コメント：ストレス、薬物乱用、そして特定の自然な報酬の両方がDeltaFosBの蓄積を引き起こしますが、ストレスは異なる下流の細胞と後に異なる受容体と遺伝子を活性化します。 言い換えれば、中毒とストレスへの抵抗は根本的に異なるメカニズムに依存しています
J Neurosci。 2010 Oct 27; 30（43）：14585-92。
Vialou V、迷路I、Renthal W、ラップランドQC、ワッツEL、Mouzon E、Ghose S、Tamminga CA、Nestler EJ。
ソース
フィッシュバーグ神経科学科、マウントシナイ医科大学、ニューヨーク、ニューヨーク10029、アメリカ。
抽象
ストレスや薬物誘発神経細胞の適応の根底にある分子メカニズムは不完全に理解されています。 そのような適応に関係する1つの分子は、慢性的なストレスまたは乱用薬物への反復暴露のいずれかに反応して、げっ歯類の側坐核（NAc）、重要な脳の報酬領域に蓄積する転写因子、ΔFosBである。 Tこれらの環境刺激によるΔFosB誘導を制御する上流の転写機構は、とらえどころのないままである。 ここでは、ストレス依存性の新規上流メディエーターとして、活性依存性転写因子、血清反応因子（SRF）を同定します。 コカインではない - 、ΔＦｏｓＢを誘発した。 ＳＲＦは、鬱病のヒト患者のＮＡｃおよび社会的敗北ストレスに慢性的に曝露されたマウスの両方において下方制御されている。 ＳＲＦのこの下方制御は回復力のある動物には存在しない。 誘導性突然変異誘発の使用を通して、我々は主に回復力のあるマウスで起こるΔFosBのストレス媒介性誘導がこの脳領域におけるSRF発現に依存することを示す。。 さらに、ＳＲＦのＮＡｃ特異的遺伝子欠失は、様々なうつ病様および前不安様表現型を促進し、動物を慢性的なストレスの有害な影響に対してより敏感にする。 対照的に、我々はSRFが慢性コカイン曝露に反応してNAc中のΔFosB蓄積に役割を果たしていないことを証明する。 さらに、SRFのNAc特異的ノックアウトはコカイン誘発行動に影響を及ぼさず、慢性的な社会的敗北ストレスと反復コカイン曝露は独立したメカニズムを通してΔFosB蓄積と行動感受性を調節することを示している。
概要
重要な脳の報酬領域である側坐核（NAc）は、環境刺激に反応して動機付けに関連する行動を推進する感覚および認知入力を統合するのに重要です（Nestler and Carlezon、2006; Sesack and Grace、2010）。 ＮＡｃはまた、薬物嗜癖および鬱病に関連する行動異常にも関係している。 したがって、深部脳刺激でＮＡｃを標的化することは、ヒトおよびげっ歯類の両方における鬱病および嗜癖様行動を軽減することが示されている（Ｓｃｈｌａｐｆｅｒら、ＸＮＵＭＸ； Ｖａｓｓｏｕｒｅｒら、ＸＮＵＭＸ； Ｈｅｉｎｚｅら、ＸＮＵＭＸ； Ｋｕｈｎら）。他、ＸＮＵＭＸ）。
乱用薬物またはストレスの薬物への反復暴露は、潜在的に依存症および鬱病の慢性性の根底にある、NAcにおける遺伝子発現の変化したパターンを誘発する（Bertonら、2006； Krishnanら、2007； Mazeら、2010； Vialouら）。 、ＸＮＵＭＸ）。 興味深いことに、fosB遺伝子のスプライス産物である転写因子ΔFosBは、反復薬物またはストレス曝露に応答してNAcに蓄積する（Nestler、2010； Perrottiら、2008； Vialouら、2008）。 ΔＦｏｓＢは、レクリエーション薬の使用から慢性中毒状態への移行を導く潜在的な分子スイッチとして提案されている（Ｎｅｓｔｌｅｒら、ＸＮＵＭＸ； ＭｃＣｌｕｎｇら、ＸＮＵＭＸ； Ｒｅｎｔｈａｌら、ＸＮＵＭＸ）。いくつかの薬物乱用に対するやりがいのある反応。 さらに最近になって、慢性的な社会的敗北ストレス後のNAcにおけるΔFosB誘導の役割（Nikulinaら、1999; Vialouら、2004）が明らかにされている：ΔFosBはストレスの多い刺激に対する能動的対処反応を促進し、回復力を高める。。 ΔＦｏｓＢ誘導は刺激依存的に起こるが、ＮＡｃにおける薬物およびストレス誘導ΔＦｏｓＢ蓄積の原因となるメカニズムは未知のままである。
血清応答因子（SRF）は、c-fos、fosb、Egr1、Arcなどのいくつかの前初期遺伝子の活性依存性転写活性化に必要な転写因子です（KnöllandNordheim、2009）。 最近の研究では、成体の脳におけるシナプス活動や回路形成の調節など、ニューロンの形態学的および細胞構築的特性に対するSRFの効果が実証されています（KnöllandNordheim、2009）。 これらの発見は、SRFが乱用またはストレスの薬物への慢性的な曝露によって機能的に調節されているかどうか、およびこれらの条件下でのΔFosB誘導に対するそのような調節の潜在的な影響を調査することを促しました。
ここでは、NAcのSRFのダウンレギュレーションが抑制性および不安惹起性の表現型を促進し、最終的に慢性ストレスの有害な影響に対する動物の脆弱性を高める新しいメカニズムについて説明します。。 これらの効果は、ストレスを受けた動物のNAcにおけるΔFosB誘導の喪失によって部分的に媒介されます。 うつ病患者から得られた死後NAc組織で観察されたSRFおよびΔFosB発現の減少は、ヒトのうつ病に対する我々の発見の関連性を裏付けています。 興味深いことに、ΔFosB蓄積を制御するこのメカニズムはストレス特異的であるように見えます：慢性コカイン曝露はSRF発現に影響を与えず、NAcからのSRF削除は慢性コカイン曝露後のΔFosB蓄積に影響を与えず、そのようなSRF削除はコカインに影響を与えません-誘発された行動。 ストレスとの関連で、SRFとΔFosBの間のこの新しい相互作用は、慢性ストレスに対する個人の感受性を調節する重要な恒常性メカニズムを表している可能性があります。
材料と方法
動物
８週齢のＣＸＮＵＭＸＢＬ ／ ＸＮＵＭＸＪ雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をすべての行動および生化学実験に使用した。 すべての動物は実験操作の少なくとも57週の間動物施設に慣れ、6 h明/暗サイクル（1：23 AMから25：12 PMに点灯）で7-00°Cで自由に飼育した。食料と水へのアクセス。 実験は、神経科学学会のガイドラインおよびマウントシナイ医学部の施設内動物管理使用委員会に従って行われた。
