Nat Neurosci. 저자 원고; PMC Jan 1, 2014에서 사용할 수 있습니다.
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Nat Neurosci. Jul 2013; 16 (7) : 10.1038 / nn.3420입니다.
온라인으로 Jun 2, 2013 게시. doi : 10.1038 / nn.3420
PMCID : PMC3703824
NIHMSID : NIHMS477621
추상
사회적으로 일부일처 제의 대초원에서Microtus ochrogaster), 교합은 파트너 선호도 형성에 의해 개시되고 옥시토신, 바소프레신 및 도파민을 포함한 다양한 신경 전달 물질에 의해 조절되는 지속적인 페어-본드를 유도한다. 여기 우리 쌍 결합 규제 중재 잠재적 인 후생 적 메커니즘을 조사했다. 우리는 히스톤 deacetylase 억제제 나트륨 butyrate 및 TrichoStatin A (TSA) 짝짓기없이 여성 프레리들에서 파트너 선호도 형성을 보여줍니다. 이것은 각각의 프로모터에서 히스톤 아세틸 화의 증가를 통해 핵 축적 체에서 옥시토신 (OTR) 및 바소프레신 V1a 수용체 (V1aR)의 특이 적 상향 조절과 관련이있다. 또한, 핵 축적에서 OTR 또는 V1aR 차단에 의해 TSA 촉진 파트너 선호가 방지되었다. 중요하게도, 짝짓기 유발 파트너 선호는 TSA와 동일한 OTR 및 V1aR 유전자 프로모터의 후성 유전 적 조절을 촉발시켰다. 따라서 이러한 관찰은 TSA 및 교배가 후성 유전 적 사건을 통해 파트너 선호를 촉진하고, 페어-본딩의 후성 유전 적 조절에 대한 최초의 직접적인 증거를 제공한다는 것을 나타낸다.
개요
사회적 제휴는 인간의 사회적 행동의 필수 특성이며 사회적인지 결핍은 정신 분열증 및 자폐증 스펙트럼 장애뿐만 아니라 중독 및 우울증을 포함한 다수의 신경 정신병 적 장애에서 공통적 인 특징입니다.1. 사회적으로 일부일처 제 프레리 들쥐 (Microtus ochrogaster) 실험실과 자유 생활자가 장기 쌍의 유대를 형성함에 따라 사회 부착의 신경 생물학적 기초를 조사하는 데 매우 흥미로운 모델로 등장했습니다.2-4파트너 우선 순위라고하는 파트너에 대한 선택적 제휴 행동의 형성에 의해 시작됩니다.5. 파트너 선호도의 이러한 형성은 신경 펩티드 옥시토신 및 바소프레신 (AVP) 및 중소 변동성 도파민을 비롯한 다양한 신경 전달 물질 및 호르몬 시스템을 포함한다5.
In 일반적으로, 파트너 선호도 형성은 수컷의 복강 두엽 및 횡격막 (LS)에서 AVP 신경 전달, 및 암컷 어 큐벤 (NAcc)의 옥시토신 신경 전달 및 암컷 프레리 밭의 예비 피질을 통해 매개됩니다.6-8.
일반적으로 짝짓기와 같은 자연적인 보상에 관여하는 도파민은 프레리 밭에서 파트너의 선호를 결정하는 중요한 중재자 역할을합니다. NAcc에서 도파민 D2- 타입 수용체 (D2R)의 활성화는 촉진되는 반면, 도파민 D1- 타입 수용체 (D1R)의 활성화는 수컷 및 암컷 프레리 es에서 파트너 선호도 형성을 억제한다9-11.
중요하게도, 옥시토신 및 AVP V1a 수용체, OTR 및 V1aR의 유전자 발현의 변화는 그 자체가 파트너 선호에 크게 영향을 줄 수있다. 예를 들어, 여성 대초원에서, NAcc에서 OTR의 과발현은 짝이 없을 때 파트너 선호를 촉진12-14.
옥시토신 및 AVP는 페어 본딩의 규제를 넘어 사회적 인식, 침략 및 모성 관리를 포함한 광범위한 사회적 행동에 연루되어 있습니다.15, 16. 특히, 설치류에서 후자의 행동의 방해는 에스트로겐 수용체 알파의 DNA 메틸화를 포함한 후성 유전 적 메카니즘을 통해 오래 지속되는 신경 적응을 유도한다17 및 AVP 유전자18글루코 코르티코이드 수용체 프로모터의 히스톤 아세틸 화뿐만 아니라19. 또한, 설치류 뇌에서 증가 된 히스톤 아세틸 화를 통해 유전자 발현을 향상시키는 히스톤 데 아세틸 라제 (HDAC) 억제제20이러한 변경 사항을 되돌릴 수 있습니다.19성적 수용과 같은 사회적 행동에 직접 영향을 미칩니다.21. 중요하게는, 폐암 세포주에서, HDAC 억제제 트리코 스타틴 A (TSA)는 히스톤 아세틸 화를 국소 적으로 촉진함으로써 OTR 전사를 직접적으로 향상시킨다22.
따라서, 프레리 밭에서 파트너 선호도 형성의 후성 유전 적 근거가 제안 될 수있다. 이 가설을 테스트하기 위해 먼저 성인 여성 프레리 밭에서 파트너 선호도 형성에 대한 두 가지 HDAC 억제제 인 나트륨 부티레이트 (NaB) 및 TSA의 효과를 평가했습니다. 그 후, 우리는 여성 프레리 밭에서 파트너 선호도를 유도하는 데 TSA의 영향을 매개하는 분자 메커니즘을 조사했습니다. 마지막으로, 우리는 동거 동안 TSA에 의해 유발 된 후성 유전 적 변화가 또한 교배에 의해 유발되는지 여부를 결정하고자 하였다.
