PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
жалпылаган
кокаин көз карандылыкты негизинен мүмкүн нейрондордун Саясат жана жүрүм-турум жагынан ген сөздөр себеп өзгөрүүлөр Кокаин-жасалма өзгөртүүлөр. Биз гистон 3 метионин 9 (H3K9) dimethylation үчүн маанилүү ролун аныктап, метионин кокаин айынан структуралык жана жүрүш-туруш пластикалык менен G9a dimethyltransferase. Кайталап кокаин башкаруу ядросу accumbens жылы H3K9 dimethylation дүйнөлүк көлөмүн кыскарткан. Tкокаин айынан копиялоо эске ΔFosB менен жөнгө салынган, бул мээ аймактагы G9a эсептелинет, гистон methylation анын азайтуу аркылуу кыйыр түрдө болду. шарттуу mutagenesis жана ээледи-арачылыгы ген төлөмү аркылуу, биз G9a downregulation бул кокаин узак мөөнөттүү иш-гистон methylation үчүн чечүүчү ролду түзүү ядро, кокаин нейрондор жана күчөтүлгөн артыкчылык accumbens боюнча dendritic омурткасы пластикасын жогорулагандыгын тапкан.
тааныштыруу
Кайталап кокаин таасири ядро accumbens ичинде ген сөз жана өзгөртүлөт нейрондордун Учак туруктуу өзгөрүүлөр менен мүнөздөлөт (УИА), мээнин сыйлык схемотехникасын негизги компоненти (1-2). Хроматин каалады кокаин көз аспекттерин негизинде болушу мүмкүн экенин, бул мээ аймакта бузук жүргүзүлсө протоколдун өзгөрүүлөрдүн маанилүү (3-9). жарым-жартылай НАК жыйынтыктары хроматин структурасын Кокаин жөнгө салуу, хроматин Enzymatic техниканын түз кокаин айынан өзгөртүүлөрдү, гистон acetylation жана phosphorylation өзгөрүүлөргө алып (4, 7-9); Бирок, гистон methylation көзөмөлдөөчү энзимдер ролдор ге иликтенген эмес.
Жакында гендик-кең жайылып талдоо microarrays кыйынчылыктарынан хроматин immunoprecipitation колдонуу (Чип-чип жагы) аныкталган репрессиялык гистон менен өзгөргөн моделдерин H3 метионин 9 (H3K9) жана 27 (H3K27) НАК белгилүү ген көрсөтүүчүлөргө боюнча methylation кайталап кокаин дарылоо төмөнкү (6). Демек, көп сандаган, метионин methyltransferases (KMTs) жана demethylases (KDMS) H3K9 же H3K27 methylation көзөмөлдөө үчүн белгилүү Баяндамада көрсөтүлгөн (Сүрөт. 1A). Бир гана эки энзимдер, G9a жана GLP, туруктуу жүргүзүлсө протоколдун жөнгө 24 саат эки экспрессия кыйла downregulated келгенде, кийин кокаин башкаруу жолу көрсөттү. G9a жана GLP атайын H3K9 (H3K9me2) жөнүндө dimethylation күчөтүүнү болгондуктан, кокаин, алардын downregulation бул жолу учурда байкалган euchromatic H3K9me2 глобалдык өлчөмдө азайган менен шайкеш келет (Сүрөт. 1B). Ал эми, heterochromatic H3K27 methylation дүйнөлүк денгээлдери кайталап кокаин таасир бойдон жашап келyyдө (Сүрөт. Онлайн материалдык колдоо S1). Улам да каталитикалык иш, анын өтө жогорулугуна экстракорпоралдык жана бододо, (10), Биз мындан ары УИА кайталанат кокаин таасири төмөнкү G9a репрессиялар иш маанисин иликтөө үчүн жолго чыккан. G9a белок даражалары, анын РНК менен денгээлде болуп, кыйла 24 саат өткөндөн кийин кайра кокаин башкарууну кыскарган (Сүрөт. S2). G9a РНК сөздөр НАК жылы 35% га кыскарган да, иммуногистохимиялык талдоо жолу кокаин башкаруу кийин H15K9me21 байкалган 3% төмөндөшү (толугу менен шайкеш G9a белок баскычтарда дагы жөнөкөй 2% га төмөндөп, ачыпСүрөт. 1B). G9a РНК сөз да мээдеги бул аймакта 20% га кокаин нече өз алдынча башкаруунун төмөнкү downregulated болду (Сүрөт. S3).
euchromatic H3K9me2 өзгөрүүлөр НАК жылы ген мааниде гендик-кең өзгөртүүлөр менен байланыштырууга, же жокпу, аныктоо үчүн, microarray чейин кокаин таасири менен жаныбарларда же тарыхтын жок кокаин кыйынга дозасы менен жасалма ген сөздөр маалыматтарда карап анализ иштеген (кошумча көрүп ген тизмеси Tables S1-S3). кайталап кокаин алган Жаныбарлар тийет жаныбарларды мамиле салыштырганда бир кокаин шек кийин кескин ген сөздөр 1 саат көбөйгөн көрсөтө (Сүрөт. 1C). Бул жогорулаган ген сөз дагы кайталап кокаин тартып алып коюу 1 жумадан кийин берилген кокаин чакырыкка жооп болгон. Мурунку маалыматтарга ылайык, ген (~ 10%) бир аз гана пайызы кайра кокаин башкаруу төмөнкү жүргүзүлсө протоколдун жооп калдыкпы көрсөтө (Сүрөт. 1C; көрүү Мазмуну S1) (5). түздөн-түз кайталап кокаин кийин байкалган күчөтүлгөн ген мааниде G9a downregulation ролун иликтөө, чычкан ички НАК Herpes Симплекс тумоосу менен сайма (КЭС) ачкан же G9a да билдирген багыттарын алган жана G9a overexpression аныктоо үчүн какырыкты же кайталап кокаин менен мамиле ген сөз айкашынын кайра-кайра кокаин айынан жогорулатуу бөгөт коюу үчүн жетиштүү болгон. кайталап кокаин төмөнкүдөй сөз ого бетер көлөмүн көрсөтүү 12 менен кокусунан тандалган гендер бир катар тартып, биз G9a кыйла ушул гендердеги 50% күчөтүү сөздөр (кыскаруу байкалганМазмуну S4).
