側坐核のDeltaFosBは、性的報酬の効果を強化するのに重要です。 （2010）

コメント：Delta FosBは、行動と化学の両方のすべての中毒のマーカーです。 この分子が報酬回路で増加するにつれて、習慣性の行動も増加します。 これは、神経可塑性の変化に関与する分子のXNUMXつです。 この実験は、薬物中毒の場合と同様に、性的経験とともに増加することを示しています。 実験では、彼らは遺伝子工学を使用して、そのレベルを「通常」を超えて増加させました。 これにより、性的活動の促進が強化されました。 これはポルノ中毒で起こると思います。

フルスタディ

ピッチャーＫＫ、フローマダーＫＳ、ビアロウＶ、ムゾンＥ、ネストラーＥＪ、リーマンＭＮ、クールＬＭ。

遺伝子脳行動。 2010 Oct; 9（7）：831-40 doi：10.1111 / j.1601-183X.2010.00621.x。 Epub 2010 8月16。

カナダ、オンタリオ州、ロンドンのウェスタンオンタリオ大学シューリッヒ医学部および歯学部の解剖学および細胞生物学科。

抽象

雄ラットの性行動はやりがいがあり、強化しています。 しかし、性的報酬を媒介する特定の細胞および分子メカニズム、またはその後の性行動の発現に対する報酬の強化効果についてはほとんどわかっていない。 本研究は、ΔFosB、安定に発現された短縮型のFosBが、性行動の強化、ならびに性的動機およびパフォーマンスの経験誘発促進において重要な役割を果たすという仮説を検証する。

性的経験は、側坐核（NAc）、内側前頭前野、腹側被蓋野、尾状被殻を含むいくつかの辺縁系脳領域にΔFosBの蓄積を引き起こすが内側前視核では起こらないことが示された。

次に、ΔＦｏｓＢの下流の（抑制された）標的であるｃ − Ｆｏｓの誘導を、性的経験のある未経験の動物において測定した。 性的経験のある動物では、性的にナイーブな対照と比較して、交配誘導c-Fos免疫反応性細胞の数が有意に減少した。

最後に、ΔＦｏｓＢレベルおよびＮＡｃ中のその活性を、ウイルス媒介遺伝子導入を用いて操作して、性的経験および性的能力の経験誘発性促進を媒介することにおけるその潜在的役割を研究した。 ΔＦｏｓＢ過剰発現を有する動物は、対照と比較して性的経験を伴う性的能力の促進の促進を示した。 対照的に、ΔＦｏｓＢの優性ネガティブ結合パートナーであるΔＪｕｎＤの発現は、緑色蛍光タンパク質およびΔＦｏｓＢ過剰発現群と比較して、性的経験の性的経験誘発促進を促進し、促進の長期的維持を妨げた。

まとめると、これらの知見は、性行動および性的経験の性行為の促進の強化効果のためのNAcにおけるΔFosB発現の重要な役割を支持する。

はじめに

性行動は男性のげっ歯類にとって非常にやりがいがあり強化されています（Coolen等。 2004; ファウス ら。 2001） さらに、性的経験はその後の性的行動と報酬を変えます（テンク ら。 2009） 交尾を繰り返すと、性行動が促進または強化されます。これは、交尾および性的能力の促進を促す潜伏期の短縮によって証明されます（バルフォー ら。 2004; ファウス ら。 2001） ただし、性的報酬と強化の基になる細胞および分子メカニズムはよくわかっていません。 交尾を予測する性行動および条件付けされた合図は、雄ラットの中側辺縁系において即時初期遺伝子c-fosの発現を一時的に誘導することが示されている（バルフォー ら。 2004; ファウス ら。 2001） さらに、性的経験が雄性ラット中側辺縁系において長期にわたる神経可塑性を誘発することが最近実証された（Frohmader ら。 2009; 投手 ら。 2010). さらに、雄ラットでは、性的経験がΔFosBを誘発することが示されています。 側坐核（NAc）のFosファミリーメンバー（ウォレス ら。 2008） ＦｏｓＢの短縮型スプライス変異体であるΔＦｏｓＢは、そのより大きい安定性のためにＦｏｓファミリーの独特のメンバーである（カール ら。 2007; Ulery-Reynolds ら。 2008; ウレリー ら。 2006そして、乱用薬物および中毒を媒介する長期の神経可塑性に対する動機づけおよび報酬の強化において役割を果たす（ネスラー ら。 2001） ΔＦｏｓＢは、Ｊｕｎタンパク質、好ましくはＪｕｎＤとヘテロメリック転写因子複合体（活性化タンパク質－ＸＮＵＭＸ（ＡＰ － ＸＮＵＭＸ））を形成する。チェン ら。 1995; 廣井 ら。 1998). 二重トランスジェニックマウスを用いた線条体に主に限定されるΔFosBの誘導性過剰発現を通して、以前の薬物曝露がないにもかかわらず薬物中毒様行動表現型が生じる (McClung ら。 2004） この行動表現型は、コカインに対する感作された自発運動反応を含む（ケルツ ら。 1999）、コカインのための高められた好み（ケルツ ら。 1999）とモルヒネ（ザカリオウ ら。 2006）、およびコカイン自己投与の増加（）コルビー ら。 2003).

