(АДАМ) Жүрүм-турум жана өнөкөт Кокаин үчүн түзүмдүк жооптор Feedforward Loop тартуу ΔFosB жана Калий / Calmodulin-каранды протеин Креатинкиназа Ядро Accumbens дартынын II талап (2013)

копиялоо себеби ΔFosB жана мээ-байытылган кальций / calmodulin көз каранды белок Креатинкиназа II (CaMKIIα) ядро ​​accumbens (УАК) эки белоктор дары жоопторду курчутулат ортомчу болгон, кокаин же кыянаттык менен башка psychostimulant дары өнөкөт таасири менен коштолот . ΔFosB жана CaMKIIα да эки НАК жылы AMPA протоколу сезгич сөздөр жана милдеттерин жөнгө салуу, УАК орто бадал нейрон (MSNs), жана буту кокаин үчүн маа- боюнча dendritic омурткасы түзүү, бул молекулалар менен тикелей байланышы күнгө чейин чалгындалган. Бул жерде биз ΔFosB белок-турукташтырууга Ser27 боюнча CaMKIIα тарабынан phosphorylated деп көрсөтүүгө жана CaMKII болуп саналат чычкан НАК жылы ΔFosB Кокаин-арачылыгы топтоо үчүн зарыл.

Тескерисинче, биз ΔFosB бододо CaMKIIα ген сөз кокаин кошулуу үчүн зарыл жана жетишерлик болгон да, Д иргеп бир таасир көрсөтөт₁НАК номиналдык аймак боюнча белгиси MSNs.

Мындан тышкары, ΔFosB менен НАК overexpression кийин НАК MSNs боюнча dendritic үрөйүн жана кокаин үчүн жүрүш-туруш ийкемдүүлүгүн кёбёйгён дарстарында да CaMKII көз каранды болуп саналат.

Маанилүүсү, биз НАК жылы ΔFosB биринчи жолу кошулуу жана CaMKII үчүн көрсөткөн адам кокаин көз каранды, Келечектеги дарылык кийлигишүү мүмкүн максаттарды деген. Бул маалыматтар ΔFosB жана CaMKII өнөкөт кокаин жооп мээнин сыйлык Байбичелер жөнгө салуу үчүн негизги механизми катары бир клетканын-Секи- жана мээ-аймак-айкын оң feedforward укурук менен алек экенин белгилейт.

тааныштыруу

далил жогорулатуу ген сөз өзгөрүүлөрдү колдойт наркоманиянын механизмдерин салым (Робисан жана Nestler, 2011). Бул өзгөртүүлөрдүн бир маанилүү арачы ΔFosB, бир үй-бүлө жашап кетүүсүнүн копиялоо жагдай (болотNestler, 2008). кыянаттык менен дээрлик бир препараттын Өнөкөт башкаруу ядросу accumbens жылы ΔFosB узак созулган топтолушун алдыруучу (УИА), бир лимбикалык аймакта сыйлык жүрүш үчүн абдан маанилүү. SҮч дарстарында D1 тинейджер кабылдагычтарга билдирет НАК орто бадал нейрон (MSN) классына айкын көрүнөт. Бул D1-түрү НАК MSNs жылы ΔFosB боюнча Inducible overexpression кокаин жана Morphine үчүн, таяныч жана үзүрлүү жооп көбөйтөт (Kelz .Удаалаш., 1999; Zachariou .Удаалаш., 2006) Жогорулаган кокаин өзүн-өзү башкаруу, анын ичинде, (Колби .Удаалаш., 2003). Мындан тышкары, ΔFosB жүргүзүлсө протоколдун иш генетикалык же ээледи блокада бул дары-пайдалуу таасирлери (азайтатZachariou .Удаалаш., 2006), ΔFosB бул туруктуу дарстарында жана өнөкөт дары тарабынан НАК жасалма узакка өзгөрүүлөрдүн маанилүү арачы деп көрсөтүү.

ΔFosB (башка бардык FOS үй-бүлө белокторго салыштырмалуу) өзгөчө туруктуулук эки молекула бир ички менчиги болуп саналат, улам degron домендердин толук узундугу ушул жылышышы FosB (Карле .Удаалаш., 2007), Жана кандайдыр бир жөнгө салынуучу жараян. ΔFosB phosphorylated болот экстракорпоралдык жана бододо, Ser27 боюнча, жана бул мамиле мындан ары ΔFosB турукташууда, ~ 10 эсе, клетка маданият жана NAC бододо, (Ulery-Рейнолдс ж.б.., 2009). Ser27-ΔFosB казеиндин Креатинкиназа-2 үчүн субстрат болуп далилденсе да экстракорпоралдык (Ulery .Удаалаш., 2006), Анын механизми боюнча бододо, phosphorylation белгисиз бойдон калууда.

Кальций / calmodulin көз каранды белок Креатинкиназа II (CaMKII) кадыр-билдирди серин / threonine Креатинкиназа кимдин α жана β isoforms dodecameric зрели менен гетеросексуалдык-holoenzymes пайда болот бододо,Жана алары менен бир нече түрлөрүн үчүн маанилүү шарт болуп саналат (Lisman .Удаалаш., 2002; Colbran жана Браун, 2004). CaMKIIα өнөкөт amphetamine менен НАК сөөктөрүндө тандап башчыны да ынандырууга болот (Мөөрөмөк .Удаалаш., 2010), Ошондой эле КР УАК сөөктөрүндө CaMKII ишин дары-дармек менен блокада amphetamine үчүн жүрүш-туруш маа- азайтат (Мөөрөмөк .Удаалаш., 2008) Жана кокаин (Пирс .Удаалаш., 1998), Бул НАК аймак боюнча CaMKIIα менен ээледи overexpression буту лугун жана amphetamine өзүн-өзү башкарууну жакшыртат, ал эми (Мөөрөмөк .Удаалаш., 2010). CaMKIIα AMPA протоколу кабылдагыч исламчыл жана тездиги аркылуу сыйлык жүрүм-турумуна таасир этиши мүмкүн (Пирс .Удаалаш., 1998), CaMKIIα иши узак алары бир нече түрлөрүн AMPA кабылдагыч милдетин жана кичинекей-максат менен байланышта болгон деп (Malinow жана Суши, 2002).

Бул адабият ΔFosB жана CaMKII ортосунда бир нече окшош көрсөтөт: эки кыянаттык менен дары-дармектерди бир нече жүрүш таасиринен үчүн зарыл жана жетиштүү болгон, ар кандай нейрондордун клетка түрлөрү боюнча dendritic ийнелери upregulate бододо, (Jourdain .Удаалаш., 2003; Maze .Удаалаш., 2010), Жана AMPA кабылдагыч Модулатион аркылуу өздөрүнүн жүрүш-туруш таасири жок дегенде бир этет (Kelz .Удаалаш., 1999; Malinow жана Суши, 2002; Vialou .Удаалаш., 2010). Бул окшош карабастан, ΔFosB жана CaMKII ортосунда эч кандай иш шилтеме белгилүү. Бул жерде биз ΔFosB жана CaMKII ортосундагы өз ара жөнгө салууга өбөлгө түзөт, ал эми эки белоктор кокаин менен башчыны да ынандырууга болот НАК орбитада бир D1-түрүн MSN-айкын тоют-алдыга луп түзүү жана кокаин жоопторунун бир катар жөнгө экенин көрсөткөн бододо,.

Баруу:

Материалдар жана ыкмалар

Эксперимент 1: iTRAQ Proteomic НАК Shell жана Корак кийин Кокаин мамиле анализи (сүрөт 1A)

Бойго жеткен (8 апта) эркек чычкандар 20 мг / кг кокаин же туздуу транспорт IP күнүнө бир жолу жети күн ишке алынган. акыркы сайган 24 саат, УАК кабыгы жана негизги microdissected болду (сүрөт 1A) Жана Flash токтотулган. iTRAQ талдоо мурда айтылгандай жасаган (Росс .Удаалаш., 2004; Davalos .Удаалаш., 2010).

Figure 1

кокаин менен НАК жылы CaMKII боюнча Shell конкреттүү дарстарында

Эксперимент 2: Rat НАК Корак жана Shell кийин Кокаин мамиле протеин өзгөрүүлөр аныктоонун (Сүрөт 1B-D)

Бойго жеткен (8 апта) эркек чычкандар 10 мг / кг кокаин же туздуу транспорт IP күнүнө бир жолу, таяныч жазуу бөлмөлөрдүн жети күн ишке алынган. Таяныч кокаин саюудан жооптор (5 мг / кг IP) кокаин менен мурда мамиле жаныбарлардын жазылып алынган ( "өнөкөт" деп аталган) жана какырыкты менен мамиле кылгандардын бир бөлүгү ( "курч" деп аталат), жана буту-жооптор наборун үчүн жалгыз калган өнөкөт туздуу мамиле жаныбарлардын ( "туздуу" деп аталган) белгиленген. Таяныч иш сынамыгын айтылгандай жасаган (Hiroi .Удаалаш., 1997). Кыскасы, Эркегинин келемиш 18 мүн habituate үчүн "× 24" 30 PAS ачык-талаа жазуу ячейкаларды (Сан-Диего инструменттери) жайгаштырылган, какырыкты бир IP сайма дарысын жана кошумча 30 мүн көзөмөлгө алынган жана берилген 5 бирдиктүү IP ийне / кг кокаин мг жана 30 мүн мониторинг.

Бул акыркы куюуну төмөнкү 24 саат, чычкандар нейрондордун белок баскычтарында жана phospho-мамлекеттердин боюнча анестезия кесепеттерин болтурбоо үчүн оорутпай эле чириген жок. Brains сериялык бир 1.2 мм матриксиндеги кесинди алынган (Брейнтри Илимий) жана максаттуу кыртыш кездешүүчү түрдөгү туздуу камтыган протеазынын-жылы алынып салынган (Roche) жана phosphatase (Сигма Алдрех) бир 14 арымын НАК өзөгүн сериясы жана калган бир 12 арымын сериясы аркылуу ингибиторлору НАК катмары үчүн кыртыш (кара: сүрөт 1A) Ошол замат кургак муз токтотулган. Үлгүлөр барак Ripa туруучу жарык sonication боюнча гомогендүү алынган: 10 MM Tris базаны, 150 мм натрий хлор, 1 MM EDTA, 0.1% натрий dodecyl кычкыл, 1% Triton X-100, 1% натрий deoxycholate, рН 7.4, протеазынын жана phosphatase ингибиторлору ошондой эле жогоруда көрсөтүлгөн. Laemmli Санитардык тышкары кийин, белоктор 4-15% polyacrylamaide градиент ЗАРИ (критерий системасы, BioRad) боюнча бөлүнүп, өндүрүүчүсү протоколдорго ылайык Батыш өчүрөм Odyssey системасын (Li-Кор) колдонуу менен аткарылган.

Эксперимент 3: Rat НАК Корак жана Shell кийин Кокаин коюунун протеин өзгөрүүлөр аныктоонун (сүрөт 1E)

Бойго жеткен (8 апта) эркек чычкандар 10 мг / кг кокаин же туздуу транспорт IP күнүнө бир жолу жети күн ишке алынган. 14 күн акыркы сайган, туздуу суу менен мамиле жаныбарлар башка туздуу сайма берилген (аталган "туздуу) жана кокаин менен мамиле жаныбарлар башка туздуу сайма берилди (14 күн алуу же" 14d WD ") же кокаин саюудан ( тартуу үчүн "14d WD Чал" деп аталат). акыркы дозасы сайылгандан кийин бир саат, жаныбарлардын чириген жана Батыш өчүрөм эле жасалган Experiment 2.