G9a сөз айкашынын кайра-кайра кокаин айынан репрессияны ортомчу суунун жүргүзүлсө протоколдун иш-чараларды аныктоо үчүн, ΔFosB үчүн мүмкүн ролун, дароо эле башында ген жогорку туруктуу жонулган продукт изилденип fosB. ёскён кокаин сыйлык тойгузуп жатат ΔFosB кокаин, кайра-кайра таасиринен кийин НАК топтобогонун (11). ΔFosB тартылган максаттуу гендин жараша жүргүзүлсө протоколдун Activator же repressor да ошондой иш-аракет кылышыбыз керек (3, 5, 6, 12). Колдонуу bitransgenic NSE-TTA × tetOP-ΔFosB чычкан ΔFosB сөз жеткен жаныбарлардын НАК жана көкүрөк striatum менен тандап кылба ала турган, (13), Биз НАК жылы H3K9me2 Кокаин жөнгө салуу жана KMTs боюнча ΔFosB сөз таасирин карап. ΔFosB overexpression эки H3K9me2 көлөмүн азайтуу үчүн жетиштүү болгон (Сүрөт. 1D) Жана G9a сөз айкашы (Сүрөт. 1E), Бул жолу кокаин кесепеттерин туурайм. Ал эми, ΔFosB тиешелүүлүгүнө жараша, GLP мээдеги бул аймакта билдиришине жана SUV39H1 жана EZH2, H3K9 жана H3K27 үчүн негизги trimethylating энзимдерди эч кандай таасир эткен кыскартуу эмес (Сүрөт. S4). көз карандысыз ΔFosB overexpression тутумун колдонуу менен бул маалыматтарды тастыктоо үчүн, wildtype жеткен чычкандар Adeno-байланыштуу вирус (AAV) бир күндүк-NAC эки тараптуу сайма алган ачкан же ΔFosB да билдирген багыттары. мээдеги бул аймакта ΔFosB жөнүндө Интернетте чагылдырылуусу-арачылыгы overexpression G9a сөз көлөмүн азайган (Сүрөт. 1E).
G9a мындай айкын жана конкреттүү жөнгө НАК нейрондордо атайын G9a сөздөр өзгөртүү кокаин үчүн жүрүш-жооп жөнгө же иликтөө үчүн түрткү берди. Wildtype чычкандар ачкан же G9a билдирген КЭС багыттын ички NAC дарыны кабыл алды, андан кийин дары сооп кыйыр чараларын камсыз бир калыс кокаин шартталган жер артыкчылыктуу парадигманы, жардамы менен талданды. НАК нейрондордо G9a жөнүндө Интернетте чагылдырылуусу overexpression жүрүш тестирлөө төмөнкү тастыктады (Сүрөт. 2A). G9a overexpression кыйла ачкан overexpressing жаныбарларга салыштырмалуу кокаин үчүн артыкчылык азайган (Сүрөт. 2B), Ошондой эле КР УАК жылы H3K9me2 көлөмүн көбөйдү (Сүрөт. 2C). G9a (G9aH1093K) бир Каталитикалык өлгөн мутантты Overexpression (14) Кокаин артыкчылык таасир эткен эмес (Сүрөт. 2B) Жана эч кандай бул мээ аймактагы H3K9me2 денгээлде таасир берген (Сүрөт. 2C).
андан ары кокаин жүрүш таасир G9a ролун изилдөө, жана НАК жылы G9a сөз айкашынын кайра-кайра кокаин айынан репрессияны тууроону өзгөчө, бойго жеткен G9aет / ет чычкан (14) Контролдоо катары CRE recombinase же ачкан билдирген AAV багыттын ички NAC дарыны кабыл алды. immunohistochemically тастыкталды УАК,-жылы G9a боюнча AAV-CRE далил (Сүрөт. S5), Бир кыйла орун аналоги эксперименттерде кокаин кесепетин кёбёйгён жана НАК жылы H3K9me2 өлчөмдө азайган (Сүрөт. 2D, E). G9a жана GLP бир сатыкта дары-дармек менен ингибиторун, BIX01294 (15-16), Энзим к¼рс¼тм¼ же ушундай кокаин үчүн жүрүш-жооп тиешеси бар же жогун аныктоо үчүн колдонулган. Чынында эле, УАК жылы H9K3me9 G2a жана GLP кыйла кокаин үчүн артыкчылык жогорулаган жана төмөндөгөн дары-дармек менен аталат (Сүрөт. 2F, G).
кокаин кайталап башкаруу НАК орто бадал нейрон боюнча dendritic үрөйүн тыгыздыгын жогорулатып (17), Excitatory glutamatergic боюнча иш өзгөрүүлөргө байланыштуу бир жараян бул нейрондордун көздөй күйгүзөт (18-19) Курчутулат дары үчүн жүрүш-жооптор (17, 20). Биз кайра кокаин менен НАК жылы G9a ошол иштин downregulation гипотеза НАК нейрон dendritic омурткасы жыштыгын жөнгө салуу КОКАИН жөндөмүн ортомчу мүмкүн. каршы G9a греч хроматин immunoprecipitation (Чип) колдонуу, биз мурда кокаин айынан dendritic пластикалык аткыланды келе жатат, алардын ар бири УАК, бир катар алыскы G9a ген максаттарын аныктаган (Сүрөт. 3A) (20-26). Биз кайра-кайра кокаин башкаруу кыйла милдеттүү G9a төмөндөгөн таап, бул ген көрсөтүүчүлөргө боюнча, ошондой эле H3K9me2 гээли (Сүрөт. 3B). Ал эми, курч кокаин башкаруу тез кокаин курч дозаны бергенден НАК 9 саат байкалган ошол эле ген көрсөтүүчүлөргө, G9a сөз көбөйүү менен шайкеш кээ бир G1a ишке (Сүрөт. S6). белгилүү ген көрсөтүүчүлөргө боюнча милдеттүү G9a анын сөз өзгөрүүлөр менен байланышта болсо да, мындай иш-чаралар НАК жылы G9a такое глобалдык де¾гээлдердеги ортомчулугу аркасында жаткан-жатпаганыбызды түшүнүксүз бойдон калууда жана / же G9a тандоодо айырмачылыктар курч төмөнкүлөр менен vs. кайталап кокаин башкаруу.
