Жаздын Natl Acad ЭЕ АКШ А. 2005 февраль 1; 102(5): 1737-1742.
жалпылаган
Кокаин, кыянаттык менен бир дары, аксон терминалдарында тинейджер reuptake чектейт striatum кичинекей тинейджер көлөмүн көбөйтөт. Cyclin көз каранды Креатинкиназа 5 (Cdk5) жана анын Activator p35, postmitotic нейрондордо субстраттарды phosphorylation тартылган белоктор, кокаин үчүн өнөкөт таасиринен кийин жөнгө деп табылган. мындан ары striatal тинейджер сигналдаштыруунун боюнча Cdk5 жана p35 кошулуу таасирин карап үчүн, биз Cdk5 же p35 нейрондордо атайын overexpressed турган эки көз карандысыз transgenic чычкан линиясын түзүлгөн. Биз p5 натыйжасында, Cdk35 ишин көбөйгөн бул жерде тууралуу эмес, Cdk5 overexpression боюнча, кокаин-арачылыгы тинейджер сигналдаштыруунун өчүүсү алып келет. Көбөйтүү тинейджер боюнча phosphorylation Cdk5-арачылык кылган жана лагерь-жөнгө белок, молекулярдык массалык 32 KDA (DARPP-32) Анда-75 боюнча, Анда-32 боюнча DARPP-34 менен phosphorylation кыскаруу менен коштолгон. Жогорулатуу клетка сыртындагы сигнал-жөнгө боюнча phosphorylation Cdk5-арачылыгы Креатинкиназа Креатинкиназа Анда-1 боюнча 286 клетка сыртындагы белги-жөнгө киназ жигердүүлүгү кыскаруу менен коштолгон 1 / 2. Бул таасир кокаин айынан САМР жооп элемент-милдеттүү белок phosphorylation, ошондой эле striatum менен с-кетүүсүнүн бир аз кошулуу өчүүсү салым кошкон. Бул жыйынтыктар Cdk5 иши кокаин, демек таасир кокаин азыраак түпкү нейрондордун иш узакка созулуучу өзгөртүүлөрдү өнөкөт таасиринен кийин өзгөртүп ген сөз катышып жатат деген ойду колдойм.
Кокаин ядрого тинейджер D1 кабылдагыч келген алгачкы сигнал таратуу клеткадагы жол менен иштетип dopaminoceptive нейрондордо striatum жана ген сөздөр өзгөртөт кичинекей тинейджер көлөмүн көбөйтөт (1). кокаин көз каранды болгон нейрондордун кыймыл жасоого негизинде ойлоп жаткан ген сөз менен узак мөөнөттүү өзгөрүүлөргө кокаин үчүн Өнөкөт таасири натыйжасында, бир нече макала себеп Эсеп-жөнгө салуучу (2). Мындай копиялоо себеби болуп ΔFosB, (3), Кокаин үчүн жаныбарлардын жүрүм-жоопкерчилигин күчөтүү үчүн көрсөтүлгөн (4, 5). Ошондуктан, ΔFosB кошулуу менен жөнгө салынат максаттуу гендердин аныктоо молекулярдык механизми негизги кокаин көз көбүрөөк түшүнүүгө өбөлгө түзөт деп күтүлүүдө. Жакында ΔFosB кошулуу аркылуу striatum менен кокаин менен жаныбарлардын өнөкөт дарылоо cyclin көз каранды Креатинкиназа эркбилдирүүсүнө Эсеп-жөнгө 5 (Cdk5) көрсөткөн жана анын Activator p35 (6, 7).