Эксперимент 4: Кокаин өзүн-өзү башкаруу кийин Rat НАК Корак жана дартынын протеин өзгөрүүлөр аныктоонун (Сүрөт 2A-C)

Радж үйрөтүлгөн өзүн-өзү башкаруу 0.5 мг / кг / кокаин келүүчү белгиленген-катышы боюнча бир саат сессияларына 1 тартибине тогуз күн болду. тогуз базалык Отурумдан кийин, чычкандар Акыркы эки сабакта боюнча кокаин тамактарды салмактуу эки топко бөлүндү. келемиштер бир топ өз алдынча башкаруу кокаин (0.5 мг / кг / мунун) бир саат сессияларында (кыска кирүү, Бааша) алты-с жыйналыштарына чычкандар өз алдынча башкарылган кокаин башка топ (көп кирүү, ал эми уруксат берилди, ЖӨБО ) он кошумча күн (ырбап сессиялары) үчүн.

Brain участоктору айтылгандай immunohistochemistry үчүн иштелип чыкты (Perrotti .Удаалаш., 2004). Brains калган бардык immunoreactivity ΔFosB чагылдырып, мындай деп ар кандай калган толук метраждуу FosB белок бузулушу натыйжасында, дары-дармек менен акыркы таасиринен кийин 18-24 саатка эле иштеген жок. Бул бузулуу ΔFosB тааныган эмес, толук метраждуу FosB С терминалын каршы багытталган бир антитело менен эч кандай олуттуу бойоктор көрсөткөн Батыш өчүрөм, тастыктады (маалыматтар көрсөтүлгөн жок). 35 мкм бөлүктөргө бөлүүдөн кийин, ΔFosB immunopositive клеткалардын саны ар бир келемиштер НАК аркылуу эки бөлүктөн турган Blinded байкоочу ашырылуусунун сан, ал эми талаада × 40 күнүнө орточо мааниси, андан кийин ар бир жаныбар үчүн аймакка эсептелген. Ар бир жаныбардын статистикалык талдоо үчүн жекече байкоо каралды. Paxinos колдонуп кызыгуу Аймак аныкталды жана Уотсон (Paxinos жана Уотсон, 2007).

айтылгандай CaMKIIα immunoreactivity сандык бир Licor тутумун колдонуу менен аткарылган (Клей .Удаалаш., 2009). CaMKII жана GAPDH комплекстүү йнъл Odyssey программалык камсыздоо менен аныкталган. Results мм күнүнө интегралдык сыйымдуулугу баалуулуктар катары көрсөтүлөт² жана ± Шем (дегенди катары көрсөтүлөтn = Топтун 4-10). GAPDH үчүн баалуулуктар кесим туурасынан жана шарттарын CaMKII жандуураак нормалдаштыруу шилтеме катары пайдаланылган.

Figure 2

өзүн-өзү башкаруу келемиштер жана адам кокаин көз НАК сөөктөрүндө CaMKII кошулуу

Эксперимент 5: Кокаин-адамдардан көз каранды протеин Levels аныктоонун (сүрөт 2D)

процедура

Патологоанатомиялык адам мээ ткандары Quebec Suicide Brain банктан алынган (Дуглас психикалык саламаттык University институту, Калгари, Канада). кыртыш сактоо сүрөттөлгөн олуттуу берди (Quirion .Удаалаш., 1987). Кыскасы, бир казылып алынган, мээнин бир коробка нымдуу муз жайгаштырылат жана Quebec Suicide Brain банк мекемелерине шашылыш болуп жатат. Шарлары дароо мээге, мээ аягына чыкпагандыгы жана мээченин ортосунда sagittal кесилген менен бөлүнгөн. Кан тамырлар, Белл, тордомо түйүнүндө, жарым Денеде жана жарым мээ устуну, адатта, андан кийин нөлдөн алдында 1 см-коюу бүдүрчөлөр салып coronally кыйылып, сол жарым шардагы чейин кесилген жатат. акыркы жарым мээче sagittally үшүп алдында 1cm-коюу бүдүрчөлөр салып кесип жатат. Tissues ~ 2 секунд -40 ° С 60-methylbutane селейдим эскиз болуп саналат. Бардык тоъдурулган кыртыштардын өзүнчө -80 ° С узак мөөнөттүү сактоо үчүн пластикалык пакетке сакталып турат. Белгилүү мээ аймактары айлана-чөйрөнүн температурасы көзөмөлдөө үчүн бүт кургак муз менен дат баспас болоттон жасалган плитада тоъдурулган coronal бүдүрчөлөр чейин кесилген жатат. Батыш өчүрөм сүрөттөлгөн аткарылган Experiment 2.

Когорта

37-3 жашка чейинки курактагы чейинки когорта, 15 эркек жана аял 66 субъекттеринин курамында болгон. Бардык сабактар ​​узак agonal мамлекет жок эле өлгөн же медициналык оору узакка созулуп кеткен. Ар бир учурда, өлүмдүн себеби Quebec анын Coroner тарабынан жана токсикологиялык экран өлүм убагында дарылоо, жана мыйзамсыз зат колдонуу жөнүндө маалыматтарды алуу үчүн ткандык үлгүлөр менен жүргүзүлгөн аныкталмайынча. аты тобу кокаин көз каранды SCID-I критерийлерге 20 адамдар турган. башкаруу тобу 20 субъекттердин кокаин көз карандылык жок тарыхы менен турат жана эч кандай ири психиатриялык диагноздоонун болду. Бардык субъекттер мээ кыртышы боюнча түздөн-түз таасирин тийгизген себептерин күтүлбөгөн жерден көз жумган. Groups орточо аты курагына, муздаткыч токтоосуз жана рН үчүн келген эле. бардык сабактар ​​үчүн, психологиялык autopsies мурда айтылгандай жасаган (Dumais .Удаалаш., 2005), Бизге толук иш психиатриялык жана медициналык тарых жөнүндө маалыматтарды, ошондой эле башка тиешелүү клиникалык жана тобун маалыматтарга жетүү мүмкүнчүлүгүнө ээ болууга мүмкүндүк берүүчү. Кыскасы, атайын даярдыгы бар берүүчү өткөрүлдү DSM-IV үчүн структураланган Клиникалык маек Психиатриялык Disorders (SCID-I) каза болгон бир же бир нече маалымат берүүчү менен. доктур бир кашектин SCID-I баалоо, иштин отчетторду, жабырлануучу, анын белгилерин, ошондой эле медициналык жазууларды консенсус психиатриялык диагноз алуу каралган.

Эксперимент 6: хроматин Rat NAC үчүн Immunoprecipitation (Сүрөт 3A-C)

Бойго жеткен (8 апта) эркек чычкандар 10 мг / кг кокаин же туздуу транспорт IP күнүнө бир жолу жети күн ишке алынган. акыркы сайынуу 24 саат өткөндөн кийин, УАК кабыгы жана негизги microdissected алынган. Хроматин immunoprecipitation (Чип) топтоо тараптуу НАК 14 жылы кыртышында же негизги тобунун жети келемиштер чейин узатканды жалпы топтордун (98 жаныбарлар бардыгы болуп, 7 кокаин пулдарын, 7 туздуу пулдарын) аткарылган. Кыртыштардын, бири-бири менен байланышкан кайчылаш болгон жуундум, ошондо sonication менен хроматин кыркуу чейин -80 ° C сакталат. Кыркып хроматин мурда магниттик мончок (Dynabeads M-280, Invitrogen) менен байланышкан башка антителолор менен түн инкубатордо болгон. Non-иммундук IgG контролдоо катары колдонулган. Кайтарым кайчылаш-сайттардын жана ДНК тазалангандан кийин, qPCR CaMKIIα колдоочусу ДНК көлөмүн өлчөө үчүн пайдаланылган. Грунттарды бир аймакты бир AP-1 консенсус тизмегин жайгашкан ~ копиялоо чейин 450 базистик баштоо сайтына камтыган күчөтүш үчүн иштелип чыкты (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Кайрылуу: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figure 3

CaMKIIα Cell Секи- жана конкреттүү регионунда ΔFosB дарстарында бододо,

Эксперимент 7: Уюлдук түрү-айрым ΔFosB Overexpression менен CaMKII протоколуна жана протеин далили өлчөө (сүрөт 3D)

алынган Эркек bitransgenic чычкандар NSE-TTA (Сызык A) × TetOp-ΔfosB (Сызык 11) жана NSE-TTA (Сызык B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (Сызык 11) чычкандар (Chen .Удаалаш., 1998; Kelz .Удаалаш., 1999; Werme .Удаалаш., 2002; Zachariou .Удаалаш., 2006) Кош бойлуу жана иштетүүдө ΔFosB сөздөр басуу үчүн 100 мкг / мл-тримаксозол күнү тирилди. ОДНОПОМЕТНИКИ эмчектен боюнча бөлүнгөн: жарым маал калган жарымы суу менен алмашып калган жана ΔFosB менен жүргүзүлсө протоколдун таасири азайып кетет жаныбарлар 8 кийин жума 11 колдонулган (Kelz .Удаалаш., 1999; McClung жана Nestler, 2003). жүргүзүлсө протоколдун анализдөө үчүн, чычкан тез Айтпа, ошондой эле мээси жок жана муз жайгаштырылган. НАК жүргүзгөн анатомиялык изилдөөлөрдүн бир 14-арымын ийне чертиши менен кабыл алынат жана РНК казылып чейин тез кургак муз камакка алынганын билдирген. РНК обочолонуу, qPCR жана маалыматтарды талдоо мурда айтылгандай жасаган (LaPlant .Удаалаш., 2009). Кыскасы, РНК TriZol реагенти (Invitrogen) менен бөлүнүп калган, андан ары Qiagen тартып RNAeasy чакан комплекти менен тазаланып, анан Agilent анын Bioanalyzer менен сапаты текшерилет. Кайтарым копиялоо iScript (BioRad) колдонуу менен аткарылган. qPCR төмөнкү цикл параметрлери бир Колдонмо Биосистемалардын 7900HT RT ПКО системасы менен ишке ашырылган: 10 ° С 95 мин; 40 95 ° C үчүн 1 мүн стадиялары, 60 ° C үчүн 30 сек, 72 ° 30 секунд C; түздөлүп жылытуу бир УРКнын азыктарын ырастоо үчүн акылы ийилген иштеп ° C 95 үчүн. ΔFosB жана CaMKIIα белок сөз Иммуногистохимиялык талдоо айтылгандай жасалган Experiment 4.

Эксперимент 8: Кокаин-арачылыгы протеин өзгөртүү жөнүндө Intra-НАК D1 жана D2 тинейджер Receptor антагонисттер Effects (сүрөт 3H)

Бойго жеткен (8 апта) эркек чычкандар 10 мг / кг кокаин же туздуу транспорт ( "транспорт" тобу) IP жети күн бир жолу күнүнө ишке алынган. Ар бир кокаин киргизилгенге чейин 30 мин, чычкандар IP же D1 сезгич окуянын SCH 23390 (0.5 / кг мг, "D1 Ant" тобу), же D2 сезгич окуянын eticlopride ишке берилди (0.5 / кг мг, "D2 Ant" тобу) же туздуу көзөмөл ийне менен ( "кокаин" тобу). акыркы сайган 24 саат жаныбарлардын чириген жана протеиндер сыяктуу күнүнө Батыш өчүрөм менен сан көрсөткүчтөрү алынган Experiment 2.