薬物報酬と同様に、ΔＦｏｓＢは自然の報酬行動によってアップレギュレートされ、そしてこれらの行動の発現を媒介する。 げっ歯類モデルを用いたＮＡｃにおけるΔＦｏｓＢの過剰発現は自発的な車輪走行を増加させる (ウェルメ ら。 2002), 食物に反応する楽器 (オラソン ら。 2006), スクロース摂取量 (ウォレス ら。 2008), そして男性を促進する (ウォレス ら。 2008）と女性（ブラッドリー ら。 2005) 性行動。 したがって、ΔFosBは自然のやりがいのある経験の影響を媒介することに関与している可能性があります。。 T彼の現在の研究は、特に後縁交配行動における交尾行動および神経活性化に対する性的経験の長期転帰におけるNAcにおけるΔFosBの役割を調査することによって、以前の研究を拡大している。.

  • 第一に、報酬回路および性行動に関与するどの脳領域が性経験誘導性ΔFosBを発現するかが確立された。
  • 次に、性の経験によるΔFosBが、ΔFosBによって抑制される下流の標的であるc-Fosの交配による発現に及ぼす影響Renthal ら。 2008）、調べた。
  • 最後に、性行動および性的動機付けおよび成績の経験誘発促進に対するＮＡｃ中のΔＦｏｓＢ活性（遺伝子過剰発現およびドミナントネガティブ結合パートナーの発現）の操作の効果を、ウイルスベクター送達技術を用いて決定した。

方法

動物

成体オスのSprague Dawleyラット（200〜225グラム）は、Charles River Laboratories（カナダ、QC、Senneville）から入手した。 実験を通して、動物を同じ性別ペアでトンネルチューブを有するプレキシガラスケージに収容した。 コロニー室を温度調節し、12 / 12 hr明暗サイクルで食物と水を利用可能に維持した。 アドリブで 行動テスト中を除く。 交尾セッションのための刺激のある女性（210 - 220グラム）は、深部麻酔下での両側卵巣摘出術後に5％エストラジオールベンゾエートと95％コレステロールを含む皮下インプラント（0.35gケタミン/ 0.052gキシラジン）を受けました。 試験の約500時間前に、0.1 mLゴマ油中の4μgプロゲステロンの投与により性的受容性を誘導した。 すべての手順は、ウェスタンオンタリオ大学の動物管理委員会によって承認され、研究に脊椎動物を含むCCACガイドラインに準拠した。

性行為

交配セッションは、暗赤色照明下の初期暗期（暗期の開始後2〜6時間）に発生した。 実験開始前に、動物を無作為に群に分けた。 交尾セッション中、雄ラットを射精または1時間まで交尾させ、性潜時（ML；雌の導入から最初の登載までの時間）、挿入潜伏期（IL；導入からの時間）を含む性行動のパラメータを記録した。最初のマウントまで膣への侵入までの女性）、射精潜伏期（EL;最初の挿入から射精までの時間）、射精後の間隔（PEI;射精から最初の次の挿入までの時間）、マウントの回数（M;膣なし突き出し）侵入数、挿入数（IM、膣挿入を含むマウント）、交尾効率（CE = IM /（M + IM））（Agmo 1997） 射精を示さなかった動物の分析にはマウント数と挿入数は含まれていなかった。 射精潜伏期、マウント数、交尾効率は性的パフォーマンスを反映しているのに対し、マウントおよび挿入の潜時は性的動機を示すパラメータです（ハル2002).

実験ＸＮＵＭＸ：ΔＦｏｓＢの発現

性的にナイーブな雄ラットを清潔な試験ケージで交配させた （60×45×50 cm）5連続、毎日の交尾セッション、または性的にナイーブなまま。 補足表1 実験群の行動パラダイムを概説する：無性セックス（NNS; n = 5）、無性セックス（NS; n = 5）、無セックス（ENS; n = 5）および経験性（ES; n = 4）。 NSおよびES動物は、交配によって誘発されたc-Fos発現を調べるために、交配の最終日に射精後1時間で屠殺した。 最後の交配セッションの24時間後に、NNS動物をENS動物と同時に屠殺して、性経験によって誘発されたΔFosBを調べた。 その後の検査の前に、性的経験のあるグループの性行動が一致した。 適切な交配セッション内の行動測定に関して、群間で有意差は検出されず、性経験の性行動誘発性促進は両経験群によって示された（補足表2） 対照には、雌と直接接触することなく、女性の匂いへの曝露および発声を確実にするために、交尾中の動物と同時に取り扱われる性的に未熟な男性が含まれた。

