側坐核のDeltaFosBは、性的報酬の効果を強化するのに重要です。 （2010）

コメント：Delta FosBは、行動と化学の両方のすべての中毒のマーカーです。 この分子が報酬回路で増加するにつれて、習慣性の行動も増加します。 これは、神経可塑性の変化に関与する分子のXNUMXつです。 この実験は、薬物中毒の場合と同様に、性的経験とともに増加することを示しています。 実験では、彼らは遺伝子工学を使用して、そのレベルを「通常」を超えて増加させました。 これにより、性的活動の促進が強化されました。 これはポルノ中毒で起こると思います。

フルスタディ

ピッチャーＫＫ、フローマダーＫＳ、ビアロウＶ、ムゾンＥ、ネストラーＥＪ、リーマンＭＮ、クールＬＭ。

遺伝子脳行動。 2010 Oct; 9（7）：831-40 doi：10.1111 / j.1601-183X.2010.00621.x。 Epub 2010 8月16。

カナダ、オンタリオ州、ロンドンのウェスタンオンタリオ大学シューリッヒ医学部および歯学部の解剖学および細胞生物学科。

抽象

雄ラットの性行動はやりがいがあり、強化しています。 しかし、性的報酬を媒介する特定の細胞および分子メカニズム、またはその後の性行動の発現に対する報酬の強化効果についてはほとんどわかっていない。 本研究は、ΔFosB、安定に発現された短縮型のFosBが、性行動の強化、ならびに性的動機およびパフォーマンスの経験誘発促進において重要な役割を果たすという仮説を検証する。

性的経験は、側坐核（NAc）、内側前頭前野、腹側被蓋野、尾状被殻を含むいくつかの辺縁系脳領域にΔFosBの蓄積を引き起こすが内側前視核では起こらないことが示された。

次に、ΔＦｏｓＢの下流の（抑制された）標的であるｃ − Ｆｏｓの誘導を、性的経験のある未経験の動物において測定した。 性的経験のある動物では、性的にナイーブな対照と比較して、交配誘導c-Fos免疫反応性細胞の数が有意に減少した。

最後に、ウイルス媒介遺伝子導入を用いて側坐核におけるΔFosBの発現レベルとその活性を操作し、性的経験および経験によって誘発される性的パフォーマンスの促進におけるΔFosBの潜在的な役割を研究した。ΔFosBを過剰発現させた動物は、対照群と比較して、性的経験による性的パフォーマンスの促進が増強された。対照的に、ΔFosBのドミナントネガティブ結合パートナーであるΔJunDの発現は、緑色蛍光タンパク質およびΔFosB過剰発現群と比較して、性的経験によって誘発される性的パフォーマンスの促進を減弱させ、促進の長期維持を阻害した。

まとめると、これらの知見は、性行動および性的経験の性行為の促進の強化効果のためのNAcにおけるΔFosB発現の重要な役割を支持する。

はじめに

性行動は男性のげっ歯類にとって非常にやりがいがあり強化されています（Coolen等。 2004; ファウス ら。 2001） さらに、性的経験はその後の性的行動と報酬を変えます（テンク ら。 2009） 交尾を繰り返すと、性行動が促進または強化されます。これは、交尾および性的能力の促進を促す潜伏期の短縮によって証明されます（バルフォー ら。 2004; ファウス ら。 2001） ただし、性的報酬と強化の基になる細胞および分子メカニズムはよくわかっていません。 交尾を予測する性行動および条件付けされた合図は、雄ラットの中側辺縁系において即時初期遺伝子c-fosの発現を一時的に誘導することが示されている（バルフォー ら。 2004; ファウス ら。 2001） さらに、性的経験が雄性ラット中側辺縁系において長期にわたる神経可塑性を誘発することが最近実証された（Frohmader ら。 2009; 投手 ら。 2010). さらに、雄ラットでは、性的経験がΔFosBを誘発することが示されています。 側坐核（NAc）のFosファミリーメンバー（ウォレス ら。 2008） ＦｏｓＢの短縮型スプライス変異体であるΔＦｏｓＢは、そのより大きい安定性のためにＦｏｓファミリーの独特のメンバーである（カール ら。 2007; Ulery-Reynolds ら。 2008; ウレリー ら。 2006そして、乱用薬物および中毒を媒介する長期の神経可塑性に対する動機づけおよび報酬の強化において役割を果たす（ネスラー ら。 2001） ΔＦｏｓＢは、Ｊｕｎタンパク質、好ましくはＪｕｎＤとヘテロメリック転写因子複合体（活性化タンパク質－ＸＮＵＭＸ（ＡＰ － ＸＮＵＭＸ））を形成する。チェン ら。 1995; 廣井 ら。 1998). 二重トランスジェニックマウスを用いた線条体に主に限定されるΔFosBの誘導性過剰発現を通して、以前の薬物曝露がないにもかかわらず薬物中毒様行動表現型が生じる (McClung ら。 2004） この行動表現型は、コカインに対する感作された自発運動反応を含む（ケルツ ら。 1999）、コカインのための高められた好み（ケルツ ら。 1999）とモルヒネ（ザカリオウ ら。 2006）、およびコカイン自己投与の増加（）コルビー ら。 2003).