コカイン実験［ウエスタンブロッティングおよび定量クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）］には、ＸＮＵＭＸ〜ＸＮＵＭＸ週齢のオスのＣＸＮＵＭＸＢＬ ／ ＸＮＵＭＸＪマウスを用いた。 動物に生理食塩水またはコカイン（8 mg / kgコカイン-HCl; Sigma）のいずれかを毎日7回腹腔内注射した。 マウスは、最終処置の1時間後に10で使用された。 行動実験のために、マウスを手術後に単独で飼育し、そして以下に記載するように、57 mg / kg（自発運動感作）または6 mg / kg（条件付け場所選択）コカイン-HClで腹腔内に処置した。
Ｓｒｆｆｌ ／ ｆｌマウスは、以前に記載されているように生成された（Ｒａｍａｎａｎら、ＸＮＵＭＸ）。 SrfのNAc特異的ノックアウトは、定位注射およびそれに続くアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合したCreレコンビナーゼ（Cre）のウイルス過剰発現によって達成された。 自己削除しないCreが使用されました。 対照として、Ｓｒｆｆ１ ／ ｆｌマウスにおいて、ＡＡＶ − Ｃｒｅ − ＧＦＰの代わりにＡＡＶ − ＧＦＰを注射した。 手短に言えば、マウスをケタミン（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）とキシラジン（ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｋｇ）の混合物を使用して、ウイルス送達に使用される以下の定位座標で麻酔した：＋ ＸＮＵＭＸ（前方／後方）、＋ ＸＮＵＭＸ（外側）、 - 正中線から（ブレグマに対して）2005°の角度にある10（背側/腹側）。 合計で10μlの精製ウイルスを、1.6分の期間にわたって両側に送達し（1.5μl/分）、続いて4.4分の休止をおいた。 ウイルス発現が最大になったとき、マウスを手術後ＸＮＵＭＸ週に試験し、標準的な組織学的方法を用いて全ての動物についてウイルス注射部位を確認した。 ウイルス媒介Ｃｒｅ発現の効率は、免疫組織化学およびＡＡＶ − Ｃｒｅ − ＧＦＰおよびＡＡＶ − ＧＦＰをＮＡｃに与えられた動物からの顕微解剖されたＮＡｃパンチで行われたＳｒｆについての逆転写ＰＣＲによって検証された。 ＡＡＶ − ＧＦＰおよびＡＡＶ − Ｃｒｅ − ＧＦＰウイルスは、以前に記載されたように生成された（Ｍａｚｅら、ＸＮＵＭＸ）。
行動手順
社会的敗北のストレス
ＣＸＮＵＭＸＢＬ ／ ＸＮＵＭＸＪマウスを、以前に記載されているように（Ｂｅｒｔｏｎら、ＸＮＵＭＸ； Ｋｒｉｓｈｎａｎら、ＸＮＵＭＸ； Ｖｉａｌｏｕら、ＸＮＵＭＸ）ＸＮＵＭＸ連続日にわたって慢性的な社会的敗北ストレスに供した。 手短に言えば、各マウスを、１日当たりＸＮＵＭＸ分の間、不慣れで攻撃的なオスのＣＤＸＮＵＭＸ引退したブリーダーマウスに曝露した。 ＣＤＸＮＵＭＸアグレッサーとの直接的な相互作用の後、動物は次のＸＮＵＭＸのために同じケージの隣接区画に感覚的接触はしないが物理的接触はしないで置かれた。 対照動物は同等のケージに収容されたが、同じ系統の成員を有する。 社会的相互作用テストは敗北の最終日の翌日に行われた。
なじみのないCD1雄マウスに対する社会的回避は、公表されたプロトコルに従って評価された（Berton et al。、2006; Krishnan et al。、2007; Vialou et al。、2010）。 実験用マウスは、最初に空の金網ケージを含むオープンフィールドに2.5分間導入されました。 1回目のセッションでは、見慣れないCD8オスマウスが有線ケージに導入されました。 インタラクションゾーン（ケージを囲む幅2007cmの廊下）で過ごした時間を測定しました。 敗北したマウスの感受性および回復力のある亜集団への分離は、以前に記載されたように実施された（Krishnan et al。、2010; Vialou et al。、100）。 対照マウスの大多数は、空のターゲットエンクロージャーよりもソーシャルターゲットとの対話に多くの時間を費やしたため、100の相互作用比（ソーシャルターゲットの存在下と非存在下での相互作用ゾーンで費やされた等しい時間）をカットオフとして設定しました。 スコアが100未満のマウスは感受性があるとラベル付けされ、スコアが2007以上のマウスは回復力があるとラベル付けされました。 広範な行動、生化学的、および電気生理学的分析は、これらの明確な感受性および回復力のある亜集団の有効性を裏付けています（Krishnan et al。、2009; Wilkinson et al。、2010; Vialou et al。、XNUMX）。
Ｓｒｆｆｌ ／ ｆｌマウスの社会的敗北ストレスに対する脆弱性を調べるために、ＡＡＶ − ＧＦＰまたはＡＡＶ − Ｃｒｅ − ＧＦＰを両側に注射したマウスを同日に３回連続して敗北させ、その後社会的相互作用について試験した。 この準最大敗北法は、遺伝子操作後の感受性感受性表現型を明らかにするために以前に検証されている（Krishnanら、24； Vialouら、2007）。
学習性無力感。
ＡＡＶ − ＧＦＰまたはＡＡＶ − Ｃｒｅ − ＧＦＰのいずれかを過剰発現しているＳｒｆｆｌ ／ ｆｌマウスを、以前に記載されているように（Ｂｅｒｔｏｎら、ＸＮＵＭＸ）学習された無力手順に供した。 簡潔には、マウスを、連続した2007日数にわたって1時間にわたって断続的に避けられない足の衝撃に曝した（2 mA、0.45の持続時間）。 試験当日、マウスを5連続エスケープ試験のためにボックスに再導入した。 各試行の間、連続的なショックを与え、そしてマウスに隣接する非電化コンパートメントに入ることによって逃げる機会を与えた。 脱出が成功した後、ドアは自動的に閉じられ、逃避潜時が記録された。 マウスが15以内に逃避しなかったとき、試験は終了し、失敗として記録された。 以前の研究は、ＮＡｃおよび他の領域におけるウイルス発現が、ストレスがない場合のベースライン逃避行動に影響を及ぼさないことを示した（Ｎｅｗｔｏｎら、ＸＮＵＭＸ； Ｂｅｒｔｏｎら、ＸＮＵＭＸ）。
自発運動感作
AAV-GFPまたはAAV-Cre-GFPのいずれかのNAc内注射の30週間後、Srffl / flマウスを自発運動感作に供した。 マウスを運動領域に4日10分間30日間慣れさせた。 馴化後、動物に6 mg / kgのコカイン-HClを腹腔内注射し、自発運動ボックスに入れました。 動物の自発運動は、フォトビームシステム（サンディエゴインスツルメンツ）を使用して、XNUMX日XNUMX分間の歩行可能なビーム遮断として記録されました。 自発運動感作はXNUMX日間にわたって記録された。