НАК көп сандаган пластикалык байланыштуу ген G9a анын жөнгө салуу боюнча, биз кайра кокаин дарылоо Бул мээ аймактагы G9a сөз тейлөө кокаин айынан dendritic омурткасы түзүүгө бөгөт коюу жетиштүү эле түздөн-түз же жокпу, карап. НАК жылы dendritic омурткасы кошулуу көмөк мурда көрсөткөн кокаин дарылоо протокол колдонуу (20), Биз КЭС-орунга илинди же КЭС-G9a же ийне менен жаныбарлар омурткасы тыгыздыгы каралат. Өткөн жыйынтыгы менен макулдашуу боюнча, биз кокаин дарылоо төмөнкү НАК жылы dendritic омурткасы тыгыздыгы бир кыйла өскөндүгү байкалган, G9a overexpression тарабынан толугу менен жабылган таасир (Сүрөт. 3C). жалгыз G9a overexpression кокаин жок чажыт dendritic омурткасы тыгыздыгы азаят үчүн жетиштүү эмес. Бул маалыматтарды толуктоо үчүн, G9aет / ет чычкан КЭС-CRE ичиндеги NAC сайма дарыларды кабыл алып, омуртка тыгыздыгы сан көрсөткүчтөрү менен кокаин жок КЭС-орунга илинди алган жаныбарларга салыштырып алды. G9a сөз далил кыйла НАК орто бадал нейрон боюнча омурткасы тыгыздыгы өскөн (Сүрөт. 3C).
НАК кийин кайталап кокаин менен G9a downregulation ΔFosB арачылык далил эске алып, биз кийинки бул макала себеп да НАК dendritic үрөйүн жөнгө салуу менен алектенген жокпу, карап. ΔFosB буга чейин dendritic пластикалык үчүн causally байланышкан эмес да, Cdk5 жана NFκB исламчыл үч, анын ичинде максаттуу, бир нече, ошондой тиешеси бар (20-23), жана НАК нейрондордо ΔFosB болгон туруктуу сөз айкашы кайталап кокаин дарылоо кийин dendritic омурткасы жыштыгы менен байланышта (27). Биринчиден, биз G9a жана H3K9me2 сөздөрдү downregulated, кокаин жок bitransgenic чычкандардын ΔFosB ошол кошулуу табылган (Сүрөт. 1D, E), G9a көптөгөн пластикалык байланыштуу ген үчүн милдеттүү түрдө азайган, ошондой эле алардын көбү ΔFosB өзү түздөн-түз максаттуу болуп көрсөтүлгөн (Сүрөт. 3D) (3, 6). Биз кийинки, УАК жылы ΔFosB менен ээледи overexpression олуттуу базалдык шарттарда dendritic омурткасы тыгыздыгы өскөн көрсөттү байкаган кайталап кокаин башкаруу төмөнкү окшош (Сүрөт. 3E). Тескерисинче, ΔJunD, ΔFosB жүргүзүлсө протоколдун ишин antagonizes басымдуулук кылган терс мутант белок менен НАК жылы overexpression НАК жылы dendritic омурткасы жогорулатат кайталап кокаин жөндөмүн бөгөттөлгөн (Сүрөт. 3C).
Биздин байкоо ΔFosB NAC жылы G9a сөздөр жөнгө салат жана ΔFosB жана G9a эле максаттуу гендердин кээ бир жөнгө салуу үчүн, ΔFosB жана G9a ортосундагы өз ара карап алып келди. курч кокаин G9a раммаларды G9a камалышы, көбөйгөн, кийин fosB ген G9a сөз айкашы, G9a үчүн милдеттүү түрдө тыюу салынган, кийин кайра кокаин, ал эми жогорулаган fosB ген тёмёндёгён (Сүрөт. 3A). Мындай G9a кайталап кокаин үчүн байкалган эмес кийин милдеттүү түрдө азайган с-кетүүсүнүн, G9a кайталап кокаин көбөйдү ченемдүү кайда (Сүрөт. S7). Бул, чынында эле шайкеш келет айырмаланып, fosB, с-кетүүсүнүн өнөкөт psychostimulant таасири менен, жасалма эмес, репрессияга жатат (5). bitransgenic чычкандардын ΔFosB overexpression кыйла G9a үчүн милдеттүү төмөндөтүү үчүн жетиштүү болгон fosb ген (Сүрөт. 3D). Мындан тышкары, G9a overexpression кайталап кокаин башкаруу төмөнкү көбөйдү ΔFosB сөздөр азайтуу үчүн жетиштүү болгон (Мазмуну S4). Бул маалыматтар G9a башында курч кокаин башкаруу боюнча ΔFosB кошулуу чектеп турган бир autoregulatory укурук сунуштайбыз. Бирок, ΔFosB кайталап дары таасири менен топтоп, ал G9a жана ошону менен өзүнүн мындан аркы кошулуу potentiates кысмакка.
Жыйынтыктап айтканда, биз НАК жылы гистон метионин methylation кокаин жооп нейрондордун ген сөздөр жөнгө сын тартылган эмес экенин көрсөттү. dendritic пластикалык бузук түрлөрүн жөнгө салуу үчүн белгилүү көптөгөн гендердин жүргүзүлсө протоколдун кошулуу аркылуу G9a жана H3K9me2 нече кокаин башкарууну төмөнкү репрессияларды, жарым-жартылай, кокаин артыкчылык өбөлгө түзөт. ген жакшыраак түшүнүүгө ээ болуу сыяктуу механизмдер аркылуу жөнгө салынуучу наркомания ооруулары комплекстүү биологиялык негизи биздин билимин жакшыртат жана көзкаранды оорулардын натыйжалуу дарылоо өнүктүрүүгө жардам алган.
Материалдар жана ыкмалар
Жаныбарлар жана дарылоо
башкача айтылбаса, чычкан менен колонияда беш капаска төрт түнөчүбүз 12 саат жарык / караңгы айлампасынын (7 тартып жарык: 00 AM 7 үчүн: 00 PM) туруктуу температурада (° C 23) менен ад либитум суу жана тамак-аш үчүн пайдалануу. Бардык мал протоколдор UT түштүк борборуна жана Синай тоосунда дары-мектебинде да IACUC тарабынан бекитилген.