薬物報酬と同様に、ΔFosB は自然な報酬行動によって上方制御され、これらの行動の発現を媒介します。げっ歯類モデルを用いた NAc での ΔFosB の過剰発現は、自発的な車輪走行( Werme et al . 2002 )、食物に対する道具的反応( Olausson et al . 2006 )、ショ糖摂取( Wallace et al . 2008 ) を増加させ、雄( Wallace et al . 2008 ) および雌 ( Bradley et al . 2005 )の性的行動を促進します。したがって、ΔFosB は自然な報酬経験の効果を媒介することに関与している可能性があります。本研究は、性的経験の長期的な結果がその後の交尾行動および中脳辺縁系における神経活性化に及ぼす NAc での ΔFosB の役割を具体的に調査することにより、これまでの研究を拡張しています。

  • 第一に、報酬回路および性行動に関与するどの脳領域が性経験誘導性ΔFosBを発現するかが確立された。
  • 次に、性の経験によるΔFosBが、ΔFosBによって抑制される下流の標的であるc-Fosの交配による発現に及ぼす影響Renthal ら。 2008）、調べた。
  • 最後に、性行動および性的動機付けおよび成績の経験誘発促進に対するＮＡｃ中のΔＦｏｓＢ活性（遺伝子過剰発現およびドミナントネガティブ結合パートナーの発現）の操作の効果を、ウイルスベクター送達技術を用いて決定した。

方法

動物

成体雄スプラーグ・ドーリーラット（200～225グラム）は、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（カナダ、ケベック州センヌヴィル）から入手した。動物は、実験中、同性のペアでトンネルチューブ付きのプレキシガラス製ケージに収容した。コロニー室は温度調節され、12時間明暗サイクルで維持され、行動試験中を除き、餌と水は自由に摂取できるようにした。交尾セッションの刺激雌（210～220グラム）には、深麻酔（0.35gケタミン/0.052gキシラジン）下で両側卵巣摘出後、5%安息香酸エストラジオールと95%コレステロールを含む皮下インプラントを投与した。性受容性は、試験の約4時間前に0.1mLゴマ油に溶解した500µgプロゲステロンを投与することによって誘発した。すべての手順は、ウェスタンオンタリオ大学の動物実験倫理委員会によって承認され、脊椎動物を用いた研究に関するCCACガイドラインに準拠して実施されました。

性行為

交尾セッションは、暗期開始後2～6時間後の暗期初期に、薄暗い赤色照明下で行われた。実験開始前に、動物はランダムにグループ分けされた。交尾セッション中、雄ラットは射精または1時間交尾することが許され、以下の性的行動のパラメーターが記録された：マウント潜伏期（ML；雌の導入から最初のマウントまでの時間）、挿入潜伏期（IL；雌の導入から膣への挿入を伴う最初のマウントまでの時間）、射精潜伏期（EL；最初の挿入から射精までの時間）、射精後間隔（PEI；射精から次の最初の挿入までの時間）、マウント回数（M；膣への挿入を伴わない骨盤突き出し）、挿入回数（IM；膣への挿入を伴うマウント）、および交尾効率（CE = IM/(M+IM)）（Agmo 1997）。射精を示さなかった動物については、マウント回数と挿入回数は分析に含まれなかった。交尾潜時と挿入潜時は性的な動機を示す指標であり、射精潜時、交尾回数、交尾効率は性的なパフォーマンスを反映している（Hull 2002）。

実験ＸＮＵＭＸ：ΔＦｏｓＢの発現

性的に未経験の雄ラットを清潔な試験ケージ（60 × 45 × 50 cm）で5日間連続して交尾させるか、または性的に未経験のままにした。補足表1は、実験群の行動パラダイムの概要を示している：未経験で性交なし（NNS; n=5）、未経験で性交あり（NS; n=5）、経験なしで性交あり（ENS; n=5）、経験ありで性交あり（ES; n=4）。NSおよびES動物は、交尾の最終日の射精後1時間で屠殺し、交尾によって誘発されるc-Fos発現を調べた。NNS動物は、最後の交尾セッションから24時間後にENS動物と同時に屠殺し、性経験によって誘発されるΔFosBを調べた。性経験群は、その後のテストの前に性行動についてマッチングされた。適切な交尾セッション内の行動指標については、グループ間に有意差は検出されず、性経験群の両方で性経験によって誘発される性行動の促進が示された（補足表2）。対照群には、性的に未経験のオスを用い、交尾中の動物と同時に飼育することで、メスとの直接的な接触を避けつつ、メスの匂いや鳴き声に触れる機会を確保した。