屠殺するために、ペントバルビタールナトリウム（ＸＮＵＭＸｍｇ ／ ｋｇ； ｉ．ｐ）を使用して動物を深く麻酔し、ＸＮＵＭＸ ｍＬのＸＮＵＭＸ％食塩水、続いてＸＮＵＭＸ ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）中のＸＮＵＭＸ ｍＬのＸＮＵＭＸ％パラホルムアルデヒドで心臓内灌流した。 脳を摘出し、そして同じ固定剤中で室温にて270時間後固定し、次いで50 M PB中の0.9％スクロースおよび500％アジ化ナトリウムに浸漬し、そして4℃で保存した。 冠状切片（ＸＮＵＭＸμｍ）を凍結ミクロトーム（ＨＸＮＵＭＸＲ、Ｍｉｃｒｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で切断し、凍結防止剤溶液（ＸＮＵＭＸ％ＰＢ中のＸＮＵＭＸ％スクロースおよびＸＮＵＭＸ％エチレングリコール）中に４つの平行シリーズで集め、−ＸＮＵＭＸ℃で保存した。 浮遊切片は、インキュベーションの間に0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS; pH 1〜20）で十分に洗浄しました。 切片を0.01％Hにさらした2O2 内因性ペルオキシダーゼを破壊するために室温でＸＮＵＭＸ分間、その後、ＸＮＵＭＸ％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳであるＰＢＳ ＋インキュベーション溶液（カタログ項目ＸＮＵＭＸ − ＸＮＵＭＸ − ＸＮＵＭＸ；ペンシルバニア州ウェストグローブのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＸＮＵＭＸ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘでブロッキングした。 ＸＮＵＭＸに対する−ＸＮＵＭＸ（カタログアイテムＢＰＸＮＵＭＸ − ＸＮＵＭＸ； Ｓｉｇｍａ − Ａｌｄｒｉｃｈ）ｈ。 次いで切片を、pan-FosBウサギポリクローナル抗体（10：0.1K; sc-005 Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルーズ）中、000℃で一晩インキュベートした。 pan-FosB抗体は、FosBおよびΔFosBによって共有される内部領域に対して惹起された。 刺激後時間（ＸＮＵＭＸ時間）に検出可能な全ての刺激誘導性ＦｏｓＢが分解されるので、ΔＦｏｓＢ − ＩＲ細胞は特にΔＦｏｓＢ陽性であった（Perrotti ら。 2004; Perrotti ら。 2008） さらに、この実験では、最終日に交配している動物（ＮＳ、ＥＳ）を、交配のｈ時間後、したがってＦｏｓＢ発現の前に屠殺した。 ウエスタンブロット分析により、およそ1 kDでのΔFosBの検出が確認された。 一次抗体インキュベーション後、切片をビオチン結合ヤギ抗ウサギIgG（37：PBS中1； Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）中で1時間、次いでアビジン - ビオチン - ホースラディッシュペルオキシダーゼ中で500時間（ABC elite）インキュベートした。 ； ＸＮＵＭＸ：ＰＢＳ中のＸＮＵＭＸＫ； Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州、バーリンゲーム）。 このインキュベーション後、切片を以下の方法のうちの１つで処理した。

1 単一ペルオキシダーゼ標識

ＮＮＳおよびＥＮＳ動物の切片を性的経験誘発性ΔＦｏｓＢ蓄積の脳分析に使用した。 ＡＢＣインキュベーション後、ＸＮＵＭＸ分間の処理の後、ペルオキシダーゼ複合体を、ＸＮＵＭＸ％硫酸ニッケルを含むＸＮＵＭＸ％ＸＮＵＭＸ'－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ； Ｓｉｇｍａ － Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を含む色素原溶液で可視化した。過酸化水素（ＸＮＵＭＸ％）。 切片をＸＮＵＭＸ Ｍ ＰＢ中で徹底的に洗浄して反応を停止させ、そしてｄｄＨ中のＸＮＵＭＸ％ゼラチンを含むコード化されたＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ＋ガラススライド（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）上にマウントした。20 脱水後、全てのスライドをＤＰＸ（ジブチルフタレートキシレン）でカバースリップした。

2 二重免疫蛍光

ＮＡｃおよびｍＰＦＣを含有する４つすべての実験群からの切片をΔＦｏｓＢおよびｃ − Ｆｏｓの分析に使用した。 ＡＢＣインキュベーション後、切片をビオチン化チラミド（ＢＴ； ＸＮＵＭＸ：ＰＢＳ中のＸＮＵＭＸ ＋ ＸＮＵＭＸ％Ｈ）と共にＸＮＵＭＸ分インキュベートした。2O2 Ｔｙｒａｍｉｄ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、マサチューセッツ州ボストンのＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＡｌｅｘａ ＸＮＵＭＸ結合ストレプトアビジン（ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸ；ペンシルバニア州ウェストグローブのＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたＸＮＵＭＸ ｍｉｎ用。 次に切片をc-Fosを特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（30：488; sc-1; Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA）と共に一晩インキュベートし、続いてヤギ抗ウサギCy100結合二次抗体と共に1 minインキュベートした。 （ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸ；ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ウェストグローブ、ペンシルベニア州、米国）。 染色後、切片を150 M PBで完全に洗浄し、ddH中52％ゼラチンを含むコード化スライドガラス上にマウントした。2ＸＮＵＭＸおよび褪色防止剤ＸＮＵＭＸ−ジアザビシクロ（ＸＮＵＭＸ）オクタン（ＤＡＢＣＯ； ＸＮＵＭＸ ｍｇ ／ ｍｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ − Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する水性封入剤（Ｇｅｌｖａｔｏｌ）でカバースリップした。 免疫組織化学的対照は、一方または両方の一次抗体の省略を含み、その結果、適切な波長での標識化が行われなかった。

