内因性カンナビノイドシステムは、脳の報酬回路を調節することが知られています（ガードナー、2005, マルドナド他、2006）、しかし、内因性カンナビノイド系に対するΔFosBの効果は調査されていません。

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2。 材料および方法

2.1。 試薬

[ 35 S]GTPγS (1250 Ci/mmol)、[α- 32 P]ATP (800 Ci/mmol) および [ 3 H]cAMP (26.4 Ci/mmol) は、PerkinElmer (Shelton, CT) から購入した。ATP、GTP、GDP、cAMP、ウシ血清アルブミン、クレアチンホスホキナーゼ、パパベリン、イミダゾール、および WIN-55212-2 は、Sigma Aldrich (St. Louis, MO) から購入した。GTPγS は、Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL) から購入した。DAMGO は、National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) の Drug Supply Program から提供された。Econo-1 シンチレーション液は、Fisher Scientific (Norcross, GA) から入手した。Ecolite シンチレーション液は、ICN (Costa Mesa, CA) から入手した。その他のすべての化学物質は、Sigma Aldrich または Fisher Scientific から入手した。

2.2。 マウス

NSE-tTA（系統A）× TetOp-ΔFosB（系統11）由来の雄の二重トランスジェニックマウスは、Kelzら（Kelzら、1999）に記載されている方法で作製された。二重トランスジェニックマウスは、トランスジーンの発現を抑制するために、ドキシサイクリン（飲料水に100 µg）を与えて受胎および飼育された。8週齢で、トランスジーンの発現を可能にするために、マウスの半数には飲料水からドキシサイクリンを除去し、残りのマウスにはトランスジーンを抑制するためにドキシサイクリンを与え続けた。8週間後、ΔFosBの転写効果が最大となる時期に脳を採取した（McClungおよびNestler、2003）。 2番目のトランスジェニックマウス系統では、線条体、海馬、頭頂皮質のD 1 R/ダイノルフィン細胞とD 2 R/エンケファリン細胞でc-Junの優性阻害拮抗薬であるΔc-Junが発現している（ Peakmanら、2003）。C-Junおよび関連するJunファミリータンパク質はFosファミリータンパク質と二量体を形成し、標的遺伝子のAP-1部位に結合して転写を調節する。しかし、c-JunのN末端の切断（Δc-Jun）により、この複合体は転写的に不活性となり、活性AP-1複合体のDNA結合を阻害することができる。NSE-tTA（系統A）×TetOp-FLAG-Δc-Jun（系統E）由来の雄の二重トランスジェニックマウスは、Peakmanら（Peakmanら、2003）に記載されているように作製された。二重トランスジェニックマウスは、トランスジーンの発現を抑制するためにドキシサイクリン（飲料水に100 µg）を投与して受精・飼育された。仔マウスは3週齢で離乳させ、遺伝子型を判定し、グループ分けした。半数はドキシサイクリン含有水で、残りの半数は通常の飲料水で飼育し、FLAG-Δc-Junの発現を誘導した。6週間後、FLAG-Δc-Junの発現量が最大となる時点（Peakmanら、2003）に脳を採取した。すべての動物実験手順は、米国国立衛生研究所の実験動物の飼育および使用に関するガイドに従って実施された。

2.3。 膜の準備

脳はアッセイ当日まで-80℃で保存した。アッセイの前に、各脳を解凍し、氷上でNAcを解剖した。各サンプルを50 mM Tris-HCl、3 mM MgCl 2、1 mM EGTA、pH 7.4（膜緩衝液）中で、4℃でガラスホモジナイザーを用いて20回ストロークしてホモジナイズした。ホモジネートを4℃で48,000 × gで10分間遠心分離し、膜緩衝液に再懸濁し、再び4℃で48,000 × gで10分間遠心分離し、50 mM Tris-HCl、3 mM MgCl 2、0.2 mM EGTA、100 mM NaCl、pH 7.4（アッセイ緩​​衝液）に再懸濁した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（BSA）を標準物質として用いたブラッドフォード法（Bradford, 1976 ）によって測定した。