Cdk5 серин / threonine kinases боюнча Cdk үй-бүлөнүн мүчөсү болуп саналат. клетка-цикл агат негизги жөнгө салуучу башка Cdks айырмаланып, Cdk5 postmitotic нейрондордо субстраттарды phosphorylation негизинен тартылган эмес (8). Cdk5 ишинин нейрондордун өзгөчөлүгү басымдуу postmitotic нейрондор менен берилет, анын жандандыргандан менен мамилелешүү аркылуу да, p35 же p39 да, ишке ашат (8). мээнин өрчүшүндө да Cdk5 маанилүү ролу тышкары (9, 10), МенТ эле төрөттөн кийин мээдеги dopaminergic берүү аткыланды келет (11, 12). striatum ёскён тинейджер релизинде Cdk5 иш жыйынтыгы Көлдү Cdk5 бир presynaptic милдетин көрсөткөн тинейджер чыгарууну терс регулятор катары (11). Мындан тышкары, Cdk5 DARPP-32 САМР-каранды киназ бир ингибиторун салып айлантат Анда-32 боюнча dopamine- конуштун-жөнгө белок phosphorylating менен postsynaptic тинейджер сигналдаштыруунун натыйжалуулугун, молекулалык массасы 75 KDA (DARPP-32) modulates (айымдарга) (12).
Булар Cdk5 жана p35 кокаин үчүн өнөкөт таасиринен кийин тинейджер сигналдаштыруунун узак кошулуу агым жөнгө болуп саналат, демек, кокаин көз каранды экенин айтышууда. мындан ары striatal тинейджер сигналдаштыруунун боюнча Cdk5 ролун чечүү үчүн, биз p5 колдоочусу контролдугу астында нейрондордо атайын Cdk35 же p35 да overexpressed болгон эки чычкан transgenic линиясын түзүлгөн. Биздин жыйынтыктар Cdk5 иши p35 белок деңгээл чен-чектөө Cdk5 иши үчүн деп айткан, p35 протеин, бирок Cdk5 белок көтөрүлүшү менен жөнгө деп көрсөтүлгөн. Биз бул жерде камсыз бододо, p5 overexpression натыйжасында, Cdk35 ишин көбөйгөн далилдер, ядрого кокаин-арачылыгы тинейджер сигналдаштыруунун азайтуу үчүн, айымдарга жана көпшөк белги-жөнгө Креатинкиназа (ЭРК) каскаддарынын бир тыюу салуу аркылуу келет.
Материалдар жана ыкмалар
Антителолор. Cdk5 (C-8) жана p35 (C-19) үчүн Polyclonal антителолор Санта-Крус-Biotechnology сатылып алынган. phosphorylation көз каранды жана ЭРК киназ үчүн ишкердигин антителолор (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, станды-жооп элемент-милдеттүү белок (CREB) клетканын сигналдашуусунун технология (Beverly, MA) алынган. phospho-Анда-34 DARPP 32 үчүн антителолор (13), Phospho-Анда-75 DARPP-32 (12), Жалпы DARPP-32 (12), Жана с-кетүүсүнүн (14) Сүрөттөлгөндөй колдонулган. актин үчүн антитело сигма алынган.
Эксперименталдык Жаныбарлар. Биз буга чейин чычкан p35 генди клондолгон Cdk5r1, Бул p35 белок жана анын геномдук түзүлүшүн мүнөздөлөт коддолушат (15). p35 (Tgp35) жөнүндө нейрондордун overexpression менен transgenic чычканды түзүү үчүн 6-Kb ЭкоМассалык башЭкобир 1.2-кб колдоочусу аймакты камтыган RI үзүндүсү салып subcloned болгон pGEM9Z (-) плазмиддердин, жана салып SV45 алынган 40-BP тег киргизген болчу KPNМен Турман агым сайты (A+) Белги (Анжир. 1A). тег камтылган Үмүт мененжаныбарлардын genotyping үчүн сайты. 6-кбайт үзүндүсү плазмиддердин жана тазаланган тартып excised, transgenic чычкандар түзүү үчүн transgene боюнча pronuclear сайынуу менен коштолду. 1.2-кбайт p35 колдоочусу ченемдик көзөмөлүндө transgene билдирүү статусун карап үчүн бододо,, Эки transgenic чычкан (Tgp35; p35 - / -) андан ары Tgp35 чычканды бир ички p35-күчүн алкагында калыбына болгон менен, эки кадам асыл стратегияны колдонуу менен иштелип чыккан. Бул макалада колдонулган башка чычкан моделдер p35 +/-, p35 кирген - / - Cdk5 +/- жана Cdk5 (TgCdk5) жөнүндө нейрондордун overexpression менен transgenic чычкан (9, 16, 17). Бул чычкандардын генотибин куйругу biopsies ажыратпай геномдук ДНКдагы Түштүк олдоксон талдоо же УРК да аткаруу менен аныкталган. Чычкандар бир 12-ч жарык / 12-ч караңгы айлампасынын алкагында бөлмөсүнө чыгышты. Бардык сактоо лабораториялык жана эксперименталдык жаныбарларды сактоо жана пайдалануу боюнча Саламаттык сактоо колдонмолору улуттук институтунун ылайык берилген.