動物を屠殺するために、ペントバルビタールナトリウム（270mg/kg、腹腔内投与）で深く麻酔し、50 mLの0.9%生理食塩水で心臓内灌流した後、500 mLの0.1 Mリン酸緩衝液（PB）中の4%パラホルムアルデヒドを灌流した。脳を取り出し、同じ固定液で室温で1時間後固定した後、0.1 M PB中の20%スクロースと0.01%アジ化ナトリウムに浸し、4°Cで保存した。冠状断切片（35 µm）を凍結ミクロトーム（H400R、Micron、ドイツ）で切断し、凍結保護溶液（0.1 M PB中の30%スクロースと30%エチレングリコール）に4つの並行シリーズで収集し、-20°Cで保存した。遊離浮遊切片は、インキュベーションの間に0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS；pH 7.3～7.4）で十分に洗浄した。切片を室温で10分間1% H 2 O 2に曝露して内因性ペルオキシダーゼを破壊した後、0.1%ウシ血清アルブミン（カタログ番号005-000-121；Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、PA）および0.4% Triton X-100（カタログ番号BP151-500；Sigma-Aldrich）を含むPBS+インキュベーション溶液で1時間ブロッキングした。その後、切片をpan-FosBウサギポリクローナル抗体（1:5K；sc-48 Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）中で4℃で一晩インキュベートした。汎FosB抗体は、FosBとΔFosBに共通する内部領域に対して作製された。ΔFosB-IR細胞は、刺激後（24時間）には検出可能な刺激誘導性FosBがすべて分解されるため、特異的にΔFosB陽性であった（Perrotti et al . 2004 ; Perrotti et al . 2008）。さらに、この実験では、最終日に交尾した動物（NS、ES）は交尾後1時間、つまりFosB発現前に屠殺された。ウェスタンブロット解析により、ΔFosBが約37 kDaで検出されたことが確認された。一次抗体インキュベーション後、切片をビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG（PBS+で1:500希釈；Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム、米国）中で1時間インキュベートし、続いてアビジン-ビオチン-ワサビペルオキシダーゼ（ABC elite；PBSで1:1K希釈；Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム、米国）中で1時間インキュベートした。このインキュベーション後、切片を以下のいずれかの方法で処理した。

1 単一ペルオキシダーゼ標識

NNSおよびENS動物の切片を、性的経験によって誘発されるΔFosB蓄積の脳分析に使用した。ABCインキュベーション後、ペルオキシダーゼ複合体を、0.02% 3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB；Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）を含む発色溶液で10分間処理し、0.1 M PB中の0.02%硫酸ニッケルと過酸化水素（0.015%）で増強して可視化した。切片を0.1 M PBで十分に洗浄して反応を停止させ、コード付きSuperfrost plusガラススライド（Fisher、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）にddH 2 0中の0.3%ゼラチンでマウントした。脱水後、すべてのスライドをDPX（ジブチルフタレートキシレン）でカバーガラスした。

2 二重免疫蛍光

NAcとmPFCを含む4つの実験グループすべての切片をΔFosBとc-Fosの分析に使用した。ABCインキュベーション後、切片をビオチン化チラミド（BT；PBS + 0.003% H 2 O 2チラミドシグナル増幅キット、NEN Life Sciences、ボストン、マサチューセッツ州で1:250）で10分間、Alexa 488結合ストレプトアビジン（1:100；Jackson Immunoresearch Laboratories、ウェストグローブ、ペンシルベニア州）で30分間インキュベートした。次に、切片をc-Fosを特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（1:150; sc-52; Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA）と共に一晩インキュベートし、続いてヤギ抗ウサギCy3標識二次抗体（1:200; Jackson Immunoresearch Laboratories、West Grove、PA、USA）と共に30分間インキュベートした。染色後、切片を0.1 M PBで十分に洗浄し、ddH 2 0中の0.3%ゼラチンでコード化ガラススライドにマウントし、抗退色剤1,4-ジアザビシクロ(2,2)オクタン（DABCO; 50 mg/ml、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を含む水性封入剤（Gelvatol）でカバーガラスをかけた。免疫組織化学的コントロールには、一次抗体のいずれか一方または両方を省略し、適切な波長での標識をなくすことが含まれた。

データ解析

ΔFosBの脳解析

治療内容を知らされていない2人の実験者が、コード化されたスライド上で脳全体のスキャンを実施した。脳全体にわたるΔFosB免疫反応性（-IR）細胞は、表1に概説されているように、ΔFosB陽性細胞の数を表すスケールを使用して半定量的に分析された。さらに、半定量的な結果に基づいて、Leica DMRD顕微鏡（Leica Microsystems GmbH、ドイツ、ヴェッツラー）に取り付けられたカメラルシダ描画チューブを使用して、報酬と性的行動に関係する脳領域の標準的な分析領域を使用してΔFosB-IR細胞の数がカウントされた：NAc（コア（C）とシェル（S）；400×600µm）は、3つの吻側尾側レベルで分析された（Balfour et al . 2004）。腹側被蓋野（VTA；1000×800µm）を吻側尾側レベル3箇所（Balfour et al . 2004）およびVTA尾部（Perrotti et al . 2005）で解析した。前頭前皮質（前帯状皮質（ACA）、前辺縁皮質（PL）、下辺縁皮質（IL）；各600×800µm）、尾状核被殻（CP；800×800µm）、内側視索前核（MPN；400×600µm）（補足図1～3）。各サブ領域につき2つの切片をカウントし、動物ごとに平均してグループ平均を算出した。ΔFosB-IR細胞の性的未経験群と経験群の平均値を、各サブ領域について対応のないt検定を用いて比較した。

