Cdk5 Phosphorylates тинейджер D2 Receptor жана коколой башы ылдый белги (2013)

Комментарийлер: Cdk5 допамин D2 рецепторлорунун төмөн жөнгө салуусуна алып келерин көрсөтүү үчүн пайда болду. Таң калыштуусу, котормо фактору deltafosb Cdk5 өндүрүшүн шарттайт. Төмөнкү сызык Deltafosb сенсибилизацияда жана сезгичтиктен ажыратууда чоң роль ойнойт

Жонг J, Park YU, Ким DK Ли S, Kwak Y, жана башкалар. (2013) PLoS ONE 8 (12): e84482. чтыкта: 10.1371 / journal.pone.0084482

жалпылаган

тинейджер D2 кабылдагыч (DRD2) мындай маанай, сыйлык жана сезим катары тинейджер байланышкан мээнин иштеши ортомчулук негизги сезгич болуп саналат. Cyclin көз каранды Креатинкиназа 5 (Cdk5) бир Каунсил-багытталган серин / threonine Креатинкиназа Анын милдети мээнин сыйлык схемасында катышкан деп эсептелет. Бул макалада болсо серин 321 калган (S321) DRD2 (D2i3) үчүнчү клеткадагы илмегинде Cdk5 бир роман ченемдик сайт экенин ачып берген. D5i321 жылы S2 боюнча Cdk3 көз каранды phosphorylation байкалган экстракорпоралдык жана клетка маданият системалары.

Биз мындан ары S321 боюнча phosphorylation DRD2 боюнча agonist-сигнал үстүндөгү сөздөр начар жана DRD2 үчүн G белок кошкуч төмөндөө байкалган. Мындан тышкары, суунун ылдый жагындагы Кэмп жолду улам DRD35 кыскарта Тоскоол болуучу иш, сыягы, окшошпогон системасы жана p2 нокаут түйүлдүктөрүн баштапкы нейрондордун маданияттарда да таасир эткен. Бул жыйынтыктар боюнча S5 Cdk321-арачылыгы phosphorylation тинейджер жылдырыш үчүн бир көркөм кара сөз чыгармасына киреби жөнгө салуу механизмин камсыз кылуу, DRD2 милдетин тоскоол болуп турат.

Figures

12

шилтеме: Жонг J, Park YU, Ким DK Ли S, Kwak Y, жана башкалар. (2013) Cdk5 Phosphorylates тинейджер D2 Receptor жана ылдый билдиребиз ошондой але. PLoS БИР 8 (12): e84482. чтыкта: 10.1371 / journal.pone.0084482

редактор: Джеймс Портер, Түндүк Дакота University, Америка Кошмо Штаттары

кабыл алынган: 20 берсин, 2013; кабыл алынган: November 14, 2013; Жарыяланган: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Жонг ж.б.. Бул шарттарда бөлүштүрүлөт ачык-мүмкүндүк макала Creative Commons Attribution License, Ар кандай каражаттар менен чектөөсүз пайдалануу, жайылтуу жана кайра жол турган, баштапкы жазуучу жана булагы түшөт каралган.

Каржылоо: Бул иш гранттардын тарабынан колдоого алынды (NRF-2012R1A2A2A01012923 жана NRF-2012R1A4A1028200) корей өкмөтү (MSIP), жана ошондой эле Корея NRF башкарган эл аралык кызматташтык боюнча программанын алкагында колдоого алынган (2012K2A1A2033117) жана Корея Brain изилдөө институту (KBRI) MSIP негизги изилдөө программасы (2031-415). SKP 2004 жана 2006 Улуттук шаблон жана депрессия (NARSAD) Жаш тергөөчү Awards изилдөө союз бир болду. бюросу изилдөө долбоорлоо, маалыматтарды топтоо жана талдоо, жарыялоо жөнүндө чечим, же кол жазма даярдоодо эч кандай тиешеси болгон эмес.

кызыкчылыктарын атаандашууда: Жазуучулар жок атаандаш кызыкчылык бар деп жарыялашкан.

тааныштыруу

Тинейджер белги ар кандай мээ иш-милдеттерин, анын ичинде мотор макулдашуу, маанай контролдоо жана сыйлык механизмдерин катышып жатат [1]. Омурткалуу жаныбарлардын ичинде тинейджер сигналдаштыруунун негизги компоненти striatal орто бадал нейрон (MSNs) тандап тинейджер кабылдагыч тобун билдирүүгө жана негизинен ventral tegmental райондун dopaminergic салымын кабыл алуу менен аракет (VTA) жана substantia Nigra (SN) [2]. Тинейджер кабылдагычтар жети transmembrane домендерге G белок акыр кабылдагычтар (GPCR) болуп саналат жана эки чакан турат, тинейджер сигналдаштыруунун менен өз ара иш-аракеттерди ортомчу D1 сыяктуу жана D2 сыяктуу кабылдагычтар, [1]. Мисалы, тинейджер D1 сыяктуу кабылдагычтар (D1, D5) G аркылуу adenylyl cyclase жандантуугаαs станды клеткадагы жогорулатуу, бирок тинейджер D2 сыяктуу кабылдагычтар (D2, D3, D4) G аркылуу adenylyl cyclase үгүттөөαi , конуштун клеткадагы денгээлин төмөндөтүү [1], [3].

тинейджер кабылдагыч арасында D2 кабылдагыч (DRD2) шаблон жана наркомания ооруулары, анын ичинде бир нече ири психикалык оорулардын, остеохондроздун, аткыланды [4]Көптөгөн сайуулардын дары жок дегенде жарым-жартылай DRD2 максат ушундай. Ошондой эле бул иш-DRD2 мал моделдер кыянаттык менен дары-турумдук кесепеттери менен жакшы байланышта экени белгилүү болду [5]. Депрессияга жана маанай салгычтар натыйжалуулугун да айымдарга, ЭрК жана GSK2 арачылык DRD3 же ылдый клеткадагы сигналдаштыруунун клетка бетиндеги сөз өзгөрүүгө байланыштуу болду [1], [4], [6]. Мээнин ичинде DRD2 үчүн бул маанилүү ролун карабастан, DRD2 касиеттери эместигин жана татаалдыгын ыйгарат толук жөнгө салуу механизмдери толук түшүнүшкөн эмес.

далилдерди жакындашуусу саптары нече posttranslational өзгөртүүлөр DRD2 ишин кылдат бир жөнгө салуу менен алектенген жатканын көрсөтүп турат. DRD2 көп glycosylation эрте сурот туугандык этикеткалоо изилдөө түшүрүлгөн [7]Жана DRD2 ичинде disulfide байланыш түзүү, ошондой эле милдеттүү түрдө ligand үчүн маанилүү өзгөртүүлөрдү катары аныкталган [8]. Мындан тышкары, тарабынан DRD2 боюнча phosphorylation сайттары башында аныкталды экстракорпоралдык ар кандай kinases ортомчулугу аркасында ар кандай укуктук жолдор менен камсыз кылуу жолдору, Radioisotopes менен пробирдик [9]. Чынында эле, белок Креатинкиназа C (PKC) клеткадагы тт DRD2-арачылыгы тартууга жөнгө салат жана клетканын скелетинин белоктор менен DRD2 өз ара modulates [10]. GPCR Креатинкиназа 2 тарабынан Phosphorylation (GRK2) DRD2 боюнча agonist айынан resensitization үлгүлөрүн жөнгө салат [11].