кокаин тажрыйбаларды [immunohistochemitry, батыш өчүрөм, сандык ПКОдо (qPCR), microarray талдоо жана хроматин immunoprecipitation (Чип)] Анткени, 8- 10-жума-эркек C57BL үчүн / 6J чычкандар колдонулган. Жаныбарлар да "туздуу" (7 дарылоо наборун, ИМ) күн сайын денеге сайма дарыларды кабыл алып, "курч" кокаин (6 дарылоо туздуу + бир дарылоо 20 / кг кокаин-HCL, IP мг) же "кайра-кайра" кокаин (7 дарылоо 20 мг / кг кокаин-HCL, IP). Чычкандар акыркы мамиле төмөнкү 1 саат же 24 саат бирине курмандыкка чалынган. microarray изилдөө үчүн, жаныбарлар күн сайын же "туздуу" (15 дарылоо наборун, IP), "курч" кокаин (14 дарылоо наборун + 1 дарылоо 20 мг / кг кокаин-HCL, IP) менен кокаин "+ курч кайталап" мамиле ( 7 дарылоо туздуу + 8 дарылоо 20 мг / кг кокаин-HCL, IP) же "кайра-кайра чакыртып + курч" кокаин (7 20 мг / кг кокаин-HCL + 7 дарылоо туздуу дарылоо + 1 чакырык дарылоо 20 мг / кг кокаин-HCL, ИМ) жана жыйынтыктоочу дарылоо кийин 1 саат курмандыкка чалынган. жүрүм-турумдук эксперименттерде чычкандар контракттын пост-хирург бөлмөсүнө жана төмөндө сүрөттөлгөндөй 10 мг / кг кокаин-HCL, IP менен мамиле кылышкан. КЭС-ачкан жана КЭС-G9a-орунга илинди жугузуп төмөнкү dendritic омурткасы талдоо жана microarray тастыктоо үчүн, чычкан "наборун" менен мамиле кылган (5 дарылоо туздуу, IP) же "кайталап кокаин" (5 дарылоо 20 мг / кг кокаин-HCL, IP ) 3 күн бою, бул ийне менен протокол мурда Herpes Симплекс вирус болгон мөөнөттүн ичинде ядросунда (УАК) нейрондорду accumbens боюнча омурткасы тыгыздыгын жогорулатуу көрсөтүп турат (КЭС) катары transgene сөз (Кошумча булак S1). dendritic омурткасы талдоо үчүн колдонулган Mice акыркы мамиле төмөнкү 4 саат курмандыкка чалынган.
НАК нейрон менен чектелген G9a протоколдун жергиликтүү жок кылууну, оокат үчүн, башка майда-чүйдөсүнө чейин айтылып келе жаткан бир floxed G9a allele үчүн homozygous мутант чычкандар колдонгон (S2). CRE-тымызын биригип жуп айландырылып протоколдун нонсенс-арачылыгы ажыроо алып чыккан алкагында генин 22 үчүн тагылып 25 өндүрөт. Биз G9a толугу C57BL / 6J чычкандар менен backcrossed болгон чычкандар floxed колдонулат. Чычкандар НАК-Adeno байланышкан менен sterotaxically-ийне менен вирус (AAV) багыттарды (serotype 2) 7 жана 10 жума курак менен ачкан же CRE-орунга илинди билдиришкен. Иммуногистохимиялык анализ CRE-арачылыгы биригип жуп натыйжалуулугун текшерүү үчүн колдонгон (кара Кошумча сүрөт. S5). Биз жарыяланган докладдар менен ырааттуу AAV, G21a жаныбарларды 9 күн пост-хирург, анткени биригип жуп ийне чычкан floxed бул убакыт учурда туруктуу жана максималдуу болуп колдонгон (S3-S4). G9a жана ΔJunD overexpression эксперименттер ушундай ачкан, wildtype G9a-орунга илинди, Каталитикалык өлгөн G9aH1093K-орунга илинди же ΔJunD-орунга илинди же көрсөтпөө КЭС вирус багыттарды пайдалануу менен жүргүзүлдү (кара S2 G9a мдъг өнүктүрүү маселелери боюнча маалымат алуу үчүн). immunohistochemistry аркылуу байкалган КЭС overexpressing чычкандар, overexpression бул убакыт учурда максималдуу болгондуктан 3 күн пост-хирург колдонулган. Улам КЭС сөз убактылуу мүнөздөгү, ошондой эле AAV сөз бир кыйла туруктуу мүнөзгө ээ, КЭС багыттары AAV багыттары transgene сөз узак убакыт талап эксперименттеринде колдонулган, ал эми тез, кыска мөөнөттүү transgene сөз айкашы талап эксперименттеринде колдонулган. Эки багыттар көрсөтүлүп жатат, көп алдын ала изилдөө, afferent же бир нейрондун узун талчалары топтошуп ар кандай оору жок, ийне мээ аянттын чегинде гана нейрондордун клетка органдарын эте.
дары-дармек менен G9a / GLP ингибиторун аркылуу жүрүм-турум эксперименттердин үчүн, BIX01294 (25 нг / μl), чычкан sterotaxically эки Жылкыда мини-алуучу колонкалар, ошондой эле эки тараптуу жол cannulae, УАК кирип менен туташтырылган. Мини-насостор 12 чейин транспорт каражатын же үзгүлтүксүз жеткирүү (0.25 μl / саат) (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) же анын жүрүшүндө убакыт жүрүш баа коюлган 14 күн, дары демилгесин салдырууга саат ишке берилди.