テーブル1     

性的経験のない動物および経験豊富な動物におけるΔFosB発現の要約
ΔFosBとc-Fosの解析

画像は、Leica 顕微鏡 (DM5000B、Leica Microsystems、ドイツ、ヴェッツラー) に取り付けられた冷却 CCD カメラ (Microfire、Optronics) と Neurolucida ソフトウェア (MicroBrightfield Inc) を使用して、すべての被験者に対して固定カメラ設定 (10 倍対物レンズを使用) で取得されました。NAc コアとシェル (それぞれ 400×600µm、補足図 1 ) および mPFC の ACA (600×800µm、補足図 3 ) の標準分析領域で c-Fos-IR または ΔFosB-IR を発現する細胞数は、実験グループを知らされていない観察者によって、Neurolucida ソフトウェア (MBF Bioscience、米国バーモント州ウィリストン) を使用して動物ごとに 2 セクションごとに手動でカウントされ、動物ごとに平均されました。 c-Fos細胞またはΔFosB細胞のグループ平均は、二元配置分散分析（要因：性的経験と性的活動）と、事後比較のためのFisher LSD法を用いて、有意水準0.05で比較した。

実験ＸＮＵＭＸ：ΔＦｏｓＢ発現操作

ウイルスベクター媒介遺伝子導入

性的に未経験の雄のスプラーグ・ドーリーラットを、定位脳手術の前にランダムにグループ分けした。すべての動物に、GFP（コントロール；n=12）、野生型ΔFosB（n=11）、またはΔFosBのドミナントネガティブ結合パートナーであるΔJunD（n=9）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターをNAcに両側性に微量注入した。ΔJunDは、遺伝子プロモーター内のAP-1領域に結合する前にΔFosBと競合的にヘテロ二量体を形成することにより、ΔFosBを介した転写を減少させる（Winstanley et al . 2007）。ウイルス力価はqPCRによって決定され、研究開始前にin vivoで評価された。力価は1～2× 10¹¹感染粒子/mLであった。 rAAVベクターは、ハミルトンシリンジ（5µL、Harvard Apparatus、Holliston、MA、USA）を用いて、7分間かけて1.5µL/側で注入した（座標：ブレグマからAP +1.5、ML +/−1.2、頭蓋表面からDV −7.6、PaxinosおよびWatson、1998による）。ベクターは、コントロール注入単独よりも毒性を示さない（Winstanleyら、2007；AAV調製の詳細については、Hommelら、2003を参照）。行動実験は、最適かつ安定したウイルス感染を可能にするため、ベクター注入後3週間後に開始した（Wallaceら、2008）。マウス種におけるトランスジーンの発現は10日後にピークに達し、少なくとも6か月間は高い状態が維持される（Winstanleyら、2007）。実験の最後に、動物を心臓経由で灌流し、NAc 切片を GFP (1:20K; ウサギ抗 GFP 抗体; Molecular Probes) で免疫処理し、ABC-ペルオキシダーゼ-DAB 反応 (上記のとおり) を使用して、GFP をマーカーとして注射部位を組織学的に確認した (補足図 4 )。ΔFosB および ΔJunD ベクターには、内部リボソーム進入部位で隔てられた GFP を発現するセグメントも含まれており、すべての動物で GFP の可視化により注射部位を確認できる。注射部位とウイルスの拡散が NAc に限定されている動物のみを統計解析に含めた。ウイルスの拡散は一般的に NAc の一部に限定され、核全体に吻側尾側方向には拡散しなかった。さらに、ウイルスの拡散は主にシェルまたはコアのいずれかに限定されているように見えた。しかし、NAc 内の注射部位と拡散の変動は行動への影響に影響を与えなかった。最後に、GFP注射は、以前の研究の手術を受けていない動物と比較して、性的行動や経験によって誘発される性的行動の促進に影響を与えなかった（Balfour et al . 2004）。

性行為

ウイルスベクター送達の3週間後、動物は1回の射精（または1時間）で連続した4連続性交配セッションで性的経験を獲得し（経験セッション）、続いて経験の長期発現による性行動の促進について試験された1そして最後の体験セッションの2週間後（テストセッション1と2）。 性行動パラメータは、上記のようにすべての交配セッション中に記録された。 各交配セッション中のすべてのパラメータの統計的差異は、二元配置反復測定ANOVA（要因：治療および交配セッション）または一元配置分散分析（射精潜伏期、マウント数および侵入数；係数：治療または交配）を用いてグループ内およびグループ間で比較した。 0.05の有意水準での事後比較のためのFisher LSDまたはNewman-Keuls検定。 具体的には、交尾パラメータに対する性的経験の促進効果を、経験セッション1（ナイーブ）と経験セッション2、3、または4それぞれの間、および各経験セッション内の実験群間で比較した。 さらに、性行動の長期的促進に対する治療（ベクター）の効果を分析するために、各治療群内の経験セッション4と試験セッション1および2との間で交配パラメータを比較し、各試験セッション内の実験群間で比較した。