Cyclin көз каранды Креатинкиназа 5 (Cdk5) улам, анын маанилүү жандандыргандан мээ-айкын билдирүүгө артыкчылыктуу иш бар Каунсил-багытталган серин / threonine Креатинкиназа болуп саналат p35 жана p39 [12]. Cdk5 нейрондордун кыймыл-мигранттардын жана аксон жетекчилик, анын ичинде ар кандай нейрондордун салууда катышып жатат, жана Cdk5 жана p35 күчүн чычкандар кабык катмарлардын кемчиликтерди көрсөтүп [13]. Жакында эле ал WAVE1 ошол phosphorylation көрсөтүп жана Cdk5 тарабынан ephexin болгон dendritic омурткасы жасалышы жөнгө салат [14]. Мындан тышкары, Cdk5 ошондой эле жер үстүндөгү NMDA кабылдагычы билдирүү көлөмүн, NR2B жана NR2A-кыйыр NMDA агымдар жөнгө салат [15], [16]. Бул далилдердин бир нече даана Cdk5 жана тинейджер системасынын ортосундагы ынак мамиледе сунуш экендигин белгилей кетүү керек. Cdk5 тирозин гидроксилаз phosphorylates (TH), анын туруктуулугун жөнгө салуу, жана натыйжада dopaminergic гомеостаз сактоо [17]. Жылы postsynaptic нейрондор, качан T75 тинейджер жана туруучу-AMP жөнгө белок-32kD калган (DARPP-32) Cdk5 тарабынан phosphorylated, ал эми айымдарга ишин жана натыйжада тинейджер DRD1-кыйыр айымдарга белги төбөлдөр жайлатуучу болот [18]. Кызыктуусу, кокаин, тинейджер кабылдагыч кыйыр agonist, орто бадал нейрондордо келемиш, РНК жана Cdk5 көбөйтүү белок баскычтарда өнөкөт башкарылып турганда [19]. Жалпысынан, Cdk5 дары-азгырган кичинекей кайра жасоого тартылган окшойт. Бул сабакта, биз мындан ары тинейджер сигналдаштыруунун жылы Cdk2 ролун жайылтылат DRD5 жана Cdk5 бир иш өз ара көрсөтөт.

Материалдар жана ыкмалар

Антителолор

Анти-коен кан DRD321 (D321i2) үчүнчү клеткадагы курс phospho-серин 2 (pS3) камтыган пептиддердин каршы көтөрүлдү. Phospho-пептиддик, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), санаалаштардын тазалануу (20401, PIERCE) үчүн пептиддик-жактагы мамычаны үчүн колдонулган. Анти-pS321 антитело өндүрүүчүнүн тапшырмасы кийинки бир туугандык тазалоо системасы менен байытылды. Тазаланган phospho-антитело 0.1% натрий azide жана 0.1% желатин менен PBS сакталган. Анти-чычкан каршы Cdk5 антитело (СК-249) жана анти-коен каршы p35 антитело (СК-820) Cdk5 / p35 Батыш өчүрөм жана иммуно-гистохимиялык үчүн пайдаланылган. Анти-чычкан каршы ачкан антитело (СК-9996) DRD2-орунга илинди менен immunoprecipitation жана Батыш өчүрөм үчүн колдонулган. Анти-коен каршы FLAG антитело (СК-807), анти-коёндорго каршы HA антитело (СК-805), анти-чычкан каршы GST антитело (СК-138) жана анти-чычкан каршы GAPDH антитело (sc- 32293) Санта-Крус-биотехнологий сатылып алынган.

жаныбарлар

p35 нокаут чычкан Японияда RIKEN Brain илимий институтунун доктор Katsuhiko Mikoshiba бир боорукер белеги болгон жана алгачкы нейрон маданият үчүн колдонулат. genotyping үчүн Primer топтому мурда айтылгандай 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC жана 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT болду [20]. ICR чычкандар жана Спрэг Dawley чычкандар мээ lysate даярдоо үчүн пайдаланылган. Бардык мал-жоболору Илим жана технология Институттук Animal сактоо жана пайдалануу боюнча комитетинин Пхохан University тарабынан бекитилген.

плазмиддердин Constructs

бир адам DRD2 узак isoform EGFP-N1 плазмиддердин багытына жана DRD2 үчүнчү клеткадагы луп (212-373 аминокислоталарды, анын ичинде 29 кошумча аминокислоталарды узак isoform DRD2 кайталангыс) бир pFLAG-CMV-2 плазмиддердин багытка пайдалануу болгон. Адам Cdk5 бир pCMV-HA плазмиддердин багытка орнотулушу жана адам p35 бир pcDNA 3.1 плазмиддердин багытка киргизилген болчу. Адам Cdk5 бир cytomegalovirus (CMV): иммуно-гистохимиялык үчүн кош сөздөр куруу үчүн бир pcDNA 35 багытка адам p3.1 (Cdk5 / p35) менен бирге колдоочусу астына эле сезгич internalization тамганы, [35S] -GTPγS милдеттүү аспаптык, radioligand милдеттүү пробасы жана САМР энзим immunoassay.

Менин суроом Креатинкиназа тамганы

IP-шилтемеленген экстракорпоралдык Креатинкиназа сыноочу төмөндөгүдөй аткарылган. Бир бүт чычкан мээ 3 мл lysis чекти сорушат (ELB) (50 мм Tris (рН 8.0), 250 MM NaCl, 5 MM EDTA, 0.1% NP-40) бир Dounce homogenizer боюнча 20 соккулары менен гомогендүү мээ lysates алуу үчүн lysed болду . lysates 30 мин үчүн муз инкубатордо sonicated жана 16,000 × боюнча ийбөө алынган g 10 мүн. supernatants жигердүү Cdk35 / p5 комплексин алууга каршы p35 каршы коен греч immunoprecipitated алынган. Cdk5 / p35 татаал жана тазаланган GST биригүү белок аденозин 5'-triposphate менен аралашып эле, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) жана Креатинкиназа туруучу (30 мм HEPES (рН 7.2) менен инкубатордо, 10 MM MgCl2, 0.2 мм DTT) бөлмө температурасында 1 ч үчүн [18], [21]. Purified Cdk5 / p25 татаал (14-516, Millipore) үчүн да колдонулган экстракорпоралдык Жогоруда сүрөттөлгөн Креатинкиназа пробирдик эле. үлгү жүктөө Санитардык × 2 жооп аралашма кошулуп жана 100 ° С бышырылса. андан кийин SDS-БЕТ дуушар жана кургатылган гел autoradiography тарабынан бааланган эмес.

Суюк (LC) -жмк спектроскопия (MS) / MS талдоо

рекомбинанттык GST-D2i3 белок LC-MS / магистр төмөнкүдөй анализ эле IP-шилтемеленген экстракорпоралдык Креатинкиназа сыноочу. Биз LC-MS / MS маалыматтар X !! Булбылым колдонуу (версия Dec-01-2008) менен пептиддик аныктоо жүргүзүлөт. Ар бир RAW берилмелер алгачкы транс-proteomic куурунун пайдалануу mzXML динин кабыл алган (ЖЭБин; версия 4.3). MS / MS өзгөртөсүзбү mzXMLs менен Скандоолордун анда X UniProt чычкан белок катар маалымат базасы (релиз 2010_07), анын ичинде GST-D2i3 кезек менен каршы издөө кабылган !! Тандем. сабырдуулук 3 Дарийдин үчүн прекурсорлордун иондору жана 2 Дарийдин үчүн үзүндүсү иондору баштаган. трипсин үчүн энзим өзгөчөлүгү колдонулган. Өзгөрмө өзгөртүү параметрлери Cysteine ​​боюнча carbamidomethylation (57.021 Да) ишке ашыруу үчүн колдонулган, тирозин кычкылдануу (15.995 Да), аспарагин гидролизи (0.987 Да) жана, аланин жана phosphorylation (79.966 Да).

Immunoprecipitation

Immunoprecipitation ELB lysis туруучу клетка lysates жүргүзүлгөн. Анти-орунга илинди антитело lysates кошулуп, 3 ° С 4 ч үчүн инкубатор болгон. Immunocomplexes белок-A агароза менен тазаланышты. бууланган 30 ° С 37 мүн SDS үлгү жүктөө туруучу менен инкубатор, ошондой эле SDS-БЕТ жана Батыш өчүрөм дуушар.

GST Хэйруллина-ылдый тамганы

тазаланган GST жана GST-D10i2 боюнча 3 мкг 1.5 ° С 4 ч үчүн чычкан мээ lysate менен инкубатордо болгон. glutathione боюнча 30 μL (усулдук) Sepharose 4B бусы (17-0756-01, GE Саламаттыкты сактоо) lysis туруучу менен equilibrated кошо жана кошумча 1 ч үчүн инкубатор болгон -conjugated. Beads 2,000 × боюнча экстрагирлөө менен чогултулганg жана lysis туруучу 4 жолу жууш [22], [23]. Бөлүнүп каршы Cdk5 жана анти-p35 антителолорду колдонуп Батыш өчүрөм текшерилген.