Түштүк чийип талдоо. куйругу biopsies алынган геномдук ДНК менен айлануу болду ЭкоRI жана Үмүт мененМен 0.9% агароза Лари боюнча electrophoresed жана нейлон кабыкча көздөй которулган. мембрана бир кокустук-башыма менен инкубатордо болгон 32P-ачаар түнү 42 ° С ишин козгоду. 485-BP иликтөө p35 нокаут (p35 - / -) менен genotyping жана Tgp35 чычкандар төмөнкү грунттарды колдонуу менен ПКОдо менен түзүлдү: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 жана 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3 ". инкубатордо кабыкча 2 × РСК / 0.1% SDS 42 ° C үчүн 10 мин боюнча эки жолу жууп, 0.1 мүн 0.1 ° C эки 65 боюнча РСК / 20% SDS × убакта, рентген тасмасы туш болгон.
Drug Treatment. Кокаин (Sigma) стерилденген наборун-жылы жоюлган. Жаныбарлар сайган IP-ийне менен кокаин менен (15 мг / кг) же бирдей убакыттын ар кандай чекиттеринде кесүү менен 3 ай жана каза жашында наборун көлөмүнүн (15, 30, 60 жана 120 мин) болгон. Brains тез алынып, муз-суук PBS-жылы үзүлгөн жок. STRIATA андан кесилген жана Түндүк жана Батыш олдоксон талдоого кабылган. иммуногистохимиялык талдоо үчүн, striatal бөлүктөр сайган чычкандар 2 ч алынган.
Түндүк чийип талдоо. айтылгандай жалпы РНК TRIzol реагенти STRIATA (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, CA) алынган жана Түндүк олдоксон талдоого дуушар болгон (18). с-FOS табылыш үчүн РНК, айтылгандай, чычкан с-кетүүсүнүн cDNA бир 189-BP үзүндүсү Иликтөөгө катары колдонулган (19). с-кетүүсүнүн РНК өлчөмү ынчан сүрөтү программалар менен бир сүрөттөлүш талдоо системасын пайдалануу менен белгилүү бир топ оптикалык тыгыздык өлчөп сан көрсөткүчтөрү болсо, котормо 1.62.
Батыш чийип талдоо. Striatal кыртыштардын 1% SDS-жылы sonicated жана 10 мүн кайнатып жатышты. Ар бир үлгүнүн протеин топтолуу BCA белок тамганы (Пирс) менен аныкталган. белок бирдей суммалар nitrocellulose кабыкча көздөй өткөрүп берүүгө чейин SDS / БЕТ ажыратылган эле. кабыкча 1 PBS 5% камтыган × майсыздандырылган сүттү бөгөттөлгөн жана 0.05% жоромолдоп 20 жана 4 ° С түнү негизги антителолор менен инкубатордо болгон. peroxidase-жактагы каршы чычкандын же коен IgG (Сигма) менен укма 60 мүн бөлмө температурасында аткарылган. Бир сигнал күчөтүлгөн chemiluminescence (Пирс) менен аныкталган, ал эми Ишпошеттин оптикалык курбакалар жогоруда айтылгандай сан көрсөткүчтөрү алынган.