結果

性的経験はΔFosB蓄積を引き起こす

まず、性経験のある雄と性経験のない対照群における脳全体のΔFosB蓄積の半定量的調査を実施した。全体的な結果の概要を表1に示す。ΔFosB-IR分析は、標準的な分析領域を使用して、いくつかの辺縁系関連脳領域におけるΔFosB-IR細胞数を決定することによってさらに進められた。図1は、性経験のない動物と性経験のある動物のNAcをDAB-Niで染色した代表的な画像を示している。mPFCサブ領域（図2A）、NAcコアとシェル（2B）、尾状核被殻（2B）、およびVTA（2C）において、有意なΔFosBアップレギュレーションが認められた。NAcでは、NAcコアとシェルのすべての吻側尾側レベルで有意差が存在し、図2に示すデータはすべての吻側尾側レベルの平均値である。対照的に、視床下部内側視索前核におけるΔFosB-IRの有意な増加は認められなかった（NNS：平均1.8±0.26、ENS：平均6.0±1.86）。

図1    

 

ナイーブ無性別（A）および無性別（B）グループのNAcにおけるΔFosB-IR細胞（黒）を示す代表的な画像。 aco：前部交連スケールバーは100 µmを示します。
図2      

Ａ．内側前頭前野の内辺縁（ＩＬ）、前辺縁（ＰＬ）および前帯状皮質（ＡＣＡ）小領域におけるΔＦｏｓＢ − ＩＲ細胞の数； Ａ． Ｂ．核は核および殻を側坐し、尾状核被殻（ＣＰ）を有する。 C.吻側、中央、尾側、尾 ...

性的経験は交配誘発c ‐ Fosを減弱させる

ＮＡｃ中のΔＦｏｓＢレベルに対する性的経験の影響は、蛍光染色技術を用いて確認された。 さらに、c-Fosの発現に対する性的経験の影響を分析した。 図3 全ての実験群（Ａ、ＮＮＳ； Ｂ、ＮＳ； Ｃ、ＥＮＳ； Ｄ、ＥＳ）におけるΔＦｏｓＢ−（緑色）およびｃ − Ｆｏｓ（赤色）−ＩＲ細胞の代表的な画像を示す。 性的経験は、NAcコアにおけるΔFosB発現を有意に増加させた（図4A：F1,15 = 12.0; p = 0.003）とシェル（図4C：F1,15 = 9.3; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 対照的に、灌流の1時間前の0.008の交配は、ΔFosB発現に影響を及ぼさなかった（図4A、C性的経験と灌流直前の交尾との間の相互作用は検出されなかった。 両方のNAcコアにおいてc-Fos発現に対する灌流前の交配の全体的な効果があった（図4B：F1,15 = 27.4; p <0.001）およびシェル（図4D：F1,15 = 39.4; p <0.001）。 さらに、性的経験の全体的な影響がNAcコアで検出されました（図4B：F1,15 = 6.1; p = 0.026）とシェル（図4D：F1,15 = 1.7; p = 0.211）および性的経験と灌流前の交配との間の相互作用がNAcコアで検出された（F1,15 = 6.5; p = 0.022）、シェル内の傾向（F）1,15 = 1.7; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； F1,15 = 3.4; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 事後分析は、性的にナイーブな男性のコアおよびシェルにおける交配誘導c-Fos発現を実証した（図4B、D） しかし、性的経験を積んだ男性では、c-FosはNAcコアで有意に増加しませんでした（図4B）およびシェルで大幅に減衰図4D） このように、性的経験は交配誘発c-Fos発現の減少を引き起こしました。 特定のペアワイズ比較のP値は図の説明文にあります。

図3      

各実験群についてＮＡｃ中のΔＦｏｓＢ（緑色）およびｃ − Ｆｏｓ（赤色）を示す代表的な画像。 スケールバーは100 µmを示します。
図4      

性体験によるΔFosBと交配によるc-Fos 各群に対するΔＦｏｓＢ（コア、Ａ；シェル、Ｃ； ＡＣＡ、Ｅ）またはｃ − Ｆｏｓ（コア、Ｂ；シェル、Ｄ； ＡＣＡ、Ｆ）免疫反応性細胞の数：ＮＮＳ（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）、ＮＳ（ｎ ＝）。 5）、ENS（n = 5）、またはES（n = 5）。 データが表現されている ...