결과
TSA 치료는 파트너 선호를 용이하게합니다
성적으로 순진한 여성 프레리 밭을 뇌 실내 주사했다icv.) 0.08, 0.4 또는 4를 포함하는 CSF 또는 CSF 사용 n교미하지 않은 수컷과 6- 시간 동거 직전에 TSA g를, 파트너 선호도를 테스트 하였다. 짝짓기없이 수컷과 6 시간 동안 동거하는 것은 여성 프레리 무리에서 파트너 선호도 형성을 유도하지 않습니다4 따라서이 행동 패러다임은 파트너 선호도 형성 촉진에 대한 다양한 약물의 효과를 평가하는 데 광범위하게 사용되었습니다5.
CSF- 처리 된 동물은 짝짓기없이 6 시간의 동거 후 파트너 또는 낯선 사람과 비 선택적으로 나란히 접촉하는 것으로 나타났다 (t15= 0.76, P = 0.46; 그림 1a). 그러나, 시험 된 모든 용량에서 TSA로 처리 된 동물은 낯선 사람보다 파트너와 우선적으로 더 많은 시간을 보냈다 (t8= 4.35, P = TSA 0.002의 경우 0.08 ng 그룹; t15= 3.63, P = TSA 0.002의 경우 0.4 ng 그룹; 과 t8= 2.58, P = TSA 0.03의 경우 4 ng 그룹). 중요한 것은 운동 활동에서 그룹 차이가 발견되지 않았다는 것입니다.F3,46 = 1.25, P= 0.30, 그림 1b) 및 시험 여성이 낯선 사람이나 파트너를 향한 공격적인 행동은 관찰되지 않았으며, 이는 TSA의 효과가 낯선 사람에 대한 운동 또는 사회적 혐오의 변경에 부수적 인 것이 아니라 사회적 선호에 특유한 것임을 보여줍니다.
TSA가 파트너 선호도 형성에 관여하는 뇌 구조에서 히스톤 아세틸 화를 강화하는지 여부를 조사하기 위해, 별도의 배치의 암컷에게 중간 용량의 TSA (0.4)를 주사 하였다. ng) 30 분, 2 또는 9 시간 동안 교배가없는 경우 수컷과 동거. 특히, 글로벌 히스톤 H3 아세틸 화 (Lys14) 수준의 유의 한 변화는 NAcc 및 미달 퍼터 멘의 어느 시점에서도 검출 될 수 없었다 (P > 모든 그룹에 대해 0.05, 그림 1c & d). 이것은 TSA가 NAcc 또는 미량 푸틴에서 글로벌 히스톤 H3 아세틸 화에 영향을 미치지 않더라도 짝짓기없이 파트너 선호도 형성을 촉진한다는 것을 입증한다.
중요하게도, 나트륨 부티레이트는 또한 NAcc에서 글로벌 히스톤 H6 아세틸 화 (Lys3)의 증가와 관련하여 짝짓기없이 14 시간 동안 수컷과 동거 한 후 여성 프레리 밭에서 파트너 선호도를 촉진시켰다.보충 그림 1). 따라서, 파트너 선호도 형성에 대한 TSA의 효과는 다른 HDAC 억제제와 함께 재현 될 수 있으며, 이는 파트너 선호도의 촉진에있어서 TSA의 비특이적 효과보다는 HDAC 억제의 관여를 시사한다. TSA가보다 구체적이고 아핀 클래스 I / II HDAC 억제제임을 고려23, 24그리고 TSA의 행동 효과가 NaB보다 더 두드러 졌기 때문에, 본 연구의 다음 부분에서 특정 분자 상관을 조사하기 위해 NaB보다 TSA를 사용하기로 결정했다.
TSA 촉진 파트너 선호도의 분자 상관
vole NAcc에서 유전자 발현 수준의 변이가 일부일처 및 비단 일체 사이의 서로 다른 짝짓기 전략과 관련되어 있으며, 특히 프레리 밭에서 파트너 선호도 형성의 변경과 관련이 있음12, 13, 25, 26, 우리는 TSA 촉진 파트너 선호 형성이 NAcc에서 유전자 발현의 변형과 관련이 있는지 여부를 평가했다.
TSA 치료 (0.4 ng, icv.) CSF- 처리 된 대조군과 비교하여 2 시간의 동거 후 NAcc에서 OTR mRNA 수준의 증가를 유도 하였다 (t10 = 2.38, P = 0.038, 그림 2a), 9 시간의 동거 후 지속되는 경향 (t9 = 2.17, P = 0.058, 그림 2b). VSANUMXaR mRNA의 약간의 증가는 TSA 주사 후 NAcc 1 시간에서 관찰 될 수 있지만 D2R 또는 D1R을 포함하여 측정 된 다른 mRNA에 대해 어느 시점에서도 다른 그룹 차이가 검출되지 않았다 (P > 0.05, 그림 2a, b). 중요한 것은, 어떤 시점에서 그리고 미량 측정 된 mRNA에 대해 미숙 한 Putamen에서 그룹 차이가 관찰되지 않았다는 점이다 (P 모든 그룹에 대해> 0.05, 그림 2c, d), TSA- 처리 된 동물에서 관찰 된 OTR mRNA의 증가는 NAcc에 특이적임을 시사한다. 또한, NAcc의 OTR 및 V1aR mRNA 수준이 동거없이 TSA 주사 후 변경되지 않은 2 시간 동안 유지 되었기 때문에, 이러한 상향 조절은 남성과 동거 후에 만 존재 하였다 (OTR : CSF 그룹의 경우 100.0 % ± 11.70, CSF 그룹의 경우 86.7 % ± 12.11, TSA의 경우). 그룹, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR : CSF 그룹의 경우 100.0 % ± 26.24, TSA 그룹의 경우 92.3 % ± 13.75, t9 = 0.27, P = 0.791).