Cdk5 Креатинкиназа тамганы. Striatal lysates бир lysis туруучу 50 мм Антипатриске турган менен даярдалган · HCL, рН 7.4 / 50 мм NaCl / 5 мм EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 мм phenylmethylsulfonyl fluoride / 1 мкг / мл aprotinin / 1 мкг / мл leupeptin / phosphatase ингибиторлору (phosphatase ингибиторун аралашмасы Мен жана II, Сигма). lysates же каршы Cdk5 (C-8) же каршы p35 (C-19) антителолор менен immunoprecipitated алынган. Cdk5 immunoprecipitates каршы Cdk300 греч (300 мкг) түнү 5 ° С протеин A-агароза мончок μl боюнча 3 менен ары-инкубаторлордун артынан менен lysate боюнча 4 μl боюнча инкубаторлор (белок мкг 25 ылайык) менен даярдалган (50 lysis Санитардык-жылы% аралашмасы; Санта-Крус-биотехнология) 3 ° С 4 ч үчүн. p35 immunoprecipitates даярдоо үчүн, lysate боюнча 500 μl (белок мг 1 ылайык) жогоруда айтылгандай эле, анти-p35 греч (3 мкг) менен инкубатордо болгон. immunoprecipitates 50 мм Антипатриске турган Креатинкиназа туруучу менен lysis аймак жолу менен эки жолу жууп + HCL, рН 7.4 / 5 MM MgCl2/ 1 MM EDTA / 1 мм EGTA / Креатинкиназа Санитардык-жылдын 1 μl менен resuspended 60 MM DTT. Креатинкиназа иш субстрат катары гистон H1 менен ишке ашырылган (18).
Immunohistochemistry. Чычкандар avertin интеллектуалдык менчик сайма менен Эллисон алынган (250 / кг мг, Fluka) жана transcardially 0.1 M натрий кездешүүчү чогултуу менен эле иштеген, рН 7.4, Streck Tissue Fixative (Streck лабораториясында, Ла Vista, NE) кийин, бир эмес crosslinking fixative. Изилдөө Баткен ары дагы fixative 37 ° С түнү-жылы бекитилген. Андан кийин, Баткен керосин киргизилген жок, 5-мкм-коюу coronal бөлүктөргө кесип, avidin-biotin-peroxidase комплекстүү ыкманы (тараткычтарды лабораториялар) бир субстрат катары diaminobenzidine менен колдонуп immunohistochemistry дуушар. бөлүмдөр түнү 4 ° С с-FOS каршы туугандык-тазаланып polyclonal греч инкубатордо болгон. бойоктор өзгөчөлүгү негизги греч өткөрүү менен бааланган.
натыйжалары
p35 болгон нейрондордун Overexpression менен Transgenic Чычкандарда өндүрүү. 35-кбайт үндөгөндөй жана p6 бүт код тизмегин камтыган клондоштуруу жолу чычкан p35 ген p1.2 болгон нейрондордун кыймыл-сөз көбөйдү жетүү үчүн колдонулат transgene 35-кб бөлүгүн түзгөн (Анжир. 1 A). чычкандардын генотибин Түштүк олдоксон талдоо p35 айырмалоо үчүн иштелип чыккан бир аспапты колдонуу менен белгиленген - / - жана Tgp35 жапайы түрү чычкандардын чейин чычкандар (Анжир. 1 A жана B). 1.2-кбайт p35 колдоочусу көзөмөлүндө transgene сөздөрдү карап үчүн, биз эки transgenic чычкандар түзүлгөн (Tgp35; p35 - / -) p35 турган сөздөр transgene гана шартталган. p35 сөздөр Tgp35 боюнча; p35 - / - чычкан мээде байкалган (Анжир. 1C) Мейкиндик сөз үлгү жапайы түрү чычкандардын эмнеси менен окшош болгон жерде, (Анжир. 1D). p35 жоктугу чычкандардын мээ кабыгында жана Hippocampus таткан катмарлануу түзүмүндө алып көрсөтүлгөн (10). Бирок, Tgp35; p35 - / - чычкандар p35 толук кутулууну көрсөттү - / - мээ түспөлүм (Анжир. 1E). Бул маалыматтар 1.2-кб p35 колдоочусу ички p35 ген тартып p35 окшош сөздөр кароо transgene эркбилдирүүсүнө көзөмөлүндө экенин айткан.