データ解析

ΔFosBの脳解析

治療を盲目にした2人の実験者が、コード化スライド上で脳全体のスキャンを行った。 脳全体のΔＦｏｓＢ免疫反応性（−ＩＲ）細胞を、下記に概説されるようにΔＦｏｓＢ陽性細胞の数を表すためのスケールを用いて半定量的に分析した。 テーブル1。 さらに、半定量的知見に基づいて、Leica DMRD顕微鏡（Leica Microsystems GmbH、Wetzlar）に取り付けられたカメラlucida描画管を用いて報酬および性行動に関与する脳領域における標準分析領域を用いてΔFosB-IR細胞の数を数えた。 、ドイツ）：３つの吻側 - 尾側レベルで分析されたＮＡｃ（コア（Ｃ）およびシェル（Ｓ）； ＸＮＵＭＸ×ＸＮＵＭＸμｍ）。バルフォー ら。 2004; 3つの吻側尾側レベルで分析した腹側被蓋断面積（VTA; 1000×X NUM Xµm）（バルフォー ら。 2004）とVTAテール（Perrotti ら。 2005; 前頭前皮質（前帯状皮質領域（ＡＣＡ）；前縁皮質（ＰＬ）；下縁皮質（ＩＬ）；それぞれＸＮＵＭＸ×ＸＮＵＭＸμｍ）。 尾状被殻（CP; 600×800µm）; 内側視索前核（MPN; 800×800 µm）（補足図1〜3） 小区域ごとに２つの切片を数え、群平均の計算のために動物ごとに平均した。 性的にナイーブで経験豊富なΔFosB-IR細胞のグループ平均を、対応のないt検定を使用して各小領域について比較した。

テーブル1     

性的経験のない動物および経験豊富な動物におけるΔFosB発現の要約
ΔFosBとc-Fosの解析

ライカ顕微鏡（ＤＭＸＮＵＭＸＢ、ライカマイクロシステムズ、ドイツ、ウェッツラー）に取り付けられた冷却ＣＣＤカメラ（Ｍｉｃｒｏｆｉｒｅ、Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ）および（ＸＮＵＭＸｘ対物レンズを使用して）全ての被験者用の固定カメラ設定を有するＮｅｕｒｏｌｕｃｉｄａソフトウェア（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｉｎｃ）を使用して画像を撮影した。 ＮＡｃコアおよびシェルにおける標準分析領域においてｃ − Ｆｏｓ − ＩＲまたはΔＦｏｓＢ − ＩＲを発現している細胞の数（それぞれＸＮＵＭＸ×ＸＮＵＭＸμｍ。 付図1）およびｍＰＦＣのＡＣＡ（ＸＮＵＭＸ×ＸＮＵＭＸμｍ）。 付図3実験群を知らされていないオブザーバーによって、Neurolucidaソフトウェア（MBF Bioscience、Williston、VT）を用いて動物あたり2切片で手動で計数し、動物あたり平均した。 有意水準ＸＮＵＭＸで事後比較のために、二元配置分散分析（因子：性的経験および性行為）およびフィッシャーＬＳＤを用いて、ｃ − ＦｏｓまたはΔＦｏｓＢ細胞の群平均を比較した。

実験ＸＮＵＭＸ：ΔＦｏｓＢ発現操作

ウイルスベクター媒介遺伝子導入

性的にナイーブなオスのSprague Dawleyラットを、定位手術の前に無作為にグループに分けました。 すべての動物に、GFP（対照; n = 12）、野生型ΔFosB（n = 11）、またはΔFosBのドミナントネガティブ結合パートナーをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターのΔJunD（n = 9）の両側微量注入を施した。 NAcに。 ΔＪｕｎＤは、遺伝子プロモーター内のＡＰ － ＸＮＵＭＸ領域に結合する前にΔＦｏｓＢと競合的にヘテロ二量体化することによってΔＦｏｓＢ媒介転写を減少させる（ウィンスタンリー ら。 2007） ウイルス力価をqPCRによって決定し、そして評価した。 インビボの 研究開始前に。 力価は1 – 2×10でした11 mLあたりの感染性粒子。 ハミルトンシリンジ（ＸＮＵＭＸμＬによるＰａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ、ＸＮＵＭＸによると、ｒＡＡＶベクターを、ＸＮＵＭＸ分（座標：ＡＰ ＋ ＸＮＵＭＸ、ＭＬ ＋／－ ＸＮＵＭＸ； ＭＬ ＋／－ ＸＮＵＭＸ； ＢＲＸｍａ）からＸＮＵＭＸμＬ ／ ｓｉｄｅで注入した。 ； Harvard Apparatus、Holliston、MA、USA）。 ベクターは対照注入単独よりも高い毒性を示さない（Winstanley他、2007; AAV調製の詳細については、を参照のこと。 Hommelら、2003） 行動実験はベクター注射の3週後に開始され、最適で安定したウイルス感染を可能にした（ウォレス ら。 2008） マウス種における導入遺伝子の発現は10日にピークに達し、少なくとも6月の間上昇したままである（ウィンスタンリー ら。 2007） 実験の終わりに、動物を経心的に灌流し、ＮＡｃ切片をＡＢＣ－ペルオキシダーゼ－ＤＡＢ反応（上記のように）を用いてＧＦＰ（ＸＮＵＭＸ：ＸＮＵＭＸＫ；ウサギ抗ＧＦＰ抗体； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）について免疫学的に免疫処理した。マーカーとしてGFPを使用して注射部位を確認する（付図4） ΔＦｏｓＢおよびΔＪｕｎＤベクターはまた、内部リボソーム進入部位によって分離されたＧＦＰを発現するセグメントを含み、これは全ての動物におけるＧＦＰ可視化による注射部位の確認を可能にする。 ＮＡｃに限定された注射部位およびウイルスの広がりを有する動物のみを統計分析に含めた。 ウイルスの蔓延は一般にNAcの一部に限られており、核全体に吻側尾側に広がっていなかった。 さらに、ウイルスの拡散は主にシェルかコアのどちらかに限られているように見えました。 しかしながら、注射部位の変動およびＮＡｃ内での広がりは、行動への影響に影響を及ぼさなかった。 最後に、GFP注射は、以前の研究からの非手術動物と比較して、性行動または経験に起因する性行動の促進に影響を及ぼさなかった（バルフォー ら。 2004).