条件付きの場所の好み。
プレイスコンディショニング手順は、以下の変更を加えて、以前に説明されたように（Maze et al。、2010）実行されました。 簡単に説明すると、Srffl / flマウスにAAV-GFPまたはAAV-Cre-GFPをNAc内注入してから18日後、10つの文脈的に異なる環境からなるコンディショニングチャンバーに動物を入れました。 30つのコンディショニングチャンバーのいずれかに対して有意な選好を示すマウスは研究から除外されました（すべての動物の<7.5％）。 コンディショニンググループは、まだ存在する可能性のあるチャンバーバイアスを調整するためにさらにバランスが取られました。 翌日、動物に生理食塩水を注射し、午後に一方のチャンバーに30分間閉じ込め、次にコカイン（20 mg / kg、ip）を注射し、翌日、もう一方のチャンバーにXNUMX分間閉じ込めました。治療ごとにXNUMXラウンドの関連トレーニング（XNUMXつの生理食塩水とXNUMXつのコカインペアリング）。 試験の日に、マウスを２０分間処置せずに装置に戻し、側の好みを評価するために試験した。 コカインに対する運動反応は、薬物治療の有効性を確保するために、コカインペアチャンバーでのビーム遮断を介して評価されました。 すべてのグループについて、生理食塩水に応答したベースラインの移動を評価して、移動がウイルス治療によって影響を受けなかったことを確認した。
その他の行動試験
Ｓｒｆｆｌ ／ ｆｌマウスを、公開されているプロトコルに基づいて、オープンフィールド試験、明／暗試験、および強制水泳試験で試験した（Ｖｉａｌｏｕら、ＸＮＵＭＸ）。 オープンフィールドでのマウスの活動を、赤色光条件下でビデオ追跡システム（Ethovision）を用いて2010 minの間記録した。 明／暗テストのために、マウスは、小さな閉じたアリーナに接続された１つの大きな照明付きアリーナからなる２室の箱を自由に探索することを許可された。 マウスをＸＮＵＭＸ分の期間試験していずれかの囲いで過ごした時間量を評価した。 オープンフィールド試験および明／暗試験では、それぞれ、中心部および明部で過ごした時間を、不安関連反応の逆指数として評価した。 5 d強制水泳試験を5 minの期間行った。 強制水泳テスト中の無動時間の増加は、うつ病様行動として解釈されました。 1 d強制水泳試験はマウスで広く使用されており、抗うつ薬療法は不動時間を短縮するという点で、予測妥当性の尺度として検証されています。
免疫組織化学
Ｓｒｆｆｌ ／ ｆｌマウスを麻酔し、ＸＮＵＭＸ％パラホルムアルデヒド／ ＰＢＳで心臓内灌流した。 脳を取り出し、4％スクロース/ PBS中で凍結保護した。 冠状切片（ＸＮＵＭＸμｍ）を凍結ミクロトームで切断し、そして免疫組織化学的分析のために処理した。 Ｓｒｆｆ１ ／ ｆｌノックアウトの検証は、ＳＲＦに対するポリクローナル抗体（ＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸ； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。 CreはGFPに融合しているので、解剖した脳におけるGFP（ニワトリポリクローナル、30 / 30、Aves Labs）発現を介してCre発現を確認した。 Srffl / flノックアウトマウスにおける社会的敗北ストレス後のΔFosB誘導の定量化のために、タンパク質のN末端領域に対して産生させたウサギポリクローナル抗体（1 / 2000; Santa Cruz Biotechnology）を用いてΔFosBを検出した。 共焦点顕微鏡（ＸＮＵＭＸ×倍率； Ｚｅｉｓｓ）で画像を撮影した。 ΔＦｏｓＢ免疫反応性について陰性および陽性として計数されたＧＦＰ免疫陽性細胞の数を各動物について複数の画像で定量し、その後各動物について平均値を計算した。 各動物を統計分析のために個々の観察と見なした。
ヒト死後NAc組織
人間の死後の脳組織は、ダラス脳コレクションから入手しました。このコレクションでは、近親者の同意を得て、ダラス医療検査官事務所とテキサス大学サウスウエスタン校（UT）の組織移植プログラムから組織を収集しています。 年齢、死後の間隔、RNA完全性数（RIN）、およびpHを一致させた男性と女性の両方から組織を分析しました。 昏睡、低酸素症、発熱、発作、脱水症、低血糖症、多臓器不全、死亡時の神経毒性物質の摂取などの特定の死戦期呼吸は、死後の脳組織のRNAの完全性に影響を与えます（Tomita et al。、2004）。 死戦期呼吸スケール（AFS）を使用して、これら0つの条件のそれぞれで組織サンプルを特徴付けました。 死戦期呼吸因子がない場合はスコア1が割り当てられ、死戦期呼吸がない場合は0としてスコア付けされ、8〜0の合計AFSスコアが得られます。死戦期呼吸スコアが1または1の組織は、高品質のサンプルを反映しています。 症例の人口統計を表40に示します。優れた組織品質は、高いRIN値によって確認されました。 ケースは、-80°Cのイソペンタンで急速凍結し、-XNUMX°Cで保管する前に、標準的な解剖を受けました。 NAcのさらなる解剖は凍結組織で行われた。 UTサウスウエスタンの機関審査委員会は、研究用にこの組織の収集を審査し、承認しました。 後日、うつ病の各症例について直接の情報提供者インタビューが行われ、症例の病気に関する情報が文書化されました。 大うつ病性障害のコンセンサス診断は、XNUMX人の研究精神科医によってDSM-IV基準を使用して行われました。 この研究に含まれる症例のいずれも、乱用薬物、アルコール、または抗うつ薬以外の処方薬に対して陽性の血液毒物学スクリーニングを持っていませんでした。 抗うつ治療にもかかわらず、すべての被験者は死亡時に臨床的にうつ病でした。 組織サンプルは、分析のために盲検法で分配された。
表1。
ヒトの死後研究のための人口統計データ
ウエスタンブロッティング