더 높은 OTR mRNA 수준과 일치하여, TSA- 처리 된 동물은 또한 NAcc (2 시간)의 두 시점에서 더 높은 OTR 단백질 수준을 나타냈다 : t10 = 2.34, P = 0.041; 9 시간 : t10 = 3.16, P = 0.01, 그림 2e, f)이지만 푸 타멘을 부정하지는 않음 (t10 = 0.41, P = 0.69, 그림 2g, h). 흥미롭게도, VSANUMXaR mRNA 수준의 유의 한 변화는 TSA 주사 후 1 또는 2 시간에 NAcc에서 검출 될 수 없었다 (그림 2a, b), V1aR 단백질 수준은 NAcc에서 CSF- 처리 된 동물과 비교하여 9 시간에서 유의하게 증가 하였다 (t9 = 3.46, P = 0.007, 그림 2f)이지만 푸 타멘을 부정하지는 않음 (t10 = 0.98, P = 0.35, 그림 2h). 약간의 변형이 있었지만, NAcc 및 우 두부 푸 타멘에서 D1R 및 D2R 단백질 수준은 TSA 투여에 의해 크게 영향을받지 않았다 (P > 0.05, 그림 2e-h).
TSA, oxtr 및 avpr1a의 히스톤 아세틸 화 촉진
TSA 처리 후 동거 후 OTR에 대한 mRNA 및 단백질 수준 둘 모두의 증가는 TSA가 oxtr, 단백질의 번역 또는 전환을 변경하기보다는 OTR을 코딩하는 유전자. 또한, V1aR 단백질 수준은 NAcc에서 더 높았으며, 이는 TSA 처리 후 mRNA 수준의 약간이지만 유의미한 증가와 관련이 없었다 (Fig. 2). TSA가 강력한 클래스 I 및 II HDAC 억제제임을 고려23, 24, 27우리는 TSA가 히스톤 아세틸 화를 증가 시킨다는 가설을 세웠다. oxtr 및 avpr1a NAcc의 프로모터는 이후 전사를 향상시킨다. 새로운 동물 배치를 받았습니다 icv. TSA 주사 (0.4 ng) 희생되기 전에 30 분 동안 교배하지 않고 수컷과 즉시 동거 하였다. 30- 분 시간 윈도우는 래트 및 마우스에서 국소 TSA 주사 후 히스톤 아세틸 화의 최대 증가를보고 한 이전 연구에 기초하여 선택되었다28, 29. 에 H3K14 아세틸 화 oxtr 및 avpr1a 이어서, 프로모터를 염색질 면역 침전에 의해 분석 하였다.
이전에 관찰 된 OTR mRNA 및 단백질 수준의 증가와 관련하여, TSA- 처리 된 동물은 이의 히스톤 H460 아세틸 화에서 매우 높은 증가 (+ 3 %)를 나타냈다. oxtr NAcc에서 CSF- 처리 된 대조군과 비교 한 유전자 프로모터 (t10 = 5.88, P = 0.0002), Putamen을 우회하지 않음 (t9= 0.31, P = 0.76, 그림 3a). 또한, 히스톤 H3 아세틸 화 avpr1a NAcc에서 프로모터는 TSA 투여 (+ 30 %) 후 196 분이 유의하게 상승 하였다 (t10 = 3.12, P = 0.01)이지만 putamen을 부정하지 않음 (t9= 0.38, P CSF- 처리 된 대조군과 비교하여 = 0.71)그림 3b). 따라서, TSA는 수컷과 동거가 시작된 후 30 분 전에 NAcc에서 히스톤 아세틸 화 부위를 특이 적으로 증가시켰다.
TSA, OTR 및 V1aR을 통한 파트너 선호
이전의 실험 세트에서, 동종 작용 동안 TSA가 히스톤 아세틸 화를 강화시키는 작용의 분자 모델이 나타났다. oxtr 및 avpr1a 그 후, 그들의 전사를 향상시키고 동거 기간의 시작 후 최대 1 시간까지 더 높은 OTR 및 V9aR 단백질 수준을 초래하는 프로모터. 중요하게도,이 TSA 효과는 우 두부 퍼터에 영향을 미치지 않기 때문에 부위에 따라 다르다. 여기 우리는 OTR 및 V1aR의 TSA 유발 증가 파트너 선호도 형성 촉진과 관련이 있는지 테스트했습니다. 암컷 프레리 들쥐는 TSA (0.04)의 비강 내 주사를 받았다n사전 주사 유무 (TSA 주사 전 30 분, 0.5)n2 개의 상이한 OTR 길항제, OTA (B) 및 OTA (T) 중 하나 또는 V1aR 길항제 (V1aRA) 중 하나를 함유하는 CSF 또는 CSF의 측면 당 g). TSA 주사 직후, 암컷은 짝짓기없이 6 시간 동안 수컷과 동거하였고, 파트너 선호도 시험이 이어졌다.
CSF- 처리 된 동물은 파트너 선호도를 나타내지 않았다 (t5 = 0.17, P = 0.87, 그림 4a). 그러나, TSA- 처리 된 동물은 "낯선 사람"보다 "파트너"와 나란히 접촉하는 데 훨씬 더 많은 시간을 보냈으며, 이는 NAcc에 직접 단일 TSA 주사가 짝짓기없이 파트너 선호도 형성을 촉진하기에 충분하다는 것을 시사한다 (t5 = 7.04, P = 0.0009). 흥미롭게도 OTA (B), OTA (T) 또는 V1aRA로 전처리하여 OTR 또는 V1aR을 봉쇄하면 TSA의 영향을 방지 할 수있었습니다 (P 모든 그룹에 대해> 0.05). 운동 활동에서 그룹 차이가 발견되지 않았기 때문에 (F4,32 = 1.89, P = 0.14, 그림 4b), 이들 데이터는 NAcc의 TSA가 행동-특이 적 방식으로 OTR- 및 V1aR- 매개 메커니즘을 통해 파트너 선호도 형성을 촉진한다는 것을 시사한다.