Анткени ΔFosB overexpression тажрыйбаларды [батыш өчүрөм, qPCR жана Chip], эркек bitransgenic NSE-TTA × tetOP-ΔFosB чычкан (10 жума-эски) колдонулган, н туунду маал (маал өчүрүү 8 апта) жок болсо, чаап, мал күчтүү striatal уюмдаштыруу ΔFosB эркбилдирүүсүнө (чектелип көрсөтүлөтS5). Бул чычкандардын ΔFosB overexpression qPCR аркылуу тастыкталган. NSE- аркылуу бул маалыматтарды тастыктоо үчүнTTA × tetOP-ΔFosB чычкан, wildtype 8-жума жаштагы C57BL / 6J эркек чычкандар sterotaxically-ийне ички НАК ачкан же ΔFosB-орунга илинди же билдирүү AAV сызыктарын менен алынган. AAV багыттар алдайм жуктуруп жана bitransgenic ΔFosB overexpressing чычкандардын ортосунда түздөн-түз салыштыруу үчүн жол берип, мындай учурда, пост-хирургиялык 8 жума боюнча максималдуу ΔFosB сөздөр камсыз кылуу үчүн колдонулду. Интернетте чагылдырылуусу overexpression 8 жума боюнча чыр-хирург (15-арымын НАК шибегелер, сайынуучу сайтында астында изилдөө алынган) qPCR аркылуу тастыкталган. AAV-ачкан жана AAV-ΔFosB-орунга илинди overexpressing qPCR үчүн колдонулган эмес, чычкандар туздуу менен дарыланган (14 дарылоо наборун, IP) же кайталап кокаин (14 дарылоо 30 мг / кг кокаин-HCL, IP) 6 жумадан кийинки баштап хирургия. акыркы мамиле төмөнкү 4 күн, мээси бир vibratome боюнча жаныбарларды союп жана dendritic омурткасы талдоо үчүн колдонулган 4% paraformaldehyde менен белгиленген, жок.
Батыш олдоксон талдоо
14-арымын НАК шибегелер 1 мм coronal бөлүктөн турган дат баспас болоттон жасалган чычкан мээ булагы аркылуу алынган жана 1 M HEPES lysis туруучу (1% SDS) протеазынын жана phosphatase ингибиторлору камтыган sonicated эле алынган. 10-жалпы белок 30 мкг үлгүлөрү 18% SDS ЗАРИ боюнча electrophoresed алынган. Белоктор PVDF кабыкчаларындагы өткөрүлүп каршы H3K9me2 (чычкан monoclonal, 1: 500) же инкубатордук эле, анти-β-тубулин (чычкан monoclonal, 1: 60,000), анти-жалпы гистон H3 (коён polyclonal, 1: 5,000), анти-орунга илинди (муштум кыртышында бирдей ээледи сөз текшерүү үчүн) (коён polyclonal, 1: 1000), анти-H3K27me3 (коён polyclonal, 1: 500) же каршы актин антителолор (чычкан monoclonal, 1: 60,000) түнөөгө 4 ° C (бардык кабыкча 5% сүт же 5% оору жана кан Методикалык албай). Кабыкча анда peroxidase-ачаар орто антитело (1 менен инкубатордо болгон: 15,000-1: 60,000 негизги греч жараша) жана групп SuperSignal Батыш Дура субстрат менен ченеп чыкты. Bands NIH Image J үчүн программаларды жана маалыматтар H3K9me2 топтору менен сан көрсөткүчтөрү алынган актин же β-тубулин да таркады жана бирдей жъктёё ъчън көзөмөлдөө гистон H3 суммасында. Кайталап кокаин актин деӊгээлине эч кандай таасир эткен (Сүрөт. S8) Же жалпы гистон 3 (Сүрөт. S1) НАК-жылы. Мындан тышкары, КЭС-G9a-ачкан жана КЭС-G9aH1093K-орунга илинди жугуштуу НАК менен β-тубулин жалпы санына эч таасирин тийгизген (Сүрөт. S8).
Immunohistochemistry
Буга чейин айтылгандай, Mice chloral гидраты бир түпкө менен наркоздо жана 4% paraformaldehyde менен эле иштеген бир же эки immunohistochemistry текшерилген чейин эле (S6). Кыскасы, кийинки негизги Баткен 30 мкм (35% кант жок dendritic омурткасы талдоо үчүн колдонулган Баткен 100 мкм бөлүмдөрдө бир vibratome боюнча жаныбарларды союп алынган) учурда жаныбарларды союп чейин бөлмө температурасында түнү 30% кант боюнча инкубатор болгон. Эркин-калкып НАК бөлүктөрү 1X PBS менен жууп бөгөттөлгөн (3% кадимки эшек кан, 0.1% tritonX, 1X PBS), кийинчерээк анти-орунга илинди (тоок polyclonal, 1: 8000) менен инкубатордо болгон жана / же каршы G9a (коён polyclonal , 1: 500) чечүүгө тоскоолдук антителолор. dendritic үрөйүн анализи Рубрикалар 1 бир коен polyclonal каршы ачкан греч инкубатордо болгон: 200. түнү-инкубаторлордун кийин, УАК бөлүктөрү 3X Төртиликтин 10 мүнөт 1 жолу жууш, Cy2 жана / же Cy3 Fluorescent акыр 1 саат 2X PBS тосуп чечүү орто антителолор менен инкубаторлор менен алынган. микроорганизмдер изилдөө үчүн колдонулган Рубрикалар түнү бөлмө температурасында орто антителого инкубатордо болгон. Ядролук биргелешип бойоктор 1X PBS жылы DAPI камтыган (1: 50,000) бөлүмдөрдү incubating жетишкен 10 мүнөт. Рубрикалар дагы бир жолу жууп, этанол суусуздануу менен жана DPX менен күчөп жатты. Бардык бөлүмдөр confocal микроскопия жана башка ыкмаларды пайдаланып чагылдырылган жок.
РНК обочолонуп жана qPCR
Эки тараптуу 14 калибрдүү NAc соккулары Тризолдо бир тектүү болуп, өндүрүүчүнүн көрсөтмөсүнө ылайык иштетилген. РНК RNAesy Micro мамычалары менен тазаланып, спектроскопия менен РНК 260/280 жана 260/230 рационунун> 1.8 болгонун тастыктады. Андан кийин РНК Bio-Rad iScript комплектинин жардамы менен транскрипцияланган. cDNA qPCR аркылуу SYBR Green колдонгон. Ар бир реакция эки же үч нускада жүргүзүлүп, ΔΔCt ыкмасына ылайык талданып, буга чейин глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) нормалдаштыруу контролу катары колдонулган (S7). көрүү кошумча стол S5 РНК Primer ырааттуулугу үчүн.