ヒトおよびマウスのＮＡｃ標本を以前に記載されているように処理した（Ｍａｚｅら、ＸＮＵＭＸ）。 凍結組織を、プロテアーゼ（Roche）およびホスファターゼ阻害剤（Sigma）を含む2010％SDSを含む5 mM HEPES溶解緩衝液中で超音波処理した。 タンパク質濃度は、Dcタンパク質アッセイ（Bio-Rad）によって決定した。 等量のタンパク質サンプルをSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにかけた。 ＳＲＦに対する抗体（ＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸ； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはＧＡＰＤＨ（ＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸ； Ａｂｃａｍ）を用いてウエスタンブロットをプローブし、次いでＯｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（Ｌｉｃｏｒ）を用いてスキャンし定量した。
RNAの単離と定量的PCR
ＲＮＡ単離、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、およびデータ分析は、以前に記載されているように実施した（Ｍａｚｅら、ＸＮＵＭＸ； Ｖｉａｌｏｕら、ＸＮＵＭＸ）。 手短に言えば、RNAをTriZol試薬（Invitrogen）で単離し、QiagenからのRNAeasyマイクロキットでさらに精製した。 全てのＲＮＡ試料は、ＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸおよびＸＮＵＭＸ ／ ＸＮＵＭＸ値≧ＸＮＵＭＸを有すると決定された。 逆転写はｉＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏ − Ｒａｄ）を用いて行った。 ＳＹＢＲグリーン（Ｑｕａｎｔａ）を用いたｑＰＣＲは、以下のサイクルパラメータを用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＸＮＵＭＸＨＴ ＲＴ ＰＣＲシステムを用いて実施した。 ＸＮＵＭＸについてはＸＮＵＭＸ℃、ＸＮＵＭＸについてはＸＮＵＭＸ℃、ＸＮＵＭＸについてはＸＮＵＭＸ℃。 単一のPCR産物を確認するための解離曲線を作成するために、2010°Cまで加熱を段階的に行った。 治療条件のＣ（ｔ）値（対照対感受性または回復マウス、またはヒト対照対鬱病患者）をΔΔＣ（ｔ）法（Ｔｓａｎｋｏｖａら、ＸＮＵＭＸ）と比較することによってデータを分析した。 ΔＦｏｓＢ ｑＰＣＲプライマー：順方向、ＡＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＴＣＧＧＡＧＡＴおよび逆方向、ＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧ。
チップ
ＣｈＩＰは、コントロール、感受性、および回復力のあるマウスからのプールされた両側ＮＡｃパンチ（４つのＸＮＵＭＸゲージパンチ／マウス）および前回の敗北経験からｘｈの食塩水およびコカインからの以前の記載（Ｍａｚｅら、ＸＮＵＭＸ）に従って行った。処置動物は、最終処置からｈ時間後に処置した。 組織をＸＮＵＭＸ％ホルムアルデヒド中で架橋した。 続いて固定をグリシン適用により中断し、そして組織を洗浄しそして使用するまで－ＸＮＵＭＸ℃に保った。 剪断したクロマチンを、予め磁性ビーズに結合した抗ＳＲＦ抗体（Santa Cruz Biotechnology）（Dynabeads M-2010； Invitrogen）と共に一晩インキュベートした。 逆架橋およびＤＮＡ精製の後、ｆｏｓｂプロモーターへのＳＲＦの結合を、２つの血清応答エレメント結合部位を含むｆｏｓｂプロモーターの領域にまたがるプライマーを使用してｑＰＣＲによって決定した。 ＳＲＦプルダウンは、無抗体対照と比較して有意に濃縮されていた。 マウスfosb遺伝子プロモータープライマー：フォワード、CCCTCTGACGTAATTGCTAGGおよびリバース、ACCTCCCAAACTCTCCCTTC。
統計分析
一元配置分散分析を使用して、生化学的分析および行動分析において、対照、感受性、および回復力のあるマウス間の平均を比較しました。 二元配置分散分析を使用して、Srfローカルノックアウトマウスの社会的敗北によるΔFosB誘導を比較し、学習性無力感および運動感作プロトコルにおけるSrfノックアウトの効果を比較しました。 スチューデントのt検定を使用して、ΔFosB誘導に対するSrfノックアウトの効果の平均を比較し、ヒトの死後組織とマウスのChIP分析のグループ間で平均を比較しました。 実験条件間の差は、p≤0.05の場合に統計的に有意であると見なされました。
結果
ヒト鬱病および社会的に敗北したマウスにおけるSRFおよびΔFosBの発現
うつ病のような行動の発達におけるSRFの潜在的な役割を探求するために、我々は最初に死後のうつ病患者のNAcにおけるSRFタンパク質発現を評価しました。 うつ病の被験者は、年齢を一致させた対照と比較して、NAcで有意に低下したSRFレベルを示しました（t（19）= 1.9; p <0.05）（図1A）。 活動依存性の初期遺伝子発現の調節におけるSRFの役割を考えると（Ramanan et al。、2005）、SRFがこの脳領域でのΔFosB発現の制御に関与している可能性があると仮定しました。 この仮説を支持して、我々は、ΔfosbmRNAレベルが鬱病のヒトのNAcでも有意に減少したことを観察した（t（16）= 1.8; p <0.05）（図1B）。 これは、これらの条件下でもΔFosBタンパク質のレベルが低下するという最近の発見と一致しています（Vialou et al。、2010）。
図1。
SRFの慢性ストレス誘発性抑制は、NAcにおけるΔFosB転写の減少と相関しています。 A、B、死後のヒトうつ病患者は、SRFタンパク質のレベルの低下（n = 10 /グループ; A）およびNAcにおけるΔfosbmRNA発現（n = 8 /グループ; B）を示します。 Ｃ、慢性（１０日間）の社会的敗北ストレスにさらされたマウスは、感受性および回復力のある亜集団に分類された。 D、慢性的な社会的敗北ストレスは、Cに示される社会的相互作用試験の10時間後の対照と比較して、感受性マウスのNAcのSRFタンパク質レベルを低下させるが、回復力のあるマウスは低下させない。E、NAcのΔfosBmRNAレベルは感受性マウスでは変化しないが、有意に回復力のある動物でアップレギュレートされます（n = 24–7 /グループ）。 F、SRFタンパク質は、感受性のないマウスでのみ、慢性的な社会的敗北ストレスの後にfosb遺伝子プロモーターへの結合の増加を示します（n = 15 /グループ）。 表示されるデータは、平均±SEM（エラーバーとして表される）として表されます。 Con。、コントロール; Dep。、落ち込んでいる; Sus。、影響を受けやすい; 解像度、弾力性。 * p <5対コントロール; *** p <0.05対コントロール; #p <0.001対影響を受けやすい; ## p <0.05対影響を受けやすい; ### p <0.01対影響を受けやすい。