Эксперимент 9: AAV-арачылык ΔFosB Overexpression Белок көрсөтпөө жөнүндө Effects (Сүрөт 4 A-C)

Stereotaxic хирургия Эркегинин келемиштер (8 апта) жүргүзүлгөн AAV-орунга илинди сайган (жашыл протеин) же AAV-орунга илинди-ΔFosB (Maze .Удаалаш., 2010). 33 орны ийне (Hamilton) пост-куюунун калган мезгилде мүн кошумча 0.5 кийин бардык хирургиялык, аруу жогорку titer тумоосу μl кайсы 5 учурунда эки тараптуу мезгил мин бир 5 тундурат эле колдонулган. Бардык аралыктар Bregma салыштырмалуу бааланат: 10 ° бурч, AP = + 1.7 мм, лат = 2.5 мм, DV = -6.7 мм. 14 күн хирургиялык кийин, жаныбарлар ΔFosB overexpression аракеттеринин таасирин баалоо үчүн, таяныч мониторинг бөлмөсүндө 10 мг / кг кокаин бир IP сайма берилген. Бул акыркы сайынуу 24 саат өткөндөн кийин, чычкандар боюнча сөөгү чыкты Experiment 2Жана кыртыш microdissection ачкан-оң НАК ткандарын алуу үчүн химиялык микроскопиялык жетекчилиги астында жүргүзүлгөн. Батыш өчүрөм анда ылайык жүзөгө ашырылган Эксперимент 2.

Figure 4

ΔFosB NAC сөөктөрүндө кокаин-кыйыр D1 сезгич көз каранды CaMKIIα кошулуу үчүн зарыл жана жетишерлик болгон да

Эксперимент 10: AAV-арачылык ΔJunD Overexpression боюнча Кокаин-каранды протеин көрсөтпөө жөнүндө Effects (Сүрөт 4 D-F)

AAV-орунга илинди же AAV-орунга илинди-ΔJunD боюнча Stereotaxic сайынуу жолу боюнча аткарылган Эксперимент 8. хирургиялык кийин 14 күн, жаныбарлар 10 мг / кг кокаин же туздуу транспорт IP күнүнө бир жолу, таяныч жазуу бөлмөлөрдүн жети күн ишке алынган. кокаин саюудан үчүн таяныч жооптор (5 мг / кг IP) же туздуу жазылган. 24 саат бул акыркы дозасы сайылгандан кийин, чычкандар, баштары болгон кыртыш жыйналган, ал эми Батыш доскада эле аткарылган Эксперимент 9.

Experiment 11: Менин суроом Протеин Креатинкиназа сынамыгын (Сүрөт 5A-D)

Recombinant CaMKIIα жана ΔFosB курт-кумурска клеткалардан тазаланышты (Brickey .Удаалаш., 1990; Jorissen .Удаалаш., 2007) Жана белок Креатинкиназа сынамыгын жасаган (Colbran, 1993), Буга чейин айтылгандай. Кыскасы, CaMKII ΔFosB боюнча 2.5 мкм (же көрсөтүлгөн топтолуу) менен муз preincubated эле, 1 MM Ca²⁺, 40 мм Mg²⁺, 15 мкм calmodulin жана 200 мм HEPES рН 7.5. Phosphorylation менен 200 мкм СПС тышкары же жок козголгон [γ-³²P] ATP жана бөлмө температурасында 10 мүн улантууга жол (Figure 5A & B) Же муз 2 мүн (Fig 5C & D). Products Батыш өчүрөм менен чечилип (Figure 5A & B) Же autoradiogram жана жумгуча эсептөө (сүрөт B-D) менен.

Figure 5

ΔFosB CaMKIIα үчүн күчтүү субстрат болуп саналат

Эксперимент 12: Ser27 ΔFosB Phosphorylation аныктоо (сүрөт 5E)

экстракорпоралдык Креатинкиназа сынамыгын боюнча аткарылган Experiment 11Белоктор SDS-БЕТ тарабынан бөлүнүп, ΔFosB тиешелүү сансыз кесип менен тандем массалык спектрометрия дуушар болушкан. такталар бардык тиешелүү ион толду м / Z тапшырмалар ион чокулары үстүнө белгиленген. Бардык үзүндүсү иондору Орундун чектелүү улам белгиленген эмес. Жалпысынан алганда, үзүндүсү ион этикеткалар үчүн текст, алар түздөн-түз тастыктоочу башка учурларда кара түстүү же кызыл менен белгиленген жаткан учурда, кызыктуу phosphorylation сайттардын катышуусу далилдерди кошуп жатышат. омуртка чачырашынан азыктарына далилдер бир амино-кислота кат багытына кызыл түс менен көрсөтүлгөн phosphorylation калган аныкталган сайттын phosphopeptide кезеги эсептелиши берилген. байкалган үзүндүсү иондордун сан сүрөттөлүшү, ошондой эле б жана ж ион деп пептиддик кезеги боюнча белгиленген. м / Z огу боюнча участкаларына зум жагдайлар аз жандуураак үзүндүсү иондору ар бир үзүндүсү масс-спектр жана жогору жагында белгиленген көрсөтүүгө. панелдин H көрсөтүлгөн үзүндүсү иондору сайттар башка phosphorylated isoforms аралашмасынан ичинде Ser27 болушу Бирок, isoform phosphorylated тастыктайт Ser28, Ser31, Ser34 жана Thr37. pa5 болушу, pa5-P, pb5 жана pb5-P иондору уникалдуу Ser27 калдыгын phosphorylation тастыктайт.

Эксперимент 13: Ser27 phosphorylation сандык (сүрөт 5F)

Стандарттык Пептиддер Ser27 ΔFosB менен phospho жана азык-phospho түрлөрүн туурайм иштелип чыкты. синтези жана тазалангандан кийин, ар бир "оор" idiotypic пептиддик бир 50 / 50 acetonitrile / суу тосмо жана синтетикалык пептиддик Сток чечүү боюнча абсолюттук топтоо аныктоо үчүн аминокислота талдоо үчүн жөнөтүлөт таркатылган. Ар бир "оор" пептиддик анда түздөн-түз MS / MS бөлүнгүс жана эки төрт MRM Өткөрүүлөргө мыкты кагылышуу энергия аныктоо 4000 QTRAP Масс-спектрометр (MS) салып берип жатты эле. Кийинки, тыкан, "оор" Пептиддер пептиддик ажыратууну камсыз кылуу 4000 QTRAP боюнча LCMS дуушар болушкан. инструмент үч quadrupole режимде чуркап келип, Q1 белгилүү прекурсорлорду м / Z наркы боюнча белгиленген (Q1 карап эмес,) менен, Q3 ошол полипептиддин белгилүү бир майда тиешелүү белгилүү бир м / Z маанисине койду. MRM режиминде бир кубулуштардын бир катар (коллизиялар энергетикалык кызыкчылык үзүндүсү иондору күчтүү оптималдаштыруу гымдын прекурсорлорду / үзүндүсү ион өтүү) ырааттуу ченөө жана цикл (адатта 1-2 сек) бою looped болду HPLC бөлүштүрүү бүт убакыт. MRM ташылып жаткан пептиддердин жана MS / MS спектрлерден аныкталган. жогорку сыйымдуулук үзүндүсү иондору ылайык, полипептиддин күнүнө эки өткөрүп, анда тандалып алынган жана кагылышуу энергия өндүрүш үчүн программалык каражаттарды пайдалануу менен MRM бийлик сигнал күчүн жогорулатуу үчүн оптималдаштырылган. CaMKII же контролдоо дуушар стандарттык пептиддердин жана ΔFosB үлгүлөрүн натыйжасында Peaks анда иретинде ар бир пептиддик түрүндө абсолюттук мол аныктоо салыштырганда алынган. LC-MRM маалыматтары боюнча маалыматтарды талдоо AB Multiquant 1.1 программалык каражаттарды пайдалануу менен жүзөгө ашырылат.

Эксперимент 14: CaMKII Overexpressing Чычкандарда ΔFosB менен клуб (Fig 5G & H)

Transgenic чычкандар overexpressing T286D CaMKII (Mayford .Удаалаш., 1996; Kourrich .Удаалаш., 2012) Жана жапайы түрү ОДНОПОМЕТНИКИ transgene сөздөр уруксат берүү үчүн маал жок көтөрүлдү. Бойго жеткен чычкандар 20 мг / кг кокаин же туздуу IP бир жолу күн сайын 14 күн ишке алынган. 24 акыркы дозасы сайылгандан кийин саат жаныбарлардын чириген жана ΔFosB сөз immunohistochemistry жана сандык эле аткарылган жок Experiment 4.

Эксперимент 15: НАК Dendritic тикенеги КЭС-арачылык ΔFosB Overexpression жана CaMKII токтотуу боюнча Effects (Сүрөт 6A-E)

Эркегинин чычкан (8 апта) stereotaxically КЭС-орунга илинди менен НАК менен башташкан, КЭС-орунга илинди-ΔFosB (Olausson .Удаалаш., 2006), КЭС-GFPAC3I, же КЭС-GFPAC3I-ΔFosB. Бул мдъг, AC3I, CaMKII ишин пептиддик негизделген ингибиторун, ачкан С-терминалын үчүн кошулуп жатат. GFPAC3I төмөнкү грунттарды менен pMM400-багыттарын GFPAC3I камтыган типтик колдонуп ПКОдо клондоштуруу жолу болгон: GFPAC3I-F: 5 "CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3" (clampNheIKozakmet); Ачкан-AC3I-R: 5 "CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3" (clampBspEIstop). натыйжасында PCR продукт NheI жана BspEI сайттарды колдонуунун -Δ FosB сызыктарын p1005 + жана p1005 + киргизилген болчу. курган тартибин менен бекитилген. Stereotaxic координаты болгон: 10 ° бурч, AP = + 1.6 мм, лат = + 1.5 мм, DV = -4.4 мм (Barrot ж.б., 2002.). Иштеген жана мээ бөлүмдүн боюнча аткарылган Experiment 4.

Spine талдоо айтылгандай аткарылган (Christoffel .Удаалаш., 2011). Кыскасы, жок денебизде тартып dendritic сегменттер 50-150 мкм туш келди ачкан билдирип КЭС-жуктуруп клеткалардан тандалып алынган. Сүрөттөр rayburst алгоритм менен NeuronStudio колдонуп түркүмдөрүнүн талдоо үчүн confocal LSM 710 (Carl Zeiss) боюнча сатылып алынган. NeuronStudio төмөнкүдөй баалуулуктары негизинде жука, козу карын, же Stubby катары ийнелери бөлүштүрөт: (1) өлчөм, (2) моюн карата башчысы, жана (3) башчысы диаметри. моюнду менен ийнелери арык же козу карын жана олуттуу мойнуна жок Stubby болуп саналган, же өлкөлөрдүн катарына кирет. моюнду менен ийнелери башчысы диаметрине жараша ичке же тепек катары белгиленген.

Figure 6

CaMKII иш блокадниктеринин НАК жылы ΔFosB түркүмдөрүнүн жана жүрүм-турумдун кесепеттерин алдын

Эксперимент 16: Кокаин Жооптор КЭС-арачылык ΔFosB Overexpression жана CaMKII токтотуу боюнча Effects (сүрөт 6F)

Эркегинин чычкандар программалуу ийне эле күнүнө Experiment 15Жана кокаин бир 5 мг / кг сайынуу үчүн буту-жооптор боюнча өлчөнгөн Эксперимент 9. Таяныч маалыматтар кокаин сайган 30 мин үстүнөн жалпы нуру тынымсыз көрсөтүлгөн.

Кошумча маалымат

Animal Турак жай

Эркек Спрэг Dawley Аймактык терроризмге каршы түзүмүнүн (250-275 г; Charles River лабораторияларга) жуп-бөлмөсүнө эле. Сегиз-жума жаштагы C57BL / 6J эркек чычкан (Jackson лаборатория), капаска беш жаныбарлар максималдуу менен бир жайда турган. Бардык мал-жылы эксперименталдык курал алдында ≥1 жума мал мекемесине органдарынын ченемдик жана бөлмөсүнө алынган климаттын көзөмөлдөгөн бөлмөлөрдүн (23-25 ° C) бир 12 саат жарык / караңгы айланышы (7 боюнча жарык: 00 AM) тамак-аш менен камсыз болгон жана суу ад либитум. Эксперименттер Нейро коому жана Синай тоосунун этегинде институттук жаныбарларды сактоо жана пайдалануу боюнча комитет (IACUC) боюнча нускамасына ылайык жүргүзүлгөн.