иммуно-гистохимиялык

Transfected Кирилла 293 клеткалары жана striatal нейрондор coverslips боюнча маданияттуу кездешүүчү түрдөгү какырыкты (PBS) менен бир жолу жууп, муздак 4% paraformaldehyde сууга белгиленген / PBS 30 мүн. Негизги антитело тосмолоо чечүү (PBS жылы Triton X-2 1% жылкы кан жана 100%) менен аралаштырып келген. Alexafluor-647-жактагы анти-чычкан антитело (A20990, Invitrogen) жана Alexafluor-568-жактагы каршы коен антитело (A11011, Invitrogen) орто антитело сыяктуу колдонулду. Hoechst ядро ​​бойоктор үчүн пайдаланылган. Images confocal микроскопту (чокудагы болуп, FluoView-1000) тарабынан алынган.

Receptor Internalization тамганы

transfection кийин 24 ч, клеткалар 1 мкм quinpirole (Q102, Сигма) 30 ° С 90 мин жана 37 мүн менен мамиле жасашчу. Клеткалар 2 мл-кайра токтотулган суук PBS жана 200 μL aliquots ар бир кабыл алуу үчүн пайдаланылган. Drug дарылоо төмөнкү байытуу боюнча 3 ч үчүн бөлмө температурасында жүргүзүлгөн; 3 Н.М. [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 мкм sulpiride (895, TOCRIS), 10 мкм haloperidol (H1512, Сигма). Hydrophobic [3H] -spiperone жалпы билдирди кабылдагычтарга белгилөө үчүн колдонулган жана кычкылдуулукка sulpiride кабыкчага кабылдагыч-байлап [ордуна колдонулган3H] -spiperone сигналдар. Кабыкча менен байланышкан сезгич сигналдар жалпы билдирди сезгич баалуулуктардан клеткадагы сезгич баалуулуктарын кемитүү аркылуу эсептелген. Клеткалар бир ГК / B (Millipore) чыпкалуу жана кир жуугуч туруучу менен 3 жолу жууп (50 мм Tris-HCL (рН 7.4), 100 MM NaCl) боюнча чогултулду. Чыпкалар кургатуу жана калган RADIOACTIVITY суюк жумгуча санагыч менен өлчөнгөн [24].

Клетка мембранасы даярдоо

Кетүүсүнөн 100 мм transfection кийин маданият-тамак-муз-суук PBS жана 1 мл ХСК Санитардык-жылы түшүм менен жууп (25 мм HEPES (рН 7.5) клеткалар, 2 MM MgCl2Мм EDTA 1). Гомогендүү lysates 500 мүн г × 15 менен ийбөө жана supernatants кийин 36,000 мүн г × 30 менен ийбөө алынган. ХСК Санитардык-кайра токтотулду гранул сынамыгын үчүн пайдаланылган.

[35S] -GTPγS милдеттүү түрдө аткарууга тийиш болгон тамганы

1 мкм quinpirole клетка мембранасы үлүштөр менен алдын-инкубатор болгон (Q102, Сигма) пробирдик Санитардык-жылы (25 мм HEPES (рН 7.5), 1.5 MM MgCl2, 100 MM NaCl, 1 мм EDTA жана 0.01 MM ИДП) 10 мүн. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) 3 μL жылы 30 NM акыркы топтолушуна кошулуп, андан ары 90 мүн инкубатордо болгон. 170 муз муздак туруучу боюнча μL (10 ММ Tris-HCL (рН 8.0), 100 MM NaCl, 10 MM MgCl2Жана 0.1 мм Аккорды) кабыл токтотууга кошулду. Кабыкча бир ГК / B шүүлтүүр (Millipore) жана кир жуугуч туруучу (3 мм Tris-HCL (рН 50), 7.4 мм NaCl) менен 100 жолу жууп боюнча чогултулду. Чыпкалар кургатылган апрелде жумгуча санагыч менен өлчөнгөн алынган [25], [26].

Radioligand милдеттүү түрдө аткарууга тийиш болгон тамганы

Лебилердин клеткалар 0.01 Н.М. [менен инкубатордо болгон3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) жана quinpirole боюнча тыгыздыгын жогорулатуу (Q102, Сигма) пробирдик Санитардык-жылы 30 мин (25 мм HEPES (рН 7.5) үчүн, 1.5 MM MgCl2, 100 MM NaCl, 1 мм EDTA). Кабыкча бир ГК / B шүүлтүүр (Millipore) жана кир жуугуч туруучу (3 мм Tris-HCL (рН 50), 7.4 мм NaCl) менен 100 жолу жууп боюнча чогултулду. жооп GF / C чыпкалар менен тез чыпкалап тарабынан токтотулган. Калган RADIOACTIVITY суюк жумгуча санагыч менен өлчөнгөн [27]-[29].

САМР энзим Immunoassay

Transfected Кирилла 293 клеткалар 10 мкм rolipram (R6520, Сигма) менен pretreated алынган 1 ч үчүн, андан кийин 0.1 мкм forskolin менен мамиле кылган (F6886, Сигма) жана 102 мүн quinpirole (Q30, Сигма) жөнүндө тыгыздыгын жогорулатуу. Башталгыч маданияттуу striatal нейрондор 10 ч үчүн 1 мкм rolipram менен дарыланган, анан 1 мкм тинейджер 1 ч үчүн [22]. Cell lysates 0.1 M HCL менен даярдалган жана лагерь денгээлдери өндүрүүчүнүн тапшырмасы төмөнкү САМР энзим immunoassay комплектиге (Sapphire биобилим) тарабынан аныкталган болчу.

Баштапкы Cultured Striatal Neuron

Striatal аянты чычкан эмбриондук мээ (E15) бөлүнгөн болчу. Изилдөө тканы минималдуу зарыл маалымат каражаттарында (ӨКМ)-жылы тарап болгон (11095, Invitrogen) 0.25% трипсин камтыган (T4549-100, Сигма) жана 0.1% DNase Мен 6 ° С 37 мин. Клеткалар жалатуу каражаттарында кайрадан suspened алынган (0.01 менен ӨКМнын M HEPES (рН 7.4) жана 10% (Бети / том) жылкы кан суусунан (16050-122, GIBCO)). Нейрондор 7 күн маданияттуу алынган экстракорпоралдык (DIV 7) ӨКМнын B27 кошумча менен (17504-044, Invitrogen) конуштун энзим immunoassays колдонулат чейин.

натыйжалары

DRD5 үчүнчү клеткадагы укурук менен Cdk321 Phosphorylates серин 2 экстракорпоралдык

романы Cdk5 субстраттардын аныктоо үчүн, биз менен системалуу издөө жүргүзүлөт (S / T) PX (K / H / R) Cdk5 таануу консенсус ырааттуулугу сыяктуу [30] жана талапкер субстрат катары DRD2 аныктады. серин 321 ичинде консенсус катар, ар кандай ченемдик-укуктук механизмдери тургандыгы болжолдонуп айтылып жүрөт DRD2 (D2i3) үчүнчү клеткадагы кырында жайгашкан [3], [10], [11]. ырааттуулугу evolutionarily калган бир иш маани берүү, омурткалуулардагы DRD2 корук жатат (Сүрөт. 1A).

эскиз

Figure 1. Cdk5 DRD321 үчүнчү клеткадагы илмегинде серин 2 phosphorylates экстракорпоралдык.

(A) ар кандай түрлөрдүн DRD2 жана корук аймактарын көрсөтүү аминокислота тизмеги тегиздөө (боелгон). мүмкүн болуучу Cdk5 phosphorylation сайт жылдызча менен белгиленген. (B) IP-шилтемеленген экстракорпоралдык рекомбинанттык GST-D2i3 жана GST-D2i3 мутант белоктор менен Креатинкиназа проба. Cdk5 / p35 каршы p35 immunoprecipitation менен чычкан мээ сүзүлгөн байытылган татаал Креатинкиназа мамиле колдонулган. phosphorylated протеиндердин бир autoradiograph эле килкилдекке Coomassie мыкты көк бойоктор менен бирге көрсөтүлөт. Arrowhead GST-D2i3s жана ачык жаанын тиешелүү уулуу белги p35 алынып келинген сигналдарды көрсөтүп турат. (C) D2i3 боюнча phosphorylated пептиддик жазманын MS / MS спектри. теориялык чачырашынан узоры спектри төмөндө көрсөтүлгөн жок. Бардык үзүндүсү иондору арасында табылган у б-иондор аралыктын ичинде белгиленет. ж6 жана ж7 иондору катуу серин 321 менен phosphorylation көрсөтүп турат. (D) экстракорпоралдык GST-D5i25 жана GST-D2i3 мутант белоктор менен тазаланган Cdk2 / GST-p3 комплекси менен Креатинкиназа проба. Phosphorylated белоктор Coomassie мыкты көк бойоктор менен бирге, бир autoradiograph көрсөткөн. Arrowhead GST-D2i3 жана ачык жебенин GST-p25 алынып келинген сигналдарды көрсөтүп тиешелүү уулуу белги көрсөтүп турат.