これらの調査結果を拡張するために、マウスの慢性的な社会的敗北ストレスプロトコルを使用しました。 社会的回避の尺度に基づいて、敗北したマウスの2007つの識別可能なグループ、感受性と回復力が明らかであり（Krishnan et al。、2,23）、感受性動物は対照動物と回復力のある動物の両方と比較して社会的相互作用が大幅に減少しました（F（157.2、 0.001）= 0.001; p <0.05;ボンフェローニ補正を使用したt検定、感受性vsコントロール、p <0.01;回復力vsコントロール、p <1;回復力vs感受性、p <2,32）（図4.7C）。 最後の敗北エピソードの0.05日後、感受性、回復力、および無敗の対照マウスをNAcでのSRF発現について分析しました。 人間のうつ病の所見と同様に、SRFタンパク質レベルはコントロールと比較して感受性マウスのNAcで有意に減少しましたが、SRFレベルは回復力のあるマウスのNAcでは影響を受けませんでした（F（0.05）= 0.05; p <1; t検定ボンフェローニ補正、感受性対対照、p <XNUMX;弾性対感受性、p <XNUMX）（図XNUMXD）。
次に、これら14つのグループの動物のNAcにおけるΔfosbmRNA発現を調べ、回復力のある動物のみでΔfosb発現の有意な増加を観察しました。傾向はありますが、感受性マウスでは有意な増加は観察されませんでした（t（2.1）= 0.05; p <1 ）（図8E）。 SRFレベルとΔfosb転写の間の可能な相互作用をさらに調査するために、ChIPを使用して、感受性マウスと回復力マウスの別々のコホートで慢性的な社会的敗北ストレスの後にfosb遺伝子プロモーターへのSRF結合が変化したかどうかを調べました。 弾力性のある動物は、コントロール（t（2.1）= 0.05; p <8）および感受性マウス（t（2.0）= 0.05; p <1）と比較して、NAcのfosbプロモーターへの有意に増強されたSRF結合を示しました。 おそらく感受性マウスにおけるSRF誘導の欠如を反映して、対照と感受性マウスの間に差は観察されなかった（図XNUMXF）。
慢性的な社会的敗北ストレス後のΔFosBの調節におけるSRFの役割を確認するために、Srffl / flマウスを使用して、ΔFosBのストレス誘導に対するNAcからのSRFの選択的欠失の影響を調べました。 Srffl / flマウスに、GFPまたはCre-GFPを発現するAAVベクターをNAc内に定位注射しました。 AAV-Cre-GFPによって誘導されたSRFのNAc特異的ノックアウトが免疫組織化学的に確認されました（図2A）。 実際、SRF染色とCre発現の間に重複はなく、ノックアウトの有効性を示しています。 顕微解剖されたNAcパンチでは、SRFタンパク質レベルの有意な50％の減少が検出されました（t（11）= 4.3; p <0.001）。 この大きさは、そのような顕微解剖の組織の一部がウイルスに感染していないという事実を反映している可能性があります。
図2。
SRFは慢性的な社会的敗北ストレスによるΔFosB誘導を仲介します。 A、Srffl / flマウスのNAcにAAV-Cre-GFPを注入すると、Cre発現ニューロンでSRFタンパク質がノックアウトされます。 AAV-GFPの注入は識別可能な効果がありませんでした。 B、NAcからのSRFのそのような選択的ノックアウトは、慢性的な社会的敗北ストレス後のNAcにおけるΔFosBの誘導を完全にブロックします（n = 4 /グループ）。 表示されるデータは、平均±SEM（エラーバーとして表される）として表されます。 * p <0.05対AAV-GFPコントロール; ** p <0.01対AAV-GFP敗北。
次に、AAV-Cre-GFPまたはAAV-GFPのいずれかをNAc内に注射した敗北したSrffl / flマウスのNAcにおけるΔFosBの定量的免疫組織化学を実施しました。 慢性的な社会的敗北ストレスに続いて、ΔFosB発現はAAV-GFPを注射した動物のNAcで有意に誘導された（ウイルス×治療相互作用、F（1,12）= 6.4;ボンフェローニ補正によるt検定、対照対敗北、p <0.05; AAV-Cre対AAV-GFP、p <0.01）。 しかし、この誘導はAAV-Cre-GFPを投与されたSrffl / flマウスでは観察されず（図2B）、慢性ストレスによるNAcでのΔFosB誘導にはSRFが必要であることを示しています。
NAcにおけるSRFノックアウトは、鬱病様および前不安様表現型を促進する
慢性的な社会的敗北ストレスによるΔFosB誘導は回復力を媒介することが以前に示されているので（Vialou et al。、2010）、感受性動物におけるSRFのダウンレギュレーション、および結果として生じるΔFosB誘導の喪失は最終的にレンダリングする負の適応を表す可能性があると仮定しました動物はストレスの有害な影響に対してより脆弱です。 この仮説をテストするために、上記のように成体Srffl / flマウスでSrf遺伝子の局所NAc特異的欠失を誘発し、得られたマウスとその対照を一連の行動パラダイムでテストして、ベースラインのうつ病と不安神経症を評価しました。行動のように。 SRFの局所NAc欠失は、強制水泳試験で測定されたうつ病のような効果（t（30）= 2.5; p <0.05）と、オープンフィールドで測定された不安惹起効果（t（38））を促進しました。 = 1.9; p <0.05）および明/暗テスト（t（8）= 1.9; p <0.05）。 したがって、NAcにAAV-Cre-GFPを投与されたSrffl / flマウスは、強制水泳試験での不動までの潜時の減少、オープンフィールドの中心での時間の短縮、および明暗ボックスの明室での時間の短縮を示しました。 AAV-GFPを注射した動物と比較した（図3A–C）。 しかし、SRFのNAc内欠失は運動のベースラインレベルを変化させなかった。これは、SRFノックアウト動物で観察された行動効果が一般的な自発運動の異常によるものではないことを示唆している（図3D）。 これらのデータは、NAcのΔFosBがうつ病のような行動を調節するものの、不安関連の反応には関与していないように見えることを示唆する以前の報告に照らして興味深いものです（Vialou et al。、2010）。 SRFの喪失が不安惹起反応を誘発するという我々の現在の発見は、それがΔFosB以外の標的を介して誘発することを示唆している。