Drugs

Drugs IP жүргүзүлөт, кокаин, анын ичинде стерилденген наборун,-жылы жоюлуп кеткен (5-20 келемиштерди 10 мл күнүнө / кг 1 чычкандардын μl мг, Нида) жана SCH 23390 же eticlopride гидрохлориддин (0.5 мг / кг 1 мл, Tocris) . stereotaxic хирургиялык үчүн, чычкан кетамин бир "Ананас" менен Эллисон жана xylazine (100 / кг мг) (10 мг / кг) (Henry Schein) стерилденген наборун менен.

Антителолор

CaMKIIα (жалпы): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (жалпы): клеткалык сигналдаштыруунун 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (жалпы): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Сигма HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Статистикалык анализ

Бардык статистикалык анализдер Prism 6 программа топтомун (GraphPad) аркылуу ишке ашырылган. Студенттин Т-тесттер бардык жуп акылман салыштыруу үчүн колдонулган (т балл берилет натыйжалары көрсөтүлгөн), жана бир жолу ANOVAs ар бир нече салыштыруулар (F балл берилет жыйынтык бөлүмүндө көрсөтүлгөн) ишке ашыруу үчүн колдонулган.

Баруу:

натыйжалары

НАК дартынын Өнөкөт Кокаин CaMKII алдыруучу

Көптөгөн изилдөөлөр НАК кыртыш жана ядродогу MSNs кыянаттык менен дары өнөкөт таасиринен ар түрдүү биохимиялык, психологиялык жооп бар экенин көрсөтөт (Kourrich, Томас, 2009; Мөөрөмөк .Удаалаш., 2010) Жана эки субаймактык differentially дары-издеп жүрүш-турушун жөнгө салуучу (Ito .Удаалаш., 2004). НАК контурун белок шайлоочуларга кокаин түрдүү кесепеттерин аныктоо үчүн vs. негизги, биз Multiplexed Isobaric Тег (iTRAQ) жана Тандем массалык спектроскопия (MS / MS) колдонулат. Эркегинин чычкандар кокаин менен IP ийне болгон (20 мг / кг) же туздуу 7 күн бою; акыркы сайган 24 саат, УАК кабыгы жана негизги microdissected болду (сүрөт 1A) Жана Flash токтотулган. Бул үлгүлөрдө белоктор, анан iTRAQ аркылуу сан көрсөткүчтөрү алынган. Бардык төрт CaMKII isoforms негизги салыштырмалуу НАК кабыгына конкреттүү кокаин дарылоо кийин сөз өскөн көрсөткөн. Бир нече белок phosphatases, анын ичинде PP1 мурда башка системалардын ар кандай CaMKII уланган менен байланыштырып келишкен каталитикалык жана ченемдик исламчыл жана PP2A, (Colbran, 2004), Бир мүнөздө болгон. Бул жыйынтыктар берилген роман, CaMKII белги жолу маанилүү бир катмар-белгилүү бир тартипте чажыт-жылы кокаин менен жөнгө салынат деп калыс далили.

көп сандык ушул сурамжылоого ырастоо үчүн, биз кокаин менен кокаин менен жогоруда (доза ар кандай) же туздуу жана ченегенде, таяныч жооп катары жасалган чычкандар мамиле (5 мг / кг) же туздуу кыйынчылык дозасын. 10 мг тобокелдигин Кайталап / кг кокаин буту маа- типтүү үлгү алып (сүрөт 1B). кокаин акыркы дозасы сайылгандан кийин бул ичүүнүн менен андан ары изилдөө ачып, CaMKIIα алдыруучу кокаин кайталап Батыш өчүрөм пайдалануу менен тандап НАК кабыгы 24 с-жылы (Сүрөт 1C жана D; б = 0.0019; F = 7.943; DF = 29). Мындан тышкары, AMPA кабылдагычтын GluA831 курамдык канондук CaMKII субстрат Ser1 боюнча phosphorylation олуттуу НАК сөөктөрүндө өстү жана негизги эмес, (б = 0.0261; F = 4.208; DF = 28), CaMKIIα Thr286 autophosphorylation күчтүү болчу, ал эми ал жок, гана сөөктөрүндө кошулуу багытында маанилүү багыт (сүрөт 1D). Бир нече башка протоколу кабылдагычтар көз каранды болгон. CaMKII бул чаралар айырмаланып, ошол эле кыртыштын үлгүлөрү да сөөктөрүндө ΔFosB кошулуу көрсөткөн (б = 0.0260; F = 4.189; DF = 29) жана ядро ​​(б = 0.0350; F = 3.807; DF = 29) НАК жөнүндө (Сүрөт 1C жана D), Мурунку жыйынтыгы менен шайкеш (Perrotti .Удаалаш., 2008).

AMPA өнөкөт кокаин тартып алып коюу ~ 14 күн өткөндөн кийин (талкуулоо карагыла) жаныбарларды талдоо кабылдагыч кокаин жөнгө салуу боюнча бир катар алдын ала изилдөө, демек, биз бул биохимиялык бул жолу учурда анализ кайталады. Биз 14 күн кокаин акыркы сайган, ΔFosB NAC боюнча бийик бойдон калууда, деп табылган (б = 0.0288; F = 4.258; DF = 22), GluA1 Ser831 боюнча CaMKII да phosphorylation да көбөйгөн бойдон калууда, ал эми (сүрөт 1E). Бирок, 1 кокаин бир 10 мг / кг чакырык дозасын кийин саат жалпы CaMKII гээли (б = 0.0330; F = 3.947; DF = 26) жана GluA1 Ser831 (б = 0.0213; F = 4.509; DF = 27) жөнүндө phosphorylation алгачкы өнөкөт кокаин таасиринен кийин окшош бир да бийик даражадагы жатышат (сүрөт 1E). Бул маалыматтар, балким, CaMKII ген колдоочусу (карагыла талкуулоо) түздөн-түз Азгырык шилтемелерди аркылуу НАК номиналдык нейрондор, өзүн-өзү тыюунун узак мезгилинде CaMKII кошулуу үчүн башыма коюп жатканын көрсөтүп турат. Мындан тышкары, талкуулоо менен капталган эле CaMKII жөнгө салуу боюнча "сындырып", талыкпай хроматин негизделген же башка болобу, ΔFosB дарстарында CaMKII кошулуу караганда туруктуу экенин, кошумча механизмдер бар экенин далилдеген.

мындан ары да ушул байкоолорун күчөтүү үчүн, биз муштап, дары алууну талап кокаин өз алдынча башкаруунун моделдерин, изилденген. Эркегинин чычкандар кокаин кыска же узак мүмкүнчүлүгү да берилди; күтүлгөндөй (Ахмед жана Koob, 1998), Бир гана узак кирүү шарттары дары өзүн-өзү башкаруу күчөп алып келди (сүрөт 2A). ΔFosB узак тарабынан кыйла даражада жасалма болгон vs. эки НАК сөөктөрүндө кокаин кыска мүмкүндүк алуу (б = 0.0011; F = 11.12; DF = 17) жана негизги (б = 0.0004; F = 13.86; DF = 17). Ал эми, CaMKIIα НАК кабыгына кокаин узак жетүү менен гана жасалма болгон (Сүрөт 2B жана C; б = 0.0236; F = 4.957; DF = 16). Бул кыска мүмкүндүк жаныбарлардын боюнча орточо күндүк кокаин алууну салыштыруу кызыктуу болот (~ 12 мг / кг IV), узак мүмкүндүк жаныбарлар (~ 70 мг / кг IV) жана экспериментаторго башкарылган жаныбарлар (10 мг / кг), жана акыркы кыска жетүү эми ΔFosB ишенимдүү кошулуу жана CaMKII алышына эмне үчүн жок суроо. Мындай дал келбөөчүлүк улам жогорку кокаин бирдей (бир куюуга IP катары экспериментаторго башкаруучу кокаин берилет, өзүн өзү башкаруучу кокаин нече IV ичүүнүн аркылуу жеткирилет, ал эми) айырмачылыктарга, же экспериментаторго дармек ТААСИРИ (7 күн узундугу айырмачылыктардан улам мүмкүн башкаруу, жергиликтүү өз алдынча башкаруу боюнча 19 күн).

кокаин иш ΔFosB ири адабият жана CaMKII карабастан, адам кокаин колдонуучулар бул белоктордун эч кандай изилдөөлөр бар. Бул жерде, биз да ΔFosB өлчөмү биринчи далилдерди (б = 0.0316; т = 1.921; DF = 34) жана CaMKII (б = 0.0444; т = 1.755; DF = 32) кокаин көз каранды адамдардын НАК өстү (сүрөт 2D, стол 1). Бул маалыматтар грызун НАК менен кокаин менен ΔFosB жана CaMKII кошулуу биздин экспертиза адам кокаин көз карандылыкка клиникалык тиешелүү экенин көрсөтүп турат.

стол 1

адам кокаин көз карандылар үлгүлөрдү Каармандар жана келген башкаруу тобу

ΔFosB CaMKII копиялоо НАК Shell жана D1-түрү MSNs менен тандап жөнгө

CaMKII жана ΔFosB да грызун НАК менен кокаин менен upregulated жаткан ачылыш ΔFosB CaMKII ген чечмелөө жөнгө салуу үчүн же жогун аныктоого алып келди. Биз мурда НАК бир калыс microarray анализинде ΔFosB үчүн мүмкүн максат катары CaMKIIα билдиришти (McClung жана Nestler, 2003), Бирок, бул ачылыш андан ары изилдөөгө бекитилген эмес. Биз биринчи ΔFosB Эркегинин келемиштер НАК жылы CaMKIIα ген колдоочусу уланат аныктоо үчүн сандык Chip (qChIP-Chip сандык ПКОдо менен) пайдаланылган, жана сөөктөрүндө, өнөкөт кокаин башкаруу бул олуттуу ёскён милдеттүү экенин кетчү нерсе табылган ( б = 0.0133; т = 2.901; DF = 12), бирок негизги, субрегионалдык (сүрөт 3A). мындан ары CaMKIIα колдоочусу үчүн милдеттүү ΔFosB бул субрегионалдык-айкын айырмачылык менен байланышкан механизмин түшүнүү үчүн, биз бул геномдук облусунун гистон modfications абалын мүнөздөө үчүн qChIP колдонгон. Алдын ала изилдөөлөр жалпы чычкан НАК менен CaMKIIα колдоочусу боюнча H3 acetylation Кокаин кошулуу көрсөткөн (Wang .Удаалаш., 2010). Алардан айырмаланып, биз кокаин тандап НАК ядродогу CaMKIIα колдоочусу боюнча H3 acetylation төмөндөйт деп табылган (сүрөт 3B; б = 0.0213; Т = 2.726; DF = 10), ΔFosB милдеттүү тышкары субрегионалдык-айкын хроматин өзгөртүүлөргө ылайык келүүгө сөөктөрүндө көрүнгөн жок өзгөртүү менен. qChIP репрессия белгиге, dimethylated H3 метионин 9 (H3K9me2), номиналдык жана негизги субаймактык да кыскартууну багыттарын ачып берген (сүрөт 3C).