p35 протеин Даража Cdk5 ишин Up-жөнгө салуу үчүн чен-чектелип жатат. Биз ген-дозалап p35 тартып striatal үзүндүлөрү протеин көрсөтпөө жөнүндө p5 жана Cdk35 коддогон гендин таасирин карап - / - p35 +/-, жапайы түрү, Tgp35, Cdk5 +/- жана TgCdk5 3 ай жашында чычкандар. p35 жана Cdk5 белок өлчөмү тиешелүүлүгүнө жараша, ген дозалары менен байланышы (Анжир. 2 A жана B). Tgp35 чычкандар Cdk1.6 белок этаптары p35 белок түрдүү денгээлде көз каранды болгон, ал эми жапайы түрү чычкандар менен салыштырганда p5 протеин деъгээлинин ≈35 эсе жогорулагандыгын көрсөткөн. TgCdk5 чычкандар p1.9 белок этаптары Cdk5 белок түрдүү денгээлде көз каранды болгон, ал эми жапайы түрү чычкандар менен салыштырганда Cdk35 протеин деъгээлинин ≈5 эсе жогорулагандыгын көрсөткөн. Cdk35 иши жөнүндө p5 белок ар түрдүү көлөмдөгү таасирин текшерип, Cdk5 каршы Cdk5 антитело жана Креатинкиназа ишине striatal үзүндүлөрү тартып immunoprecipitated эле өлчөнгөн. Ошо сыяктуу эле, Креатинкиназа иши жөнүндө Cdk5 белок ар түрдүү көлөмдөгү таасирин карап, p35 каршы p35 греч striatal үзүндүлөрү тартып immunoprecipitated эле, Креатинкиназа иш өлчөнгөн. Cdk5 иши жакшы p35 протеин деъгээлинде менен байланыштуу, ал эми Cdk5 белок менен бирге эмес, (Анжир. 2 C жана D). Бул жыйынтыктар p35 белок суммасы Cdk5 иши үчүн чен-жагдай экенин билдирген. Ошондуктан биз striatal тинейджер сигналдаштыруунун ёскён Cdk35 ишинин таасирин изилдөө Tgp5 чычкандар колдонгон.
Анда-32 боюнча DARPP-34 Кокаин-Кош Phosphorylation Tgp35 Чычкандарда уялтпоо. DARPP-32 милдети бир нече сайттар өз phosphorylation абалына көз каранды болот (20). Айымдарга Анда-32 боюнча DARPP-34 phosphorylates, ал эми Cdk5 Анда-32 боюнча DARPP-75 phosphorylates. Ошентип, биз жапайы түрү жана Tgp32 чычкандар тартып striatal үзүндүлөрү менен DARPP-35 боюнча phosphorylation абалын карап чыкты. phospho-Анда-75 DARPP-32 деъгээли Tgp35 чычкандар жогору болгон (Анжир. 3A; 1.6 жапайы түрү чычкандар наркынын жогору ± 0.2 эсе). Биз кийинки striatal тинейджер сигналдаштыруунун ёскён Cdk5 ишинин натыйжаларын баалоо. Биз Tgp35 чычкандардын кокаин айынан эми айымдарга жандануусуна карап Анда-32 боюнча DARPP-34 боюнча phosphorylation абалын талдоо. phospho-Анда-34 DARPP-32 деъгээли кокаин сайган жапайы түрү чычкандардын 15 мүн жогорулаган (Анжир. 3B; 1.8 базалдык жогору ± 0.2 эсе). Бирок, DARPP-34 боюнча Анда-32 phosphorylation боюнча кокаин таасир Tgp35 чычкандар менен начарлагандыгынын болгон (базалдык жогору 1.2 ± 0.3 эсе). Бул жыйынтыктар Cdk5 жигердъълъктън жогорулашы, балким, Анда-32 боюнча DARPP-75 phosphorylation аркылуу кокаин-азгырган айымдарга жандануусуна начарлагандыгынын (көрсөтүлгөн6, 12). Бул presynaptic Cdk5 жигердүүлүктүн өсүшү тинейджер боштондукка азайган алып барат, ошондой эле мүмкүн болгон, жана бул кокаин кыскартылган күчүнө өбөлгө түзөт деп. Белгилей кетчү жагдай, кокаин саюудан p35 жана Cdk5 белок, ошондой эле Креатинкиназа ишин көлөмүн таасирин тийгизген жок (Анжир. 3 C жана D). Бул кокаин үчүн өнөкөт таасири болгон мурунку изилдөө айырмаланып p35 жана Cdk5 эркбилдирүүсүнө Эсеп-жөнгө салуу үчүн көрсөтүлгөн эмес (6).