교배는 TSA와 유사한 신경 적응을 유도합니다
우리의 이전 관찰에 따라, 우리는 암컷 NAcc에서 옥시토신 및 바소프레신 신경 전달의 후성 유전 학적 강화가 짝짓기없이 파트너 선호도 형성을 촉진하기에 충분하다는 것을 확립 하였다. 이러한 신경 적응이 파트너 선호도의 자연 형성 중에 발생하는지 여부를 조사하기 위해, 짝짓기 존재시 24 시간 동안 암컷 프레리 밭을 수컷과 함께 동거하여 파트너 선호도를 유도합니다.4, 희생했다. 성적으로 순진한 여성과 비교하여 NACC에서 OTR 및 V1aR mRNA 및 단백질 수준의 증가가 관찰되었습니다 (OTR : + 38 %, t10 = 2.68, P = mRNA의 경우 0.02, + 58 % t8 = 3.05, P = 단백질의 경우 0.01; V1aR : + 89 %, t14= 2.53, P = mRNA의 경우 0.02, + 26 % t20 = 2.23, P = 단백질의 경우 0.037, 그림 5a, b).
OTR 및 V1aR에 대한 mRNA 및 단백질 수준이 교배와 함께 동거에 의해 증가함에 따라, 본 발명자들은이 상향 조절이 후성 유전 적 향상과 관련이 있는지 여부를 조사 하였다. oxtr 및 avpr1a 유전자 전사. 따라서 암컷의 새로운 배치를 6 시간 동안 수컷과 함께 동종 배양하고 H3K14 아세틸 화를 수행 하였다. oxtr 및 avpr1a 염색질 면역 침전에 의해 측정 된 프로모터. OTR 및 V1aR mRNA 및 단백질 수준에 따라, 암컷 프레리 덩이는 더 높은 H3K14 아세틸 화를 나타낸다. oxtr 및 avpr1a 성적으로 순진한 여성에 비해 NAcc의 발기인oxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 그림 5c, d). 이 데이터는 여성 프레리 밭에서 파트너 선호를 안정적으로 유도하는 동거 패러다임이 TSA 처리 후 관찰 된 후성 유전 적 메카니즘을 통해 NAcc에서 OTR 및 V1aR 발현의 상향 조절을 유발한다는 것을 시사한다.
토론
이 연구에서 우리는 파트너 선호도 형성의 후 성적 규제를 처음으로보고합니다. 먼저, 우리는 HDAC 억제제의 투여에 의해 NAcc에서 히스톤 아세틸 화를 증가시키는 것이 짝짓기없이 성인 여성 프레리 밭에서 파트너 선호도 형성을 용이하게한다는 것을 입증 하였다. T암컷의 동거와 짝짓기가 증가함에 따라 암컷의 파트너 선호 형성이 후 성적으로 주도된다는 직접적인 증거를 우리는 공개했다 oxtr 및 avpr1a NAcc에서 강화 된 히스톤 아세틸 화를 통한 유전자 발현. NAcc에서의 TSA 투여는 파트너 선호를 유도하고 NAcc에서 더 높은 수준의 OTR mRNA 및 단백질을 유도 하였다. 또한, 글로벌 히스톤 H3 아세틸 화는 TSA- 처리 된 암컷에서 영향을받지 않았지만, 히스톤 아세틸 화의 현저한 농축은 oxtr NAcc의 프로모터는 TSA 투여 후 30 분만큼 일찍 관찰되었다. 마지막으로, NAcc에서 OTR을 차단하는 것은 TSA 촉진 파트너 선호를 방지하기에 충분했습니다.. 파트너 선호도를 유도하는 것으로 알려진 절차 하에서 짝짓기와 동종 후 유사한 후성 유전 적 변형이 검출되었으므로, 우리의 데이터는 사회적 행동의 후성 유전 적 규제를위한 모델을 제시했다. D수컷, TSA 또는 짝짓기와 동거하는 동안 특정 히스톤 H3 아세틸 화를 빠르게 유도합니다. oxtr NAcc의 프로모터는 그것의 전사를 향상시켜, 더 높은 OTR mRNA 및 단백질 수준을 초래하며, 그 후에 파트너 선호도 형성을 촉진시킨다.
암컷 프레리 밭에서 짝짓기없이 수컷과 6의 동거 시간은 파트너 선호도 형성을 유도하지 않습니다4이 행동 패러다임은 파트너 선호도의 유도에 대한 약리학 적 조작의 영향을 조사하는 데 사용되었습니다5. 우리의 연구에서, 식염수 또는 CSF- 처리 된 대조군은 파트너 선호도를 개발하지 않았지만, NaB 또는 TSA로 처리 된 여성 프레리 밭은 않았다. NaB 나 TSA가 전체 운동에 영향을 미치지 않았기 때문에 파트너 선호도에 미치는 영향은 운동에 대한 이차 효과보다는 행동에 특정한 것으로 보입니다. TSA의 이러한 특정 효과는 분자 관찰에 의해 추가로 확인되었다. 실제로는 관리되지만 icv, 우리는 NAcc에서 유전자 발현의 특정 변경을 검출 할 수 있었지만, 인접 구조 인 미끼 퍼터에서는 그렇지 않았다. 또한, NAcc 내에서도 D1R 및 D2R mRNA 및 단백질 수준은 영향을받지 않았다. 이러한 특이성은 클래스 I 및 II HDAC 모두에 영향을 미치는 TSA와 같은 광범위한 HDAC 억제제에 대해 놀라운 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, TSA는 포유 동물 게놈에서 단지 작은 유전자 서브 세트의 발현에 영향을 미치는 것으로보고되었다30-32마우스를 포함하여20.