чтыкта: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

D5i2 phosphorylate үчүн Cdk3 дараметин баалоо үчүн, биз IP-байланыштуу аткарылган экстракорпоралдык Креатинкиназа уланган катары активдүү Cdk5 / p35 p35 immunoprecipitation-GST D2i3 тазаланган рекомбинанттык менен чычкан мээнин lysate чейин байытылган комплекси (аминокислоталарды 212-373) белокторду колдонуп сынамыгын. Биз тазаланган GST-D2i3 жылы phosphorylation сигналдарды байкалган жана GST-D2i3 S297A белоктор, бирок сигнал кыйла GST-D2i3 S321A аркылуу мурдагыдай эле (Сүрөт. 1B). андан ары GST-D321i2 жылы серин 3 боюнча phosphorylation текшерүү үчүн, биз IP-байланыштуу үлгүлөрдү LC-MS / MS талдоо жүргүзүлөт экстракорпоралдык LTQ XL массалык спектрометрия менен Креатинкиназа сынамыгын. Үзгүлтүксүз, phospho-серин 321 пептиддердин массасы ылайык phospho-Пептиддер калыбына болду (Сүрөт. 1C). LC-MS / MS талдоо учурунда маалыматтарды көз каранды сатып алуу тандалып чексиз белокторду аныктоо шыктуу экенин эске [31], Бул маалыматтарды серин 321 калган D5i2 аймактагы Cdk3 үстөмдүк phosphorylation сайт деп божомолдоого болот. Cdk321 тарабынан GST-D2i3 жылы серин 5 түздөн-түз phosphorylation далилдөө үчүн, экстракорпоралдык тазаланган рекомбинанттык GST-D5i25 белоктор менен Креатинкиназа пробирдик Cdk2 / GST-p3 комплекси тазаланып пайдалануу аткарылган. Биз GST-D2i3 S2A жок болгон GST-D3i321 олуттуу phosphorylation белги аныкталган (Сүрөт. 1D). Чогуу алганда, бул натыйжалар D2i3 S321 калган Cdk5-арачылыгы phosphorylation үчүн артыкчылыктуу максаттуу экенин көрсөтүп турат.

КЛЕТКАЛАР Cdk5 DRD321 үчүнчү клеткадагы укурук менен серин 2 Phosphorylates

серин 321 боюнча phosphorylation аныктоо үчүн, биз phospho-серин 321 (pS321) үчүн өзгөчө бир антителонун көтөрүлгөн. IP-шилтемеленген үлгүлөрү экстракорпоралдык Креатинкиназа сыноочу каршы pS321 антитело менен Батыш өчүрөм текшерилген. Доскада GST-D2i3 көз каранды болгон Креатинкиназа кабыл алганынан өзүнчө тобун көрсөткөн (Сүрөт. 2A). каршы ачкан жана пайдалануу Батыш өчүрөм менен клеткаларда Cdk321 тарабынан DRD2 жылы серин 5 болуучу phosphorylation, Кирилла 293 клеткалардын DRD2-орунга илинди билдирген жана DRD2 S321A-орунга илинди менен же HA-Cdk5 жана p35 туруп каршы ачкан immunoprecipitates талдоо жүргүзүлгөн текшерүү анти-pS321 антителолор. DRD2 мүнөздүү сыйпалган тобу сигналдар каршы ачкан греч улам ашыкча glycosylation үчүн белгилүү гана DRD2-орунга илинди алдында байкалат, ошондой эле анти-pS321 антитело гана Cdk2 / p5 биргелешип сөз окшош DRD35 сигналдарды табылды (Сүрөт. 2B) [7]. мындан ары Cdk321 тарабынан серин 5 боюнча phosphorylation текшерүү, D2i3 (FLAG-D2i3) жана D2i3 мутантты түрүндө (FLAG-D2i3 S321A) иштелип чыккан. FLAG-D2i3 жана FLAG-D2i3 S321A же HA-Cdk5 жок экендигин билдирди жана p35 Кирилла 293 клеткаларда бир SDS-гел мобилдүү нөөмөт тамганы текшерилген. Олуттуу Cdk5 көз каранды мобилдүүлүк нөөмөт FLAG-D2i3 боюнча байкалган, FLAG-D2i3 S321A үчүн эмес, (Сүрөт. 2C). Ошондой эле, биз agonist стимулдаштыруу боюнча Ser2 боюнча DRD321 боюнча phosphorylation даражасына баа берди. Кирилла 293 клеткалары DRD2-ачкан жана Cdk5 көрсөтпөө / p35 татаал quinpirole менен дем алып, клетка lysates келген каршы ачкан immunoprecipitates каршы ачкан жана анти-pS321 антителолорду колдонуп Батыш өчүрөм текшерилген. Биз Ser5 боюнча DRD2 боюнча Cdk321-арачылыгы phosphorylation GRK- жана PKC-ортомчулугу phosphorylations башкача көрүнөт agonist дем берүү, жабыр тарткан жок деп табылган (Сүрөт. 2D) [32], [33]. Менен бирге, бул натыйжалар Cdk5 уюлдук чөйрөдө DRD321 боюнча серин 2 тебелеп phosphorylate мүмкүн экенин көрсөтүп турат.

эскиз

Figure 2. Cdk5 камераларда DRD321 үчүнчү клеткадагы илмегинде серин 2 phosphorylates.

серин 5 боюнча Cdk321-арачылыгы phosphorylation каршы pS321 антитело менен талданды. (A) IP-шилтемеленген үлгүлөрү экстракорпоралдык көрсөтүлгөн башка антителолор менен GST-D2i3 белокторду колдонуп Креатинкиназа пробирдик Батыш өчүрөм (ДБ) тарабынан текшерилген. Arrowheads GST-D2i3s көрсөтүп турат. (B) DRD2-ачкан жана DRD2 S321A-орунга илинди же Кирилла 5 клеткаларда HA-Cdk35 жана p293 туруп билдирди. Анти-орунга илинди immunoprecipitates каршы ачкан жана анти-pS321 антителолорду колдонуп Батыш өчүрөм текшерилген. кашаа DRD2 сигналдарды жана ачык жебенин каршы ачкан immunoprecipitates чейин менчиктин сигналдарды көрсөтүп турат. '% Киргизүү "бир IP караш жалпы lysate% ы болуп саналат. Начар ички Cdk5 сигналдар толлгондо тарабынан көрсөтүлгөн. (C) Гэл ыкчам нөөмөт проба. Кирилла 293 көрсөтүлгөн transfected клеткалар Батыш өчүрөм текшерилген. (D) Transfected Кирилла 293 клеткалар quinpirole каршы ачкан immunoprecipitates менен мамиле каршы ачкан жана анти-pS321 антителолор менен өчүрөм Батыш текшерилген. Open жебенин каршы ачкан immunoprecipitates чейин менчиктин сигналдарды көрсөтүп турат.