Cdk5 ишин Up-жөнгө салуу ERK1 / 2 боюнча Кокаин-Кош Кошулуу үчүн ошондой але. Жашыруун далилдер striatum менен тинейджер сезгич жандантуу да ЭРК жолуна, анын ичинде башка белги каскад ишке экенин көрсөтүп турат (21, 22), Кокаин үчүн жүрүш-туруш жооп маанилүү ролду ээ болгон (23). Ошондуктан биз Cdk5 иши ЭРК жолуна Кокаин айынан жандануусуна таасир этиши мүмкүн, жокпу, карап. ЭРК жолуна кошуу жапайы түрү чычкандардын чейин striatal үзүндүлөрү менен кокаин сайган, MEK1 / 2 Ser-217 жана Ser-221 боюнча phosphorylation көбөйгөн айкын эле (базалдык жогору 1.5 ± 0.2 эсеге) жана ERK1 боюнча байкалган / Анда-2 боюнча 202 жана сааты-204 (ERK2 phosphorylation: базалдык жогору 1.5 ± 0.2 эсе) (Анжир. 4 A жана B). Бирок, кокаин айынан MEK1 / 2 жандандыруу (базалдык жогору 1.2 ± 0.2 эсеге) жана ERK1 / 2 боюнча (ERK2 phosphorylation: базалдык жогору 1.2 ± 0.2 эсе) Tgp35 чычкандардын начарлагандыгынын болду (Анжир. 4 A жана B). Мындан тышкары, phospho-ERK1 / 2 базалдык сапаты Tgp35 чычкандардын тёмён болгон (0.8 ± жапайы түрү чычкандар наркынан төмөн 0.2 эсеге), бул көрүнүш статистикалык мааниге ээ болгон жок, ал эми. Бул акыркы жыйынтыгы каталитикалык иштин азайууга дуушар болгон Анда-5 боюнча MEK1 боюнча Cdk286 көз каранды phosphorylation ыйгарылышы мүмкүн (24). Бул мүмкүнчүлүгүн баалоо үчүн, Анда-1 боюнча MEK286 боюнча phosphorylation абалын карап жана phospho-Анда-286 MEK1 жогорку өлчөмү Tgp35 чычкандардын тартып striatal үзүндүлөрү бар деп табылган (Анжир. 4C; 1.3 жапайы түрү чычкандар наркынын жогору ± 0.1 эсе). Мындан тышкары, Анда-1 боюнча MEK286 боюнча phosphorylation мамлекеттик Cdk5 иши мамилелерден жабыр эмес, таап менен ырааттуу кокаин бир инжектордук, тарабынан белгиленет жана өзгөртүлөт эмес, (Анжир. 3D).
Ядрого тинейджер белги Propagation жогорулатуу Cdk5 иш-тозогун жатат. Айымдарга жана ЭрК катышуусу менен бир нече белги каскаддарынын иштеринин Кокаин айынан жандантуу Ser-133 анын phosphorylation аркылуу ядросундагы копиялоо себеп CREB кийинки кошулуу алып келүүдө (22, 25). Айымдарга жана ЭРК жандандыруу каскаддарынын боюнча Cdk5-кыйыр Тоскоол болуучу таасирлери ядросундагы CREB phosphorylation кошулмак мүмкүн же иликтөө үчүн, биз жапайы түрү жана Tgp133 чычкандар тартып striatal үзүндүлөрү менен Ser-35 боюнча CREB боюнча phosphorylation абалын карап чыкты. phospho-CREB базалдык деңгээл Tgp35 чычкандардын төмөн болгон (0.7 ± жапайы түрү чычкандар наркынын 0.1 эсе) (Анжир. 5). кокаин жумшалбаса жооп, phospho-CREB деъгээли жапайы түрү чычкандардын striatum (базалдык жогору 1.5 ± 0.1 эсеге) кёбёйгён, ал эми кокаин бул жооп Tgp35 чычкандардын начарлагандыгынын болгон (1.2 ± 0.1- бүктөп базалдык жогору) (Анжир. 5).