여기서 Lys3에서 히스톤 H14의 아세틸 화가 oxtr 프로모터, 뇌 가소성 동안을 포함하여 향상된 유전자 전사와 관련된 변형33, 34, 더 높은 OTR mRNA 및 단백질 수준을 강조한다. TSA에 대한 반응으로 oxtr 프로모터는 인간 세포주에서 그의 전사의 활성화를 증가시키고 촉진시킨다22, 우리의 발견을지지 oxtr 후생 적으로 조절 될 수 있습니다. NAcc에서 OTR의 국소 봉쇄는 TSA의 행동 효과를 방지하기에 충분했기 때문에, 본 데이터는 동거 동안 NAcc에서 OTR의 TSA- 유도 된 발현이 파트너 선호도 형성의 촉진을 매개한다는 것을 시사한다. 또한, 암컷 프레리 밭에서 파트너 선호도를 확실하게 유도하는 것으로 알려진 절차 인 교배와의 24 시간 동거는 암컷 NAcc에서 OTR 발현의 유사한 증가를 유도했습니다. 이것은 여성 밭에서 파트너 선호 형성의 신경 생물학에서 옥시토신과 그 수용체의 알려진 관여와 완전히 일치한다. 교배는 NAcc에서 세포 외 옥시토신 수준의 증가를 유도합니다25, 및 옥시토신의 NAcc 내로의 국소 주입은 정합이 없을 때 파트너 선호도 형성을 용이하게한다8. 또한, OTR 길항제는 옥시토신 투여 또는 교배에 의해 유도 된 파트너 선호도 형성을 차단한다8, 35. 중요하게는, 암컷 NAcc에서 OTR의 바이러스-매개 과발현은 파트너 선호도 형성을 촉진하기에 충분하다12, 13.
OTR의 역할을 강화하는 것 외에도, 본 발명의 결과는 짝짓기없이 남성과 동거하는 동안 후성 유전 적 메카니즘을 통해 OTR 유전자 발현의 활성화에 대한 증거를 제공한다. 실제로, 파트너 선호를 유도하기에는 불충분하지만, 짧은 시간 동안 교배하지 않는 그러한 동거는 파트너 선호도 형성의 기초가되는 신경 생물학적 과정을 활성화시킨다. 예를 들어, 수컷에 대한 2 시간의 자유 노출은 암컷 NAcc에서 옥시토신 방출에서 약간이지만 유의하지 않은 상승을 유도합니다.25. 그러므로 TSA 또는 NaB는 남성과 동거에 의해 유도 된 신경 적응을 강화시켜 파트너 선호도의 발달을 촉진시키는 것으로 제안 될 수있다. 흥미롭게도, 그러한 강화는 NaB 및 TSA를 포함하여 클래스 I 및 II HDAC 억제제가 대조군 동물에서 장기 기억 형성을 초래하지 않는 학습 이벤트의 통합을 용이하게하는 설치류에서 이미보고되었다36, 37. 이 개념을 지원하기 위해 더 긴 기간의 동거예., 48hours)는 짝이없는 경우에도 파트너의 선호를 유도 할 수 있습니다.4. 교배와의 동거는 여성 NAcc에서 TSA 처리와 동거 후 관찰 된 것과 동일한 후 성적 메커니즘을 통해 OTR 및 V1aR 발현의 상향 조절을 유발했으며, 이는 TSA와 교배가 동일한 경로에 영향을 미침 파트너 선호도 형성. 중요하게도, TSA는 수컷과의 동거가없는 경우 암컷 NAcc에서 OTR 및 V1aR의 상향 조절을 유도하지 않는다. 전체적으로, 이것은 TSA가 이들 또는 상이한 신경 적응을 자체적으로 활성화시키는 것이 아니라 수컷과의 동거에 의해 자연적으로 유발되는 내인성 신경 적응의 강화를 통해 파트너 선호도의 형성을 촉진한다는 가설을지지한다.