чтыкта: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 комплекси жана DRD2 денелик Associated бар

Биз Cdk5 / p35 татаал жана DRD2 ортосундагы мүмкүн болгон денелик өз ара, анткени көптөгөн Cdk5 субстраттардын дене Cdk5 / p35 комплексинин менен бирге белгилүү иликтөө [23], [34], [35]. Биринчиден, GST Сүйрөп түшүп эксперимент жүргүзүлдү. Purified рекомбинанттык GST-D2i3 белок чычкан мээ lysate жана GST аскерлерин-ылдый бууланган Батыш өчүрөм боюнча анализделген менен инкубатордо болгон. көрүнүп тургандай Сүрөт. 3A, Ички Cdk5 жана p35 DRD2 ортосунда жеке өз ара көрсөтүү менен, аскерлерин-ылдый бөлүнүп аныкталган жана Cdk5 / p35 татаал болду (Сүрөт. 3A). Мындан тышкары, HA-Cdk5 жана p35 DRD293-ачкан жана Cdk2 / p5 билдирген Кирилла 35 клетка lysates чейин каршы ачкан immunoprecipitates аныкталган (Сүрөт. 3B). Мындан тышкары, биз immunocytochemical талдоо жана DRD2-орунга илинди, HA-Cdk5 жана p35 Кирилла 293 клеткалардын кабыкчага аянтында олуттуу кошумча чектөө белгилерди көрсөтүп жатканын байкоо жүргүзүлөт (Сүрөт. 3C, Жогорку панелдер). Биз да нейрондордун кыймыл-контекстинде DRD2 жана Cdk5 / p35 биргелешип жергиликтештирүүнү изилденген. Үзгүлтүксүз, DRD2-орунга илинди эле DRD5 жана Cdk35 / p7 ортосунда олуттуу маданияттуу striatal нейрондордо ички Cdk2 жана p5 менен биргеликте жергиликтештирүүнү (DIV35), андан ары иш шилтемелер колдоо көрсөткөн (Сүрөт. 3C, Төмөнкү панелдер). натыйжалары DRD2 жана Cdk5 / p35 комплексин түзүү жана ошону менен бирге, DRD2 Cdk5 бир психологиялык субстрат болуп саналат деген түшүнүктү колдойбу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.

эскиз

Figure 3. Cdk5 / p35 DRD2 менен комплекси пайда болот.

(A) GST аскерлерин-ылдый чычкан мээ көчүрмө менен тазаланган рекомбинанттык GST-D2i3 белок колдонуп проба. GST Сүйрөп-ылдый бууланган Батыш өчүрөм анализдер дуушар болушкан. "Bead" GST протеиндердин жок Сүйрөп ылдый бөлүнүп турат. (B) DRD2 жана Cdk5 / p35 комплексинин Immunoprecipitation. transfected клеткалардан lysates тартып Анти-орунга илинди IP Батыш өчүрөм анализ дуушар болушкан. кашаа DRD2 сигналдарды жана ачык жебенин каршы ачкан immunoprecipitates чейин менчиктин сигналдарды көрсөтүп турат. материалдык ресурстар үчүн overexposed олдоксон да укугу көрсөтүлөт. (C) Immunocytochemical DRD2 жана Cdk5 / p35 талдайт. Кирилла 293 клеткалары DRD2-ачкан жана Cdk5 / p35 билдирген каршы Cdk5 каршы p35 антитело (Жогорку панелдер) менен булганган болчу. DRD2-орунга илинди жалгыз маданияттуу striatal нейрондор жана анти-Cdk5 каршы p35 антитело (Юрист панелдер) менен булганган билдирди. Hoechst ядро ​​бойоктор үчүн пайдаланылган. шкала бар 5 мкм болуп саналат. Бардык сүрөттөр confocal микроскопия (Olympus, FluoView-1000) жардамы менен алынган.

чтыкта: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

DRD5 боюнча Cdk2-кыйыр Phosphorylation ошондой але Receptor ишин

Бул phosphorylation мындай G белок бириге турган, сезгич internalization, клеткадагы чектөө жана модулятору белок менен бирге эле GPCRs критикалык касиеттерин modulates деп билдирди келет [9], [11], [24]. Аgonist айынан сезгич internalization сигналдардын берилүүсүнүн маанилүү ченемдик-укуктук жараян. Биз DRD5 internalization боюнча Cdk2-арачылыгы Модулатион изилденген. Кирилла 293 клеткалары айтып DRD2-ачкан жана DRD2 S321A-орунга илинди же жок Cdk5 / p35 1 мкм quinpirole менен agonist-сигнал DRD2 internalization түрткөнүн инкубатордо болгон (Сүрөт. 4A). [3H] DRD2-орунга илинди билдирген клеткалардын -spiperone сигналдар бир кыйла 30 мин quinpirole дарылоо кыскарган 90 мин орду толтурулуп берилген. Кызыктуусу, [3H] клеткаларды айтып DRD2-ачкан жана Cdk5 / p35 боюнча -spiperone сигналдары да 30 мин quinpirole дарылоо кыскарган, бирок 90 мин боюнча калыбына жок (Сүрөт. 4AЭкинчи бөлүм). Башка жагынан, [3H] карабастан Cdk2 / p321 менен биргеликте-сөз, 30 мин боюнча DRD90 S5A-орунга илинди билдирген клеткалардын -spiperone сигналдар 35 мин кыскартылган жана кайра калыбына келген. Мурунку изилдөөлөр internalized DRD2 узакка agonist стимулдаштыруу боюнча кайра плазма кабыкчасы менен иштетип экенин көрсөттү [11]. Tгус ал DRD5 боюнча Cdk2-арачылыгы phosphorylation agonist айынан DRD2 internalization төмөнкү resensitization жараянына катышып турат.

эскиз

Figure 4. Cdk5-арачылыгы phosphorylation DRD2 бетиндеги сөздөр жана ылдыйкы билдиребиз ошондой але.

(A) DRD2 бетиндеги сөздөр менен өлчөнөт [3H] сыноочу милдеттүү -spiperone. Transfected HEK293 клеткалар көрсөтүлгөн жолу 1 мкм quinpirole менен сигнал жана мөмө жок, 3 Н.М. кийин [3H] -спиперон менен 3 саат дарылоо. Радиоактивдүүлүк өлчөнүп, жер үстүндөгү сигналдар эсептелген. Ката тилкелери ± SE орточо маанисин билдирет (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Даннетт post hoc тест менен бир тараптуу ANOVA: бардык мамычалар менен башкаруу тилкесин салыштырыңыз). (B) [35S] -GTPγS сыноочу милдеттүү. Клетка кабыкчасындагы көрсөтүлгөн transfected клеткалардан даярдалган. Мембрана даярдык 1 мкм 3 Н.М. артынан quinpirole менен инкубатордо болгон [35S] -GTPγ90 мүн. S Ката тилкелери орточо ± SEни билдирет (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Bonferroni post hoc тест менен бир тараптуу ANOVA: бардык жуп мамычаларды салыштырыңыз). (C) Квинпирол менен атаандашуу [3H] сыноочу милдеттүү -spiperone. transfected клеткалардан Кабыкчасындагы даярдык 0.01 Н.М. [менен инкубатордо болгон3Н] -спиперон жана хинпирол концентрациясы 30 мүн. Сызыктуу эмес регрессия GraphPad тарабынан алынган. Ката тилкелери орточо SE (n = 3) билдирет. (D) трансфекцияланган HEK 293 клеткаларындагы cAMP ферментинин иммундук анализдери. Трансфекцияланган клеткалар 10 мкм ролипрама менен 1 саат бою алдын-ала иштелип, андан кийин 0.1 µM форсколин менен чогуу иштелип, 30 мин хинпиролдун концентрациясы жогорулады. Сызыктуу эмес регрессия GraphPad тарабынан алынган. Ката тилкелери орточо SE (n = 4; ** p <0.01; эки куйруктуу) билдирет t-tests). (E) Cultured striatal нейрондор жапайы түрү жана p35 нокаут түйүлдүктөрүн (DIV 7) тартып 10 ч үчүн 1 мкм тинейджер кийин 1 ч үчүн 1 мкм rolipram менен мамиле жок. Error барлар ± SE дегенди билдирет (н = 4; **p<0.01; эки куйруктуу t-tests).

чтыкта: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Биз мындан ары agonist-сигнал G белок бириге турган мүмкүн болуучу өзгөрүүлөр Cdk2-арачылыгы phosphorylation пайдалануу менен байланышкан DRD5 бааланууда [35S] -GTPγS милдеттүү сыноочу [25], [26]. DRD2-ачкан жана DRD2 S321A-орунга илинди же Cdk5 жок / p35 Кирилла 293 клеткалардын айтылган. Кабыкча даярдалган жана 1 мкм quinpirole менен сигнал жана андан ары жол [35S] -GTPγS кусадар. DRD2-ачкан жана Cdk5 / p35 билдирген клетка мембранасы бир кыйла начар көрсөттү [35S] -GTPγS башка клетка кабыкчасындагы салыштырмалуу милдеттүү (Сүрөт. 4B). Бул жыйынтыктар Cdk5-арачылыгы phosphorylation agonist-сигнал G DRD2 боюнча милдеттүү протеин майдалоочу-жөнгө экенин көрсөтүп турат.