2.4。 アゴニスト刺激[35S]GTPγSバインディング

膜をアッセイバッファー中のアデノシンデアミナーゼ（3 mU/ml）とともに30℃で10分間プレインキュベートした。次に、膜（5～10 µgタンパク質）を、0.1%（w/v）BSA、0.1 nM [ 35S ]GTPγS、30 µM GDP、およびアデノシンデアミナーゼ（3 mU/ml）を含むアッセイバッファー中で、適切な濃度のDAMGOまたはWIN55,212-2の有無にかかわらず、30℃で2時間インキュベートした。非特異的結合は20 µM GTPγSで測定した。インキュベーションは、GF/Bガラス繊維フィルターによるろ過で終了し、続いて3 mlの氷冷50 mM Tris-HCl、pH 7.4で3回洗浄した。結合した放射能は、フィルターをEcono-1シンチレーション液に一晩浸漬して抽出した後、液体シンチレーション分光光度計を用いて測定した。

2.5。 アデニリルシクラーゼアッセイ

膜（5～25 µg タンパク質）を上記のようにアデノシンデアミナーゼとプレインキュベートした後、1µM フォルスコリンの存在下または非存在下、DAMGO、U50,488H または WIN55,212-2 の有無にかかわらず、50 µM ATP、[α- 32 P]ATP（15 µCi）、0.2 mM DTT、0.1%（w/v）BSA、50 µM サイクリック AMP、50 µM GTP、0.2 mM パパベリン、5 mM ホスホクレアチン、20 単位/ml クレアチンホスホキナーゼ、およびアデノシンデアミナーゼ（3 mU/ml）を含むアッセイバッファー中で、最終容量 100 µl で 1.5 分間 30°C でインキュベートした。これらの条件下では、回収された総[α- 32P ]cAMPは、各サンプルに添加された総[α- 32P ]ATP量の1%未満であることが一般的であった。反応は3分間煮沸して停止させ、[ 32P ]環状AMPはSalomonの二重カラム（Dowexとアルミナ）法（ Salomon、1979 ）によって分離された。[ 3H ]cAMP（10,000 dpm）は、カラムクロマトグラフィーの前に内部標準として各チューブに添加された。溶出液45 mlをEcoliteシンチレーション液14.5 mlに溶解した後、液体シンチレーション分光光度計（3Hの効率4.5%）によって放射能が測定された。

2.6 データ分析

特に明記しない限り、データは4～8回の独立した実験の平均値±標準誤差として報告され、各実験は3回ずつ実施された。正味の刺激された[ 35S ]GTPγS結合は、アゴニスト刺激結合から基礎結合を差し引いて計算される。正味のフォルスコリン刺激アデニル酸シクラーゼ活性は、フォルスコリン刺激活性－基礎活性（pmol/mg/分）として定義される。フォルスコリン刺激アデニル酸シクラーゼ活性の阻害率は、（アゴニスト非存在下での正味のフォルスコリン刺激活性－アゴニスト存在下での正味のフォルスコリン刺激活性／アゴニスト非存在下での正味のフォルスコリン刺激活性）×100として定義される。すべての曲線フィッティングと統計解析は、Prism 4.0c（GraphPad Software, Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して実行された。濃度-効果曲線は、反復非線形回帰によって解析され、EC50値とEmax値が得られた。濃度-効果データの統計的有意性は、アゴニスト投与量と遺伝子誘導（オンまたはオフ）を主因子とする二元配置分散分析（ANOVA）によって決定した。曲線適合値（EmaxまたはEC50 ）の統計的有意性は、 EC50値の不均一分散（F検定で検出）を補正するために必要に応じてウェルチ補正または平方根変換を用いた、対応のない両側スチューデントt検定によって決定した。