ΔFosB CaMKIIα чечмелөө жөнгө аныктоо үчүн бододо,Биз inducibly атайын D1 жылы ΔFosB overexpress эки bitransgenic чычкан линиясын колдонушту vs. ичүүчү суу менен тримаксозол башкаруу тарабынан контролдонуучу тартипте D2-түрү MSNs (Chen .Удаалаш., 1998; Kelz .Удаалаш., 1999; Werme .Удаалаш., 2002). гана D1-түрү MSNs жылы ΔFosB overexpressing Эркегинин чычкандар НАК олуттуу CaMKIIα РНК көлөмүн көбөйгөн (б = 0.0337; т = 1.996; DF = 13), D2-түрү MSNs негизинен ΔFosB overexpressing чычкандардын көргөн эмес, таасир (сүрөт 3D). D1-түрү MSNs жылы ΔFosB сөз менен азгырган CaMKIIα РНК өсүшү, CaMKIIα протеин эки НАК сөөктөрүндө (б = 0.0030; т = 3.578; DF = 14) менен коштолгон кёбёйъъсъ менен коштолгон жана ядро ​​(б = 0.0392; т = 2.275; DF = 14; Инжир 3E жана F). Бул маалыматтар ΔFosB, эки субаймактык D1-түрү MSNs менен CaMKIIα ген сөздөр айдап жөндөмдүү экенин көрсөтүп турат да, Figure 3B кокаин-арачылыгы хроматин өзгөрүүлөр CaMKIIα колдоочусу эле деп айтууга болот (мисалы, кыскартылган acetylation) кокаин кийин негизги аймак боюнча CaMKII upregulating тартып ΔFosB алдын алуу.

Биздин transgenic чычкан маалыматтары CaMKII ген экспрессиясынын ΔFosB индукциясы NAcтеги D1-типтеги MSNлерге мүнөздүү экендигин көрсөткөндүктөн, кийинки жолу CaMKIIдин кокаинге көз каранды регуляциясы D1 допамин рецепторунун активдештирилишин талап кылабы же жокпу, аныктоого аракет кылдык. Бойго жеткен эркек келемиштерге мурдагыдай өнөкөт кокаин же физиологиялык эритинди колдонушкан, бирок ар бир сайылаардан 30 мүнөт мурун, кокаин тобундагы чычкандарга IP инъекциясы берилген, D1 антагонисти SCH 23390 (0.5 мг / кг), же D2 рецепторунун антагонисти этиклоприд (0.5 мг / кг). Акыркы жолу кокаин сайгандан кийин, жаныбарларга анализ жүргүзүлдү. Батыштагы блоттинг D24 эмес, D1 антагонисти кокаиндин жардамы менен ΔFosB (p <2; F = 0.0001; df = 18.96) жогорулагандыгын алдын-ала билдирген (Nye .Удаалаш., 1995), Ошондой эле CaMKII эле (б = 0.0005; F = 10.99; DF = 18; Сүрөт 3G жана H). Бул маалыматтар кокаин CaMKII ген сөз НАК орбитасынын D1-түрү MSNs атайын бир ΔFosB-арачылыгы жогорулатууга тартат гипотезаны колдоо. Бул мээ региондо CaMKII көрсөтпөө жөнүндө кокаин түздөн-түз ушул клетка-түрү белгилүү таасир көрсөтүү үчүн келечектеги изилдөө маанилүү болмок.

ΔFosB НАК дартынын CaMKII боюнча Кокаин кошулуу үчүн керектүү жана жетиштүү болуп саналат

bitransgenic чычкандардын пайдалануу толуктап туруу үчүн, биз кийинки келемиштер менен ээледи-арачылыгы гендин тикеден тике өтүү пайдалануу CaMKIIα Кокаин кошулуу ортомчулардын ΔFosB ролун изилдешкен. Биз эки тараптуу adeno байланышкан Интернетте чагылдырылуусу (AAV) НАК Эркегинин келемиштер ичине бөлүкчөлөрдү жалгыз ΔFosB плюс ачкан же ачкан overexpress үчүн (номиналдык тандап максаттуу болот) ийне. жаныбарлар анда 10 мг / кг кокаин бир IP сайма берилген. ΔFosB / ачкан overexpressing жаныбарлар гана ачкан overexpressing жаныбарларга салыштырмалуу көбөйүп, таяныч жооп көрсөткөн (сүрөт 4A). 24 с бир кокаин сайган, ачкан-оң НАК кыртыш бул жаныбарлар менен Fluorescent жарык булагы астында түзүп келген кыйылганын. Бул кыртыш Батыш өчүрөм (Сүрөт 4B жана Cөнөкөт кокаин башкаруу менен көргөн кошулуу окшош DF = 0.0070), Т = 2.894;) күчтүү ΔFosB overexpression, ошондой эле ачкан жаныбарлардын (б = 30 салыштырганда жалпы CaMKIIα белок бир кыйла жогорулатууга ачып берген. Мындан тышкары, Thr286 (бир энзим кошулуу тастыктайт) боюнча CaMKIIα autophosphorylation ΔFosB overexpression (б = 0.0330; т = 2.243; DF = 28) көбөйгөн, ал CaMKII субстрат менен phosphorylation эле, GluA831 (б = 1 боюнча Ser0.0540; т = 2.012; DF = 28), кайра өнөкөт кокаин аракеттерди туурайм (Сүрөт 1C жана D). Tчогуу Аке, бул маалыматтар НАК сөөктөрүндө ΔFosB сөз кокаин үчүн таяныч лугун жана бул аймак боюнча CaMKII кошулуу жана кошулуу үчүн жетиштүү эмес экенин далилдейт.

Биз ΔFosB NAC сөөктөрүндө CaMKIIα Кокаин-арачылыгы кошулуу үчүн да зарыл экендигин аныктоо үчүн ушундай ыкманы колдонгон. AAV бир кыскартылган Джунд белок overexpress үчүн колдонулган, ΔFosB жүргүзүлсө протоколдун кошулуу бир арачы бар ΔJunD, деп атаган (Winstanley .Удаалаш., 2007) Плюс гана ачкан же ачкан. Эки жумадан кийин, transgene сөз максималдуу болсо, жаныбарлар кокаин (10 / кг мг) берилет же туздуу 7 күн бою жана кокаин шек таяныч жооп тестирлөөдөн өтүштү (5 мг / кг) акыркы өнөкөт сайган 24 саатка (сүрөт 4D). ΔJunD overexpression кокаин үчүн таяныч маа- жол, ошондой эле CaMKIIα кошулуу жана НАК сөөктөрүндө жанданганын (алдынСүрөт 4E жана F; б = 0.0437; F = 2.997; жалпы DF = 38), бул ΔFosB жүргүзүлсө протоколдун ишин көрсөтүү менен бул аймак боюнча CaMKIIα Кокаин-арачылыгы кошулуу үчүн зарыл болуп саналат. Кызыктуусу, биз ΔJunD эки ΔFosB көлөмүн кыскарткан астында наборун жана кокаин-мамиле шарттарды деп табылган (б = 0.0004; F = 8.110; DF = 35), ΔFosB өз сөздөр катмары үчүн AP-1 ишине көз каранды экенин романы мүмкүнчүлүгүн жогорулатуу.

CaMKII Ser27 боюнча ΔFosB Phosphorylates

колдонуу менен экстракорпоралдык белок Креатинкиназа сынамыгын, биз тазаланган ΔFosB CaMKIIα үчүн туруктуу субстрат деп аныкталат. жана укма Анын₆CaMKIIα жана СПС менен -ΔFosB ΔFosB боюнча electrophoretic мобилдүүлүк жогорулоо өтүүнү алып (сүрөт 5A); бир нече натыйжасында аскерин phosphorylation бир нече сайттар сунуш кылды. Окшош экстракорпоралдык колдонуу Креатинкиназа сынамыгын [γ-³²P] ATP өттү ΔFosB топко radiolabeled кездешүүчү каттоо боюнча көрсөткөн (сүрөт 5B), Белок түз phosphorylation көрсөткөн. Биз ΔFosB буга чейин мүнөздөлгөн Ser27 үчүн phospho-белгилүү бир антитело түзүлгөн (Ulery .Удаалаш., 2006). Антителолор ΔFosB (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес) Ser27-phosphorylated бар мээ үзүндүлөрү каршы бир сигнал өндүрүү да, биз Ser27 phosphorylation аныктоо мүмкүн болгон экстракорпоралдык CaMKII колдонуп Креатинкиназа пробасы (сүрөт 5B). ΔFosB боюнча CaMKII phosphorylation кинетикалык анализдер ал киназ үчүн күчтүү субстрат (экенин көрсөтүп туратсүрөт 5C), Ачык K менен_M 5.7 ± 2.0μM жана К_CAT 2.3 ± 0.3min жөнүндө^-1. Бул жыйынтыктар жакшы мүнөздүү көптөгөн менен салыштырууга болот бододо, CaMKII боюнча субстраттардын (Colbran жана Браун, 2004). Мындан тышкары, биз CaMKII ΔFosB 2.27 бир суюктуктардын менен ± 0.07 мол phosphorylates аныкталат / Mol (сүрөт 5D), Ичинде CaMKII phosphorylation, жок эле дегенде, үч сайттар бар экенин көрсөтүү менен анын₆-ΔFosB белок, анын макулдугу менен сүрөт 5A.

phosphorylation айрым сайттарга иликтөө үчүн, MS үлгүлөрдү талдоо иштеген биздин экстракорпоралдык Креатинкиназа сынамыгын. сүрөт 5E Буга чейин мүнөздөлгөн Ser27 боюнча ΔFosB phosphorylation көрсөтүп турат жана бир нече кошумча жерлерде (маалыматтар көрсөтүлгөн жок). Ser27 алдын ала иш мүнөздөмөлөрүн эске алып, биз phospho- туурайм деп атаган синтетикалык пептиддерди жардамы менен ушул сайттан багытталган жана nonphospho-мамлекеттердин Ser27 менен, анда бул пептиддердин белгилүү санда колдонулат MRM ΔFosB чейин анализ жана стандарттары кийин экстракорпоралдык CaMKII менен phosphorylation. Кийинки quantitation (сүрөт 5F) Ser27 CaMKII үчүн күчтүү субстрат деп тастыктайт. Бул жыйынтыктар ΔFosB бир нече phosphorylated калдыктардан арасында Ser27 CaMKII үчүн өзгөчө натыйжалуу субстрат бар экенин көрсөтүп турат.

CaMKII НАК дартынын ΔFosB боюнча Кокаин топтоо ортомчулук

CaMKII ΔFosB phosphorylate алат экстракорпоралдык толугу менен өзүнүн туруктуулугун арттырат бир сайтта экстракорпоралдык жана бододо, (Ulery .Удаалаш., 2006; Ulery-Рейнолдс ж.б.., 2009), Биз CaMKII иш НАК жылы ΔFosB денгээлин көзөмөлдөйт жокпу аныкталат бододо,. Бул суроого жооп алыш үчүн, биз биринчи УАК, анын ичинде бир нече мээ аймактарда CaMKIIα (T286D) бир кальций-карандысыз Мутант overexpressing чычкан колдонгон (Mayford .Удаалаш., 1996; Kourrich .Удаалаш., 2012). Биз жаш курагына келген Эркегинин мутант жана wildtype ОДНОПОМЕТНИКИ менен 20 мг / кг кокаин же какырыкты 14 күн бою күнүнө бир жолу сайып, андан кийин акыркы дозасы сайылгандан кийин Жаныбарларды бир күн талдоо. Биз ΔFosB базалдык сапаты НАК сөөктөрүндө мутант жаныбарлар көбөйүп деп тапты (б = 0.0001; F = 9.207; DF = 37), ал эми ядро ​​жок (Сүрөт 5G жана H). Кызыгы, ΔFosB Кокаин көз каранды дарстарында CaMKII түздөн-түз НАК сөөктөрүндө ΔFosB стабилдүүлүктү жөнгө салуу мүмкүн, бирок, бул деген, кыртыш жана ядро ​​да мутант жаныбарлар бөгөттөлгөн эмес, ал дагы эки НАК субаймактык кокаин-жандырылды жолунан ΔFosB жогору калп .