Андан тышкары, quinpirole-атаандаш [3H] милдеттүү сынамыгын Cdk2-арачылыгы phosphorylation менен DRD5 боюнча agonist-улутка эч кандай мүмкүн болуучу өзгөрүүлөрдү иликтөөгө жасаган -spiperone. камалышы Атаандаштык [3H] transfected тартып кабыкча даярдоого quinpirole боюнча тыгыздыгын жогорулатуу дарылоо боюнча -spiperone өлчөнгөн. quinpirole жана милдеттүү атаандаш [3H] DRD2-ачкан жана DRD2 S321A-орунга илинди боюнча -spiperone окшош logK жасадыi баалуулуктар (-9.789 үчүн DRD2-орунга илинди, -9.691 DRD2 S321A-орунга илинди үчүн), DRD2 үчүн ligand Оррулуунун кыйла DRD5 боюнча Cdk2-арачылыгы phosphorylation тиешеси жок экенин билдирген (Сүрөт. 4C).

Cdk5-кыйыр Phosphorylation DRD2-Camp белги барган жол Down-жөнгө салуучу

Андан ары, биз Cdk2 тарабынан DRD5 өзгөртүү ылдый белги жол менен тиешеси бар же жогун иликтөө. Биз конуштун энзим immunoassay колдонуп DRD2-ачкан жана DRD2 S2A-орунга илинди билдирген клеткаларда adenylyl cyclase менен forskolin-сигнал САМР өндүрүү DRD321-арачылыгы жайлатып мониторинг. DRD2-билдирүү клеткалар көрсөткөн дозасын-каранды абалда quinpirole жооп конуштун өлчөмдө азайган. Белгилей кетчү нерсе, Cdk5 / p35 биргелешкен билдирүү олуттуу САМР пайда максималдуу жайлатып кыскарган (Сүрөт. 4D, сол панели). Башка жагынан алганда, DRD2 S321A-орунга илинди клеткалардын билдирүүгө, Cdk5 / p35 кошуунун түзүлүштөрү натыйжалуу сөз карамагына көз карандысыз, дарылоочу quinpirole жооп тосулуп алынган (Сүрөт. 4D, оң панели). Бул жыйынтыктар боюнча DRD5 Cdk2-арачылыгы phosphorylation ылдый САМР белги жолуна DRD2 боюнча Тоскоол болуучу иш коколой башы экенин көрсөтүп турат. мындан ары дагы психологиялык тиешелүү жагдайда кубулуштарын ырастоо үчүн, биз p35, маанилүү Cdk5 Activator кем нокаут түйүлдүктөрүн баштапкы маданияттуу нейрон колдонушкан. Башталгыч маданияттуу striatal нейрондор 1 мкм тинейджер менен мамиле жана САМР энзим immunoassay текшерилген. тинейджер менен дүүлүгүп p35 нокаут чычкандардын тартып Нейрондор жапайы түрү нейрон менен салыштырганда САМР көлөмүн кыскарткан көрсөткөн (Сүрөт. 4E). TАке менен бирге, биз DRD5 тарабынан САМР жолуна Тоскоол болуучу үн га кыскартты DRD2 жыйынтыктарын phosphorylation Cdk2-арачылык кылган түзүлгөн.

талкулоо

Биз Cdk2 бир роман субстрат катары DRD5 аныктады. phosphorylation үчүн DRD2 бети аркылуу DRD2 кыскартуу internalization кабылдагыч төмөнкү DRD2 тагдырына таасир берип, сөз айкашы G түшүп-жөнгө пайдаi-coupling жана ылдый жагындагы Кэмп жолду. phosphorylation калган S321 DRD2 узун жана кыска isoforms да бар эле, алар бул изилдөөнүн жүрүшүндө сунушталган механизми DRD2-арачылыгы сигналдаштыруунун жөнгө жалпы режими болушу мүмкүн.

орто бадал нейрондордо DRD2 гана негизги тинейджер сезгич типтин деп эсептелип келген, бирок, ошондой эле айлана-чөйрөнү коргоо стимулдарга жооп бар өзгөрүүлөргө анын албастыгын үчүн таанылган эмес. Agonist айынан сезгичтиктин жана DRD2 менен resensitization көп изилдене элек [11], [24]. Атап айтканда, бир катар иликтөөлөр striatal Сипанста тинейджер менен клетка сыртындагы жогорулатуу өнөкөт psychostimulant катнаштын таасири, мисалы, кокаин жана amphetamine катары, DRD2 postsynaptically динамикалуу өзгөрүүлөр менен коштолот экендигин көрсөттү [36]. Чынында эле, өнөкөт кокаин колдонуучулар striatal аймагында DRD2 гээлин кыскарган белгилүү, жана ядро ​​accumbens (етту) менен DRD2 болушу чычкандар менен приматтардын-жылы дары-дармек көздөгөн жана бекемдөө жүрүм-турум менен терс байланыш көрсөтөт [37]-[39]. Бул жыйынтыктар DRD2 иштешине өнөкөт дары-катнаш, анын ичинде ар кандай стимулдарга жооп ийкемдүү же акы жөнгө салуу үчүн өтө сезгич экенин көрсөтүп турат. Биздин жыйынтыктар DRD321 үчүнчү клеткадагы илмегинде S2 калган САМР жолуна DRD5 боюнча Тоскоол болуучу таасири азайышына алып келет Cdk2 тарабынан phosphorylated мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Бул өз ара DRD5 бети бар динамикалык мүнөзү менен байланыштуу болушу мүмкүн dopaminoceptive нейрондордо Cdk2 менен байланышкан бир көркөм кара сөз чыгармасына киреби жөнгө салуу механизмин сунуш кылат.

Бул Cdk5 нейрондордун кыймыл-чөйрөнү ийкемдүү өзгөрүүлөргө ортомчулардын маанилүү компонент болуп белгилүү экендигин белгилей кетүү керек. Мисалы, лимбикалык районго нейрондордо dendritic үрөйүн структуралык жана иш өзгөртүүлөр кайталап psychostimulant таасиринен кесепеттерин бири болуп саналат [40]. Бул өзгөрүүлөр өнөкөт кокаин башкаруу жооп конуштун жооп элементи-милдеттүү белок (CREB) жана ΔFosB, копиялоо себептерден туруктуу чейин жөнгө салуу көрсөтүшөт кошулуу, анын ичинде ар түрдүү молекулярдык өзгөрүүлөрдү менен коштолот [41], [42]. Маанилүүсү, Cdk5 ΔFosB бутасы болуп саналат [19], жана башка көптөгөн маанилүү компоненттери dendritic омурткасы динамикасына тиешеси бар, мисалы, PSD-95 катары p21-жандырылды КРЕАТИНКИНАЗА (PAK), β-catenin жана spinophilin, Cdk5 уланган катары кабарланды [43]-[46]. Үзгүлтүксүз, Cdk5 иш генетикалык же дары-дармек менен боемочулуктарды mesolimbic тинейджер микросхемалардын молекулярдык жана түркүмдөрүнүн өзгөрүүлөр Cdk5 үчүн маанилүү ролун берүү, dendritic омурткасы Саясат жана кокаин үчүн жүрүш-жооптордун өзгөртүүлөр ашыгышат [47], [48]. Биздин жыйынтыктар DRD2 Cdk5 бир роман максаттуу Cdk5 боюнча тинейджер, анткени кийинки ΔFosB-кыйыр чейин жөнгө өнөкөт дары камтылып жооп системасынын ийкемдүү өзгөрүүлөргө кошумча өбөлгө түзөт деп көрсөтүү DRD2 боюнча phosphorylation бир тоник жогорулатууга шарт түзө алат . Мындан тышкары, көптөгөн DRD2 уюлдук жараяндарды конуштун жана MAP Креатинкиназа жолдору жана ылдыйкы жүргүзүлсө протоколдун окуяларды жөнгө салуу, анын ичинде таасир белгилүү [42], [49]. Ошентип, бул илиминдеги ачылыштар гана Cdk2 тарабынан DRD5 түздөн-түз жөнгө көрсөтүлгөн эмес, бирок ошондой эле өнөкөт дары таасири менен тинейджер системасынын ийкемдүү жооп бир көркөм кара сөз чыгармасына киреби жакшыраак түшүнүүгө жардам бериши мүмкүн.