Our 연구는 또한 TSA- 처리 된 동물이 더 높은 V1aR 수준을 나타 내기 때문에 TSA- 촉진 된 파트너 선호도 형성을 방해하는 여성의 파트너 선호도 형성에서 NAcc V1aR의 중요한 역할을 강조한다. 또한, 이러한 효과는 높은 히스톤 아세틸 화와 관련이 있었다. avpr1a 최적이 아닌 시점으로 인해 V1aR mRNA의 유의 한 상승이 없었음에도 불구하고 프로모터. 비 히스톤 단백질의 아세틸 화를 통해 TSA에 의한 단백질 안정성의 규제를 배제 할 수는 없지만38이 결과는 oxtr 발기인, TSA는 avpr1a 국소 히스톤 아세틸 화를 통한 전사. 남성의 페어 본딩에서 AVP의 기여는 설명되었지만5여성의 행동에서 그 역할은 여전히 논란의 여지가있다. 한편으로는 icv. AVP 주사는 수컷과 암컷 모두에서 파트너 선호도 형성을 용이하게하며, 이는 V1aR 또는 OTR의 차단으로 방지됩니다39. 반면에 icv. V1aR 길항제의 주사는 수컷에서 짝짓기 유발 파트너 선호도를 차단하지만 암컷, 프레리 es에서는 그렇지 않습니다40. 그러나 이러한 모든 연구는 icv. 주입, 관련 구조에 대한 추가 통찰력을 방지합니다. 여기, 우리는 NAcc 내 AVP neurotransmission 여성 밭에 파트너 선호 형성에 관련 될 수있는 첫 번째 증거를 제공하는 반면 대부분의 문헌은 복 부 pallidum, 측면 격 막, 침대 핵과 같은 다른 영역에서의 관련 설명 남성의 선조 종말 기 및 편도5. 따라서 암컷 NAcc에서 OTR 또는 V1aR의 봉쇄는 TSA 처리 후 파트너 선호도 형성을 방지하기에 충분하여 파트너 선호도 형성이 V1aR과 OTR 모두의 활성화를 필요로 함을 시사합니다.. 티그의 발견은 남성 프레리의 초기 관찰에 부합하고 LS에서 OTR과 V1aR에 동시에 액세스하는 것이 AVP- 유도 파트너 선호에 필수적이라는 것을 뒷받침한다6. 더욱이, TSA- 처리 된 동물에서 OTR 및 V1aR 수준 둘 다에서의 특이 적 증가의 관찰은 쌍 결합을위한 AVP 및 옥시토신 신경 전달의 동시 활성화 요구를 추가로지지한다.
옥시토신 및 AVP와 함께, NAcc의 도파민 신경 전달은 암컷 웅덩이에서 파트너 선호도 형성을 조절한다9. 짝짓기는 NAcc에서 도파민 방출을 유도하지만9, 결합 수준의 유지에 중요한 결합과 동종의 동종의 24h보다 긴 기간 후에 만 수용체 수준의 변화가 관찰 됨10. 이러한 관찰에 따라, TSA로 처리 된 암컷 프레리 밭은 도파민 D1R 및 D2R 수용체에서 유의 한 변화없이 파트너 선호도를 나타냈다. 따라서, 이러한 도파민 수용체 조절의 부재는 TSA의 특이성에 대한 또 다른 증거를 제공한다.
우리의 데이터는 처음으로 페어 본딩의 신경 생물학에서 후성 유전 적 성분을보고하고, TSA가 여성 프레리 밭에서“허용 상태”를 유도하여 동거에 대한 자연 분자 반응을 강화하고 더 강한 사회적 상호 작용의 형성을 촉진한다고 제안한다 파트너 선호도. 따라서 TSA 촉진 파트너 선호도가 더욱 강화 될 수 있으며 지속적인 유대 관계로 이어질 수 있다는 가설을 세우고 자합니다. 관련된 특정 HDAC가 확인 된 상태로 남아 있지만, 선택적 침략 및 양부모 보호와 같은 대초원의 일부일처 생활 전략과 관련된 다른 행동에 대한 TSA의 영향을 추가로 조사하는 것은 흥미로울 것입니다. 인간에서 쌍 결합의 신경 생물학적 메커니즘을 모델링 할 때 프레리 밭의 관련성을 고려5임상 시험에서 이미 유망한 HDAC 억제제24, 41, 42우리의 데이터는 새로운 약리학 적 가능성이 사회적 행동에 영향을 미칠 수있는 길을 열어줍니다.
행동 양식
주제
성적으로 순진한 여성 프레리 들쥐 (Microtus ochrogaster) 실험실 번식 식민지에서 21 일에 젖을 짜고 물과 음식을 제공하는 플라스틱 케이지 (12 × 28 × 16 cm)에 동성 형제 쌍으로 수용 광고 무제한. 모든 케이지는 14 : 10 h 명암 주기로 유지되었고 온도는 대략 20 ° C였다. 모든 동물은 70-90 일에 도달했을 때 실험군에 무작위로 배정되었습니다. 사용 된 동물의 수는 우리 그룹과 다른 사람들의 이전 연구를 기반으로 한 전력 분석과 함께 사용되었습니다. 실험 절차는 플로리다 주립 대학교의 동물 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
약물
식염수에 용해 된 나트륨 부티레이트 (NaB) 및 인공 뇌척수액 캐리어 (CSF, BioFluids, MD, Rockville, MD)에 용해 된 Trichostatin A (TSA)는 둘 다 Sigma-Aldrich (미국 미주리 주 세인트루이스)에서 구매했습니다. NaB를 복강 내 주사 하였다 (ip) 600 mg / kg의 용량에서, 이는 마우스의 몇몇 뇌 구조에서 히스톤 아세틸 화를 유도하는 것으로 알려져있다43, 44. 유사하게, TSA에 사용 된 용량-범위는 설치류에서 국소 히스톤 아세틸 화 사건 및 유전자 발현의 변이를 유도하는 데있어서의 효과를 결정하는 이전 연구에 기초 하였다19, 20. 선택적 V1aR 수용체 길항제 V1aRA, d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP 및 OTR 길항제 OTA (B), [d(CH2)5, 티르 (Me)2, Thr4Tyr-NH29] -OVT)는 Bachem (Torrance, CA)로부터 입수 하였다. 두 번째,보다 선택적 OTR 길항제, OTA (T), d글리 NH2-d(CH2)5 [티르 (나)2, Thr4] OVT45, 모리스 매닝 박사 (OH, 톨레도 대학)가 친절하게 제공했습니다. 사용 된 이들 길항제 및 용량은 각각 V1aR 또는 OTR에 대한 그들의 선택성을 입증하는 이전 연구에 기초하여 선택되었다35, 39, 46-49.