図3。
NAcからのSRFノックアウトは、うつ病および不安症のような表現型を促進します。 A–C、Srffl / flマウスのNAcへのAAV-Cre-GFP注射によって達成される、NAcからのSRFの選択的ノックアウトは、強制水泳試験での不動までの潜時を短縮します（n = 14–18 /グループ。 A）オープンフィールド（B）およびライト/ダーク（C）テストで、それぞれ中央で費やされる時間とライトコンパートメントで費やされる時間を削減します（n = 5〜15 /グループ）。 D、AAV-GFPまたはAAV-Cre-GFPのNAc内注射を受けたマウスのオープンフィールドでは、基礎自発運動の違いは観察されませんでした。 E、F、学習性無力感（n = 7–8 /グループ; E）および社会的敗北ストレス（n = 5–6 /グループ; F）に対する感受性の増加、それぞれ、逃避までの潜時および社会的相互作用時間によって測定。 表示されるデータは、平均±SEM（エラーバーとして表される）として表されます。 * p <0.05対GFP、または対ターゲット不在。 ** p <0.01対GFP; *** p <0.001対GFP。
次に、NAcのSRF欠失が、繰り返されるストレスの有害な影響に対する動物の脆弱性も増加させるかどうかを研究しました。 AAV-Cre-GFPまたはAAV-GFPのいずれかをNAcに注射したSrffl / flマウスを、14,180つのうつ病モデルで調べ、無力感と慢性的な社会的敗北ストレスを学びました。 学習性無力感では、AAV-Cre-GFPを投与されたSrffl / fl動物は、避けられない足のショックストレスに以前にさらされた後、足のショックから逃れるための待ち時間の増加を示しました（治療×試行の相互作用、F（10.2）= 0.001;ボンフェローニ補正によるt検定、 p <0.01; AAV-Cre vs AAV-GFP、p <3）、ストレス誘発性の行動障害に対する感受性の増加を示しています（図10E）。 同様に、NAcからの局所SRF欠失も、慢性的な社会的敗北ストレス（図1.8F）、うつ病のような効果に続いて、AAV-GFPを注射した対照動物と比較して社会的嫌悪を増加させた（t（0.05）= 3; p <XNUMX）。
ΔFosB誘導におけるSRFの関与の欠如およびコカインに対する行動反応
ΔFosBがコカインなどの乱用薬物に反応してNAcにも誘導されることを考えると、コカイン作用におけるSRFの潜在的な役割を調べることは興味深いことでした。 慢性的な社会的敗北ストレスとは異なり、コカインの反復曝露はNAcのSRFタンパク質発現を変化させず（t（14）= 0.8; p> 0.05）（図4A）、この脳領域のfosB遺伝子プロモーターへのSRF結合に影響を与えませんでした（t（4）= 0.7; p> 0.05）（図4B）。 これは、ストレスとは反対に、慢性コカイン後のΔFosBの誘導がSRFを介して媒介されないことを示唆しています。 NAcにAAV-Cre-GFPとAAV-GFPを投与したSrffl / fl動物で、慢性コカイン後のΔFosB蓄積が変化するかどうかを調べることにより、これを直接テストしました。 SRFの削除は、この脳領域でのコカイン誘発性のΔFosB蓄積に影響を及ぼさないことがわかりました（図4C）。
図4。
SRFの喪失は、ΔFosBのコカイン誘導またはコカイン調節行動に影響を及ぼさなかった。 A、B、反復コカイン暴露（7 d、20 mg / kgコカイン-HCl）は、NAc（A）におけるSRFタンパク質発現またはこの脳領域におけるfosB遺伝子プロモーターへのSRF結合に影響を及ぼさなかった（B）24 h後薬物曝露（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ ／群）。 C、慢性コカイン曝露後の免疫細胞化学的に測定されたΔFosB蓄積は、SRFのNAc特異的ノックアウトによる影響を受けない。 Ｄ、Ｅ、ＮＡｃからのＳＲＦの局所的欠失もまた、コカイン誘発性の自発運動活性および感作に対する生理食塩水注射後の自発運動活性（ｄ ＸＮＵＭＸ）に影響を及ぼさなかった（ｎ ＝ Ｘ ＮＵＭＸ ／群）（ｄ Ｘ ＮＵＭＸ －Ｘ ＮＵＭＸ； Ｄ）。コカイン条件付けされた場所の好み（n = 5 /グループ; E）。 表示されたデータは平均±ＳＥＭ（エラーバーとして表される）として表される。
この驚くべき発見をフォローアップするために、NAcからの選択的SRFノックアウトがコカインに対する行動反応を変化させるかどうかを調査しました。 SRFのコカインによるΔFosB誘導の調節の欠如と一致して、SRFのNAc特異的ノックアウトは、コカインの反復暴露後に見られる急性コカインまたは自発運動感作によって誘発される自発運動に影響を与えませんでした（治療×時間相互作用、F（4,80） = 0.3; p> 0.05）（図4D）。 同様に、SRFのNAc固有のノックアウトは、コカインで条件付けられた場所の好みに影響を与えませんでした（t（14）= 0.1; p> 0.05）（図4E）。これはコカイン報酬の間接的な測定値を提供します。
議論