Author Contributions

Боюна бүтүп, эксперименттер иштелип: JJ Yup DH SKP. эксперименттерди жасашкан: JJ Yup DKK YK. маалыматтарды талдоо: JJ Yup DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Көмөк реагенттердин / материалдар / талдоо аспаптар: YHS. кагаз мындай деп жазган: JJ SKP.

шилтемелер

  1. 1. Missale C, Нэш SR, Робинсон SW, Жабер M, Caron MG (1998) тинейджер кабылдагычтар: курамынан үчүн иштейт. Physiol Аян 78: 189-225.
  2. 2. Wise RA (2002) Brain сыйлык схемасында: unsensed дем тартып Жкп. Нейрон 36: 229-240. чтыкта: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Кароо-берене
  4. PubMed / NCBI
  5. Google окумуштуу
  6. Кароо-берене
  7. PubMed / NCBI
  8. Google окумуштуу
  9. Кароо-берене
  10. PubMed / NCBI
  11. Google окумуштуу
  12. Кароо-берене
  13. PubMed / NCBI
  14. Google окумуштуу
  15. Кароо-берене
  16. PubMed / NCBI
  17. Google окумуштуу
  18. Кароо-берене
  19. PubMed / NCBI
  20. Google окумуштуу
  21. Кароо-берене
  22. PubMed / NCBI
  23. Google окумуштуу
  24. Кароо-берене
  25. PubMed / NCBI
  26. Google окумуштуу
  27. Кароо-берене
  28. PubMed / NCBI
  29. Google окумуштуу
  30. Кароо-берене
  31. PubMed / NCBI
  32. Google окумуштуу
  33. Кароо-берене
  34. PubMed / NCBI
  35. Google окумуштуу
  36. Кароо-берене
  37. PubMed / NCBI
  38. Google окумуштуу
  39. Кароо-берене
  40. PubMed / NCBI
  41. Google окумуштуу
  42. Кароо-берене
  43. PubMed / NCBI
  44. Google окумуштуу
  45. Кароо-берене
  46. PubMed / NCBI
  47. Google окумуштуу
  48. Кароо-берене
  49. PubMed / NCBI
  50. Google окумуштуу
  51. Кароо-берене
  52. PubMed / NCBI
  53. Google окумуштуу
  54. Кароо-берене
  55. PubMed / NCBI
  56. Google окумуштуу
  57. Кароо-берене
  58. PubMed / NCBI
  59. Google окумуштуу
  60. Кароо-берене
  61. PubMed / NCBI
  62. Google окумуштуу
  63. Кароо-берене
  64. PubMed / NCBI
  65. Google окумуштуу
  66. Кароо-берене
  67. PubMed / NCBI
  68. Google окумуштуу
  69. Кароо-берене
  70. PubMed / NCBI
  71. Google окумуштуу
  72. Кароо-берене
  73. PubMed / NCBI
  74. Google окумуштуу
  75. Кароо-берене
  76. PubMed / NCBI
  77. Google окумуштуу
  78. Кароо-берене
  79. PubMed / NCBI
  80. Google окумуштуу
  81. Кароо-берене
  82. PubMed / NCBI
  83. Google окумуштуу
  84. Кароо-берене
  85. PubMed / NCBI
  86. Google окумуштуу
  87. Кароо-берене
  88. PubMed / NCBI
  89. Google окумуштуу
  90. Кароо-берене
  91. PubMed / NCBI
  92. Google окумуштуу
  93. Кароо-берене
  94. PubMed / NCBI
  95. Google окумуштуу
  96. Кароо-берене
  97. PubMed / NCBI
  98. Google окумуштуу
  99. Кароо-берене
  100. PubMed / NCBI
  101. Google окумуштуу
  102. Кароо-берене
  103. PubMed / NCBI
  104. Google окумуштуу
  105. Кароо-берене
  106. PubMed / NCBI
  107. Google окумуштуу
  108. Кароо-берене
  109. PubMed / NCBI
  110. Google окумуштуу
  111. Кароо-берене
  112. PubMed / NCBI
  113. Google окумуштуу
  114. Кароо-берене
  115. PubMed / NCBI
  116. Google окумуштуу
  117. Кароо-берене
  118. PubMed / NCBI
  119. Google окумуштуу
  120. Кароо-берене
  121. PubMed / NCBI
  122. Google окумуштуу
  123. Кароо-берене
  124. PubMed / NCBI
  125. Google окумуштуу
  126. Кароо-берене
  127. PubMed / NCBI
  128. Google окумуштуу
  129. Кароо-берене
  130. PubMed / NCBI
  131. Google окумуштуу
  132. Кароо-берене
  133. PubMed / NCBI
  134. Google окумуштуу
  135. Кароо-берене
  136. PubMed / NCBI
  137. Google окумуштуу
  138. Кароо-берене
  139. PubMed / NCBI
  140. Google окумуштуу
  141. Кароо-берене
  142. PubMed / NCBI
  143. Google окумуштуу
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) тинейджер сезгич белги. J Чектин сигнал Transduct Рез 24: 165-205. чтыкта: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Амар S, Shaltiel G, Mann L Шамир A, Дин B, .Удаалаш. (2008) шаблон боюнча, остеохондроздун, компоненттердин белги пост-тинейджер D2 кабылдагычы тартуу. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197-205. чтыкта: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Кейн SB Нажаши SS, Мелло NK, Patel S, Бристоу, L, .Удаалаш. (2002) кокаин өзүн-өзү башкаруу боюнча тинейджер D2 окшош кабылдагыч ролу: D2 кабылдагыч мутант чычкандар менен романы D2 сезгич антагонисттер менен изилдөө. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6. Lee S, Жонг J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, .Удаалаш. (2012) Valproate Par-4 белок сөз кошулуу менен бирге тинейджер кабар өзгөртөт. PLoS One 7: e45618. чтыкта: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Элазар Z, Fuchs S (1995) D2 тинейджер кабылдагычы узак жана кыска isoforms үчүн өзгөрүү glycosylation жана клеткадагы сатуу. J Biol Chem 270: 29819-29824. чтыкта: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Reader TA, Molina-Holgado E, Лима L, Boulianne S, Диуор KM (1992) конкреттүү [3H] neostriatal тинейджер D2 кабылдагыч үчүн милдеттүү raclopride: disulfide жана sulfhydryl топтордун ролу. Neurochem Рез 17: 749-759. чтыкта: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY, Маллетт BF, Caron M, Dennis M, Бранн MR, .Удаалаш. (1994) Phosphorylation жана Sf2 камераларда адам D9L тинейджер кабылдагычтын palmitoylation. J Neurochem 63: 1589-1595. чтыкта: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Чжоу QY (2000) тинейджер Д тездиги (2) актин-милдеттүү белок менен кабылдагыч сигналдаштыруунун (АБП 280). Mol Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11. Cho D, Чжэн M, Min C, Ма L, Kurose H, .Удаалаш. (2010) Agonist айынан endocytosis жана сезгич phosphorylation тинейджер D (2) кабылдагыч resensitization ортомчу. Mol Endocrinol 24: 574-586. чтыкта: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Абыс LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Уэр E (1994) p35 cyclin көз каранды Креатинкиназа 5 бир нейрон-өзүнчө ченемдик курамдык бөлүгү болуп саналат. Nature 371: 419-423. чтыкта: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, улу абыс LH (2001) CDK5 бир он жылдык. Nat Аян Мол Cell Biol 2: 749-759. чтыкта: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu АК, Ип NY (2007) Cyclin көз каранды Креатинкиназа dendritic омурткасы иштетүүдө актин cytoskeleton үчүн клетка сыртындагы төлөтүүгө шилтемелер 5. Cell талыбай Migr 1: 110-112. чтыкта: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Лк Y (2003) Cdk5 жандантуу түздөн-түз NMDA кабылдагычтарга phosphorylating менен кохлеардык CA1 клетканын өлүмүнө негиз түзөт. Nat Neurosci 6: 1039-1047. чтыкта: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Чжан S, Сарай L, Liu J, Крэндолл се, Morabito MA (2008) Cdk5 тирозин 1472 NR2B менен phosphorylation жана NMDA кабылдагыч бетиндеги сөздөр жөнгө салат. J Neurosci 28: 415-424. чтыкта: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Мой LY, улу абыс LH (2004) Cyclin көз каранды Креатинкиназа 5 тирозин гидроксилаз серин 31 phosphorylates жана анын туруктуулугун жөнгө салат. J Biol Chem 279: 54487-54493. чтыкта: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Батлер JA, Снайдер GL, г. A, Ян Z, Meijer L, .Удаалаш. (1999) Cdk32 тарабынан DARPP-5 боюнча Phosphorylation нейрондордо тинейджер кабар modulates. Nature 402: 669-671.