с-кетүүсүнүн ген, анын ичинде Ser-133 боюнча CREB боюнча Phosphorylation, белгилүү ген жайылтуучу аймактагы лагеринде жооп элемент аркылуу анын жүргүзүлсө протоколдун ишин өрчүндөйт (26). Ошондуктан биз кокаин сайган жапайы түрү жана Tgp35 чычкандардын striatum менен с-FOS кошулуу карап. жапайы түрү чычкандардын, с-FOS деъгээли РНК кокаин жумшалбаса кийин жогорку наркы (базалдык жогору 1.8 ± 0.2 эсе) 30 мүн чейин ёскён, ал эми андан кийин сайган 120 мүн базалдык чейин кайтып келди (Анжир. 6 A жана B). Бирок, с-FOS өзгөрүүсү РНК сайган 30 мин чейин жапайы түрү чычкандардын караганда Tgp35 чычкандардын ≈30% тёмён болгон (Анжир. 6 A жана B). Tgp35 чычкандардын с-FOS азыраак дарстарында жана мындан ары immunohistochemistry ырасташкан эле (Анжир. 6 C-F). Кокаин башкаруу да жапайы түрү жана Tgp35 чычкандар менен, катуу striatum боюнча dorsomedial-dorsocentral бөлүктөрүндө, с-кетүүсүнүн immunoreactivity кёбёйгён жана жантайма каптал бөлүктөрүндө. Бирок, с-кетүүсүнүн-immunopositive клеткалардын саны кокаин-жасалма өсүшү өзгөчө Tgp35 чычкандардын striatum менен начарлагандыгынын болду (Анжир. 6G). Жалпысынан, бул натыйжалар ядрого striatal тинейджер сигналдаштыруунун кокаин-арачылыгы жогорулатуу Tgp35 чычкандар, өсүп Cdk5 иштин мүмкүн натыйжасында тосулуп бар экенин көрсөткөн.
талкулоо
Cdk5 жана козгогучту p35 кокаин үчүн өнөкөт таасири менен жөнгө салынат максаттуу ген аныкталган (6). Биз бул жерде далил тууралуу Cdk5 ишин өскөн, Cdk35 чейин жөнгө ордуна чейин жөнгө p5 натыйжасында, striatal нейрондордо кокаин-арачылыгы тинейджер сигналдаштыруунун өчүүсү алып келет. striatal тинейджер сигналдаштыруунун боюнча Cdk5 же p35 да, өйдө-жөнгө сөз кесепеттерин изилдеп, эки transgenic чычкан линиялары, TgCdk5 жана Tgp35 чычкандар, талдоого алынган. Биз Cdk5 иши p35 белок күч жараша Эсеп-жөнгө салынган, бирок Cdk5 белок күч менен таасир эткен жок деп табылган. Биздин мурдагы Кабарда Cdk5 иши TgCdk5 чычкан мээнин иш качан жапайы түрү чычкан мээде тёмён болгон Cdk5 immunoprecipitates пайдалануу менен бааланат деп көрсөткөн (17), Monomeric Cdk5 p5 денгээлде болсо, бир күч менен Cdk35 overexpression натыйжалары көбөйгөн эмес, деп эсептейт. Бул жыйынтыктар p35 белок деңгээл Cdk5 иши үчүн чен-жагдай экенин билдирген.
Tgp35 чычкандар кокаин үчүн striatal жооп көбөйгөн Cdk5 ишине тыюу жатканын айтып, кокаин курч сайган striatum да CREB phosphorylation жана с-кетүүсүнүн бир аз кошулуу көргөзмөгө алып чыгат. Tgp35 чычкандар менен кокаин-арачылыгы тинейджер сигналдаштыруунун өчүүсү, кыязы, бир нече белги каскаддарынын тартуу DARPP-5 боюнча Cdk32-арачылыгы тыюу салуу аркылуу жетишилет, ал эми айымдарга жана Эрк. Кокаин башкаруу ушул жооп Tgp32 чычкандардын начарлагандыгынын, ал эми жапайы түрү чычкандардын Анда-34 боюнча DARPP-35 жана айымдарга phosphorylation көбөйгөн. Анда-32 боюнча DARPP-34 жана айымдарга phosphorylation CREB менен белок phosphatase 1 (PP1), Сер-133 боюнча dephosphorylation үчүн жооптуу энзим ишин тоскоол болуу үчүн көрсөтүлгөн (27). Ошентип, PP1 иши Tgp32 чычкандардын DARPP-1 / PP35 жолуна аркылуу антогонисттик эмес.