性行為

ウイルスベクター送達の3週間後、動物は1回の射精（または1時間）で連続した4連続性交配セッションで性的経験を獲得し（経験セッション）、続いて経験の長期発現による性行動の促進について試験された1そして最後の体験セッションの2週間後（テストセッション1と2）。 性行動パラメータは、上記のようにすべての交配セッション中に記録された。 各交配セッション中のすべてのパラメータの統計的差異は、二元配置反復測定ANOVA（要因：治療および交配セッション）または一元配置分散分析（射精潜伏期、マウント数および侵入数；係数：治療または交配）を用いてグループ内およびグループ間で比較した。 0.05の有意水準での事後比較のためのFisher LSDまたはNewman-Keuls検定。 具体的には、交尾パラメータに対する性的経験の促進効果を、経験セッション1（ナイーブ）と経験セッション2、3、または4それぞれの間、および各経験セッション内の実験群間で比較した。 さらに、性行動の長期的促進に対する治療（ベクター）の効果を分析するために、各治療群内の経験セッション4と試験セッション1および2との間で交配パラメータを比較し、各試験セッション内の実験群間で比較した。

結果

性的経験はΔFosB蓄積を引き起こす

最初に、性的に経験のある男性における性的に経験のない男性における脳全体のΔFosB蓄積の半定量的調査を行った。 全体的な調査結果の要約は、にあります。 テーブル1。 ΔＦｏｓＢ − ＩＲ分析は、標準的な分析領域を使用して、いくつかの辺縁関連脳領域におけるΔＦｏｓＢ − ＩＲ細胞の数を決定することによって促進された。 図1 性的にナイーブで経験豊富な動物のNAcを染色するDAB-Niの代表的な画像を示す。 有意なΔＦｏｓＢアップレギュレーションがｍＰＦＣ小領域において見出された（図2A）、NAcコアおよびシェル（2B）、尾状被殻（2B）およびVTA（2C）。 NAcでは、NAcコアとシェルのすべての吻側レベルに有意差があり、データは 図2 すべてのロストロ尾側レベルの平均です。 対照的に、視床下部内側視索前核におけるΔＦｏｓＢ − ＩＲの有意な増加はなかった（ＮＮＳ：平均ＸＮＵＭＸ ＋／− ＸＮＵＭＸ； ＥＮＳ：平均ＸＮＵＭＸ ＋／− ＸＮＵＭＸ）。

図1    

 

ナイーブ無性別（A）および無性別（B）グループのNAcにおけるΔFosB-IR細胞（黒）を示す代表的な画像。 aco：前部交連スケールバーは100 µmを示します。
図2      

Ａ．内側前頭前野の内辺縁（ＩＬ）、前辺縁（ＰＬ）および前帯状皮質（ＡＣＡ）小領域におけるΔＦｏｓＢ − ＩＲ細胞の数； Ａ． Ｂ．核は核および殻を側坐し、尾状核被殻（ＣＰ）を有する。 C.吻側、中央、尾側、尾 ...

性的経験は交配誘発c ‐ Fosを減弱させる

ＮＡｃ中のΔＦｏｓＢレベルに対する性的経験の影響は、蛍光染色技術を用いて確認された。 さらに、c-Fosの発現に対する性的経験の影響を分析した。 図3 全ての実験群（Ａ、ＮＮＳ； Ｂ、ＮＳ； Ｃ、ＥＮＳ； Ｄ、ＥＳ）におけるΔＦｏｓＢ−（緑色）およびｃ − Ｆｏｓ（赤色）−ＩＲ細胞の代表的な画像を示す。 性的経験は、NAcコアにおけるΔFosB発現を有意に増加させた（図4A：F1,15 = 12.0; p = 0.003）とシェル（図4C：F1,15 = 9.3; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 対照的に、灌流の1時間前の0.008の交配は、ΔFosB発現に影響を及ぼさなかった（図4A、C性的経験と灌流直前の交尾との間の相互作用は検出されなかった。 両方のNAcコアにおいてc-Fos発現に対する灌流前の交配の全体的な効果があった（図4B：F1,15 = 27.4; p <0.001）およびシェル（図4D：F1,15 = 39.4; p <0.001）。 さらに、性的経験の全体的な影響がNAcコアで検出されました（図4B：F1,15 = 6.1; p = 0.026）とシェル（図4D：F1,15 = 1.7; p = 0.211）および性的経験と灌流前の交配との間の相互作用がNAcコアで検出された（F1,15 = 6.5; p = 0.022）、シェル内の傾向（F）1,15 = 1.7; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ； F1,15 = 3.4; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 事後分析は、性的にナイーブな男性のコアおよびシェルにおける交配誘導c-Fos発現を実証した（図4B、D） しかし、性的経験を積んだ男性では、c-FosはNAcコアで有意に増加しませんでした（図4B）およびシェルで大幅に減衰図4D） このように、性的経験は交配誘発c-Fos発現の減少を引き起こしました。 特定のペアワイズ比較のP値は図の説明文にあります。

図3      

各実験群についてＮＡｃ中のΔＦｏｓＢ（緑色）およびｃ − Ｆｏｓ（赤色）を示す代表的な画像。 スケールバーは100 µmを示します。
図4      

性体験によるΔFosBと交配によるc-Fos 各群に対するΔＦｏｓＢ（コア、Ａ；シェル、Ｃ； ＡＣＡ、Ｅ）またはｃ − Ｆｏｓ（コア、Ｂ；シェル、Ｄ； ＡＣＡ、Ｆ）免疫反応性細胞の数：ＮＮＳ（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）、ＮＳ（ｎ ＝）。 5）、ENS（n = 5）、またはES（n = 5）。 データが表現されている ...