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3。 結果

3.1。 オピオイドおよびカンナビノイド受容体を介したGタンパク質活性化に対するΔFosB発現の影響

MORまたはCB 1 Rを介したGタンパク質活性化が、NAcにおけるΔFosBの誘導性トランスジェニック発現によって変化するかどうかを判断するために、ΔFosBトランスジーンを条件的に発現する（ΔFosB on）または発現しない（ΔFosB off）二重トランスジェニックマウスのこの領域から調製した単離膜で、アゴニスト刺激による[35S]GTPγS結合を調べた。MOR選択的エンケファリンアナログDAMGOを使用してMORを活性化し、カンナビノイドアミノアルキルインドールWIN55,212-2を使用してCB 1 Rを活性化した。これらのリガンドは、それぞれMORおよびCB 1 Rの完全アゴニストであることが以前に示された（Breivogelら、1998、Selleyら、1997）。げっ歯類の脳ではシグナルが低すぎるため、KORを介したGタンパク質活性を調べることは不可能であった（Childersら、1998）。結果は、ΔFosB offマウスとΔFosB onマウスのNAcにおいて、DAMGOとWIN55,122-2の両方によるGタンパク質活性の濃度依存的な刺激を示した（図1）。DAMGO刺激活性（図1A）については、濃度効果データの二元配置分散分析により、ΔFosB状態（p<0.0001、F=22.12、df=1）とDAMGO濃度（p<0.0001、F=29.65、df=5）の有意な主効果が明らかになり、有意な交互作用は認められなかった（p=0.857、F=0.387、df=5）。濃度-効果曲線の非線形回帰分析により、ΔFosB onマウスではΔFosB offマウスに比べてDAMGOのEmax値が有意に高いことが明らかになった（ Emax = 73 ± 5.2%刺激、ΔFosB offマウスではEmax = 56 ± 4.1%刺激、Studentのt検定でΔFosB onマウスとp<0.05で有意差あり）。DAMGOのEC50値はΔFosB onマウスとΔFosB offマウスで差はなかった（それぞれ302 ± 72 nMと212 ± 56 nM、p = 0.346）。

図1 

アゴニスト刺激に対するΔFosB発現の影響[35NAcにおけるS]GTPγS結合。 ΔFosB発現（ΔFosBオン）またはコントロール（ΔFosBオフ）マウスの膜を、さまざまな濃度を使用する方法で説明したようにアッセイしました ...

MORアゴニストDAMGOで得られた結果とは対照的に、カンナビノイドアゴニストWIN55,212-2ではGタンパク質活性化におけるΔFosB状態依存的な差は観察されなかった（図1B）。WIN55,212-2濃度効果データの二元配置分散分析では、WIN55,212-2濃度の有意な主効果が認められた（p < 0.0001、F = 112.4、df = 7）が、ΔFosB状態の有意な主効果は認められず（p = 0.172、F = 1.90、df = 1）、相互作用も認められなかった（p = 0.930、F = 0.346、df = 7）。同様に、ΔFosBの状態はWIN55,212-2のEmax値（ΔFosBオンマウスとオフマウスでそれぞれ103±6%と108±8%の刺激、スチューデントのt検定でp=0.813）またはEC50値（ΔFosBオンマウスとオフマウスでそれぞれ103±20nMと170±23nM、p=0.123）に影響を与えなかった。