性経験が交尾誘発性c-Fosレベルに及ぼす影響は、NAcに限られなかった。性経験のある動物では、性経験のない対照群と比較して、ACAでも同様のc-Fos発現の減弱が観察された。性経験は、ACAにおけるΔFosB発現に有意な影響を与えた（図4E：F 1,15 = 154.2、p < 0.001）。灌流前の交尾はΔFosB発現に影響を与えなかったが（図4C）、ACAにおけるc-Fosを有意に増加させた（図4F：F 1,15 = 203.4、p < 0.001）。さらに、ACAにおける交尾誘発性c-Fos発現は、性経験によって有意に減少した（図4F：F 1,15 = 15.8、p = 0.001）。灌流前の性的経験と交尾の間には、c-Fos発現に関して双方向の相互作用が検出された（図4F：F 1,15 = 15.1、p < 0.001）。特定のペアワイズ比較のp値は図の凡例に記載されている。最後に、交尾経験がΔFosB発現の有意な増加を引き起こさなかった領域である内側視索前核では、交尾誘導性c-Fos発現の有意な減少は見られなかった（NS：平均63.5 ± 4.0、ES：平均41.4 ± 10.09）。これは、交尾誘導性c-Fos発現がすべての脳領域で影響を受けたわけではないことを示している。

NAc中のΔFosBは性行動の強化を仲介する

経験による性行動の促進によって実証されるような性行動の強化のための潜在的な分子メカニズムを探求するために、ΔＦｏｓＢレベルの局所的操作およびその転写活性の効果を決定した。 4回の連続した体験セッション中の性的体験は、マウントの潜時に大きな影響を与えました（図5A：F1,23 = 13.8; p = 0.001）、挿入待ち時間（図5B：F1,23 = 18.1; p <0.001）、および射精潜時（図5C：GFP、F11,45 = 3.8; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 ＧＦＰ対照動物は、経験セッションＸＮＵＭＸと比較して、経験セッションＸＮＵＭＸ中に、予想される経験に誘発された性行動の促進を示し、最初の装着、最初の挿入および射精までの有意に低い潜伏期を示した。図5A – C; p値については図の凡例を参照してください。 性行動のこの経験による促進は、マウント潜伏および潜入潜時についてのΔFosB群においても観察されたが、射精潜時において有意な差は検出されなかった（図5A – C） 対照的に、ΔJunD動物は気絶した促進を示した。 マウント、侵入、および射精の潜時が交配セッションの繰り返しで減少したとしても、経験セッション1と4の間で比較したとき、これらのパラメーターのどれも統計的に有意に達しませんでした（図5A – C） 各体験セッションのグループ間比較では、ΔFunBおよびGFPと比較して、体験セッション中のΔJunDのマウント、イントロミット、射精までの待ち時間が大幅に長くなったことが示されています（図5A – C） さらに、性的経験と治療の両方が交尾効率に大きな影響を及ぼしました（図5F：性的経験、F1,12 = 22.5; p <0.001; 治療、F1,12 = 3.3; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 経験的セッション0.049と比較して、経験的セッション4の間にΔFosB男性は交尾効率が向上した（図5F） さらに、ΔＦｏｓＢ動物は、経験セッションＸＮＵＭＸと比較して、経験セッションＸＮＵＭＸの間の射精前の量が有意に少なかった（図5D：F10,43 = 4.1; p = 0.004）、そしてΔJunDの男性は射精に先立って有意により多くの量を持っていたので、他の2つのグループのどちらよりも著しく交尾効率が下がりました（図5DとF） したがって、GFPおよびΔFosB動物は、性行動および性行為の開始の経験誘発促進を示したが、ΔJunD動物は示さなかった。

図5      

ＧＦＰ（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）、ΔＦｏｓＢ（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）およびΔＪｕｎＤ（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）動物の性行動：マウント潜伏期（Ａ）、挿入潜伏期（Ｂ）、射精潜伏期（Ｃ）、マウント数（Ｄ）、挿入数（E）および交尾効率（F）。 データが表現されている ...

ΔFosBの発現が経験誘発性性行動促進の長期発現に重要であるという仮説を検証するため、動物は最終経験セッションの1週間後（テストセッション1）と2週間後（テストセッション2）にテストされた。実際、GFP群とΔFosB群の両方で促進された性行動が維持されており、GFP群とΔFosB群内では、テストセッション1または2と最終経験セッション4の間で行動パラメーターに差はなかった（図5A～C；ΔFosB動物のテストセッション1における射精潜時と交尾効率を除く）。ΔJunD動物とGFP群またはΔFosB群との間には、両方のテストセッションで全ての性行動パラメーターにおいて有意差が検出された（図5A～F）。挿入回数、PEI、または射精した動物の割合（最後の4回の交尾セッションで全てのグループのオスの100%が射精した）を比較した場合、グループ間またはグループ内で差は検出されなかった。

考察

本研究では、性的経験が側坐核（NAc）のコアとシェル、内側前頭前皮質（mPFC）、腹側被蓋野（VTA）、尾状核・被殻を含む複数の辺縁系関連脳領域においてΔFosBの蓄積を引き起こすことを明らかにした。さらに、性的経験はNAcおよび前帯状皮質（ACA）における交尾誘導性のc-Fos発現を減弱させた。最後に、NAcにおけるΔFosBは、性的経験獲得時の交尾促進と、経験誘導性の性行動促進の長期発現を媒介する上で重要であることが示された。具体的には、ΔFosBを介した転写の減少は、経験誘導性の性的動機づけと性行動促進を減弱させた一方、NAcにおけるΔFosBの過剰発現は、より少ない経験で性行動が増加するという点で、性行動促進を増強させた。これらの知見は、ΔFosBが性的経験によって誘導される長期的な神経および行動可塑性にとって重要な分子メディエーターであるという仮説を支持するものである。