交配誘発性c-Fosレベルに対する性的経験の影響はNAcに限定されなかった。 性的に経験のある動物のACAでは、性的にナイーブな対照と比較して、c-Fos発現の同様の減衰が観察された。 性的経験はACAにおけるΔFosB発現に有意な影響を及ぼした（図4E：F1,15 = 154.2; p <0.001）。 灌流前の交配はΔFosB発現に影響を与えませんでした（図4C）c-Fosが有意に増加図4F：F1,15 = 203.4; p <0.001）ACAで。 さらに、ACAにおける交配誘発c-Fos発現は、性的経験によって有意に減少した（図4F：F1,15 = 15.8; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 性的経験と灌流前の交配との間の双方向の相互作用がc-Fos発現について検出された（図4F：F1,15 = 15.1; p <0.001）。 特定のペアワイズ比較のP値は、図の凡例にあります。 最後に、正中視索前核（NS：平均63.5 +/- 4.0; ES：平均41.4 +/- 10.09）で、交配によって誘発されたc-Fos発現に有意な減少はありませんでした。この領域では、交配の経験が有意な原因にはなりませんでした。 ΔFosB発現の増加は、交配によって誘発されたc-Fos発現がすべての脳領域で影響を受けなかったことを示しています。

NAc中のΔFosBは性行動の強化を仲介する

経験による性行動の促進によって実証されるような性行動の強化のための潜在的な分子メカニズムを探求するために、ΔＦｏｓＢレベルの局所的操作およびその転写活性の効果を決定した。 4回の連続した体験セッション中の性的体験は、マウントの潜時に大きな影響を与えました（図5A：F1,23 = 13.8; p = 0.001）、挿入待ち時間（図5B：F1,23 = 18.1; p <0.001）、および射精潜時（図5C：GFP、F11,45 = 3.8; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 ＧＦＰ対照動物は、経験セッションＸＮＵＭＸと比較して、経験セッションＸＮＵＭＸ中に、予想される経験に誘発された性行動の促進を示し、最初の装着、最初の挿入および射精までの有意に低い潜伏期を示した。図5A – C; p値については図の凡例を参照してください。 性行動のこの経験による促進は、マウント潜伏および潜入潜時についてのΔFosB群においても観察されたが、射精潜時において有意な差は検出されなかった（図5A – C） 対照的に、ΔJunD動物は気絶した促進を示した。 マウント、侵入、および射精の潜時が交配セッションの繰り返しで減少したとしても、経験セッション1と4の間で比較したとき、これらのパラメーターのどれも統計的に有意に達しませんでした（図5A – C） 各体験セッションのグループ間比較では、ΔFunBおよびGFPと比較して、体験セッション中のΔJunDのマウント、イントロミット、射精までの待ち時間が大幅に長くなったことが示されています（図5A – C） さらに、性的経験と治療の両方が交尾効率に大きな影響を及ぼしました（図5F：性的経験、F1,12 = 22.5; p <0.001; 治療、F1,12 = 3.3; ｐ ＝ ＸＮＵＭＸ）。 経験的セッション0.049と比較して、経験的セッション4の間にΔFosB男性は交尾効率が向上した（図5F） さらに、ΔＦｏｓＢ動物は、経験セッションＸＮＵＭＸと比較して、経験セッションＸＮＵＭＸの間の射精前の量が有意に少なかった（図5D：F10,43 = 4.1; p = 0.004）、そしてΔJunDの男性は射精に先立って有意により多くの量を持っていたので、他の2つのグループのどちらよりも著しく交尾効率が下がりました（図5DとF） したがって、GFPおよびΔFosB動物は、性行動および性行為の開始の経験誘発促進を示したが、ΔJunD動物は示さなかった。

図5      

ＧＦＰ（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）、ΔＦｏｓＢ（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）およびΔＪｕｎＤ（ｎ ＝ ＸＮＵＭＸ）動物の性行動：マウント潜伏期（Ａ）、挿入潜伏期（Ｂ）、射精潜伏期（Ｃ）、マウント数（Ｄ）、挿入数（E）および交尾効率（F）。 データが表現されている ...

ΔＦｏｓＢ発現が性行動の経験誘発性促進の長期発現に重要であるという仮説を検証するために、動物を最終体験セッション後ＸＮＵＭＸ週（試験セッションＸＮＵＭＸ）およびＸＮＵＭＸ週（試験セッションＸＮＵＭＸ）に試験した。 実際、GFP群とΔFosB群では、試験セッション1または1と最終体験セッション2との間で行動パラメータの違いがなかったため、GFP群とΔFosB群の両方で促進された性行動が維持された（図5A – C; 試験セッションにおける射精潜伏期および交尾効率を除く（ΔＦｏｓＢ動物）。 ΔJunD動物とGFPまたはΔFosB群との間の有意な差は、すべての性行動パラメータについて両方の試験セッションにおいて検出された（図5A – F） 侵入の数、PEI、または射精した動物の割合を比較しても、グループ間またはグループ内で差は検出されませんでした（最後の4つの交配セッション中に射精したすべてのグループの雄の100％）。