曲線の形状と、以前の研究で脳内でWIN55,212-2の濃度-効果曲線が二相性であることが示されているという事実（Breivogelら、1999年、Breivogelら、1998年）に基づき、WIN55,212-2の曲線も2部位モデルを使用して解析した。平均データの解析では、2部位モデルを使用した適合度が、単一部位モデル（ΔFosBオンマウスとオフマウスでそれぞれR 2 = 0.891と0.879、平方和 = 6561と6628）と比較してわずかに改善された（ΔFosBオンマウスとオフマウスでそれぞれR 2 = 0.933と0.914、平方和 = 3644と5463）。しかし、ΔFosB on マウスと off マウスの間で、高効力部位と低効力部位のE max値または EC 50値のいずれにおいても有意差は認められなかった (補足表 1 )。ただし、 ΔFosB on マウスでは、ΔFosB off マウスと比較して、高効力部位のEC 50値が低い傾向が見られた(EC 50 high = 28.0 ± 10.6 nM、ΔFosB off マウスでは EC 50 high = 71.5 ± 20.2 nM、p = 0.094)。さらに、ΔFosB の状態は、NAc 膜の基礎 [ 35 S]GTPγS 結合に影響を及ぼさなかった(ΔFosB on マウスと off マウスでそれぞれ 253 ± 14 fmol/mg と 226 ± 14 fmol/mg、p = 0.188)。これらのデータは、マウスの側坐核におけるΔFosBの誘導性遺伝子発現が、CB1受容体を介したGタンパク質活性や基礎的なGタンパク質活性に有意な影響を与えることなく、MORを介したGタンパク質活性化を増加させることを示している。

3.2。 オデオイドおよびカンナビノイド受容体を介したアデニリルシクラーゼの阻害に対するΔFosBの効果

ΔFosBの誘導性トランスジェニック発現がMORおよびCB 1 Rによる下流エフェクター活性の調節に及ぼす影響を評価するため、NAc膜における1 µMフォルスコリン刺激アデニル酸シクラーゼ活性の阻害を調べた。MORおよびCB 1 Rを介したアデニル酸シクラーゼ活性の阻害に加えて、KOR選択的完全アゴニストU50,488（Zhuら、1997）を用いてKOR活性の影響も調べた。これは、以前の結果で、二重トランスジェニックモデルにおいてダイノルフィンmRNAがΔFosBの標的であることが示されたためである（Zachariouら、2006）。結果は、DAMGO、U50,488、およびWIN55,212-2がそれぞれΔFosB offマウスとΔFosB onマウスの両方でアデニル酸シクラーゼ活性の濃度依存的阻害を引き起こしたことを示した（図2）。 DAMGO濃度-効果データの二元配置分散分析（図2A）では、ΔFosB状態（p = 0.0012、F = 11.34、df = 1）とDAMGO濃度（p < 0.0001、F = 29.61、df = 6）の有意な主効果が認められたが、有意な交互作用は認められなかった（p = 0.441、F = 0.986、df = 6）。DAMGO濃度-効果曲線の非線形回帰分析では、ΔFosB onマウス（101 ± 11 nM）のDAMGO EC 50値は、ΔFosB offマウス（510 ± 182 nM、スチューデントのt検定でp < 0.05）と比較して有意に低いことが明らかになった。しかし、DAMGO E max値には有意差は認められなかった（ΔFosB onマウスとoffマウスでそれぞれ20.9 ± 1.26%と19.8 ± 1.27%の阻害、p = 0.534）。

図2 

NAcにおけるアデニリルシクラーゼ活性の阻害に対するΔFosB発現の効果。 1 µMの存在下での方法に記載されているように、ΔFosB発現（ΔFosBオン）またはコントロール（ΔFosBオフ）マウスの膜をアッセイしました。 ...

KORを介したアデニル酸シクラーゼ阻害も、ΔFosBの誘導性トランスジェニック発現に応じて異なっていた（図2B）。U50,488濃度効果データの二元配置分散分析では、ΔFosBの状態（p = 0.0006、F = 14.53、df = 1）とU50,488濃度（p < 0.0001、F = 26.48、df = 3）の有意な主効果が示されたが、有意な交互作用は認められなかった（p = 0.833、F = 0.289、df = 3）。濃度-効果曲線の非線形回帰分析により、ΔFosB onマウスではΔFosB offマウスと比較してU50,488 E max値が大きく（阻害率18.3 ± 1.14%、Studentのt検定でΔFosB onとp < 0.05で有意差あり）、U50,488 EC 50値には有意差は認められなかった（ΔFosB onマウスとoffマウスでそれぞれ310 ± 172 nMと225 ± 48 nM、p = 0.324）。