この研究は、慢性的な社会的敗北ストレス後のＮＡｃにおけるΔＦｏｓＢの新規上流メディエーターとしてＳＲＦを同定し、そして鬱病および不安様行動の発達にＳＲＦを関与させる。 我々は、慢性的な社会的敗北ストレスが感受性であるが回復力のある動物ではないNAcのSRFレベルを低下させること、およびこの下方制御がこの脳領域におけるΔFosBの誘導を妨げることを直接的な証拠を提供する。すなわち、弾力性（Vialouら、2010）。 ＳＲＦ発現の同様の減少が鬱病のヒトのＮＡｃにおいて見出され、そこでΔＦｏｓＢ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現もまた減少した。。 対照的に、感受性マウスのＮＡｃでは、ＳＦＦの下方制御にもかかわらず、ΔＦｏｓＢレベルは減少しなかった。これは、ΔＦｏｓＢ発現の制御において、未知の他の転写メカニズムを意味する。 慢性ストレス後のＮＡｃにおけるΔＦｏｓＢ誘導の媒介におけるＳＲＦの原因となる役割は、この脳領域からのＳＲＦの誘導性遺伝子欠失の使用により確立された。 このＮＡｃ特異的ＳＲＦノックアウトを有するマウスの行動分析はさらに、ＳＲＦがベースラインおよびストレス誘発性の鬱病および不安様行動の両方の発達において重要な役割を果たすと示唆している。 著しく対照的に、ＳＲＦ欠失は、慢性コカイン投与に応答したΔＦｏｓＢ誘導またはコカインの行動効果に影響を及ぼさなかった。 これらの知見は、ΔＦｏｓＢ誘導の調節および異なる環境摂動に対する行動反応の調節におけるＳＲＦの新規の刺激特異的役割を支持する。
特に脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の場合、ＳＲＦ媒介転写は、カルシウム流入の増加によって主に誘発されるシナプス活性、ならびに神経栄養活性に応答することが以前に示されている（Ｂａｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ。 Xiaら、1993； Johnsonら、1996； Changら、1997； Kalitaら、2004；KnöllおよびNordheim、2006）。 これは、慢性的な社会的敗北ストレスの後にＳＲＦが感受性であるが回復力がないマウスのＮＡｃにおいて下方制御される理由についての興味深い疑問を提起する。 感受性マウスは、NAcにおいてBDNFタンパク質レベルの増加および下流BDNFシグナル伝達の増加、ならびに腹側被蓋野（VTA）ドーパミンニューロンのバースト発火の増強を示し、これはNAcを刺激するので、この差次的調節はドーパミンまたはBDNFシグナル伝達によって媒介されないと思われる。回復力のある動物は、正常レベルのBDNFシグナル伝達およびVTA発火率を示す（Krishnanら、2009）。 別の可能性は、この脳領域の変化したグルタミン酸作動性神経支配に応答してＳＲＦ発現がＮＡｃにおいて抑制されることであり、これは我々が感受性マウスと回復力のあるマウスにおいて差別的に調節されることを示す（Ｖｉａｌｏｕら、ＸＮＵＭＸ）。 これと他の可能なメカニズムを直接研究するためにさらなる作業が必要です。
ゲノムワイドおよび他の方法を用いた最近の研究は、ニューロン中の〜ＸＮＵＭＸ〜ＸＮＵＭＸ％のＳＲＦ標的遺伝子が即時型初期遺伝子であることを示唆している（Philipparら、5； Ramananら、10； Etkinら、2004；KnöllおよびNordheim、2005）。 これは、慢性ストレスによるfosb即時型初期遺伝子の短縮型産物であるΔFosBの誘導におけるSRFの重要な役割を実証する我々のデータと一致する。 興味深いことに、これらの様々な研究において同定された多数のＳＲＦ標的遺伝子はまた、ＮＡｃにおけるΔＦｏｓＢの既知の標的を表す（Ｋｕｍａｒら、ＸＮＵＭＸ； Ｒｅｎｔｈａｌら、ＸＮＵＭＸ、ＸＮＵＭＸ； Ｍａｚｅら、ＸＮＵＭＸ）。 これらの一般的に調節される遺伝子の中には、神経細胞骨格を調節することが知られているものがいくつかある（例えば、ＣｄｋＸＮＵＭＸ、Ａｒｃ、およびＡｃｔｂ）。 これは、ＳＲＦがいくつかの神経細胞型においてアクチン動態および神経運動性に影響を与えるという報告と一致している（Albertiら、2006； Ramananら、2009；Knöllら、2005）が、ΔFosBは以下のことが知られている。 NAcニューロンの樹状突起棘伸長に影響を及ぼす（Maze et al。、2008）。 そのような共通の機能的終点は、ニューロン形態および最終的には複雑な行動に影響を与えるために一連の共通の標的遺伝子に作用する、ΔＦｏｓＢのその誘導と組み合わされたＳＲＦの協調効果を反映し得る。
ＳＲＦはまた、シナプス可塑性およびニューロン活性依存性の遺伝子発現および行動の調節において重要な役割を果たすことが実証されている。 例えば、新規環境の自発的探査または電気けいれん発作によるニューロン活性化のいずれかに応答した即時型初期遺伝子のSRF依存性誘導の喪失は、Srf突然変異体の海馬における長期シナプス増強の障害と関連している（Ramanan et al。 、ＸＮＵＭＸ； Ｅｔｋｉｎら、ＸＮＵＭＸ）。 さらに、海馬におけるＳＲＦの枯渇は、長期のシナプス抑制の欠乏、新規な状況によって誘導される即時型の早期遺伝子発現、および新規環境の探索中の馴化障害を引き起こすことが示されている（Ｅｔｋｉｎら、ＸＮＵＭＸ）。 これらのデータは、新しい環境に慣れることを学ぶ前述の場合のように、または負のストレスの多い刺激に適応する場合、ストレスの伝播を防ぐために、環境の摂動に適切に適応する動物の能力におけるSRFの重要性を確立します私たちの現在の研究のように、誘発された行動障害。 したがって、感受性の高い個人の社会的敗北ストレスに応答して、またはSRFの直接ノックダウンを通じて、SRF発現の欠損を示す動物は、抑うつおよび不安のような行動の増加を示すことが観察されます。 うつ病の被験者もNAcのSRFレベルの低下を示していることを考えると、SRFは、NAcのΔFosB発現の調節を通じて、負の環境刺激に積極的に適応する個人の能力を調節する上で基本的な役割を果たしていると考えられます。
異なるメカニズム：中毒対ストレス耐性