CaMKII аракет ΔFosB-арачылык структуралык жана жүрүм-турумдук пластикалык талап кылынат

Кокаин дарстарында НАК MSNs боюнча dendritic үрөйүн бул мээ региондогу мыкты белгиленген дары-жасалма кайра жасоого бири болуп саналат, ал эми мындай омурткасы дарстарында жана дары менен курчутулат жүрүш-жооп менен байланыштуу болуп калды (Робинсон менен Kolb, 2004; Russo .Удаалаш., 2010) Жана D1-түрү MSNs Ылгап билдирди (Lee .Удаалаш., 2006). Биз ΔFosB Жакында боюнча УИА менен dendritic тикенектен кокаин дарстарында жана көз каранды эмес экенин көрсөттү жана анын ылдыйкы жүргүзүлсө протоколдун программасы (Maze .Удаалаш., 2010). башка мээ региондордо жана эксперименталдык системаларында dendritic омурткасы Саясат жана кошулуу боюнча CaMKII тартуу жөнүндө көп адабияттарды бар болсо да (Jourdain .Удаалаш., 2003; Penzes .Удаалаш., 2008; Okamoto .Удаалаш., 2009), УАК MSN омурткасы орду иликтене элек. Ошондуктан, биз CaMKII иш ачкан менен аралаштырып CaMKII ингибиторун пептиддик AC3I боюнча КЭС-арачылыгы overexpression пайдалануу менен MSN dendritic тикенектен ΔFosB-арачылыгы кошулуу үчүн талап кылынат, куруу мурда CaMKII ишин жайлатуучу көрсөтүлгөн жокпу аныкталат бододо, (Чжан .Удаалаш., 2005; Klug .Удаалаш., 2012). Чоң чычкандардын NAc кабыгында ΔFosB вирустук ашыкча экспрессиясы MSN дендриттик омуртканын тыгыздыгынын кыйла жогорулашына алып келген (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Сүрөт 6A жана BБуга чейин маалымдалгандай эле) (Maze .Удаалаш., 2010), Бул өсүш негизинен, ичке (б = 0.0027 менен шартталган; F = 5.319; DF = 59) жана Stubby (б = 0.0378; F = 2.988; DF = 59) омурткасы бир түрлөрү (экөө тең жетиле тишчелери, деп ойлогон) (Сүрөт 6C-E). Эч кандай таасир көбүрөөк жетилген көрүндү, козу карын сымал үрөйүн. Бирок, ачкан-AC3I coexpressed келгенде, тикенектен ΔFosB дарстарында толугу менен жокко чыгарылды (Сүрөт 6A-E), CaMKII иш НАК сөөктөрүндө dendritic тикенектен ΔFosB кошулуу үчүн зарыл экенин көрсөткөн.

Биз кийинки CaMKII иш кокаин үчүн жүрүш-туюмуна ΔFosB таасиринин талап кылынат аныктоо үчүн эле ээледи куралдарды колдонгон. 72 НАК ичине ээледи дозасы сайылгандан кийин саат жаныбарлар 5 мг / кг кокаин саюудан берилди жана алардын буту иш жазылган. Мурда ΔFosB дагы узак AAV overexpression менен көрүнүп тургандай (сүрөт 4A), ΔFosB боюнча КЭС-арачылыгы overexpression кокаин үчүн таяныч сезимталдыкты көбөйдү (б = 0.0002; F = 8.823; DF = 37; сүрөт 6F). боюнча coexpression менен CaMKII иш dendritic үрөйүн, тыюу салуу кошулуу менен эле ачкан-AC3I толугу КОКАИН жүрүш таасир ΔFosB-жасалма өзгөртүүлөрдү киргизүү жөнүндө CaMKII аракет талап кылынат деп көрсөтүү менен, кокаин маселе ΔFosB-арачылыгы жогорулатууга бөгөттөлгөн.

Баруу:

талкулоо

Ушул изилдөө НАК сөөктөрүндө тандап CaMKIIα ген чечмелөө upregulates кокаин НАК жылы ΔFosB алдыруучу роман тоют-алдыга механизмин, так. CaMKIIα кийин ΔFosB көбүрөөк ΔFosB топтоо алып жана CaMKIIα кошулуу андан ары phosphorylates турукташуусуна (сүрөт 6G). кокаин үчүн өнөкөт катнаш учурунда эки белоктун кызматташтыкты күчөтүү өлчөмү анда дары үчүн жүрүш-жооп, курчутулат үчүн абдан маанилүү жол менен салым кошо алат. Бул ΔFosB жана CaMKII да өзгөчө жагымдуу, гипотеза ар мурда кокаин чейин ёскён, жүрүм-турумдук жооп талап кылынат көрсөтүлгөн жатышат (Пирс .Удаалаш., 1998; Peakman .Удаалаш., 2003), Ошондой эле КР УАК сөөктөрүндө атайын оору ыкманы колдонуп ΔFosB бул табылга көбөйүшөт (инжир 4 жана and66).

transgenic ΔFosB overexpression D1-түрү MSNs менен кокаин шартында, кокаин-каргылданган жаныбарлардын НАК кыртыш жана ядро ​​да CaMKII кошулуу түртүшү мүмкүн +, экөө тең субаймактык пайда ички ΔFosB, топтоо да, УАК сөөктөрүндө атайын CaMKII кошулуу менен тебелетет . Бул айырма биздин bitransgenic моделдин жасалма ΔFosB жогорку денгээлде байланышы бар болушу мүмкүн, бирок, ошол эле учурда differentially сөөктөрүндө CaMKIIα үндөгөндөй өзгөртүүгө кокаин жөндөмүн чагылдырып мүмкүн vs. негизги MSNs ΔFosB мурдагы жылы милдеттүү жайылтуу же акыркы аймак аны жокко да. Чынында эле, биздин Chip маалыматтар, УАК ядродогу бир кокаин-арачылыгы CaMKIIα ген учурда гистондон deacetylation колдоочусу ачып эле, бир хроматин механизмин мүмкүн катышуусун колдойбуз. Бул гипотеза ылайык, D1-түрү ΔFosB overexpression MSNs кокаин жок чажыт ядродогу CaMKIIα кошулуу кууп алган (сүрөт 3F), Өнөкөт кокаин катнаш учурунда бул клуб алдын CaMKIIα колдоочусу жигердүү өзгөртүүлөр бар деп эсептейт. эмне CaMKII колдоочусу боюнча хроматин жаратылышынын жөнгө салуу, ошондой эле түшүндүрүүгө мүмкүн CaMKII өнөкөт кокаин-катышуучуга келемиштер НАК сөөктөрүндө кокаин кыйынга дозасы менен башчыны да ынандырууга болот (сүрөт 1E) Дары-каргылданган мал эмес, (сүрөт 1D). Бул ΔFosB бир нъгъъ "ген Азгырык шилтемелерди" таасир билдириши мүмкүн (Робисан жана Nestler, 2011), Жана ошону менен кокаин самаган инкубаторлор бир молекулалык механизм болушу мүмкүн (Пикенс .Удаалаш., 2011). Ошентсе да, бул хроматин өзгөрүү causally самаган инкубаторлор менен тыгыз байланышта болушу керек, анткени, ал убакыттын өтүшү менен көбөйтүү керек. Бул окуя экенин аныктоо үчүн кызыктуу болот, жана башка гендер ΔFosB көз каранды, субрегионалдык өзгөчө жөнгө кокаин менен көрсөтүп, жокпу, изилдөө. Бул CaMKII же ΔFosB да биз канал-алдыга луп бүтпөс топтоо алып келбейт сүрөттөп белгилей кетүү маанилүү (сүрөт 1E); Бул үчүн жооптуу молекулярдык "сындырып" таап, келечектеги изилдөө иштери маанилүү максаты болуп саналат.

бир нече эксперименталдык системалар жана мээ аймактарда ΔFosB жана CaMKII белгилүү иш көп денгээлдеги сүйлөшүүлөрдү (сүрөт 6F). Эки молекулалар тыгыз dendritic омурткасы өсүшү менен байланышкан: CaMKII актин cytoskeleton менен өз ара байланышта (Okamoto .Удаалаш., 2009), Омурткасы башчысы өлчөмүн жөнгө салат (Matsuzaki .Удаалаш., 2004) Жана кохлеардык organotypic кесим маданияттарда filopodia жана синапс саны пластикалык-жасалма өсүш үчүн зарыл жана жетишерлик болгон да (Jourdain .Удаалаш., 2003), ЖНАК MSNs жылы Хайл ΔFosB кокаин айынан зарыл жана жетишерлик болгон да, анткени dendritic омурткасы түзүү (Maze .Удаалаш., 2010). Андан тышкары, эки молекулалар AMPA протоколу кабылдагыч жөнгө салуу менен байланыштырып келишкен. CaMKII AMPA кабылдагыч исламчыл жалпы жөнгө салат, бирок бул синапс салып AMPA кабылдагыч киргизилгендиги дисктер жана маданият кохлеардык пирамиданын нейрондордо Ser1 боюнча GluA831 phosphorylating менен AMPA канал өткөргүчтүк жогорулайт жана жок, бододо, (Каралганда (Malinow жана Суши, 2002; Colbran жана Браун, 2004)). Мындай көбөйдү GluA1 менен синапс менен сатуу өнөкөт кокаин иш-аракет, ошондой эле тиешеси бар болду (Boudreau жана Wolf, 2005). Мындан тышкары, УАК жылы AMPA сезгич кошулуу үчүн жүрүш-аракеттер D1 тинейджер кабылдагыч-каранды абалда CaMKIIα overexpression байланыштуу болот (Ырчы .Удаалаш., 2010). ΔFosB узак мөөнөттүү D1-айкын overexpression НАК жылы GluA2 чечмелөө түрткөнүн көрсөтүлгөн (Kelz .Удаалаш., 1999Биз бул жерде көрсөткөн, ал эми GluA1 аркылуу кыйыр AMPA жооп ынтабызды турган), бул кыска мөөнөттүү ΔFosB overexpression-, ошондой эле кыска мөөнөттүү кокаин таасирленүү-бар ушул курамдык бөлүгү эч кандай таасир (сүрөт 1). Ошентсе да, биз НАК жылы D1-түрү MSNs Жакында бул кыска мөөнөттүү ΔFosB overexpression Бирок AMPA жооп азайтат таптым (Grueter .Удаалаш., 2013). Бул маалыматтар көз агат түрдүү аспектилерин негизинде эмес, бирок жакшы түшүнгөн кокаин үчүн neuroadaptations бир убакыт көз каранды катар түзөт үчүн убактылуу так механизмдерин сунуш. жүрүм-турум боюнча, CaMKII жана ΔFosB да кокаин үчүн таяныч лугун үчүн талап кылынат (жогоруда кара), жана кемирүүчүлөрдүн туруктуу кокаин өзүн-өзү башкаруу үчүн зарыл болгон (Колби .Удаалаш., 2003; Wang .Удаалаш., 2010), Эки белоктор жарым-жартылай айырмаланган негизги механизмдери аркылуу болсо да дары таасири да кыска мөөнөттүү жана узак мөөнөттүү жүрүш жасоого үчүн маанилүү экенин айткан. Болжолдуу түрдө, ΔFosB жана CaMKII андан ары иш менен түздөн-түз жүрүш өзгөрүшүнө кичинекей кубулуштарын байланыштыруу керек болсо да, УАК кичинекей милдетин өзгөртүү аркылуу бул комплекстүү жүрүш жасоого жөнгө салат.