今回の研究結果は、雄ラット（Wallace et al . 2008）および雌ハムスター（Hedges et al . 2009）のNAcにおける性経験誘発性ΔFosBを示す以前の研究を拡張するものである。Wallace et al.（2008）は、NAcにおけるrAAV- ΔFosBの過剰発現が、射精までの挿入回数の減少および射精後間隔の短縮によって示されるように、最初の交尾セッション中の性行動を性的に未経験の動物で強化したが、性的に経験のある雄には効果がなかったことを示した（Wallace et al . 2008）。

対照的に、今回の研究では、性的に未経験の雄では最初のテスト中にΔFosBの過剰発現による影響は見られなかったが、性経験の獲得中および獲得後に影響が見られた。ΔFosBを過剰発現させた個体は、GFP個体と比較して性行動（交尾効率）が向上した。

さらに、本研究では、ΔJunDを発現するウイルスベクターを用いてΔFosBを介した転写を阻害することにより、ΔFosBの役割を検証した。経験によって誘発されるΔFosB発現の増加を阻止すると、経験によって誘発される性的動機（交尾および挿入潜時の増加）および性的パフォーマンス（射精潜時および交尾回数の増加）の促進、ならびにその後の促進された性的行動の長期的な発現が抑制された。

したがって、これらのデータは、経験によって誘発される性行動の促進の獲得においてΔFosBが必須の役割を果たすことを初めて示唆するものである。さらに、これらのデータは、ΔFosBが経験によって誘発される促進行動の長期的発現にも重要な役割を担っていることを示している。我々は、この促進行動の長期的発現が自然報酬の記憶の一形態を表しており、したがってNAcのΔFosBは報酬記憶のメディエーターであると提唱する。性経験は、報酬と記憶に関与する領域であるVTAとmPFCにおけるΔFosBレベルも増加させた（Balfour et al . 2004 ; Phillips et al . 2008）。これらの領域におけるΔFosBのアップレギュレーションが報酬記憶に及ぼす潜在的な意義を解明するには、今後の研究が必要である。

ΔＦｏｓＢ発現は非常に安定しているので、慢性的摂動後の脳の持続的適応の分子メディエーターとして大きな可能性を秘めている。ネスラー ら。 2001). ΔＦｏｓＢは、複数回のコカイン注射にわたってＮＡｃが徐々に増加し、数週間まで持続することが示されている。 (希望 ら。 1992; 希望 ら。 1994). NAcΔFosB発現におけるこれらの変化は薬物報酬感作および依存症と関連している (Chao＆Nestler 2004; McClung＆Nestler 2003; McClung ら。 2004; ネスラー2004, 2005, 2008; ネスラー ら。 2001; ザカリオウ ら。 2006） 対照的に、自然の報酬を仲介することにおけるΔFosBの役割は、研究されていない。 最近の証拠は、NAcにおけるΔFosB誘導が自然の報酬に関与していることを示唆して浮上している。 ΔＦｏｓＢレベルは、スクロース摂取およびホイールランニング後にＮＡｃにおいて同様に増加する。。 ビットトランスジェニックマウスまたはラットのウイルスベクターを用いた線条体におけるΔFosBの過剰発現は、スクロース摂取量の増加を引き起こす。 食物へのモチベーションの向上と自発的なホイールランニングの向上 (オラソン ら。 2006; ウォレス ら。 2008; ウェルメ ら。 2002） 現在のデータは実質的にこれらの報告に追加され、そしてΔFosBが報酬強化および自然な報酬記憶のための重要な仲介者であるという考えをさらに支持する。

ΔFosBは、中脳辺縁系における可塑性の誘導を介して、経験によって誘発される性行動の強化を媒介する可能性がある。実際、性経験は中脳辺縁系に多くの長期的な変化を引き起こす（Bradley & Meisel 2001 ; Frohmader et al . 2009 ; Pitchers et al . 2010）。行動レベルでは、性経験のある雄ラットにおいて、アンフェタミンに対する運動反応の感作とアンフェタミン報酬の増強が示されている（Pitchers et al . 2010）。雌ハムスターにおいても、アンフェタミンに対する運動反応の変化が観察されている（Bradley & Meisel 2001）。さらに、雄ラットでは性体験の禁欲期間後に樹状突起棘の数と樹状突起樹枝の複雑さが増加することがわかっています（Pitchers et al . 2010）。本研究は、ΔFosBが性体験の長期的な結果の特異的な分子メディエーターである可能性を示唆しています。これと一致して、ΔFosBは慢性的なコカイン投与に対する反応として樹状突起棘の変化を誘導するのに重要であることが最近示されています（Dietz et al . 2009 ; Maze et al . 2010）。