  160. 19. Батлер JA, Chen J, Тейлор JR, Svenningsson P, г. A, .Удаалаш. (2001) кокаин үчүн өнөкөт катнаш Effects нейрондордун белок Cdk5 менен жөнгө салынат. Nature 410: 376-380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, .Удаалаш. (2001) cyclin көз каранды Креатинкиназа боюнча синергетикалык салымдары 5 / p35 жана Reelin / Dab1 өнүгүп чычкан мээнин камеранын нейрон турумун үчүн. Жаздын Natl Acad Илимий USA 98: 2764-2769. чтыкта: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, улу абыс LH (2004) Cyclin көз каранды Креатинкиназа 5 нейрондордо postsynaptic жыштыгы белок PSD-95-жылдын N-терминалдык домени phosphorylates. J Neurosci 24: 865-876. чтыкта: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, өспүрүмдөр A, ЛУКА жазган Жакшы Кабар депутаты, Affär ел B, .Удаалаш. (2005) Par-4 тинейджер белги жана депрессияга шилтемелер. Клетканын 122: 275-287. чтыкта: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Айала R, Пенг J, Ko J, .Удаалаш. (2000) NUDEL LIS5 жана cytoplasmic Динеин менен пикирлешип, роман Cdk1 субстрат болуп саналат. Нейрон 28: 697-711. чтыкта: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Ким KM, Valenzano KJ, Робинсон SR, Yao WD, Барак LS, .Удаалаш. (2001) G белок-коштолгон сезгич kinases жана бета-arrestins тарабынан тинейджер D2 жана D3 кабылдагыч өзгөрүү жөнгө салуу. J Biol Chem 276: 37409-37414. чтыкта: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Миллиган G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Сурамин жана didemethylated Сурамин менен A1 аденозин жана D2 тинейджер кабылдагыч өзгөрүү чакырууну өчүрүү, (NF037). Mol Pharmacol 53: 808-818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek Оо, Янг Q, Ahorn H, Freissmuth M, жана башкалар. (2000) D2-тинейджер антеннага calmodulin камалышы G белок кошуу которууну камакка кабылдагыч кабар азайтат. J Biol Chem 275: 32672-32680. чтыкта: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. Тизме SJ, Seeman P (1981) [3H] менен тинейджер жана серотонин кабылдагыч компоненттерин токтому чычкан мээ аймактарга милдеттүү spiperone. Жаздын Natl Acad Илимий USA 78: 2620-2624. чтыкта: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Гарднер B, Strange PG (1998) D2 (узак) тинейджер кабылдагычтарга Agonist иш-аракеттер: ligand милдеттүү жана иш сынамыгын. Br J Pharmacol 124: 978-984. чтыкта: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) тинейджер [3H] тинейджер D2 кабылдагычы жогорку туугандык сайттардан domperidone, бирок [3H] raclopride же [3H] изотоникалык чөйрөдө spiperone бошотот: адам Позитрондуу радиологияны үчүн анын кесепеттери. Synapse 49: 209-215. чтыкта: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: кыска катар стили менен клетка белги ара Proteome-кең алдын ала. Нуклеин кислоталарынын Рез 31: 3635-3641. чтыкта: 10.1093 / БТК / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Йетс JR 3rd (2004) кокус тандоо жана атылуучу Протеомика салыштырмалуу белок мол баалоо үчүн үлгү. Анал Chem 76: 4193-4201. чтыкта: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) тинейджер D2 кабылдагыч рын G-протеин-коштолгон сезгич kinases 2 же 5 боюнча coexpression көз каранды. Eur J BIOCHEM 260: 112-119. чтыкта: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) протеин Креатинкиназа C D2 тинейджер кабылдагычтын phosphorylation, көндүрүп, жана сатууга ортомчулук кылат. J Biol Chem 279: 49533-49541. чтыкта: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Чунг ай, эмне кылмаксын PK, Чунг SK, .Удаалаш. (2011) endophilin B5 боюнча Cdk1-арачылыгы phosphorylation Паркинсон оорусу моделдер жасалма autophagy талап кылынат. Nat Cell Biol 13: 568-579. чтыкта: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Лау KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, .Удаалаш. (2001) p35 / cdk5 айланууда жана бета-catenin phosphorylates жана бета-catenin / presenilin-1 өз ара жөнгө салат. Eur J Neurosci 13: 241-247. чтыкта: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) кокаин күчөтүү касиеттерин тинейджер гипотезасы. Айлары Neurosci 14: 299-302. чтыкта: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-ж
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, .Удаалаш. (1990) postsynaptic тинейджер кабылдагыч боюнча өнөкөт кокаин кыянаттык Effects. Am J психиатрия 147: 719-724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer ТД, Brichard L, Робинсон ES, Theobald DE, .Удаалаш. (2007) Ядро D2 / 3 кабылдагычтар өзгөчөлүгү impulsivity жана кокаин катаалдаштыруу алдын accumbens. Science 315: 1267-1270. чтыкта: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Надер MA, Морган D, Гейдж HD, Надер SH, Calhoun TL, .Удаалаш. (2006) маймылдардын өнөкөт кокаин өзүн-өзү башкаруу учурунда тинейджер D2 кабылдагыч ПЕТ сүрөт. Nat Neurosci 9: 1050-1056. чтыкта: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Робинсон TE, Kolb B (1997) amphetamine менен мурунку тажрыйбасы өндүрүлгөн ядро ​​accumbens жана prefrontal борбору нейрондордо Persistent түзүмдүк өзгөртүүлөр. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. Робинсон TE, Kolb B (1999) өзгөртүү ядросундагы дендрит жана dendritic тикенектен Учак менен accumbens жана prefrontal борбору amphetamine же кокаин менен дарылоо кайталап Артынан. Eur J Neurosci 11: 1598-1604. чтыкта: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) CREB жана DeltaFosB тарабынан ген сөз менен кокаин сооп жөнгө салуу. Nat Neurosci 6: 1208-1215. чтыкта: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Ян Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, .Удаалаш. (2000) Spinophilin dendritic үрөйүн түзүү жана милдеттерин жөнгө салат. Жаздын Natl Acad Илимий USA 97: 9287-9292. чтыкта: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Прэндж Оо, Murphy TH (2001) камеранын нейрон эрте иштетүүдө туруктуу омурткасы прекурсорлордун жана бирикме postsynaptic жыштыгы-95 кластерлерди Модулдук транспорттук. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. События S, Моссер E, Шуман EM (2002) жыйрылуу бета-Catenin кичинекей түзүлүшү жана иштеши өзгөртүүлөрдү илгерилетүү нейрондордун үрөйүн эске салат. Нейрон 35: 91-105. чтыкта: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-х
  187. 46. Хайаши ML, Чой SY, Рао BS, Юнг HY Ли HK, .Удаалаш. (2004) forebrain- өзгөчө басымдуулук-терс PAK transgenic чычкандардын камеранын кичинекей Учак жана начар эс бириктирүүнү өзгөртүү киргизилди. Нейрон 42: 773-787. чтыкта: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR Куинн JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, .Удаалаш. (2007) Cdk5 кокаин сыйлык, дем жана striatal нейрон жандануусу modulates. J Neurosci 27: 12967-12976. чтыкта: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer да, Richer E, Benkovic SA, Хайаши K, Kansy JW, .Удаалаш. Cdk2008 боюнча (5) Striatal dysregulation кокаин, мотор окутуу жана dendritic Учак үчүн таяныч жооп өзгөртөт. Жаздын Natl Acad Илимий USA 105: 18561-18566. чтыкта: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) жаңы байланыштарды даярдоо: нейрондордун пластикалык менен белги ЭРК / MAP киназ ролу. Нейрон 23: 11-14. чтыкта: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3