ДНК microarray талдоо
Төрт топтор (топ күнүнө 3 көз карандысыз биологиялык копиялайт) 12 microarrays суммасы, microarray изилдөө үчүн колдонулган жок. акыркы кокаин сайынуу төмөнкү 1 саат, жаныбарлар тездик менен сөөгү жана мээси жок жана муз салынган. НАК жүргүзгөн анатомиялык изилдөөлөрдүн бир 15-арымын ийне сериясы аркылуу алынган жана РНК казылып чейин тез кургак муз камакка алынганын билдирген. Эки тараптуу шибегелер топтун 12 чычкандар суммасы, ишке ашырган, төрт жаныбардын топтолот. РНК обочолонуп, microarray иштетүү жана маалыматтарды талдоо мурда айтылгандай жасаган (S8). Кыскача, РНК бөлүндү жана жогоруда айтылгандай тазаланды жана Агиленттин Биоанализаторунун жардамы менен сапаты текшерилди. Illumina MouseWG-6 v2.0 массивдерине тескери транскрипция, күчөтүү, этикеткалоо жана гибриддештирүү UT Southwestern микроаррай өзөгү тарабынан стандарттык процедуралардын жардамы менен жүргүзүлдү. Чийки маалыматтар Beadstudio программасынын жардамы менен алынып салынган жана квантикалык нормалдаштырылган. Нормалдаштырылган маалыматтар GeneSpring программасынын жардамы менен анализделип, 1.3 эселенген өзгөрүү чекитинин маанилүүлүк критерийлерин колдонуп, жалпы мааниге ээ p-0.05 катаал эмес p мааниси менен чектелген.
Биз бир нече себептерден улам бул маалыматтарды ишенимдин жогорку даражасын дешет. Биринчиден, бардык жаныбарлар эле шарттарда, катышкан, мамиле жана ошол эле учурда өлтүрүлгөн. Ошондой эле, ар бир РНК менен катар иштеп, ошол эле учурда аткарылган. Экинчиден, муну менен биз айрым өзгөрүүсүнөн жана статистикалык күчүн жогорулатуу үчүн келишпестиктерди азайтуу, шөкөттөп үлгүсүндөгү күнүнө ме- Arrays жасаган жана бир нече жаныбарларды пулу (S9). Үчүнчүдөн, биздин изилдөө үчүн колдонулган маалыматтарды талдоо критерийлери бул критерийлер intersite кайра жана региондор аралык жана intraplatform кайра жогорку даражасын камсыз кылуу үчүн бекитилген алынган MicroArray Сапатты башкаруу долбоору тарабынан сунуш кылынат (S10-S11).
ээледи багыттарды куруу
Байланыштуу ээледи тараткычтарды коюу көлөмү чектөөдөн, wildtype G9a же үчүн тизилишин код (G9a) же Каталитикалык өлгөн G9a (G9aH1093K) адам дароо эрте cytomegalovirus колдоочусу көзөмөлүндө ачкан билдирген bicistronic p1005 + КЭС плазмиддердин салып subcloned алынган (CMV) (G9a коюу көлөмү AAV-3.96 сызыктарын максималдуу коюу ашып кеткен) ~ 2 KB, болду. IE4 / 5 колдоочусу G9a сөздөр айдайт. Үзүндүлөр PmeI Klenow менен Орой акыры ligations мамиле аркылуу bicistronic p1005 + КЭС плазмиддердин кирип subcloned жана EcoRI G9a (pcDNA3.1 чейин) айлануу жана CIP EcoRI өздөштүрүлөт төмөнкү p1005 + мамиле. КЭС-ΔJunD-орунга илинди өндүрүү үчүн, EcoRI чектөө сайттарга коштоосунда ΔJunD боюнча коддоо ырааттуулугу EcoRI сайтына камтыган Primer олигонуклеотиддер колдонуп ПКО тарабынан иштелип чыккан. ПКО продукт анда p1005 + багыты EcoRI сайтына кирип байлашат болду. сүрөттөлгөндөй AAV багыттарын колдонуп ээледи-арачылыгы ген жеткирүү менен жетишилген НАК нейрондордо CRE recombinase Жергиликтүү сөз болду (S12). Ачкан же N-терминалдык CRE үчүн ачкан айкалышы кошундулар AAV-2 бир жонулган донордук Кабыл ырааттуулукта жана polyadenylation белги менен CMV үндөгөндөй камтыган багытка алып subcloned болду. Бардык тараткычтарды канчоосу dideoxy-тартибин тарабынан тастыкталган. Буга чейин айтылгандай, Интернетте чагылдырылуусу багыттар, үч-transfection, жардам акысыз ыкмасы менен даярдалган (S13). Тазаланган вирус -80 ° С да сакталган. Интернетте сапаты HEK293 клеткаларда баа жугуштуу titer менен бааланган. AAV-ΔFosB-орунга илинди VIRUSES ушундай даярдалган. КЭС-CRE үчүн CRE сөз нейрондордун ууландыргычтыкка CRE сөздөр азайтуу жана алдын алуу үчүн, IE4 / 5 колдоочусу, былай бир Ires колдоочусу менен шартталган (кара S14 ээледи курулуш). бардык учурларда, ээледи overexpression бекитилген, экөө тең экстракорпоралдык жана бододо, qPCR жана программалар аркылуу immunohistochemically хирургия төмөнкү НАК чектелген сөздөр өзгөрүүлөр тастыкталган.
Stereotaxic хирургия
Under кетамин (100 мг / кг) / xylazine (10 мг / кг) анестезия, чычкан майда мал stereotaxic аспап жайгашкан, ал эми мээ бетиндеги туш болгон. Отуз үч арымын шприц ийне эки тараптуу 0.5 бурч ° бир 10 боюнча НАК салып тумоосу μl байлаткан колдонулган (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) 0.1 өлчөмүндө μl / мүн өзгөртүлгөн. чычкандар 2 күн шарттаган жайгаштыруу дуушар чейин калыбына келтирүү үчүн жүрүш-тестирлөө кабыл AAV сызыктарын үчүн колдонулган уруксат берилген, ал эми КЭС сайма кабыл Жаныбарлар, 20 күн хирургиясы төмөнкү өндүрүүгө уруксат берилди. Бул жолу эки багыттын үчүн максималдуу ээледи-арачылыгы transgene сөз мезгили менен туруктуу. BIX01294 каражаттардан үчүн, эки кичи-насосторду ар бир оюк артындагы лдына жайгашкан болчу. Cannulae жайгаштыруулар bregma тартып НАК жогорудагы эки кичинекей мээ тешик бургулоо, ошондой эле cannula жеткирүү менен жетишилген (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Чычкандар 4 төмөндө сүрөттөлгөндөй кокаин үчүн жер аналоги жол-жобосун башынан чейин күн 5 үчүн хирургиялык өндүрүп берүүнү талап кылууга уруксат берилген.