ERK1 / 2 Кокаин айынан жандантуу да Tgp35 чычкандардын күчсүздөнткөн болчу. Cdk5 ERK1 / 2 Кокаин айынан кошууну чектеген турган бир нече так механизмдер бар. Биринчиден, Анда-5 боюнча DARPP-32 боюнча Cdk75 көз каранды phosphorylation ERK1 / 2 кошулуу үчүн зарыл болгон ар кандай айымдарга-кыйыр MEK1 / 2 кошулуу кийинки тыюу салуу алып, эми айымдарга жайлатуучу мүмкүн. Жакында эле жүргүзүлгөн бир изилдөөгө да Анда-32 боюнча DARPP-34 ошол phosphorylation Кокаин-арачылыгы кошулуу үчүн талап кылынат ERK1 / 2 MEK кошулуу кыйыр жөнгө салуу менен байланышкан бир нече жолдор менен, ошондой эле striatal-байытылган phosphatase жөнгө менен тапты, бир тирозин phosphatase ERK1 түздөн-түз иш-аракет / 2 (28). Бул мүмкүнчүлүгү Ser-1 жана Ser-2 боюнча MEK217 / 221 кокаин айынан phosphorylation боюнча Tgp35 чычкандар менен жоюлган деп таап тарабынан сунуш кылынат колдоо. Дагы бир мүмкүн болгон жолдору, анын каталитикалык ишин кыскартууга алып жана ERK5 / 1 ишине тыюу салуу алып келет Анда-286 боюнча MEK1 боюнча phosphorylation Cdk2 көз каранды аркылуу болот (24).
striatum жылы Cdk5 иш-Көлдү жана жаныбарлардын өнөкөт кокаин дарылоо-турумдун кесепеттерин potentiate көрсөтүп келет (6). Cdk5 ишинин чейин жөнгө гипотезага ылайык кайталап кокаин башкаруунун кесепеттерин каршы үчүн нейрондордун көнүктүрүү салым кошо алат (6), Биз striatum менен CREB phosphorylation жана с-FOS аз кошулуу натыйжасында DARPP-5 жана MEK32 боюнча Cdk1-арачылыгы phosphorylation, ERK1 / 2 Кокаин айынан туташуу өчүүсү салым кошкон деп табылган. Биздин жыйынтыктар идеясын Cdk5 ишин, өйдө-жөнгө p35 натыйжасында өсүп колдоо, кокаин үчүн өнөкөт таасиринен кийин striatum менен ген сөздөр өзгөртө алат. Бул CREB жана с-FOS катары копиялоо себеп ишине өзгөрүүлөр менен өзгөрүүлөргө дуушар болушу мүмкүн. Ошентип, Cdk5 Activator p35, Cdk5 иши жөнүндө, анын чен-чектөө таасиринен улам, кокаин көз карандылыкты негизги нейрондордун иш-узак мөөнөттүү өзгөрүүлөргө алып келиши мүмкүн.
Acknowledgments
Биз Талас ыраазычылык билдиребиз. Mary Jo Danton, кол жазманын критикалык окуу арабанын Грант жана Sashi Kesavapany. Бул иш Кыргыз Республикасынын саламаттык Грант Z01DE00664-05 институттары (ABK чейин) тарабынан колдоого алынган, АКШ Коомдук саламаттык сактоо кызматынын Грант DA10044 жана Симонс Foundation гранттардын, Петир J. чукул корунун жана Picower Foundation (PG чейин).
жазуулар
Кыскартуулар: Cdk5, cyclin көз каранды Креатинкиназа 5; ЭРК, клетка сыртындагы сигнал-жөнгө Креатинкиназа; DARPP-32, тинейджер конуштун-жөнгө белок, молекулярдык массалык 32 KDA; Айымдарга, САМР-каранды Креатинкиназа; MEK, ЭРК Креатинкиназа; CREB, САМР-жооп элемент-милдеттүү белок.
шилтемелер
;