синапс-байланыштуу протеиндердин бир CaMKII holoenzyme убакта менен өз ара ар түрдүү (Робисан .Удаалаш., 2005анын postsynaptic тыгыздыгы (СДП) даректүүлүгү жөнгө деп турган), бир кубулуш кичинекей пластикалык үчүн маанилүү деп сунуш кылды. Атап айтканда, NMDA-түрү протоколу кабылдагычтын GluN2B курамдык бөлүгү менен CaMKII ара жакында кичинекей пластикасын жана окутуу да жөнгө салуу көрсөтүлгөн (Токто .Удаалаш., 2012). AC3I пептид опокшош жатканда CaMKII боюнча autoinhibitory домен, жана натыйжада бир энзим каталитикалык ишин жайлатат, ошондой эле бир нече блоктору белок белок ара (Strack .Удаалаш., 2000; Робисан .Удаалаш., 2005). Ошентип, КЭС-орунга илинди-AC3I жана жүрүм-турумдук жана түркүмдөрүнүн таасирлери бул CaMKII максаттуу белоктордун phosphorylation кыскарган аркылуу пайда болушу мүмкүн деп билдирди, CaMKII даректүүлүгүн, же синапс CaMKII сунуштаган түзүмдүк ролу бир өзгөрүү өзгөрүүлөр (Lisman .Удаалаш., 2002).

акыркы иш кокаин башкаруу жооп чажыт кыртыш жана ядронун ортосундагы бир нече психологиялык айырмачылыктарды көрсөттү, биздин калыс iTRAQ (стол S1) маалыматтар менен тастыкталган деген сыяктуу НАК кабыгына сунушталган ΔFosB-CaMKII айлантып чектөө, атайын Белгилей кетчү нерсе, . НАК сөөктөрүндө MSNs жума колдоп турат өнөкөт кокаин кийин дараметин аткан бир депрессияны көрсөтүп, ошол эле жаныбарлардан негизги MSNs убактылуу (1-3 күн) көрсөтө эми 2 жуманын ичинде базалдык баскычтарында кайра атууга мүмкүнчүлүктөрүн жогорулатуу (Kourrich, Томас, 2009). Мындан тышкары, көптөгөн кичинекей белоктор differentially НАК катмары менен жөнгө салынат vs. GluA2, анын ичинде өнөкөт кокаин, жаныбарлардын негизги дуушар (Knackstedt .Удаалаш., 2010). өнөкөт amphetamine атайын НАК сөөктөрүндө CaMKIIα алдыруучу эле (Мөөрөмөк .Удаалаш., 2010), Биз кокаин менен ушундай таасир таба калыштуу эмес. Бирок, ΔFosB өнөкөт кокаин менен НАК кыртыш жана ядро ​​да башчыны да ынандырууга болот (Perrotti .Удаалаш., 2008), Жана биз сөөктөрүндө CaMKIIα дарстарында ΔFosB көз каранды эмес экенин көрсөтүп турат, анткени, биздин ачылыштар сөөктөрүндө CaMKIIα иргеп кошулуу үчүн жоопкерчиликтүү болушат бул эки субаймактык ортосундагы CaMKIIα колдоочусу боюнча так жүргүзүлсө протоколдун механизмдер үчүн жаңы далил болуп бере алат.

Жакында эле көп жумуш жасалыш керек D1- жана D2-түрү НАК MSNs ортосундагы айырманы ажыратуу боюнча багытталган. эки D1 жана D2 кабылдагычтар кокаин пайдалуу таасирлери катышып жатышат да (Өз алдынча башкаруу, 2010), акыркы иш D1-түрү MSNs боюнча optogenetic жандандыруу кокаин үчүн жүрүш-жооп жогорулатат деп көрсөтүп, D2-түрү MSN жандантуу, ал эми карама-каршы таасир этет (Lobo .Удаалаш., 2010). Мындай тыянактарга ылайык, D1 сезгич нокаут чычкандар кокаин өз алдынча башкаруу сатып кем (Кейн и др., 2007), D2 Рой эмес, ал эми (Кейн и др., 2002). D1 agonist башкаруу түздөн-түз НАК салып калыбына келтирүү парадигмалардын менен кокаин-издеп жүрүм-турумуна себеп (Өз алдынча башкаруу, 2010). Кызыктуусу, бул таасир НАК сөөктөрүндө CaMKII ишине D1 сезгич көз каранды көбөйөт талап кылат, ал эми ядро ​​жок (Андерсон и др., 2008), Бул жерде сунуш D1- кабыктарга атайын ΔFosB-CaMKII укурук менен сонун dovetails натыйжасы.

Биз мурда ΔFosB жылы Ser27 деп билдирди казеиндин Креатинкиназа-2 тарабынан phosphorylated болот (Ulery .Удаалаш., 2006) Бирок, биз CaMKII алда канча жогору кинетикасына жана суюктуктардын менен ушул жана башка объектилерде ΔFosB phosphorylates Бул жерде түзүү жана жогорку айкын М жуптала алат_r ΔFosB боюнча байкалган (сүрөт 5A) Кокаин таасири менен бододо, (Nestler, 2008). Биз буга чейин Ser27 phosphorylation жогорулатат ΔFosB стабилдүүлүк жана жүргүзүлсө протоколдун иши экенин билебиз (Ulery .Удаалаш., 2006; Ulery жана Nestler, 2007; Ulery-Рейнолдс ж.б.., 2009). Future иши азыр ушул изилдөөнүн тарабынан көрсөтүлгөн ΔFosB phosphorylation аныктоо жана роман сайттардын иш алып барары жөнүндө кеп болот.

бул жерде сүрөттөлгөн канал-алдыга луп кокаин НАК акырындык менен бузулууларды айдайт башкаруу жолу менен таба турган жаңы механизмин камсыз кылат. сыяктуу эле, бул биохимиялык жолу жаман оорулар келечектеги дарылоо кийлигишүү үчүн абдан маанилүү бир максат менен камсыз кылат. CaMKII ооруткан көп базалдык нейрондордун кыймыл жана жүрүш-милдеттерин үчүн зарыл болгондуктан, CaMKII Ингибиторы түздөн-түз пайдалануу көз каранды мамиле болуп кетмек. Биздин маалыматтар жеке клетка түрү жана мээнин сыйлык схемотехникасын аймак хас CaMKII кошулуу механизмин, дагы тымызын багыт алуу, системалуу CaMKII тыюу салуу жөнүндө өтүшүп кетүүнү болтурбай коюуга болмок дарылоо максаты менен камсыз болушу мүмкүн деп ойлойм.

Баруу:

Acknowledgments

Бул иш Наркология улуттук институтунун (EJN), ондогон-Yale Протеомика борбору DA018343 (сөзү жана EJN) жана ойлобойм.- корунун (сөзү) гранттардын тарабынан колдоого алынды. Жазуучулар Gabby тазаланып CaMKIIα берешендик менен белек тазаланып ΔFosB жана Роджер Colbran берешендик менен белек Rundenko ыраазычылык билдирип кетким келет.

Баруу:

шилтемелер

1. Ахмед SH, Koob ГК. Өткөөл мезгилдеги орточо чейин ашыкча дары-дармек алууга: гедонисттик белгиленген пунктунда өзгөрүү. Илим. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Андерсон SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, бас-жылы, Terwilliger EF, Cha JH, Пирс RC. CaMKII: биохимиялык көпүрө шилтемени кокаин издөөдө тинейджер жана протоколу системаларын accumbens. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC МЕНИ карышкыр. кокаин үчүн Жүрүш маа- ядросу accumbens жогорулаган AMPA сезгич беттик ишеним көрсөтпөө менен байланыштуу. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey да, Colbran RJ, клык YL, Soderling TR. Ca2 сөз айкашы жана Alpha-курамдык мүнөздөө + / calmodulin көз каранды белок киназ II baculovirus сөз системасын колдонуу. BIOCHEM Biophys Рез Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. Кейн SB Нажаши SS, Мелло NK, Patel S, Бристоу, L, Kulagowski J, D Vallone, Saiardi A, кокаин өзүн-өзү башкаруу боюнча тинейджер D2 окшош кабылдагычтардын Borrelli E. ролу: D2 кабылдагыч мутант чычкандар менен романы D2 кабылдагыч менен изилдөө Душмандарыбыз. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Кейн SB, Томсен M, Gabriel К.И., Berkowitz JS, Алтын LH, Koob ГК, Tonegawa S, Чжан J, Xu M. тинейджер D1 сезгич чычкандардын-талкала менен кокаин өз алдынча башкаруунун жоктугу. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [КУП акысыз макала] [PubMed]
7. Карле TL, Ohnishi YN, Ohnishi Ю, Alibhai IN, Wilkinson MB, Кумар A, Nestler EJ. Proteasome көз каранды жана FosB туруксуздаштыруу үчүн ишкердигин механизмдери: FosB degron домендердин жана DeltaFosB туруктуулук үчүн кесепеттерин аныктоо. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Токио N, Steffen C, Shockett ишкер, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Мээнин ичинде inducible, максаттуу ген сөз менен Transgenic жаныбарлар. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ Алтын SA, Dumitriu D, Робисан AJ, Janssen РГ, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Хан М.Х., лкёлёр JL, Eisch AJ, Dietz DM, өлгөндөр D, Neve RL, Greengard P, Ким Y, Моррисон JH , Russo SJ. IkappaB Креатинкиназа коомдук кыйратылышын стресстин айынан кичинекей жана жүрүш-пластикасын жөнгө салат. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [КУП акысыз макала] [PubMed]
10. Colbran RJ. Ca2 + / calmodulin көз каранды белок киназ II базалдык autophosphorylation боюнча Inactivation. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Белоктордун phosphatases жана кальций / calmodulin көз каранды белок Креатинкиназа II-каранды кичинекей пластикалык. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Браун AM. Кальций / calmodulin көз каранды белок Креатинкиназа II жана кичинекей пластикалык. Прогр.бөт òpin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Колби CR, Whisler K, Steffen C, Nestler Э.Дж., өз алдынча DW. DeltaFosB боюнча Striatal клетка түрү мүнөздүү overexpression кокаин үчүн стимул тат. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Клей АЛ, 3rd, Лабиринт I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton Оо, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Инчуан EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Казахстане SJ, Nestler EJ. гистон deacetylase Ингибиторы менен чечмелөө аракеттери. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [КУП акысыз макала] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Эрнандо C, аймара G, Деракшан B, Лин MI Ли JY, Чжао H, луо R, Colangelo C, Sessa WC. caveolin-1-жөнгө протеиндердин сандык Протеомика: полимераз мүнөздөө мен жана стенограммасы чыгарылыш себеп / Локлин-1 эндотелий клеткалары. Мол Cell Протеомика. 2010; 9: 2109-2124. [КУП акысыз макала] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Алда M, Руле G, Дюмон M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. негизги депрессия жанкечти аяктоо Risk себептер: байлаган жана агрессивдүү жүрүм-бир иш-башкаруу изилдөө менен эркектер. J психиатрия белем. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Робисан AJ, Neve RL, Nestler Э.Дж., Кабуки RC. ΔFosB differentially ядро ​​түздөн-түз жана кыйыр түрдө жолду милдетин accumbens modulates. Жаздын Natl Акад ЭЕ USA. басма 2013. [КУП акысыз макала] [PubMed]
18. Токто AR, Dallapiazza RF, Чжоу Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, S Wojcik, Брозе N, Silva А.Ж., Hell JW. GluN2B үчүн милдеттүү CaMKII эс ирилештирүү учурунда маанилүү. Нуруузунда J. 2012; 31: 1203-1216. [КУП акысыз макала] [PubMed]
19. Hiroi N, Браун JR, Хайле CN, Ye H, Гринберг ME, Nestler EJ. FosB мутант чычкандар: Фоско байланыштуу протеиндердин өнөкөт кокаин индукциясын жоготуу жана кокаиндин психомотордук жана пайдалуу таасирлерине сезгичтиги жогорулаган. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [КУП акысыз макала] [PubMed]
20. Ito R, Роббинс TW, Everitt BJ. ядросу менен кокаин-издеп жүрүш турушунун ар түрдүү башкаруу өзөгүн жана жер кыртышын accumbens. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Генри L, Gourneni S, Nestler Э.Дж., Руденко G. Dimerization жана ДНК-милдеттүү копиялоо себеп DeltaFosB касиеттери. Биохимия. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Мюллер D. Калий / calmodulin көз каранды белок Креатинкиназа II иш-каранды filopodia өсүшүнө жана омурткасы калыптанышына өбөлгө түзөт. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Чжан Ю.Д., Marotti L, өз алдынча DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Мээдеги копиялоо себеп deltaFosB билдирүү кокаин сезимталдыкты көзөмөлдөйт. Nature. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Матур BN, Каш TL, Wang HD, Matthews RT, Робисан AJ, Андерсон ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Клубе Striatal Орточо Spiny нейрондордо CaMKII генетикалык Inhibition Белек Excitatory синапс менен Intrinsic жандануусу тузот азайтат. PLoS One. 2012; 7: e45323. [КУП акысыз макала] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. кокаин өз алдынча башкаруу кийин кырылуу окутуу кокаин кылчумун, алаксыта glutamatergic пластикасын түртүп жатат. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [КУП акысыз макала] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Окшош нейрондор, карама-каршы жаткан көнүктүрүү: катмары каршы accumbens ядродогу касиеттерин ок psychostimulant тажрыйбасы differentially өзгөргөн. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [КУП акысыз макала] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. Striatal alphaCaMKII боюнча AMPAR-Independent Effect кокаин маа- сыйлык өбөлгө түзөт. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [КУП акысыз макала] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Мукерджи S, Коо JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Тейлор SV, Лабиринт I, Кумар A, Грэм A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler Э.Дж., Russo SJ . аял чычкандардын жумурткалардын гормон-арачылыгы стресс көбүкчөлөр өзөктүк себеп kappaB ролу. Biol психиатрия. 2009; 65: 874-880. [КУП акысыз макала] [PubMed]
29. Lee KW, Ким Y, Ким AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Кокаин айынан dendritic омурткасы D1 жана D2 тинейджер ядросу accumbens орто бадал нейрондорду кабылдагыч-камтыган пайда. Жаздын Natl Acad Илимий АКШ A. 2006; 103: 3399-3404. [КУП акысыз макала] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. кичинекей жана жүрүш-эс CaMKII милдетинин молекулалык негиздери. Nat Аян Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Клей АЛ, 3rd, Chaudhury D, кругом АК, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Заман S, Коо JW, Кеннеди PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Хан М.Х., Nestler EJ. кокаин сыйлыктан optogenetic башкара Уюлдук түрү конкреттүү BDNF жоготуу кабар опокшош. Илим. 2010; 330: 385-390. [КУП акысыз макала] [PubMed]
32. Мөөрөмөк JA, Бейкер-LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. ядросунда кыртышын accumbens жылы CaMKII амброксол курчутулат келемиштер менен amphetamine алууну күчөтүлгөн кыскарышы. Neurosci Летт. 2008; 444: 157-160. [КУП акысыз макала] [PubMed]
33. Мөөрөмөк JA, Сингер BF, Бейкер-LK, Wilke G, H Inamine, Bubula N, Александр Ж.К., Carlezon WA, Jr, Neve RL, Alpha-Ca2 боюнча Vezina P. Transient overexpression + / calmodulin көз каранды II белок Креатинкиназа ядросундагы кыртышын accumbens amphetamine жооп жүрүш-тат. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [КУП акысыз макала] [PubMed]
34. Malinow R, Кабуки RC. AMPA кабылдагыч сатуу жана кичинекей пластикалык. Annu Аян Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Эллис-Davies GC, Касай H. бир dendritic үрөйүн узак мөөнөттүү бөгөт структуралык негизи. Nature. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Бах ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. бир CaMKII transgene менен жөнгө сөз аркылуу эс түзүү контролдоо. Илим. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Лабиринт I, Клей АЛ, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, механика M, Mouzon E, Neve RL, Казахстане SJ, Рен Y, Sampath СК, Херд YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. кокаин айынан пластикалык менен гистон methyltransferase G9a негизги ролу. Илим. 2010; 327: 213-216. [КУП акысыз макала] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. CREB жана DeltaFosB тарабынан ген сөз менен кокаин сооп жөнгө салуу. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Review. көз карандылыкты жүргүзүлсө протоколдун механизмдери: DeltaFosB ролу. Статс Транс R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [КУП акысыз макала] [PubMed]
40. Nye АЛ, үмүт Б.Т., Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. striatum жана ядросу accumbens менен кокаин менен өнөкөт FOS байланышкан антиген кошулуу жөнгө салуу боюнча дары-дармек менен изилдөө. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Хайаши Y. dendritic үрөйүн түзүмдүк пластикалык менен CaMKII жана F-актин ролу: бир кичинекей тег бир болуучу молекулалык ким? Physiology (Бетезда) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler Э.Дж., Тейлор JR. ядросу accumbens жылы DeltaFosB азык-темир-аспаптык жүрүм-турумун жана түрткү жөнгө салат. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Уотсон C. stereotaxic координаттарында келемиш мээ. 6th Edition. Амстердам; Бостон: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Колби C, Perrotti LI, Tekumalla P, Карл T, Ulery P, Чао J, Думан C, Steffen C, Monteggia L, Аллен MR, Сток JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, өз алдынча DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, мээ аймагында өзгөчө transgenic чычкандардын с-июн бир басымдуулук кылган терс мутантты сөз кокаин сезимталдыкты төмөндөйт. Brain Рез. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Кехилл ME, Джонс KA, Srivastava DP. Жыйналма CaMK жана RacGEF сигналдар dendritic түзүмүн жана иш башкаруу. Айлары Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, L Monteggia, Duman RS, Nestler EJ. өнөкөт стресс кийин сыйлык байланышкан мээ структураларында deltaFosB кошулуу. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Робисан B, Renthal W, Лабиринт I, Yazdani S, Elmore RG, Карин DJ, Selley DE, Мартин BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, өз алдынча DW, Nestler EJ. кыянаттык менен дары тарабынан мээдеги DeltaFosB кошулуу айкын ченемдүүлүктөрү. Synapse. 2008; 62: 358-369. [КУП акысыз макала] [PubMed]
48. Пикенс CL, Airavaara M, Юнкер F, Fanous S, үмүт Б.Т., Чазын Y. дары самаган инкубаторлордун Нейробиология. Айлары Neurosci. 2011; 34: 411-420. [КУП акысыз макала] [PubMed]
49. Пирс RC, Quick EA, Ридер DC, Морган ZR, Kalivas PW. Кальций-кыйыр экинчи кабарчылар кокаин үчүн жүрүш-туруш маа- эркбилдирүүсүнө байытып. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Лемойн P, Ерлан КожаÑ C, бүт шар бөлүктөрдү колдонуп Dalpe M. Адам мээ сезгич autoradiography: кыртыш көрүгө азайтып жалпы ыкмасы. Synapse. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Робинсон TE, Kolb B. кыянаттык менен дары таасири менен байланышкан структуралык пластикалык. Neuropharmacology. 2004; 47 (тобу 1): 33-46. [PubMed]
52. Робисан AJ, Nestler EJ. Жүргүзүлсө протоколдун жана көз карандылыкты нъгъъ механизмдери. Nat Аян Neurosci. 2011; 12: 623-637. [КУП акысыз макала] [PubMed]
53. Робисан AJ, Bass MA, Jiao Y, МакМиллан LB, Кармоди LC, Bartlett RK, Colbran RJ. кальций / calmodulin көз каранды белок киназ II менен postsynaptic жыштыгы протеиндер Multivalent ара NR2B, densin-180 жана Alpha-actinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Росс PL, Huang YN, Marchese JN, Мукасан B, Паркер K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, жаксы S, Дэниелс S, Purkayastha S, Юхашз P, Мартин S, Bartlet-Джонс M, Ал F, Жекобсон A, Pappin DJ. Amine-жалкоолук isobaric тегдөө реагенттерди пайдалануу Saccharomyces cerevisiae жылы Multiplexed белок quantitation. Мол Cell Протеомика. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Моррисон JH, Кабуки RC, Nestler EJ. көз каранды синапс: ядросу accumbens кичинекей жана түзүмдүк пластикалык механизмдери. Айлары Neurosci. 2010; 33: 267-276. [КУП акысыз макала] [PubMed]
56. Өзүн өзү DW. Жылы: тинейджер кабылдагычтар. Neve KA, редактор. New York: HUMANA Press; 2010. бб. 479-524.
57. Ырчы BF, мөөрөмөк JA, Neve RL, Vezina P. Alpha-тт Transient ээледи-арачылыгы overexpression / ядросундагы calmodulin көз каранды белок Креатинкиназа II номиналдык Alpha-амино-3-гидроксилдик-5 узак созулган иш upregulation алып келет accumbens -метил-4-isoxazole-пропионат кабылдагычтар: тинейджер түрү-1 кабылдагычтарды белок көз каранды Креатинкиназа. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [КУП акысыз макала] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. кальций / calmodulin көз каранды белок киназ механизми жана жөнгө салуу II N-метил-D-аспартат кабылдагычтын NR2B курамдык бөлүгү үчүн багытталган. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Рейнолдс PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. DeltaFosB боюнча Phosphorylation бододо, анын туруктуулугун ортомчулук кылат. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [КУП акысыз макала] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Ser27 phosphorylation менен DeltaFosB жүргүзүлсө протоколдун ишин жөнгө салуу. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Руденко G, Nestler EJ. phosphorylation менен DeltaFosB туруктуулугун жөнгө салуу. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, .Удаалаш. Мээ сыйлык райондо DeltaFosB стресс жана чечмелөө жооп туруктуулугун ортомчулук кылат. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [КУП акысыз макала] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Ху Z, Sheng J, Хуэй B, Sun J, Ма L. Өнөкөт кокаин айынан H3 acetylation ядросундагы CaMKIIalpha менен жүргүзүлсө протоколдун жандандыруу жана accumbens дары күчөтүү үчүн түрткү абдан маанилүү болуп саналат. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913-928. [КУП акысыз макала] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, L Олсон, Gilden L, Thoren P, Nestler Э.Дж., Brene S. Delta FosB дөңгөлөк чуркап жөнгө салат. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green та, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, өз алдынча DW, Nestler EJ. обочолонушу- кабында DeltaFosB дарстарында кокаин айынан билүү бузулушуна толеранттуулукту ортомчулук кылат. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Кэссиди депутаты, Kelz MB, Шоу-Lutchman T, Berton Оо, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Кумар A, Nestler EJ. ядросунда DeltaFosB үчүн абдан маанилүү бир рол Morphine иш accumbens. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Чжан R, Khoo MS, Инчуан Y, Янг Y, Grueter CE, Ni G, Price EE, Jr, рейтинг W, Guatimosim S, ыр LS, Маду EC, Шах AN, Vishnivetskaya та, Аткинсон JB, Ленин VV, Салама G, Ледерер WJ, Colbran RJ, Андерсон ME. Calmodulin Креатинкиназа II к¼рс¼тм¼ же түзүмдүк жүрөк оорусуна каршы коргойт. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]