考察

現在の研究は、性的経験が、NAcコアおよびシェル、mPFC、VTAおよび尾状被殻を含む、いくつかの辺縁系脳領域におけるΔFosBの蓄積を引き起こすことを実証した。 さらに、性的経験は、NAcおよびACAにおけるc-Fosの交配誘発発現を減弱させた。 最後に、NAc中のΔFosBは、性的経験の獲得中の交尾の促進および性行動の経験誘発性促進の長期的発現を仲介するのに重要であることが示された。. 具体的には、ΔＦｏｓＢ仲介転写を減少させることは、性的動機およびパフォーマンスの経験誘発促進を減弱させ、一方ではΔＦｏｓＢの過剰発現は減少させた。 NAcは、より少ない経験で性的パフォーマンスの向上という観点から、性行動の促進を促進しました。 一緒に、現在の調査結果はΔFosBは性的経験によって引き起こされる長期的な神経と行動の可塑性のための重要な分子メディエータであるという仮説をサポートしています。

今回の知見は、雄ラットのNAcにおける性経験誘発ΔFosBを示す以前の研究を拡張する (ウォレス ら。 2008) と女性のハムスター (ヘッジ ら。 2009). Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ。 （2008） そのrAAV-を示したＮＡｃにおけるΔＦｏｓＢ過剰発現は、最初の交配セッション中の性的にナイーブな動物における性行動を促進した。 射精への侵入が少なく、射精後の間隔が短いことで証明されているが、性的に経験のある男性には効果がなかった（ウォレス ら。 2008).

対照的に、本研究は、最初の試験の間、性的に未熟な男性におけるΔFosB過剰発現の影響を示さず、むしろ性的経験の獲得の間およびその後にそれを示した。 ΔＦｏｓＢ過剰発現体は、ＧＦＰ動物と比較して、性的能力の増加（交尾効率の増加）を示した。

さらに、本研究は、ΔJunD発現ウイルスベクターを用いてΔFosB媒介転写を遮断することによりΔFosBの役割を試験した。 ΔＦｏｓＢ発現の経験に起因する増加の防止は、性行動（増加した射精潜伏期間および増加した回数）ならびに経験に基づく性的動機づけの促進および続く促進された性行動の長期発現を阻害した。

それ故、これらのデータは、性行動の経験誘発促進の獲得におけるΔFosBの必須の役割を示す最初のものである。 さらに、これらのデータは、ΔＦｏｓＢも経験誘発促進行動の長期発現に決定的に関与していることを示している。 我々はこの促進された行動の長期的な表現が自然な報酬のための記憶の形を表すと提案する、それ故にNAcのΔFosBは報酬記憶の仲介者である。 性的経験もVTAとmPFC、報酬と記憶に関与する分野でΔFosBレベルを増加させた (バルフォー ら。 2004; フィリップス ら。 2008). 将来の研究は、報酬記憶のためのこれらの領域におけるΔFosBアップレギュレーションの潜在的な意義を明らかにするために必要とされる。

ΔＦｏｓＢ発現は非常に安定しているので、慢性的摂動後の脳の持続的適応の分子メディエーターとして大きな可能性を秘めている。ネスラー ら。 2001). ΔＦｏｓＢは、複数回のコカイン注射にわたってＮＡｃが徐々に増加し、数週間まで持続することが示されている。 (希望 ら。 1992; 希望 ら。 1994). NAcΔFosB発現におけるこれらの変化は薬物報酬感作および依存症と関連している (Chao＆Nestler 2004; McClung＆Nestler 2003; McClung ら。 2004; ネスラー2004, 2005, 2008; ネスラー ら。 2001; ザカリオウ ら。 2006） 対照的に、自然の報酬を仲介することにおけるΔFosBの役割は、研究されていない。 最近の証拠は、NAcにおけるΔFosB誘導が自然の報酬に関与していることを示唆して浮上している。 ΔＦｏｓＢレベルは、スクロース摂取およびホイールランニング後にＮＡｃにおいて同様に増加する。。 ビットトランスジェニックマウスまたはラットのウイルスベクターを用いた線条体におけるΔFosBの過剰発現は、スクロース摂取量の増加を引き起こす。 食物へのモチベーションの向上と自発的なホイールランニングの向上 (オラソン ら。 2006; ウォレス ら。 2008; ウェルメ ら。 2002） 現在のデータは実質的にこれらの報告に追加され、そしてΔFosBが報酬強化および自然な報酬記憶のための重要な仲介者であるという考えをさらに支持する。

ΔＦｏｓＢは、中側縁系における可塑性の誘発を介して経験的に誘発される性行動の強化を仲介し得る。 確かに、性的経験は中脳辺縁系にいくつかの長期的な変化を引き起こします (Bradley＆Meisel 2001; Frohmader ら。 2009; 投手 ら。 2010）。 ザ·行動レベル、アンフェタミンに対する感作された自発運動反応、および増強されたアンフェタミン報酬は、性的に経験された雄ラットにおいて示されています。投手 ら。 2010; アンフェタミンに対する自発運動反応の変化は、女性ハムスターでも観察されています（Bradley＆Meisel 2001） さらに、雄ラットにおける性的経験からの禁断期間の後、樹状突起棘の数の増加および樹状突起樹状突起の複雑さが認められた（投手 ら。 2010). 現在の研究は、ΔFosBが性的経験の長期的転帰の特異的分子メディエーターであり得ることを示唆している。 一致して、ΔFosBは最近、慢性的なコカイン投与に反応して樹状突起棘変化を誘発するために重要であることが示されています。 (ディーツ ら。 2009; Maze ら。 2010).