MORおよびKORで観察された効果とは対照的に、誘導性トランスジェニックΔFosB発現は、カンナビノイドアゴニストWIN55212-2によるアデニル酸シクラーゼ阻害に有意な影響を与えなかった（図2C）。WIN55,212-2濃度-効果データの二元配置分散分析では、薬物濃度に有意な効果が認められた（p < 0.0001、F = 23.6、df = 2）が、ΔFosBの状態には有意な効果は認められず（p = 0.735、F = 0.118、df = 1）、有意な交互作用も認められなかった（p = 0.714、F = 0.343、df = 2）。さらに、アゴニストが存在しない場合、ΔFosBの状態は基礎またはフォルスコリン刺激によるアデニル酸シクラーゼ活性に影響を与えなかった。 ΔFosB onマウスの基礎アデニル酸シクラーゼ活性は491 ± 35 pmol/mg/minであったのに対し、ΔFosB offマウスでは546 ± 44であった（スチューデントのt検定によるp = 0.346）。同様に、1 µMフォルスコリン存在下でのアデニル酸シクラーゼ活性は、ΔFosB onマウスでは2244 ± 163 pmol/mg/minであったのに対し、ΔFosB offマウスでは2372 ± 138 pmol/mg/minであった（p = 0.555）。

3.3。 アデニリルシクラーゼのオピオイドおよびカンナビノイド受容体媒介阻害に対するΔcJunの効果

ΔFosBの誘導性遺伝子発現がNAcにおけるMORおよびKORからアデニル酸シクラーゼへの抑制シグナル伝達を増強したため、ΔFosBを介した転写の優性阻害因子がオピオイド受容体シグナル伝達を逆方向に調節するかどうかを調べることは興味深い。この疑問に対処するため、ΔcJunを条件的に発現する二重遺伝子導入マウスのNAcから調製した膜において、DAMGOおよびU50,488によるフォルスコリン刺激アデニル酸シクラーゼ活性の阻害を調べた。結果は、ΔcJun発現がMORまたはKORによるアデニル酸シクラーゼ活性の阻害に有意な影響を与えないことを示した（図3）。 DAMGO濃度-効果曲線の二元配置分散分析では、DAMGO濃度の主効果は有意であったが（p < 0.0001、F = 20.26、df = 6）、ΔcJunの状態の主効果は有意ではなく（p = 0.840、F = 0.041、df = 1）、有意な交互作用も認められなかった（p = 0.982、F = 0.176、df = 6）。同様に、ΔcJunがオンのマウス（E max = 23.6 ± 2.6%、EC 50 = 304 ± 43 nM）とΔcJunがオフのマウス（E max = 26.1 ± 2.5%、p = 0.508、EC 50 = 611 ± 176 nM、p = 0.129）の間で、E maxまたはEC 50値に有意差は認められなかった。 U50,488でも同様の結果が得られ、濃度-効果曲線の二元配置分散分析では、濃度による有意な効果（p < 0.0001、F = 11.94、df = 6）が認められたが、ΔcJunの状態による有意な効果（p = 0.127、F = 2.391、df = 1）は認められず、有意な交互作用もなかった（p = 0.978、F = 0.190、df = 6）。同様に、ΔcJunがオンのマウス（E max = 14.8 ± 2.9%、EC 50 = 211 ± 81 nM）とオフのマウス（E max = 16.7 ± 1.8%、p = 0.597、EC 50 = 360 ± 151 nM、p = 0.411）の間で、 E maxまたはEC 50値に有意差はなかった。

図3 

NAcにおけるアデニリルシクラーゼ活性の阻害に対するΔcJun発現の効果。 ΔcJun発現（ΔcJunon）またはコントロール（ΔcJunoff）マウスの膜をDAMGO（A）、U50,488H（B）またはWIN55,212-2の存在下でインキュベートしました ...