本研究の驚くべき発見は、ＳＲＦは慢性ストレスに応答してＮＡｃ中のΔＦｏｓＢ蓄積に必要であるが、慢性コカインに応答して同じ脳領域内のΔＦｏｓＢ誘導には必要ではないということである。 同様に、SRFは薬物に対する通常の行動反応には必要ありません。 これらのデータは、ΔＦｏｓＢが多くの種類の刺激に応答してＮＡｃにおいて誘導されるという事実にもかかわらず（Ｎｅｓｔｌｅｒら、ＸＮＵＭＸ； Ｎｅｓｔｌｅｒ、ＸＮＵＭＸ）、ΔＦｏｓＢ誘導を導く明確な分子経路があるように見えることを示す。 これらの発見に対する１つの可能性のある説明は、ストレス対コカインに応答してΔＦｏｓＢ蓄積を示す部分的に異なる細胞型である。 慢性ストレスは、主にＤＸＮＵＭＸ対ＤＸＮＵＭＸドーパミン受容体を発現するＮＡｃ中型有棘ニューロンの２つの主要亜集団内でほぼ等しくΔＦｏｓＢを誘導するが、慢性コカインは、主にＤＸＮＵＭＸ ＋ニューロン内でΔＦｏｓＢを誘導する（Ｋｅｌｚら、ＸＮＵＭＸ； Ｐｅｒｒｏｔｔｉら、ＸＮＵＭＸ）。 。 従って、ＳＲＦ依存性経路がＤＸＮＵＭＸ ＋ニューロンにおけるΔＦｏｓＢ誘導に重要である可能性がある。。 しかしながら、これは慢性ストレス後のＳＲＦノックアウトマウスにおけるΔＦｏｓＢ誘導の完全な喪失を説明するものではない、なぜなら誘導は両方のニューロンサブタイプで起こるからである。 別の説明として、慢性ストレスと慢性コカインは、NAcニューロンに対する異なる作用機序のために、前述のようにおそらくグルタミン酸作動性伝達の変化を介して作用し、慢性コカインは主にD1を介して作用し、異なる細胞内シグナル伝達カスケードに影響を与える。受容体シグナル伝達（Ｎｅｓｔｌｅｒ、ＸＮＵＭＸ）。 さらに別の可能性は、慢性ストレス対慢性コカインによるΔFosB誘導が、様々なグルタミン酸作動性投射領域、例えば前頭前皮質、海馬、および扁桃体のいくつかの領域からのNAcを神経支配する異なる神経入力によって差別的に制御される異なる転写機構に依存することである。 これらおよび代替の可能性を探求するには、さらに多くの作業が必要です。
一緒に、我々の調査結果はΔFosBがストレスの多い刺激への先祖伝来反応を仲介するためにNAcで誘導されることを介して新しい転写メカニズムを識別します。 この研究はまた、うつ病および不安様行動の調節においてNAcのレベルでSRFが果たす役割についての重要な新しい洞察を提供する。。 このような行動の調節におけるSRFの転写の役割をよりよく理解することは、ストレス関連障害に対する回復力に関与する新規遺伝子標的の同定に役立ち、より効果的な抗うつ療法の将来の開発を促進する可能性があります。
この作品は、国立精神衛生研究所と薬物乱用国立研究所からの助成金とアストラゼネカとの研究提携によってサポートされていました。 Srffl / flマウスを提供してくれたDavid D. Gintyに感謝します。
対応はEric J Nestler、フィッシュバーグ神経科学科、マウントシナイ医学部、One Gustave L. Levy Place、ボックス1065、ニューヨーク、ニューヨーク10029-6574に宛ててください。 [メール保護]
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1 Renthal W、
2 クマールA、
3 シャオG、
4 ウィルキンソンM、
5 コヴィントンHE 3rd。
6 迷路私、
7 Sikder D、
8 Robison AJ、
9 LaPlant Q、
10 Dietz DM、
11 ルッソSJ、
12 Vialou V、
13 チャクラヴァルティーS、
14 コダデックTJ、
15 スタックA、
16 Kabbaj M、
17 ネスラーEJ
（2009）コカインによるクロマチン調節の全ゲノム解析はサーチュインの役割を明らかにする。 ニューロン62：335 – 348。
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1 シュレーファーTE、
2 コーエンMX、
3 フリックC、
4 コセルM、
5 仲間D、
6 Axmacher N、
7 Joe AY、
8 クレフトM、
9 レナーツD、
10 嵐V
（2008）回路に報酬を与えるための深部脳刺激は、難治性大うつ病における無快感症を軽減します。 神経精神薬理学33：368〜377。
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1 Sesack SR、
2 グレースAA
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1 富田H、
2 Vawter MP、
3 Walsh DM、
4 エヴァンスSJ、
5 Choudary PV、
6 Li J、
7 オーバーマンKM、
8 Atz ME、
9 マイヤーズRM、
10 ジョーンズEG、
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12 アキルH、
13 バンニーWEジュニア
（2004）遺伝子発現プロファイルに対する寒冷および死後因子の影響：マイクロアレイ分析または死後ヒト脳における品質管理。 バイオル精神医学55：346 – 352。
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1 Tsankova NM、
2 ベルトンO、
3 Renthal W、
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6 ネスラーEJ
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1 Vassoler FM、
2 シュミットHD、
3 ジェラルドME、
4 有名なKR、
5 Ciraulo DAさん、
6 コルネツキーC、
7 ナップCM、
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1 Vialou V、
2 Robison AJ、
3 ラプランQC、
4 コヴィントンHE 3rd。
5 Dietz DM、
6 大西YN、
7 ムゾンE、
8 ラッシュAJ 3rd。
9 ワッツEL、
10 ウォレスDL、
11 イニゲスSD
12 大西YHさん、
13 Steiner MA、
14 ウォーレンBL、
15 クリシュナンV、
16 BolañosCA、
17 RLさん、
18 ゴーズS、
19 ベルトンO、
20 タミンガ、
21 ネスラーEJ
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1 ウィルキンソンMB、
2 シャオG、
3 クマールA、
4 LaPlant Q、
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1 夏Z、
2 デュデックH、
3 Miranti CK、
4 グリーンバーグME
（ＸＮＵＭＸ）ＮＭＤＡ受容体を介したカルシウム流入は、ＭＡＰキナーゼ／ ＥＲＫ依存性機序によって即時初期遺伝子転写を誘導する。 J Neurosci 1996：16〜5425。
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