입체 세관 및 미세 주사
암컷은 나트륨 펜 토바 비탈 (1mg / 10g 체중)로 마취되었고, 26 게이지 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼라 (Plastics One, Roanoke, VA)는 측면 심실을 목표로 입체적으로 이식되었습니다 (일방적으로; -2.5 mm의 코 바, 0.6 mm). 주둥이, 1.0 mm 측면 및 2.6 mm 복부에서 bregma로) 또는 특정 부위에 NAcc (양쪽으로 : -2.5 mm에서 코 바, 1.7 mm rostral, ± 1.0 mm 양측 및 4.5 mm 복부에서 bregma). 3 일의 회복 후, 대상체는 상이한 농도의 TSA를 함유하는 CSF 또는 CSF의 미세 주사를 받았다. OTR 또는 V1aR에 대한 선택적 길항제가 사용 된 경우, 이들은 TSA 전에 30 분에 주사되었다. 33 게이지 바늘을 사용하여 1 mm를 가이드 영역 아래로 확장하고 500 nL을 측면 뇌실로 주입합니다 (XNUMX mm).icv.) 또는 NAcc의 측면 당 200 nL입니다. 바늘을 폴리에틸렌 -20 튜브를 통해 해밀턴 주사기 (Hamilton, Reno, NV)에 연결하고 플런저 우울증을 천천히 수행하여 주 사당 1 분이 필요했습니다. 실험의 끝에서, 모든 대상체는 빠른 탈포에 의해 희생되었고 뇌는 추출되어 실험 조건에 대한 관찰자 블라인드에 의한 캐뉼라 배치를 확인 하였다. 캐뉼라를 잘못 놓은 피험자는 데이터 분석에서 제외되었습니다.
동거 및 파트너 선호도 테스트
팔로 잉 ip., icv, 또는 약물의 NACC 내 주사에서 암컷은 짝짓기없이 6 시간 동안 수컷과 동거되었다. 짝짓기의 부재는 비디오 녹화 된 행동을 검사하여 확인되었습니다. 짝짓기, 에스트로겐-프라임 된 암컷과의 동거에 의해 유발 된 신경 적응에 대한 조사를 위해 (하루에 2µg, ip., 3 일 동안)는 6 또는 24 시간 동안 수컷과 함께 거주하며 교배의 존재가 확인되었습니다. 귀납적으로 비디오 테이프에서 (첫 번째 6 동거 시간 동안 11에서 6까지).
파트너 선호도 테스트는 앞에서 설명한 6 시간 동거 직후에 수행되었습니다.11. 간단히 말해서, 3 챔버 테스트 장치는 두 개의 평행 한 동일한 케이지에 연결된 중립 케이지로 구성되었으며, 각 케이지에는 자극 동물 (동거 기간 동안 사용되는 익숙하지 않은 수컷 "이방자"또는 친숙한 수컷 "파트너")이 들어 있습니다. 암컷 피험자는 XNUMX 시간 동안 장치 전체를 자유롭게 움직일 수 있었고, 자극 수컷은 케이지 안에 묶여 서로 직접 접촉 할 수 없었습니다. 전체 세션을 녹화하고 대상이 파트너 또는 낯선 사람과 나란히 접촉하는 시간을 나중에 생물학적 그룹을 알지 못하는 훈련 된 실험자가 정량화했습니다. 파트너 선호도는 쌍을 이루는 양 꼬리에 의해 결정된 바와 같이 낯선 사람에 비해 파트너와 신체 접촉에 훨씬 더 많은 시간을 보내는 피험자로 정의되었습니다. t-테스트. 또한, 3 개의 챔버 장치에는 포토 빔 센서가 장착되어, 암실이 자극 챔버 내로 유입되는 횟수에 의해 표시된 운동 활동의 결정을 허용한다. 이 운동 점수는 따라서 우리 그룹과 다른 사람들이 일반적으로 사용하는 일반적인 활동, 불안 또는 새로운 환경의 변형 된 탐색과 같은 여성의 행동에 대한 약물의 추정적인 이차 효과를 제어 할 수 있습니다.12.
RNA 및 단백질 추출
암컷은 빠른 탈포에 의해 희생되었고, 뇌는 즉시 드라이 아이스에서 추출되어 얼었다. 관상 절편 (200 µm)을 극저온에서 절단하고 현미경 슬라이드에 서리를 설치했습니다. 1 mm 직경을 갖는 양측 조직 펀치를 전체 NAcc 및 꼬리 부 두부에서 채취하였고, 후자는 제어 영역이고, 처리 될 때까지 -80 ℃에 보관 하였다. 총 RNA 및 단백질은 제조사의 지시 (오하이오 주 신시내티 소재의 몰레 큘라 리서치 센터)에 따라 TRI- 시약 프로토콜을 사용하여 추출되었다.
웨스턴 블롯에 의한 단백질 발현 분석
10 % 폴리 아크릴 아미드 겔 (히스톤의 경우 15 %)에서 분리 한 후, 단백질을 니트로 셀룰로스 막으로 옮기고 다음의 1 차 항체와 항온 처리 하였다 : 항 -OTR (sc-8102, 1 : 1000), -V1aR (sc-18096, 1 : 500), -D1R (sc-33660, 1 : 1000), -D2R (sc-9113, 1 : 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -actin (A2066, 1 : 1000, 시그마 알드리치. 세인트 루이스, MO) 또는 안티 아세틸 히스톤 H3 (Lys14, # 06-911, 1 : 1000) 및 총 H3 (# 05–928, 1 : 1000, Millipore, Temecula, CA). 모든 항체는 인간, 랫트 및 마우스에서의 사용에 대해 검증되었으며, 프레리 밭은 높은 비율의 상 동성을 공유한다 (81에서 96 %까지). HRP- 접합 된 이차 항체와의 혼성화 후, 막은 ECL (ECL SuperSignal West Dura 기질, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL)로 밝혀지고 Fuji XAR 필름 (Fuji Film, Tokyo, Japan)에 노출되었다. AIS 6.0 이미지 소프트웨어 (Imaging Research, St. Catharines, Canada, Ontario, Canada)를 사용하여 정량을 수행하였고, 총 히스톤 H3 신호로 정규화 된 아세틸 -H3 신호를 제외하고 모든 신호를 동일한 막 내에서 액틴으로 정규화 하였다. 정규화 된 데이터는 CSF 처리 동물의 백분율로 표시됩니다.