ΔcJunの発現は、カンナビノイドアゴニストによるNAcのアデニル酸シクラーゼの阻害にも有意な影響を与えなかった。WIN55,212-2濃度効果曲線の二元配置分散分析では、WIN55,212-2濃度の有意な主効果が示されたが（p < 0.0001、F = 15.53、df = 6）、遺伝子型の有意な主効果は示されず（p = 0.066、F = 3.472、df = 1）、有意な交互作用もなかった（p = 0.973、F = 0.208、df = 6）。同様に、WIN55,212-2のEmax値（ΔcJunオンマウスとオフマウスでそれぞれ13.0 ± 2.3%と13.6 ± 0.9%の阻害、p = 0.821）およびEC50値（ΔcJunオンマウスとオフマウスでそれぞれ208 ± 120 nMと417 ± 130 nM、p = 0.270）に有意差は認められなかった。したがって、ΔcJunを発現するマウスではWIN55,212-2の効力がわずかに低下する傾向が見られたものの、このトランスジーンはアデニル酸シクラーゼのカンナビノイド阻害を大きく変化させることはなかった。さらに、ΔcJunの状態は基礎状態またはフォルスコリン刺激によるアデニル酸シクラーゼ活性に影響を与えなかった。基礎アデニル酸シクラーゼ活性は、ΔcJunを発現させたマウスでは1095 ± 71 pmol/mg/min、ΔcJunを発現させなかったマウスでは1007 ± 77 pmol/mg/minであった（p = 0.403）。1 µMのフォルスコリンで刺激したアデニル酸シクラーゼ活性は、ΔcJunを発現させたマウスでは4185 ± 293 pmol/mg/min、ΔcJunを発現させなかったマウスでは4032 ± 273 pmol/mg/minであった（p = 0.706）。

3.4。 討論

本研究の結果、ダイノルフィン/D 1 R 含有ニューロンで ΔFosB を誘導的にトランスジェニック発現させたマウスの側坐核 (NAc) において、MOR を介した G タンパク質活性化の増強とアデニル酸シクラーゼの阻害が認められた。ΔFosB発現マウスの NAc では、KOR を介したアデニル酸シクラーゼ活性の阻害も増強されており、ΔFosB が NAc における内因性オピオイド系を調節していることが示唆された。ΔFosB 過剰発現マウスでは、対照マウスと比較して、MOR 刺激による [ 35 S]GTPγS 結合に対するDAMGO E max値が大きく、アデニル酸シクラーゼ阻害に対する EC 50値が低かった。これらの結果は、検討したアッセイ条件下では、エフェクター調節に対する受容体予備能は存在するが、G タンパク質活性化に対する受容体予備能は存在しない可能性を示唆している。 KORアゴニストによるアデニル酸シクラーゼの最大阻害がΔFosB発現によって影響を受けるという発見は、KORを介した応答に対する受容体予備能が低いことを示唆しており、マウス脳におけるKOR結合部位のレベルが低いことと一致する（Unterwaldら、1991）。対照的に、CB1Rを介したGタンパク質活性およびアデニル酸シクラーゼの阻害はΔFosB発現の影響を受けなかったことから、これらのNAcニューロンではオピオイド系とカンナビノイド系がΔFosBに対する応答において異なっていることが示唆される。

ΔFosBがオピオイド受容体を介したシグナル伝達に及ぼす影響は、線条体におけるΔFosBの発現がモルヒネの急性および慢性効果を変化させたという我々の以前の報告（Zachariouら、2006）と一致している。その研究の発見の一つは、ダイノルフィン/D1R線条体ニューロンにΔFosBを遺伝子導入発現させたマウスは、対照群よりも場所条件付けにおけるモルヒネに対する感受性が高かったことである。さらに、この効果は、NAcへの部位特異的注入によるウイルス媒介ΔFosB発現によっても再現された。これらの観察結果は、NAcにおけるMORシグナル伝達の増強を示す今回の結果と一致している。