どの上流の神経伝達物質がNAc中のΔFosBの誘導に関与しているかは明らかではないが、DAが候補として提案されている（ナイ ら。 1995). コカイン、アンフェタミン、アヘン剤、カンナビノイド、およびエタノールを含むほぼすべての乱用薬物、ならびに自然の見返りにより、NAcのΔFosBが上昇します (Perrotti ら。 2005; ウォレス ら。 2008; ウェルメ ら。 2002). 虐待の薬物と自然の見返りの両方は、NAcのシナプスDA濃度を増加させます (ダンマ ら。 1992; Hernandez＆Hoebel 1988a, b; Jenkins＆Becker 2003). 乱用薬物によるΔFosB誘導はDA受容体含有細胞において示されており、コカイン誘導ΔFosBはD1 DA受容体拮抗薬によって遮断されるt（ナイ ら。 1995). したがって、DA放出はΔFosB発現を刺激し、それによって報酬関連神経可塑性を媒介すると仮定される。. ΔFosBレベルがDA依存性であるという考えをさらに裏付けるのは、性的経験によってΔFosBレベルが変化した脳領域が内側前頭前野および側底外側扁桃体を含む強いドーパミン作動性入力を受け取るという知見です。.

しかしながら、対照的に、視床下部の供給源からではあるが、この領域がドーパミン作動性入力を受けても、内側視索前野領域ではΔＦｏｓＢは増加しない。Miller＆Lonstein 2009） 交配によって誘発されたΔFosBの発現および性的動機およびパフォーマンスに対する性的経験の影響がDAの作用に依存するかどうかを試験するために将来の研究が必要である。 雄ラットの性的報酬におけるDAの役割は現在完全には明らかにされていない（Agmo＆Berenfeld 1990; ファウス2009） DAが女性への曝露中または交尾中にNAcに放出されるという十分な証拠がある（ダンマ ら。 1992）およびDAニューロンは性行動の間に活性化されます（バルフォー ら。 2004） しかし、DA受容体拮抗薬の全身注射は、性的な報酬による条件付き場所嗜好を妨げません（Agmo＆Berenfeld 1990また、DAが経験に基づく交尾強化に重要であるという仮説は検証されていない。

性行動に対するΔFosBの影響の下流のメディエータが何であるかについても不明である。 ΔＦｏｓＢは、ＡＰ − ＸＮＵＭＸ依存性メカニズムを介して転写アクチベーターおよびリプレッサーの両方として作用することが示されている。McClung＆Nestler 2003; ピークマン ら。 2003） 即時初期遺伝子c-fosを含む多数の標的遺伝子が同定されている（希望 ら。 1992; 希望 ら。 1994; モーガン＆カラン1989; Renthal ら。 2008; チャン ら。 2006), cdk5（ビブ ら。 2001), ダイノルフィン (ザカリオウ ら。 2006)、サーチュイン-1 (Renthal ら。 2009), NFκBサブユニット (アン ら。 2001）AMPAグルタミン酸受容体GluR2サブユニット (ケルツ ら。 1999） 現在の結果は、交配誘発性ｃ − Ｆｏｓレベルが、ΔＦｏｓＢ（ＮＡｃおよびＡＣＡ）の増加と共に脳領域における性的経験によって減少したことを実証している。 ｃ − Ｆｏｓの抑制は、前回の研究と同様に、最後の交配および繰り返しの交配セッション以降の期間に依存しているようであり、ｃ − Ｆｏｓのそのような減少は、最後の交配セッションの翌週のＸＮＵＭＸ試験の雄ラットでは検出されなかったバルフォー ら。 20041回の交配セッションのみからなる性的経験の後）Lopez＆Ettenberg 2002） さらに、現在の知見は、ΔFosBが慢性的なアンフェタミン曝露後にc-fos遺伝子を抑制するという証拠と一致している（Renthal ら。 2008） これらの所見と一致して、いくつかの即時型初期遺伝子ｍＲＮＡ（ｃ − ｆｏｓ、ｆｏｓＢ、ｃ − ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、およびｚｉｆＸＮＵＭＸ）の誘導は、急性薬物注射と比較してコカイン注射を繰り返した後に減少した（希望 ら。 1992; 希望 ら。 1994慢性アンフェタミン投与中止後のアンフェタミン誘発性c-fos抑制ジャーバー ら。 1995; Renthal ら。 2008） 慢性的な薬物治療または性的経験の後のc-Fos発現の下方制御の機能的関連性は依然として不明であり、反復報酬曝露に対する動物の感受性を調節するための重要な恒常性メカニズムであることが示唆されている（Renthal ら。 2008).

結論として、本研究は、NAcのΔFosBが性的報酬記憶において不可欠な役割を果たすことを実証し、ΔFosBが一般的な報酬強化および記憶に重要である可能性を支持する。 今回の研究から得られた知見は、性的報酬と動機を媒介する細胞および分子メカニズムの理解をさらに明らかにし、ΔFosBが自然報酬におけるΔFosBの役割を実証することによって嗜癖の発達において重要な役割を果たすことを示す強化。

補足資料

図S1-S4と表S1-S2を補足

謝辞

この研究は、カナダ衛生研究所のLMCへの寄付、国立精神衛生研究所のEJNへの寄付、およびカナダの自然科学および工学研究評議会からKKPおよびLMCへの寄付によって支えられています。

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