반 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)
총 RNA의 0.5 ㎍을 상보 적 DNA 합성을 위해 처리 한 후, 전술 한 바와 같이 분석50 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 디 하이드로게나 제 (NADH) 유전자에 대한 정규화. 모든 반응은 3 회 반복되었고, 2 % 아가 로스 겔상에서의 용융 곡선 분석 및 분리에 의해 그의 특이성이 확인되었다. 사용 된 프라이머 서열은 다음과 같았다 : 5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3 '(Fwd) 및 5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3'(Rev), OTR의 경우, 5'-GAGGTGAACAATGGCACTAAAACC-3 '(AGMAGATGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGAGGAG AVP5aR, 3'-TTAACAACAATGGGGCTCTTGTG-1 '(For) 및 5'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-3'(Rev)의 경우 D5R, 3'-GTGAAGGGGGGGGAGAGGAC-1'RexgGGTMGTMGTMGTMGTMGTM ), D5R의 경우 3'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-5 '(For) 및 3'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-2'(Rev)는 NADH입니다. 정규화 된 데이터는 CSF- 처리 된 동물의 백분율로 표현된다.
크로 마틴 면역 석출
NAcc 및 우 두부 퍼터 멘 조직 펀치에서의 히스톤 H3 아세틸 화 (Lys14)는 제조사의 지시에 따라 Magna ChIP 단백질 G 조직 키트 (Millipore, Temecula, CA)를 사용하여 분석 하였다. 간단히 말하면, 1 % 포름 알데히드와의 가교 후, Misonix XL-2000를 사용하여 200-600 bp의 단편으로 염색질을 전단시켰다. 아세틸 화 된 히스톤 H3 (Lys14)의 면역 침강은 10 ℃에서 밤새 3㎍의 항 아세틸 -H14 (Lys4) 항체 (밀리 포어)로 실현되었다. 세척 후, 비드로부터의 용출 및 가교의 역전 후, 면역 침전 된 DNA를 정제하고 풀링 된 INPUT 샘플로부터 제조 된 내부 표준 곡선을 이용하여 iCycler 플랫폼 (상기 참조)에서 RT-PCR에 의해 3 회 반복 분석 하였다. 프라이머는 프레리 볼 OTR에 대한 첫 번째 엑손 코딩의 236 bp 상류에 위치한 128 bp- 길이 영역을 증폭 시키도록 설계되었다 (oxtr, Genbank 수탁 번호AF079980) 또는 프레리 볼 V192aR에 대한 첫 번째 엑손 코딩의 업스트림 141 bp 업스트림에 위치한 1 bp- 길이 영역 (avpr1a, Genbank 수탁 번호AF069304). 서열은 다음과 같았다 : 5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3 '(Fwd) 및 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGGGGGG-3'(Rev) oxtr및 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3 '(Fwd) 및 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3'(Rev) avpr1a. 각각의 샘플은 각각의 입력 값에 의해 정규화되고,이어서 데이터는 CSF- 처리 된 동물의 백분율로 표현된다.
통계 분석 및 데이터 처리
파트너 선호도의 분석을 위해, 동거 기간 동안 또는 잘못 배치 된 캐뉼라와 짝짓기 행동을 보이는 동물은 제외되었습니다. 다른 모든 분자 분석의 경우 이상치로 식별 된 경우 생물학적 그룹당 최대 하나의 데이터 포인트가 제외되었습니다. 결과가 매우 분명한 경우를 제외하고 대부분의 실험이 복제되었습니다. 파트너 선호도 테스트 동안 자극 동물과 나란히 접촉하는 데 소요 된 시간을 쌍 꼬리 쌍으로 분석했습니다. t-테스트. 운동 점수는 양측 꼬리를 사용하여 분석되었다 t-테스트 (두 그룹의 경우) 또는 일원 분산 분석 (두 그룹 이상의 경우) 및 적절한 경우 Fischer의 PLSD 포스트 - 혹 테스트는 유의 임계 값으로 수행되었습니다. P <0.05. 정규성을 확인한 후 다른 모든 데이터는 양측 t-균일 또는 비 균일 분산이 사전에 테스트되었다고 가정합니다. 모든 통계 분석은 StatView 소프트웨어 (SAS Institute)를 사용하여 수행되었습니다. 데이터가 각각의 대조군 (CSF, 식염수 또는 짝짓기 그룹의 %)으로 표준화 될 때, 원시 데이터에 대한 통계 분석이 수행되었다.
감사의
이 연구는 국립 정신 건강 연구소 (NIMH)의 지원으로 MK와 ZW에 MHR21-083128를, ZW에 MHR01-058616를 부여했습니다. 또한 OTR 길항제 OTA (T)의 관대 한 선물에 대해 Dr. Maurice Manning에게 감사드립니다.
각주
이해 상충 : 저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.
작성자 기여
HW, FD 및 YL이 실험을 수행했습니다. HW와 FD가 데이터를 분석했습니다. HW, FD, ZW 및 MK가 연구를 설계했습니다. FD, ZW 및 MK가 논문을 작성했습니다. 모든 저자는 결과에 대해 토론하고 원고에 대해 논평했습니다.
참고자료
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