我々は以前、ダイノルフィンをコードする遺伝子がΔFosBの標的であることを特定し、ダイノルフィンの減少がΔFosB二重トランスジェニックマウスにおけるモルヒネの報酬特性の増強と一致すると提唱した（Zachariouら、2006）。今回の結果は、ΔFosBを発現するマウスではNAcにおけるKORを介したアデニル酸シクラーゼの阻害が増強されていることを示しており、これはダイノルフィンの減少に伴うKOR感受性の代償的増加を反映している可能性がある。以前の研究では、NAcを含むプロダイノルフィンノックアウトマウスの特定の脳領域でKORが上方制御されていることが示されている（Clarkeら、2003）。

ΔFosBとは対照的に、ΔFosB結合パートナーcJunの優性阻害型切断変異体であるΔcJunの誘導性遺伝子発現は、MORまたはKORアゴニストによるアデニル酸シクラーゼ阻害を変化させなかった。これらの結果は、比較的低い基礎レベルのΔFosB発現が、NAcにおけるこのシグナル伝達レベルでのオピオイド受容体シグナル伝達の維持に重要な役割を果たしていないことを示唆している。我々の以前の研究（Zachariouら、2006）でモルヒネの条件付け報酬効果がΔcJun発現によって減少したという事実は、条件付け手順中のΔFosBのモルヒネ誘導が薬物に対する行動反応の調節に重要であるか、またはオピオイド受容体による近位シグナル伝達に影響を与える以外のΔFosBの転写効果がオピオイド報酬に影響を与える可能性があることを示唆している。いずれにせよ、本研究の結果は、線条体のダイノルフィン/D 1 R発現ニューロンにおいてΔFosBの発現が基礎レベルを超えて上昇すると、NAcにおけるアデニル酸シクラーゼの阻害に対するMORとKORの結合が著しく増加することを明確に示している。

ΔFosBの過剰発現によってMORおよびKORを介したシグナル伝達が強化されるメカニズムは不明ですが、我々は以前、[3H]ナロキソン結合によって評価したMORレベルは、ΔFosBオンマウスとオフマウスのNAcで差がないことを示しました（ Zachariouら、2006）。同じ研究では、この領域におけるGαi1および2タンパク質レベルはΔFosB発現によって影響を受けないことが分かりました。しかし、以前の遺伝子発現アレイ解析では、ΔFosBオンマウスのNAcでGαo mRNAが上方制御されていることが示されました（McClungおよびNestler、2003）。今後の研究では、トランスジェニックΔFosB発現がタンパク質レベルでのGタンパク質サブユニット発現、および多くのGタンパク質調節タンパク質の発現に及ぼす影響を包括的に調べることは興味深いでしょう。

ΔFosB発現がCBを増強しなかったことは興味深い1NAcのR媒介シグナル伝達。 CBの変更が可能です1Rシグナル伝達は、NAc準備全体では不明瞭なニューロンの離散集団で発生します。 例えば、Δの投与9– THCは、NAcのシェルではなくコアにΔFosBを有意に誘導しました（ペロッティ他、2008） 私確かに、Δでの挑戦が示されています9-Δの繰り返し投与後のTHC9-THCはNAcコアのドーパミン放出を増加させましたが、シェルの放出を減少させました (カドニら、2008）。 また、バイトランスジェニックマウスの11A系統は、ダイノルフィン/ DでのみΔFosBを発現することに注意することも重要です1線条体のR陽性中型有棘ニューロン、ただしCB1Rはダイノルフィン/ Dの両方で表されます1Rおよびエンケファリン/ D2R陽性線条体ニューロン（ホーマンとヘルケンハム、2000）、および皮質求心性神経の末端（ロベ他、2001）。 ΔFosBを介した転写のドミナントネガティブレギュレーターであるΔcJunの発現も、カンナビノイド受容体シグナル伝達に有意な影響を与えませんでしたが、ΔcJunは両方のD1 とD2-これらのマウスにおける中型有棘ニューロンの集団（ピークマンら、2003）。 しかし、MORとKORの結果が示唆するように、ΔcJunが受容体シグナル伝達に影響を与えないように、ΔFosBの基礎発現が十分に低い可能性があります。 また、CB1Rシグナル伝達は基底ΔFosB発現によって適度に増強されるため、ΔFosB発現をさらに増加させるか、ΔcJunでその作用をブロックすると、統計的有意性のレベルに達しないわずかな効果しかありません。 この解釈の間接的なサポートは、WIN55,212-2 ECを比較することで確認できます50 ΔcJun対ΔFosBを発現するマウス間の値。 WIN55,212-2 ECの比率50 ECにΔcJunの発現を誘発したマウスにおけるアデニリルシクラーゼ阻害の値50 ΔFosBの発現が誘導されたマウスでのGタンパク質活性化の値は4.0でしたが、どちらの導入遺伝子も誘導されていないマウスでの同じ比率は1.2でした。