Шартталган жер артыкчылык
жер аналоги жол-жобосу төмөнкүдөй өзгөртүүлөрдү киргизүү менен мурда айтылгандай өткөрүлдү (S7). Кыскача айтканда, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP же HSV-GFP интра-NAc тундурмаларынан 1093 күндөн кийин, чычкандар кондиционердик бөлмөлөргө жайгаштырылды, алар үч чөйрөдөн турат. Эки кондиционер бөлмөлөрүнүн экөөнө тең олуттуу артыкчылык көрсөткөн чычкандар изилдөөдөн чыгарылды (<10% бардык жаныбарлар). Андан кийин кондиционердик топтор тең салмактуу болуп, ал дагы деле болсо болушу мүмкүн болгон камеранын бир тараптуулугун эске алышкан. Кийинки күндөрү жаныбарларга эритинди сайылып, түштөн кийин бир камерада 30 мүнөт камалып, андан кийин кокаин (10 мг / кг, ip) сайылып, кечинде экинчи бөлмөгө 30 күн камалып, 2 күн (эки туздуу жана эки кокаин жупташтыруу). Сыноо болгон күнү чычкандар 20 мүнөттөй дарыланбай эле кайра аппараттардын ичине жайгаштырылып, кайсы жагын жактыргандыгын баалоо үчүн сыналды. Кокаинге локомотордук реакциялар баңги заттарды дарылоонун натыйжалуулугун камсыз кылуу үчүн кокаин-жупташкан бөлмөлөрдүн нурлары менен бааланган. AAV жана BIX01294 CPP тажрыйбалары үчүн бир аз өзгөртүлгөн протокол колдонулган. Жаныбарларга дагы бир жолу туз же кокаин (10 мг / кг, ip) сайылып, атайын бөлмөлөрдө 30 мүнөттүк сеанстарда кармалды, бирок анын ордуна күнүнө бир гана жолу 4 күн кондиционерленип, андан кийин 5-күнү сыноо жүргүзүлдү (жаныбарлар шартталган кечинде жана дарылоо ыкмалары кезектешип турду). Бардык топтор үчүн, локомотивге вирустук же ингибитордук дарылоо таасирин тийгизбеши үчүн, тузга жооп катары баштапкы локомотив бааланган.
Тамырга кокаин өз алдынча башкаруу
Эксперимент башында эркек өспүрүм Лонг-Evans келемиш, салмагы 230-250 г., алынган. Алар бир humidity- жана температура көзөмөлдөгөн чөйрөдө ачып, тескерисинче 12 саат жарык / караңгы айлампасынын (9 өчүрүп жарык: 00 Жоопсуздарды) менен бирге ад либитум тамак-аш, суу алуу мүмкүнчүлүгү. Радж алардын жаңы айлана-чөйрөгө жана эксперимент башталганга чейин 1 жума бою күн сайын катышкан болгон Хоккайдо уруксат берилди. Бардык жол-жоболор Лабораториялык жаныбарларды сактоо жана пайдалануу үчүн Саламаттык сактоо Guide Улуттук институту менен ылайык жүргүзүлөт жана Синай тоосу Кудайдын Animal сактоо жана пайдалануу боюнча комитети тарабынан жактырылган. өз алдынча башкаруу жабдуулар буту жүрүм-өлчөө үчүн Infrared устундары менен жабдылган эле. Буга чейин айтылгандай, жергиликтүү өз алдынча башкаруу жүзөгө ашырылган (S15-S16) изофлуран (2.4-2.7%) наркозунун астында оң жактагы венага салынган катетер менен. Катетерлерди 0.1 U гепарин жана ампициллин (10 мг / кг) камтыган 50 мл туздуу эритме менен жуушту. Операциядан кийин бир жума калыбына келгенден кийин, өзүн-өзү башкаруу боюнча тренинг жарык / караңгы айлампанын караңгы фазасында башталды. Белгиленген коэффициент-3 (FR0.75) күчөтүү графиги боюнча жаныбарларга кокаинге (1 мг / кг / инфузия) күн сайын 1 сааттык кирүүгө уруксат берилди, мында 1 активдүү рычаг басуу дары-дармектердин бир жолу куюлушуна алып келди. Келемиштер 6 күндөн кийин кокаин ичүүнү турукташтырды (<15% катары менен 3 күн аралыгында жооп курсунун өзгөрүшү, жок дегенде 75% күчөтүлгөн рычагга жооп берди »). Акыркы өзүн-өзү башкаруу сессиясынан 24 саат өткөндөн кийин, чычкандардын башы тез кесилип, мээси тез алынып, РНКны бөлүп алуу жана qPCR үчүн иштелип чыккан.