NAc で ΔFosB を誘導する上流の神経伝達物質がどれであるかは明らかではないが、DA が候補として提案されている ( Nye et al . 1995 )。コカイン、アンフェタミン、オピオイド、カンナビノイド、エタノールなどのほぼすべての乱用薬物、および自然報酬は、NAc で ΔFosB を増加させる( Perrotti et al . 2005 ; Wallace et al . 2008 ; Werme et al . 2002 )。乱用薬物と自然報酬の両方が、NAc のシナプス DA 濃度を増加させる( Damsma et al . 1992 ; Hernandez & Hoebel 1988a , b ; Jenkins & Becker 2003 )。薬物乱用によるΔFosB誘導はDA受容体含有細胞で確認されており、コカイン誘発性ΔFosBはD1 DA受容体拮抗薬によって阻害される（Nyeら、1995）。したがって、DA放出はΔFosB発現を刺激し、それによって報酬関連の神経可塑性を媒介すると仮説が立てられている。ΔFosBレベルがDA依存性であるという考えをさらに裏付けるのは、性体験によってΔFosBレベルが変化した脳領域が、内側前頭前皮質や基底外側扁桃体を含むVTAからの強いドーパミン作動性入力を受けているという発見である。

しかし対照的に、ΔFosBは内側視索前野では増加しない。この領域は視床下部由来ではあるものの、ドーパミン作動性入力を受けているにもかかわらずである（Miller & Lonstein 2009）。交尾によって誘発されるΔFosBの発現と、性的経験が性的動機とパフォーマンスに及ぼす影響がDAの作用に依存するかどうかを検証するには、今後の研究が必要である。雄ラットの性的報酬におけるDAの役割は、現在完全には明らかになっていない（Agmo & Berenfeld 1990 ; Pfaus 2009 ）。雌に曝露されたり交尾したりすると、NAcでDAが放出されること（ Damsma et al . 1992）、また、性的行動中にDAニューロンが活性化されること（Balfour et al . 2004 ）を示す十分な証拠がある。しかし、DA受容体拮抗薬の全身投与は性的報酬によって誘発される条件付け場所選好を阻止しない（Agmo & Berenfeld 1990）ため、DAが交尾の経験誘発強化に重要であるという仮説は検証されていない。

性行動に対するΔFosBの影響の下流のメディエータが何であるかについても不明である。 ΔＦｏｓＢは、ＡＰ − ＸＮＵＭＸ依存性メカニズムを介して転写アクチベーターおよびリプレッサーの両方として作用することが示されている。McClung＆Nestler 2003; ピークマン ら。 2003） 即時初期遺伝子c-fosを含む多数の標的遺伝子が同定されている（希望 ら。 1992; 希望 ら。 1994; モーガン＆カラン1989; Renthal ら。 2008; チャン ら。 2006), cdk5（ビブ ら。 2001), ダイノルフィン (ザカリオウ ら。 2006)、サーチュイン-1 (Renthal ら。 2009), NFκBサブユニット (アン ら。 2001）AMPAグルタミン酸受容体GluR2サブユニット (ケルツ ら。 1999） 現在の結果は、交配誘発性ｃ − Ｆｏｓレベルが、ΔＦｏｓＢ（ＮＡｃおよびＡＣＡ）の増加と共に脳領域における性的経験によって減少したことを実証している。 ｃ − Ｆｏｓの抑制は、前回の研究と同様に、最後の交配および繰り返しの交配セッション以降の期間に依存しているようであり、ｃ − Ｆｏｓのそのような減少は、最後の交配セッションの翌週のＸＮＵＭＸ試験の雄ラットでは検出されなかったバルフォー ら。 20041回の交配セッションのみからなる性的経験の後）Lopez＆Ettenberg 2002） さらに、現在の知見は、ΔFosBが慢性的なアンフェタミン曝露後にc-fos遺伝子を抑制するという証拠と一致している（Renthal ら。 2008） これらの所見と一致して、いくつかの即時型初期遺伝子ｍＲＮＡ（ｃ − ｆｏｓ、ｆｏｓＢ、ｃ − ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、およびｚｉｆＸＮＵＭＸ）の誘導は、急性薬物注射と比較してコカイン注射を繰り返した後に減少した（希望 ら。 1992; 希望 ら。 1994慢性アンフェタミン投与中止後のアンフェタミン誘発性c-fos抑制ジャーバー ら。 1995; Renthal ら。 2008） 慢性的な薬物治療または性的経験の後のc-Fos発現の下方制御の機能的関連性は依然として不明であり、反復報酬曝露に対する動物の感受性を調節するための重要な恒常性メカニズムであることが示唆されている（Renthal ら。 2008).

結論として、本研究は、側坐核におけるΔFosBが性的報酬記憶において不可欠な役割を果たしていることを示しており、ΔFosBが一般的な報酬強化と記憶にとって重要である可能性を裏付けている。本研究の知見は、性的報酬と動機付けを媒介する細胞および分子メカニズムに関する我々の理解をさらに深め、ΔFosBが自然な報酬強化において重要な役割を担っていることを示すことで、ΔFosBが依存症の発症において重要な役割を果たしていることを示す文献群に新たな知見を加えるものである。

補足資料

図S1-S4と表S1-S2を補足

謝辞

この研究は、カナダ衛生研究所のLMCへの寄付、国立精神衛生研究所のEJNへの寄付、およびカナダの自然科学および工学研究評議会からKKPおよびLMCへの寄付によって支えられています。

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