あるいは、カンナビノイドはCB1Rシグナル伝達に直接影響を与えることなくΔFosBの発現を誘導する可能性がある。このシナリオでは、カンナビノイドはΔFosBを介した転写調節によって他の薬物の精神活性作用に対する反応性を調節する可能性がある。実際、 Δ9 -THCの投与はオピオイドとアンフェタミンに対する交差感作を引き起こす（Cadoniら、2001、Lamarqueら、2001）が、この仮説と一致する。さらに、カンナビノイドアゴニストCP55,940の反復投与は、本研究でΔFosBを誘導的に発現するマウスと同様に、NAcにおけるMORを介したGタンパク質活性化を増加させることが報告されている（Viganoら、2005）。 ΔFosBの発現がΔ9 -THCを介した行動に及ぼす影響は評価されていないが、今回の結果は相互作用を排除するものではない。今回の研究と我々の以前の研究（Zachariouら、2006）の結果は、ΔFosBが線条体のMORおよびKOR/ダイノルフィンに変化をもたらすことを示している。場所選好によって測定されたΔ9-THCの報酬効果はMORノックアウトマウスでは消失するが、KORの欠失はΔ9-THCの場所嫌悪を減弱させ、Δ9 -THCの場所選好を明らかにした（ Ghozlandら、2002 ）。同様に、プロダイノルフィンノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較してΔ9 -THCに対する条件付け場所嫌悪が消失している（Zimmerら、2001）。これらのデータは、Δ9-THCはΔFosB誘導後、そしてそれに続くMORシグナル伝達の誘導とダイノルフィン発現の減少後に、より報酬効果が高くなる可能性があることを示唆している。

要約すると、本研究の結果は、D 1 R/ダイノルフィン陽性線条体ニューロンにおけるΔFosBの発現が、NAcにおけるGタンパク質を介したアデニル酸シクラーゼ活性の阻害レベルで、MORおよびKORを介したシグナル伝達を増強することを示した。この知見は、報酬における内因性オピオイド系の役割を示した研究（Trigoら、2010）と一致しており、ΔFosBを介した報酬への影響の潜在的なメカニズムを提供する。対照的に、NAcにおけるCB 1 Rを介したシグナル伝達は、検討した条件下では線条体ΔFosB発現によって有意に影響を受けなかったが、ΔFosB誘導がエンドカンナビノイド系に及ぼす影響を決定するためには、さらなる研究が必要である。

研究ハイライト

  • MORシグナル伝達はΔFosBを発現するマウスの側坐核で増強される
  • アデニリルシクラーゼのKOR阻害は、ΔFosBを発現するマウスでも強化されます
  • ΔFosBの発現はCBを変化させません1側坐核におけるRシグナル伝達
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謝辞

著者らは、[ 35S ]GTPγS結合アッセイに関する技術的な支援を提供してくれたHengjun He、Jordan Cox、およびAaron Tomarchioに感謝する。本研究は、USPHS助成金DA014277（LJS）、DA10770（DES）、およびP01 DA08227（EJN）の支援を受けて実施された。

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脚注

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