Хроматин immunoprecipitation (Чип)
Буга чейин айтылгандай, Fresh НАК шибегелер чип КЖЧнын кайчылаш бири-бири менен байланышкан жана даяр болушкан (S17-S18) Анча-мынча өзгөртүүлөрдү эсепке алуу менен. Кыскасы, 4 14-арымын НАК малдын күнүнө шибегелер (үлгүсүндөгү күнүнө топтолот 5 жаныбарлар) чогултулган, 1% КЖЧнын менен кайчылаш бири-бири менен байланышкан жана 2 M Glycine менен -80 ° С нөлдөн алдында өчүп калды. 1 sonication татып чейин күн, кой каршы коендой / Чычкан (жаан-греч жараша) IgG магниттик бусы каршы G9a да тиешелүү магниттик теспе incubating менен даярдалган (коён polyclonal Chip-класста) же каршы H3K9me2 (чычкан monoclonal Chip-классты) түнү 4 боюнча антителолор бөгөттөөлөр чечүүгө айлануу астында C °. Буга чейин айтылгандай, Tissue sonication жана хроматин кыркын жүргүзүлдү (S17). sonication кийин, хроматин бирдей шогырлануы жаңы түтүктөр өткөрүлүп берилген жана ~ акыркы азыктарын 5% "киргизүү" башкаруу болуп кызмат кылышы үчүн, аман калган. жактагы мончокту / антитело аралашмалардын кылдат жууп жана resuspension кийин, антитело / шарик аралашмалардын бирдей көлөмдө (~ 7.5 мкг антитело / үлгү) ар бир хроматин үлгүдөгү кошулуп жана 16 ° С айлануу астында ~ 4 саатка инкубатордо болгон. Үлгүлөр ары ПКО тазалануу саймасы менен 65 ° С түнү ДНК тазалануу алдында жууп, кайчылаш-байланыштуу жокко чыкты. ДНК тазалануу кийин, үлгүлөр qPCR дуушар болушкан жана алардын тиешелүү "киргизүү" деп мурда текшерүүсүн сүрөттөлгөн (из нерседей жокS17). чычкан polyclonal каршы IgG антитело колдонуп Жөнөкөй чычкан IgG immunoprecipitations да сигнал үн күчөткүч тиешелүү байытуу үчүн контролдук ишке ашырылган. Аденин phosphoribosyltransferase (батир) кокаин жана ΔFosB overexpression тажрыйба үчүн терс контролдоо катары колдонулган. көрүү Кошумча стол S5 колдоочусу Primer ырааттуулугу үчүн.
Dendritic омурткасы талдоо
бододо, нейрондордун Учак жөнгө G9a ролун изилдөө үчүн, биз мурда төмөнкүдөй өзгөртүүлөрдү киргизүү менен сүрөттөлгөн ыкмаларын колдонгон (S1). КЭС-орунга илинди жумшалбаса үч күндөн кийин, КЭС-G9a-орунга илинди, КЭС-ΔJunD-орунга илинди (бардык VIRUSES wildtype C57Bl / 6J чычкандар колдонулган), же КЭС-CRE-орунга илинди (G9a колдонулганет / ет чычкан) ээледи сөз максималдуу болуп калганда, чычкан эле иштеген, мээси cryoprotected жана кийинчерээк vibratome боюнча 100 мкм боюнча жаныбарларды союп алынган. Рубрикалар андан жогору (Immunohistochemistry карагыла) сүрөттөлгөндөй ачкан каршы антитело колдонуп immunostained алынган. омурткасы номерлери жөнүндө G9a overexpression жана нокаут таасирин баалоо үчүн, ошондой эле ΔJunD overexpression менен айтканда, биз ачкан-көрсөтпөө НАК орто орто Дендриттердин дегенде 1 мкм данага нейрон болжол менен 2-299 neurites боюнча үрөйүн санын ченегенде тикенектүү бадал басып нейрондор (MSNs). MSNs мээдеги бул аймактагы КЭС негизинен DARPP-32 билдирген нейрондорду түртүүдө көрсөткөн УАК, ошондой эле буга чейинки отчеттордо башка нейрондордун калкынын morphologically айырмаланган экенин эске алып (S19), Биз MSNs гана бул изилдөө боюнча баа берилди деп ишенебиз. Ар бир жаныбардын, биз топтун ~ 6-8 3-4 жаныбарлар нейрондор карап (7 топтор), орточо балл, андан кийин статистикалык талдоо жүргүзүү үчүн ар бир жаныбардын алынган болчу. НАК омурткасы тыгыздыгынан ΔFosB overexpression кесепеттерин изилдөөгө арналган эксперименттер AAV багыттары ачкан же ΔFosB-орунга илинди убакыттын узак убакыт бою (8 апта) билдирүү үчүн колдонулат деп кошпогондо, жогоруда айтылгандай, ошол сыяктуу эле жүргүзүлгөн. Бардык КЭС сүрөттөлүштөр 100X мунай сууга максаты менен confocal микроскоптун жардамы менен (AAV сүрөттөлүштөр 63X мунай сууга максаты менен басып алынган) тартылган. Сүрөттөр 1 негизсиз бөлүмүндө pinhole топтому жана 1024 × 1024 көлөмү менен сатып алган. Dendritic узундугу слайддар эксперименталдык сканерин чейин код деп NIH Image J программалык жана омурткасы номерлери, баштапкы экспериментаторго тарабынан сокур эсептелчү менен өлчөнгөн. дендрит менен 10 мкм күнүнө үрөйүн орточо саны эсептелген.
статистикалык анализ
Жаратуучунун жана эки тараптуу ANOVAs көбүрөөк эки топтору менен коюлтулган жер артыкчылык жана dendritic омурткасы талдоо үчүн маанисин аныктоо үчүн жасалган. Студенттин т сыноолорго qPCR, анын ичинде башка салыштырууларды, батыш өчүрөм үчүн колдонулуп жатты, G9a жылы КЭС-CRE үчүн КЭС-орунга илинди салыштыруу dendritic омурткасы талдооет / ет чычкандар, микроарра анализдери (жогоруда караңыз) жана хроматин иммунопреципитация тажрыйбалары. Пландаштырылган студенттин t-тесттери дары-дармектер менен дарылоонун жана вирустун олуттуу таасирлерин тастыктаган ΔFosB ашыкча экспрессиясынан кийин дендриттик омуртканын тыгыздыгын эки тараптуу ANOVA анализинен кийин колдонулган. Сүрөттөгү легендаларга кирген бардык баалуулуктар ± SEM (* p-0.05; ** p <0.001) дегенди билдирет. Үчүн деталдуу статистикалык анализдер Инжир. 1-3 негизги текст боюнча келтирилген: Толук Figure Legends ичинде статистика.
Шилтемелер
Мен материалдарды эч аттуу кол жазмасынын камтылган деп ырастайт Кокаин айынан пластикалык менен гистон Methyltransferase G9a негизги ролу Буга чейин жарыяланган же Интернеттен, анын ичинде башка кароосунда турган болду.
жаныбарлардын колдонуу менен жасаган бардык иш Техас түштүк борборуна институтун жана Синай тоосунда дары-мектебинде да институттук жана IACUC нускамасына ылайык жүргүзүлгөн.
Шилтемелер жана Кошумча маалыматтар
;